Synthese von Goldnanopartikeln unter Verwendung von Mimosa tenuiflora-Extrakt, Bewertung von Zytotoxizität, zellulärer Aufnahme und Katalyse

Einführung

Die pflanzenvermittelte Biosynthese von Nanomaterialien ist eine umweltfreundliche Methode, die die NP-Synthese im Eintopfverfahren ermöglicht. Dies liegt daran, dass die gleichen bioreduzierenden Wirkstoffe von Pflanzenextrakten als Stabilisierungsmittel für die gebildeten Partikel mit einem geringen Anteil an toxischen Verbindungen wirken [1,2,3]. In diesem Sinne Mimosa tenuiflora (Mt)-Rinde hat einen hohen Gehalt an kondensierten Tanninen, die eine Struktur von vier Flavonoid-Einheiten haben [4], Saponine, Glucose, Alkaloide (N ,N -Dimethyltryptamin) und Stärke [5,6,7,8]. Diese Verbindungen (kondensierte Tannine) können als Metallionen reduzierende Mittel wirken, aber insbesondere wurde das Flavonoid mit der Metallkomplexierung in Verbindung gebracht [4].

Mt-ethanolischer Extrakt wurde als antibakterielles Mittel für Gram-negative, Gram-positive und Hefe verwendet [9]. Auch als Antiprotozoenmittel (mit Flavonoiden aus Blättern und Blüten des Berges) [10] und zur Hautregeneration [6]. Darüber hinaus hat es das Potenzial, schwere Hautgeschwüre zu heilen, deren Eigenschaften Molekülen und Polyphenolen der Mt-Rinde zugeschrieben wurden [11]. Pflanzenextrakte zeigen Eigenschaften wie Antioxidantien und enthalten insbesondere Polyphenole, die in der grünen Synthese von metallischen Nanopartikeln wie Au, Ag, Fe, Pt, Pd, Cu, deren Legierungen und Oxiden verwendet werden [12, 13]. Die optischen Eigenschaften von NP-Systemen, wie die Resonanzfrequenz der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), hängen nicht nur von den intrinsischen Eigenschaften der Nanomaterialien (Größe, Form, Dielektrizitätskonstante) ab, sondern auch von den Umgebungseigenschaften, die NPs umgeben, als Lösungsmittel, in denen sie sich befinden dispergiert oder die Natur stabilisierender Moleküle, die sich auf NPs erstrecken. Diese Parameter sind entscheidend, um die Peakposition von SPR in NP-Systemen zu definieren [14,15,16].

Einerseits wurde in mehreren Arbeiten über die katalytischen Eigenschaften von AuNPs berichtet, die sich auf den Abbau organischer Verbindungen wie Pestizide, Phenolverbindungen und Farbstoffe beziehen [17,18,19] und werden in katalytischen Prozessen im Zusammenhang mit der Umweltsanierung verwendet, z. B. zur Reinigung von kontaminiertem Wasser [20]. In den letzten Jahren sind mehrere Berichte über AuNPs erschienen, die mit Pflanzenextrakten wie schwarzem Kardamom synthetisiert wurden [21] und katalytische Aktivitätsbewertungen beim Farbstoffabbau, die in der Industrie verwendet werden, wie Methylenblau (MB) [22], Methylorange [19] oder Rhodamin B [23]. In die entgegengesetzte Richtung wurde jedoch in einigen Veröffentlichungen berichtet, dass mit stabilisierenden Molekülen beschichtete NPs aufgrund der für die Katalyse verfügbaren Stellen auf der NP-Oberfläche, die von organischen Molekülen besetzt war, eine schlechte katalytische Aktivität zeigten [24, 25]. AuNPs wurden auch als molekulare Sensoren verwendet, wie zum Beispiel beim kolorimetrischen Nachweis toxischer Metallionen [7] und bei theragnostischen (therapeutischen und diagnostischen) Anwendungen [26].

Funktionalisierte AuNPs mit Molekülen auf der Oberfläche zeigen optische und biologische Eigenschaften im Zusammenhang mit Zusammensetzung, Dicke, Organisation und Konformation, die ihre Eigenschaften definieren [27]. Die Nanotechnologie hat verschiedene Herausforderungen, wie die Aggregation von AuNPs im Blutkreislauf [28]. AuNPs mit einer Konzentration von weniger als 20 µg/ml und einer Größe um 20 nm zeigen keine zytotoxischen Wirkungen in gesunden und krebsartigen Zelllinien, und ihre Verwendung hat es ermöglicht, die Interaktion zwischen NPs und Zellen zu analysieren [13, 29, 30]. Dann bietet die Nanotechnologie eine Möglichkeit, auf der gleichen Skala von zellulären Rezeptoren [31] zu interagieren, die es ermöglichen, über zelluläre Prozesse [32, 33] und antimikrobielle Eigenschaften [34] zu lernen, beispielsweise bei oxidativem Stress, der eine Signalkaskade für verschiedene Effekte, wie Zytotoxizität oder antioxidative Abwehrreaktion [35]. Darüber hinaus fungieren funktionalisierte AuNPs als Transporter von Medikamenten, Genen oder Proteinen [36] und biomedizinischen Anwendungen [37, 38]. Darüber hinaus erzeugen AuNPs-Liganden als Proteine ​​und Polymere eine chemische Umgebung, die die Internalisierung der NPs begünstigt, um das Zytoplasma, den Zellkern zu erreichen oder über die Membran hinauszuhalten [39].

In dieser Arbeit wurden AuNPs mit einem reichhaltigen polyphenolischen Mt-Rindenextrakt synthetisiert. Die Zytotoxizität von AuMt wurde in HUVEC-Zellen bewertet und die zelluläre Internalisierung wurde durch konfokale Mikroskopie nach 24 h überwacht. Katalytische Aktivität von AuMt beim Abbau von MB in Gegenwart von Natriumborhydrid (NaBH₄ ) bei Raumtemperatur, ausgewertet. Unsere Ergebnisse wurden mit ähnlichen katalytischen Arbeiten mit AuNPs verglichen, die mit „grünen“ Methoden synthetisiert wurden.

Materialien und Methoden

Materialien und Chemikalien

Für die AuMt-Synthese wurden 15 µg Mt-Baumrinde in Stücke geschnitten und in einen 100-ml-Kolben gegeben. 70 ml Ethanol (Fermont, 99% rein) und 30 ml Reinstwasser (18 ml, Millipore) wurden zugegeben, dann mit Aluminium bedeckt und 15 Tage bei Raumtemperatur belassen. Die Lösung wurde mit Whatman-Filterpapier (8 µm) und später mit einer Acrodisc (0,20 µm) filtriert. Die erhaltene Lösung wurde als Reduktionsmittel (Mt-Extrakt) für die AuMt-Synthese verwendet. Ein Teil des Filtrats wurde am Rotationsverdampfer eingedampft und dann für den DPPH- und Gesamtpolyphenol-Assay lyophilisiert und um eine Eichkurve des Mt-Extrakts zu erstellen. Die Konzentration des Mt-Extraktes betrug 32,5 µg/ml, bestimmt aus einer Eichkurve. Tetrachlorgoldsäure (HAuCl₄ , Sigma-Aldrich 99% rein) wurde als metallischer Vorläufer verwendet. Die Konzentrationen der in der Synthese verwendeten Vorstufen betrugen 5,3 µM für AuMt1 und 2,6 µM für AuMt2. Das Reduktionsmittelvolumen wurde konstant gehalten (1,6 ml) und das Gesamtvolumen der Probe wurde mit Reinstwasser auf 6 ml aufgefüllt. Zusätzliche Datei 1:Tabelle S1 zeigt die bei der AuMt1- und AuMt2-Synthese verwendeten Formulierungen sowie die pH-Werte für jeden Reaktanten. Die Synthese wurde bei 25 °C unter Laborlichtbedingungen durchgeführt. Das verwendete Protokoll war wie folgt. In ein 50-ml-Röhrchen wird die Mt-Extraktlösung zugegeben, gefolgt von Reinstwasser und schließlich der Goldvorläuferlösung, wobei sofort 10 Sekunden lang bei 3000 U/min im Vortex gerührt wird. Die Synthese der AuMtNPs wurde durch die Farbänderung der Mischung innerhalb weniger Minuten visuell bestätigt. Der Reinigungsprozess von NP besteht aus dem Zentrifugieren der Suspension bei 14.000 U/min für 1 Stunde, dem Verwerfen des Überstands, dem Hinzufügen von Wasser und dem Dispergieren durch Beschallung, wobei der Vorgang zweimal wiederholt wird. Nach Zugabe von Ethanol wird AuMt erneut durch Beschallung dispergiert und 1 Stunde bei 14.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und ausgefällt und in einem Ofen bei einer Temperatur von 40 °C getrocknet. Das erhaltene Nanokomposit besteht dann aus AuNPs mit Mt-Extraktmolekülen auf der Oberfläche.

Zeitabhängige pH-Änderung der AuMtNP-Synthese

Der pH-Wert der AuMtNP-Synthese wurde während der Reaktion gemessen. Dazu wurde ein Multiparameter pH/Leitfähigkeit Benchtop Meter (Orion™ VERSA STAR™) verwendet. Das Instrument wurde bei 25 °C kalibriert, wobei eine Puffer-Referenzstandardlösung zur Kalibrierung bei pH = 4,01 verwendet wurde. Ein Umwälzbad wurde verwendet, um die Temperatur der Proben bei allen Messungen auf 25 °C (± 0,1 °C) zu kontrollieren. Der pH-Wert wurde gemessen, als die Reaktion 180 s lang durchgeführt wurde, unmittelbar nach dem Mischen der Reagenzien. Das gleiche Gerät wurde bei der pH-Messung von Reaktanten verwendet.

UV-Vis-Spektren, 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl (DPPH) und Gesamtpolyphenol-Assay

Ein Zweistrahl-Perkin-Elmer Lambda 40 UV/Vis-Spektrometer wurde verwendet, um das UV-Vis-Spektrum des Extrakts in einem Messbereich von 200–400 nm mit einer Scanrate von 240 nm/min zu erhalten. AuMt SPR wurde zwischen 250 und 875 nm überwacht.

Die Kinetik der AuMt-Bildung wurde durch Messung der Absorption bei 550 nm jede Sekunde bestimmt, während die NP-Synthesereaktion in der Quarzzelle unter Magnetrührung entwickelt wurde.

Für DPPH-Assays wurden alle Tests dreifach durchgeführt. Es wurden verschiedene Mt-Extraktkonzentrationen (25, 12,5, 6,25 und 3,125 µg/ml) getestet. 100 µl jeder Konzentration wurden 100 µl Ethanol zusätzlich zur DPPH-Lösung (300 µM) zugesetzt. Anschließend wurden die Proben 2 h im Dunkeln inkubiert, bevor die Extinktion bei 517 nm gemessen wurde. Die Ergebnisse wurden mit Vitamin C und Katechinen (70 µmol/L) verglichen und beide Moleküle als Kontrollen verwendet. Für die Abfangaktivität wurde auf Ethanol gelöstes DPPH-Radikal als Blindwert verwendet [40, 41]. Der Prozentsatz der Fängeraktivität wurde mit Gl. (1).

wobei eine Probe ist die Extinktion der Probe und eine Kontrolle ist die Blindabsorption. Die Daten wurden mittels Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey-Mehrfachvergleichstests analysiert.

Für den Gesamtpolyphenol-Assay wurden die gleichen Konzentrationen durch Zugabe von Folin-Ciocalteu bei 0,25 N und Natriumcarbonat bei 5% bei einer 1-stündigen Inkubation in Abwesenheit von Licht verwendet. Die Absorption wurde bei 750 nm gemessen. Die Ergebnisse werden als Gallussäureäquivalente ausgedrückt [42, 43].

Zeta-Potenzial und DLS-Größenbestimmung

Das Zeta-Potential (ζ) von NPs wurde mit Zetasizer NS (Malvern, PA) gemessen und die Größen wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) von Zetasizer NS (Auflösung von 0,5 nm) gemessen. Das Gerät berechnet das ζ durch Bestimmung der elektrophoretischen Mobilität (μ _e ) unter Verwendung von Henry-Gl. (2) [44]:

wo ε , η , und f (ka) bezeichnen die Dielektrizitätskonstante des Mediums, die Viskosität des Mediums bzw. die Henry-Funktion. Als Näherungswerte für f . werden im Allgemeinen zwei Werte verwendet (ka) Bestimmung, entweder 1,5 oder 1,0. Die elektrophoretischen Bestimmungen von ζ werden am häufigsten in einem wässrigen Lösungsmittel und einer mäßigen Elektrolytkonzentration durchgeführt. f (ka) nimmt in diesem Fall den Wert 1,5 an und wird als klassische Smoluchowski-Approximation bezeichnet, Gl. (3) [45].

Die Proben wurden für ζ . in eine U-förmig gefaltete Kapillarzelle gegeben Messungen. Jede Probe wurde bei Raumtemperatur (25°C) in dreifacher Ausfertigung gemessen.

Bewertung der NP-Stabilität in ergänztem Kulturmedium (s-DMEM)

Die AuMtNP-Stabilität wurde in s-DMEM durch DLS und ζ . bewertet . Der hydrodynamische Durchmesser (2R_H ) von AuMt1 und AuMt2 wurde bei 37 °C in Reinstwasser und s-DMEM in Konzentrationen zwischen 25 und 200 µg/mL gemessen. Für AuMt1 und AuMt2 in s-DMEM wurde ζ bei 37 °C gemessen, um festzustellen, ob das Kulturmedium die NP-Oberflächenladung modifiziert. Nanopartikel wurden in ein Eppendorf-Röhrchen mit zuvor thermalisiertem s-DMEM gegeben und im Vortex bei 3000 U/min 30 Sekunden lang gerührt. Die Inkubation bei 37 °C wird 15 min gehalten, bevor die Messungen bei der gleichen Temperatur durchgeführt werden.

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)

Mt-Extrakt und AuMt-FTIR wurden mit einem Perkin-Elmer Frontier FTIR unter Verwendung einer festen Probe erhalten. Das Spektrum wurde im Transmissionsmodus mit einer Auflösung von 2 cm ^− 1 . erhalten , von 4500 bis 500 cm ⁻¹ .

Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS)

XPS-Experiment wurde unter Verwendung eines Perkin-Elmer (Modell PHI 5100, Auflösung basierend auf dem FWHM des Ag3d5/2-Peaks 0,80 eV, XR-Quelle, Dual-Standard-Anode (Mg/Al) und 15 kV, 300   W, 20   mA durchgeführt ). Survey-Scan-Analysen wurden mit einer Scan-Rate von 0,5 eV/s durchgeführt. Für hochauflösende Analysen wurde eine Scanrate von 0,025 eV/s verwendet.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Für TEM wurden 10 µl der Probe auf Kupfergitter aufgebracht, die mit einem Fomvar-Kohlenstoff-Film bedeckt waren (Electron Microscopy Sciences, 300 Mesh). Die Gitter werden 1 h trocknen gelassen und für 12 h in eine Vakuumkammer gestellt. Die elektronenmikroskopische Ausrüstung ist ein Feldemissionsgerät Jeol 2010 F, das bei 200 keV betrieben wird. Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS) ist ein Detektor Bruker Quantax 200, Peltier-gekühlt und an ein TEM-System gekoppelt. Die Interplanarabstände der Kristallebenen, die durch hochauflösendes TEM (HRTEM) aufgedeckt wurden, wurden durch digitale Mikrographieanalyse (3.0 Gatan-Version) bestimmt.

Röntgenbeugung

Die Daten wurden unter Verwendung eines Bruker D8 QUEST-Diffraktometersystems, ausgestattet mit einem Mehrschicht-Spiegelmonochromator, und einer abgedichteten CuKα-Mikrofokusröhre (λ = 1,54178 Å). Frames wurden um T . gesammelt = 300 K über Scans.

AuMt zytotoxische Wirkung

Die zytotoxische Wirkung von AuMt wurde in HUVEC-Zellen mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet. Die Zellen wurden auf Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma-Aldrich), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (GibcoBRL) bei 37 °C und 5 % CO₂ . gezüchtet . HUVEC-Zellen wurden in einer Neubauer-Kammer gezählt und die Lebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Ausschlusstest (Sigma-Aldrich) bestimmt.

Für den MTT-Assay wurden die Zellen auf 100.000 Zellen/ml eingestellt und 100 µl pro Well wurden in 96-Well-Platten gegeben. AuMt1 und AuMt2 wurden in Konzentrationen von 200, 100, 50 und 25 µg/ml untersucht. Behandelte Zellen wurden 24 und 48 Stunden lang bei 37 °C, 5% CO₂ . inkubiert . Nach der Inkubationszeit wurde die Platte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und MTT-Lösung wurde zugegeben und 4 h lang inkubiert. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde zugegeben, um MTT-Kristalle aufzulösen. Die Absorption wurde bei 570 nm auf einem Multimode-Plattenlesegerät (Synergy HTX, BioTek) unter Verwendung der Gen5-Software gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung von Gl. (4):

wobei eine Probe ist die Extinktion der Probe und eine Kontrolle ist die Extinktion des Leerwerts [46, 47].

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen (SD) ausgedrückt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Tukey-Test, ggf. eine Einweg-ANOVA, analysiert. P Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Software Origin Pro 9.1 wird für das Datenmanagement, die statistische Analyse und die Diagrammerstellung verwendet. Die verwendeten Zeichen sind *p < 0,05. Die Leistung mit der Behandlung (AuMt1 und AuMt2) und der Kontrollgruppe für 24 und 48 Stunden wurde verglichen.

Für den Lebend/Tot-Assay wurden HUVEC-Zellen auf Glasobjektträger ausgesät und mit AuMt1 und AuMt2 behandelt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Objektträger mit dem Lebend-/Tot-Viabilitäts-/Zytotoxizitäts-Kit (ThermoFisher) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gefärbt. Die Proben wurden durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM800, Carl Zeiss) beobachtet.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie:Fluoreszenz von AuMt

Die konfokale Mikroskopieanalyse wurde in einem LSM 800-Gerät (Carl Zeiss, Jena Deutschland) durchgeführt, das auf einem inversen Mikroskop Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss, Jena Deutschland) montiert war. Für die Studie wurden drei Laser von 405, 488 und 640 nm mit einer jeweiligen maximalen Leistung von 5, 10 und 5 mW verwendet. Die Fluoreszenz wurde mit hochempfindlichen GaAsP-Detektoren gesammelt. Hellfeldbilder wurden durch eine Sammlung von durchgelassenem Laserlicht auf einer Photo Multiplier Tube (PMT) erhalten. Für AuMt-Fluoreszenz, Lebend/Tot-Assay und NP-Verteilung in HUVEC-Zellstudien wurde ein Plan-Apochromatisches x 40/0,95 Trockenobjektiv verwendet. Für 3D-Rekonstruktionszellen mit AuMt wurde ein planaprochromatisches x 63/1,40 Ölobjektiv verwendet.

Für die AuMt-Fluoreszenzcharakterisierung wurde ein Tropfen von 20 µL kolloidaler NP-Dispersion in einem Deckglas abgeschieden und bei Raumtemperatur getrocknet, bevor eine Analyse durch CLSM durchgeführt wurde. Als Anregungsquelle wurde ein 640-nm-Laser bei 0,5% Leistung verwendet, und die Fluoreszenz wurde zwischen 650 und 670 nm gesammelt. Hellfeld-AuMt-Bilder wurden unter Verwendung eines 488-nm-Lasers (0,2% der Leistung) im Durchlichtmodus erzeugt. Die Fluoreszenz und das Hellfeld wurden auf separaten Spuren gesammelt.

Mobile Internalisierung

Für die AuMt-Internalisierung auf HUVEC-Zellen wurde der Zellkern mit 4′,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) gefärbt und die Aktinfasern mit anti-β-Aktin-Antikörper gekoppelt an Fluorescein-5-isothiocynat (FITC) zur Abgrenzung der Zellgrenze . DAPI wurde mit einem 405-nm-Laser bei 1,0 % Leistung und FITC mit einem 488-nm-Laser bei 0,20 % angeregt. Die Emissionen von DAPI und Anti-β-Aktin-Antikörper wurden zwischen 410 und 500 nm bzw. 500–700 nm gesammelt. AuMt wurden mit einem 640 nm Laser (0,50% Leistung) angeregt und die Emission wurde zwischen 650 und 700 nm gesammelt.

3D-Zell-AuMt-Rekonstruktionen und orthogonale Projektionen wurden aus 30 Bildern im Z-Stack-Modus (insgesamt Z length = 8 μm) und sammelte die Fluoreszenz von DAPI, FITC und AuMt wie oben beschrieben. Fluoreszenzsignale wurden auf separaten Spuren für jedes Z . gesammelt Position. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde das FITC-Signal bei einer 3D-Rekonstruktion weggelassen.

Ein relativer Vergleich der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln wurde realisiert. Dazu wurde die mittlere Fluoreszenzintensität von AuMt1 und AuMt2 in HUVEC-Zellen aus konfokaler Bildanalyse mit der Software ImageJ bestimmt [48].

Katalyse

Katalytische Aktivität auf MB, bei einer Konzentration von 3,33 × 10 ⁻⁵ M, wurde durch UV-Vis-Spektroskopie analysiert. Bei der homogenen Katalyse wurden 90 µl NPs (2 µg/ml) direkt in die Quarzküvette mit MB und 200 µl NaBH₄ . gegeben bei einer Konzentration von 100 µM. Die Probe wurde durch Magnetrühren innerhalb der Spektrophotometerzelle homogenisiert. Die Reaktion wurde bei 25°C durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussionen

Synthese

Durch visuelle Untersuchung wurde festgestellt, dass die NP-Synthese in beiden Systemen sehr schnell ist. Die intensivste Farbe des AuMt1-Systems im Einschub der zusätzlichen Datei 1:Abbildung S1 zeigt einen höheren Gehalt an NPs aus dieser Synthese. Dies liegt daran, dass AuMt1 im Vergleich zu AuMt2 eine doppelte Konzentration an metallischer Vorstufe aufweist. In Zusatzdatei 1:Tabelle S1 haben Reagenzien, die bei der Nanopartikelsynthese verwendet werden, einen sauren pH-Wert. Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1 zeigt die pH-Änderungen der Reaktionen bei der Durchführung von AuMtNPs-Synthesen. Reaktionen beginnen in einer sauren Umgebung (pH < 2.65), und während sich die NP-Synthese entwickelt, nimmt der Säuregehalt zu. Dies ist auf die Deprotonierung von Hydroxylgruppen zurückzuführen, die in polyphenolischen Molekülen von Mt-Extrakt vorhanden sind. Tatsächlich ist dies der erste Schritt eines Oxidreduktionsprozesses, der zur Übertragung von Elektronen von der deprotonierten Hydroxylgruppe auf Au ³⁺ . führt Ionen. Als Produkte der Oxidreduktionsreaktion, Au ³⁺ Ionen werden zu Metallatomen Au ⁰ . reduziert und polyphenolischer Ring, der 2 Elektronen beisteuert, wird oxidiert. Der Vorgang wird im Einschub der zusätzlichen Datei 1 beschrieben:Abbildung S1.

UV-Vis-Spektren, DPPH und Gesamtpolyphenolassays

Das UV-Vis-Spektrum von Mt-Rindenextrakt ist in Abb. 1a gezeigt, wobei das Signal aus einer gut definierten Bande mit einem Maximum bei 280 nm und einer Breite von 50 nm besteht. Dieses Spektrum ist dem für Rumex hymenosepalus berichteten sehr ähnlich Wurzelextrakt, der einen hohen Gehalt an polyphenolischen Verbindungen aufweist [49]. Die Bestimmung des Polyphenolgehalts in Mt-Rindenextrakt ist wichtig, da diese Moleküle als Reduktionsmittel bei der AuNP-Synthese einen erheblichen Beitrag leisten können und die notwendigen Elektronen für die Reduktion von Au ³⁺ . bereitstellen Ion zu metallischem Gold (Au ⁰ ). Sobald NPs gebildet sind, werden polyphenolische Verbindungen auf ihrer Oberfläche absorbiert und geben den Nanomaterialien Stabilität.

Charakterisierung von Mt-Extrakt. a Mt-Extrakt UV-Vis-Spektrum und b DPPH-Hemmung mit Einweg-ANOVA-Analyse (*p < 0,05)

Für den DPPH-Assay wurde beobachtet, dass wir für 12,5 mg/l Mt-Extrakt eine Hemmung von 50 % (L50) erhielten, ähnlich den Werten, die für Vitamin C und Katechine (46 bzw. 58 %) berichtet wurden. Dies weist darauf hin, dass Mt-Extrakt eine antioxidative Kapazität besitzt, die den als Kontrollen verwendeten reinen Verbindungen sehr ähnlich ist, Abb. 1b, wo signifikante Unterschiede (*p < 0,05) von Kontrollwerten sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Der Wert von 425 mg/g aus dem Gesamtpolyphenol-Assay zeigt, dass fast die Hälfte der extrahierten Masse Gallussäure entspricht. Die hohe antioxidative Kapazität und der hohe Polyphenolgehalt im Mt-Extrakt legen nahe, dass es im Rahmen einer nachhaltigen Chemie als Reduktions- und Stabilisierungsmittel für die Nanomaterialsynthese eingesetzt werden kann [50, 51].

Charakterisierung

Kinetik der Bildung und UV-Vis-Spektren AuMt

Abbildung 2a zeigt eine zeitliche Entwicklung der Extinktion auf einem SPR-Peak von AuNPs (550 und 560 nm für AuMt1 bzw. AuMt2) während der Nanomaterialsynthesereaktion. Experimentelle Daten stimmen mit der Sigmoidalfunktion von Boltzmann [52] überein, bei der mindestens drei Wachstumsstadien beobachtet werden. Im ersten Fall wächst die Extinktion zu Beginn der Synthesereaktion langsam, wenn Au ³⁺ Ionen werden zu Au ⁰ . reduziert und bilden Aggregate aus wenigen Atomen, die sich zu kleinen NPs verbinden. In der zweiten Stufe erhöhen die kleinen NPs ihre Größe durch autokatalytisches Wachstum und die Absorption wächst schnell. In der letzten Stufe, bei der NP-Rekristallisation, erreicht die Absorption ihre stationäre Phase. Wie in Abb. 2 zu sehen ist, wird eine maximale Extinktion in 60 s für AuMt1 und 120 s für AuMt2 erreicht. Interessanterweise beträgt die erste Wachstumsphase für AuMt1 20 s, während sie für AuMt2 fast null (weniger als 1 s) beträgt, was mit dem höheren Anteil an reduzierenden Molekülen (Mt-Extrakt) in Bezug auf die metallische Vorstufe erklärt wird. Dies begünstigt die schnelle Kernbildung in NPs von AuMt2 gegenüber AuMt1; dennoch ist die nächste Wachstumsstufe der NPs für AuMt2 gering, und es werden NPs mit größerer Größe erhalten. Es wurde berichtet, dass die AuNP-Synthese unter Verwendung von Maltose und Tween80 als Stabilisierung eine Wachstumskinetik mit einer Reaktionszeit zeigt, die der in dieser Arbeit beschriebenen sehr ähnlich ist [53]. In einem anderen grünen Synthesebericht [54] wird darauf hingewiesen, dass der niedrigste Anteil an Reduktions-/Vorläufersubstanzen NPs kleinerer Größe erzeugt.

UV-Vis-Charakterisierung von AuMt1 und AuMt2. a Kinetische Bildung und b UV-Vis-Spektren

Abbildung 2b zeigt die charakteristischen Absorptionsspektren von AuMt im Bereich von 250–875 nm. SPR für AuMt1 zeigt eine symmetrische Bande mit einer maximalen Absorption von 550 nm und einer Breite von 200 nm. Der AuMt2-Plasmonenpeak erleidet eine leichte Rotverschiebung, die jetzt bei 560 nm lokalisiert ist, mit einem asymmetrischen Band und einer größeren Breite als 300 nm, was auf den Größenunterschied zwischen den beiden Nanomaterialien zurückzuführen ist (d_AuMt1 AuMt2 )_{1 2} . Ein ähnliches Verhalten wurde bei der AuNP-Synthese mit Natriumcitratum als Reduktionsmittel beschrieben, bei der die Rotverschiebung und die Plasmonenverbreiterung höheren Schwingungsmoden zugeschrieben werden, die den Extinktionsquerschnitt durch Erhöhung der NP-Größe beeinflussen [55]. Darüber hinaus zeigen beide Spektren die Absorptionsbande bei 280 nm, die den polyphenolischen Molekülen des Extrakts entspricht, was darauf hindeutet, dass Mt-Extrakt als Stabilisator der AuMtNPs wirkt.

Größe, Zeta-Potenzial und Stabilität von AuMtNPs

Die AuMtNP-Größen nach DLS und Z-Potential wurden unter verschiedenen Bedingungen für eine Konzentration (50 μg/ml) getestet, wie in Tabelle 1 gezeigt. AuMt1 und AuMt2 zeigten hohe negative Werte (≤ 30 mV) in Wasser, die die elektrostatische Stabilität beider Nanopartikel begünstigen Systeme. Gemäß Qu et al. [56], ζ Wert nimmt mit der NP-Größe allmählich zu; in unserem Fall hat AuMt1 eine kleinere Größe als AuMt2 in Wasser, eine Größe, die durch die NP-Synthese kontrolliert wird. Diese Größenwerte stimmen mit NP ζ . überein Werte, wobei der höhere ζ entspricht NP höherer Größe. Zetapotentiale (ζ ) von in s-DMEM dispergierten AuMtNPs zeigen weniger negative Werte im Vergleich zu denen, die in Reinstwasser erhalten wurden (Tabelle 1). Diese Reduktion kann auf in DMEM vorhandene Kationen und FBS-präsente Proteine ​​zurückgeführt werden, die AuMtNP-Oberflächen bedecken, die eine Abnahme der elektrostatischen Wechselwirkungen bewirken. Trotzdem ζ Reduktion bleibt der Wert für beide Systeme nahe bei − 25 mV, was darauf hindeutet, dass Nanopartikel ihre elektrostatische Stabilität nach s-DMEM-Inkubation bewahren [57]. Darüber hinaus zeigt Tabelle 1 die mit DLS erhaltenen Ergebnisse für hydrodynamische AuMtNP-Durchmesser (2R_H ) gemessen bei 37 °C in Reinstwasser und Kulturmedien. Bei s-DMEM nahm die Größe beider Systeme aufgrund der Proteinadsorption an der Nanopartikeloberfläche zu [58]. Für AuMt1 das Wachstum von 2R_H aufgrund von Proteinkorona beträgt 33,8 nm und für AuMt2 42,9 nm. Es wird erwartet, dass je größer die Nanopartikelgröße ist als die Oberfläche für die Proteinabsorption [59]. Dies könnte den etwas kleineren Wert von ζ . erklären für AuMt2 im Vergleich zu AuMt1 in s-DMEM. Bei AuMt1 und AuMt2 beruht die Wechselwirkung mit s-DMEM-Proteinen auf den Extraktmolekülen, die an die Nanopartikeloberfläche angelagert sind. Diese Moleküle unterscheiden sich geringfügig zwischen AuMt1 und AuMt2, wie die XPS-Ergebnisse zeigen. Wir haben auch den pH-Wert von Lösungen im gleichen Konzentrationsbereich gemessen. Es wurde festgestellt, dass sich der pH-Wert nicht ändert und der Mittelwert sowohl für AuMt in Reinstwasser als auch für 7,2 in s-DMEM bei etwa 7,5 lag (Tabelle 1).

Zusätzliche Datei 1:Abbildung S2 zeigt die hydrodynamischen Durchmesser von AuMtNP bei Dispersion in Reinstwasser und s-DMEM bei 37 °C in einem Konzentrationsbereich zwischen 25 und 200 μg/ml. Für jedes untersuchte System ändert sich der hydrodynamische Durchmesser nicht mit der Nanopartikelkonzentration, und nur für AuMt2 s-DMEM bei 100 μg/ml nimmt die Partikelgröße in Bezug auf die niedrigste bewertete Konzentration zu, was auf NP-Aggregationsprozesse bei diesen Konzentrationen hinweisen kann [32].

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)

Das in Abb. 3 gezeigte FTIR-Spektrum entspricht dem Mt-Extrakt, AuMt1 und AuMt2. Die charakteristischen breiten Bänder um 3250 cm ⁻¹ . zentriert werden hauptsächlich mit phenolischen OH aus Tanninen und Flavonoiden in Verbindung gebracht. Peaks bei 1594 cm ⁻¹ entsprechen der N-H-Biegeschwingung bei 1705 cm ⁻¹ azyklische Dehnung zu Keton und Bereich zwischen 1000 und 1300 cm ⁻¹ zur C–O-Streckung. Peaks im Bereich von 1600 bis 500 cm ⁻¹ werden mit Polyphenolen identifiziert, Signale bei 1235 und 1160 cm ⁻¹ hängen mit der aromatischen C-O-Bindungsstreckung zusammen, und bei 1020 cm ⁻¹ zu aliphatischer C–O-Bandstreckung und bei 1235 cm ⁻¹ sind speziell mit der Charakteristik der zyklischen Natur des Äthers verbunden. Diese Signale können mit den am häufigsten vorkommenden Verbindungen in Mt-Extrakt wie Mimosa-Tannin, Flavon-Sakuranetin, Triterpenoiden, Saponinen, Chalkonen und dem N . in Verbindung gebracht werden ,N -Dimethyltryptaminalkaloid (zusätzliche Datei 1:Abbildung S3). Die Proben AuMt1 und AuMt2 zeigen die gleichen charakteristischen Peaks im Bereich der Polyphenole, was bestätigt, dass NPs durch Mt-Extraktmoleküle stabilisiert werden [60]. Wir beobachten eine Änderung von 1331 cm ⁻¹ im Breitenband und eine Abnahme der Peakintensität für AuMt1 und AuMt2 entspricht der Bindung zwischen AuNPs und der C-H-Gruppe von Polyphenolen; 1723 cm ⁻¹ wird bei der Reduktion von Au ³⁺ . durch Oxidation von Polyphenolen in Carboxylverbindungen verschoben zu Au ⁰ [51, 61, 62].

FTIR-Spektren. Mt-Extrakt (grün), AuMt1 (schwarz) und AuMt2 (rot)

Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS)

In der XPS-Scan-Analyse für AuMt1 und AuMt2 haben die Proben eindeutig das Vorhandensein von Sauerstoff (O 1s ), Kohlenstoff (C 1s ) und Gold (Au 4f ), deren Peaks um 532, 284 bzw. 85 eV zentriert sind, wie in Abb. 4a, b gezeigt. Hochauflösende XPS-Experimente wurden durchgeführt, um eine relative Häufigkeit verschiedener funktioneller Gruppen von Molekülen zu ermitteln, die AuNP-Oberflächen beschichten. Au4f hochauflösende XPS-Spektren für AuMt1 und AuMt2 bestehen aus zwei symmetrischen Peaks, die durch 3.7 eV getrennt sind (Abb. 4b, e). Peaks im Zusammenhang mit 4f _5/2 spin-orbital coupling are located on binding energy (BE) of 88.6 and 87.7 eV for AuMt1 and AuMt2, respectively. For 4f 7/2, spin-orbital coupling peaks are located on 84.9 and 84.0 eV. The link of intensities (I4f _2.07  > I4f _5/2 ) and location and separation (ΔBE = 3.7 eV) between peaks confirm that gold ions (Au ³⁺ ) are reduced completely to metallic gold Au ⁰ [63]. Au4f signals, for AuMt1, are slightly shifted (~ 0.9 eV) at higher energies with respect to sample AuMt2. This can be explained in terms of NP size differences between samples. AuMt1 has a half population of NPs with size less to 40 nm, while AuMt2 NPs have a mean diameter of 150 nm, determined by TEM. Peak shift for Au4f signals, due to the presence of small NPs, has been reported by other authors who relate the Au4f BE increase with decreasing NP size [64, 65]. Also, the shift effect could be due to the interaction of functional groups capped on surfaces of AuNPs [66]. In Fig. 4c, f, the high-resolution XPS spectra of C1s are shown for AuMt1 and AuMt2. Spectra were deconvoluted by 3 Gaussian bands associated with C=O, C–O, and C–C or C=C. For AuMt1, peaks are centered on 286.9, 286.1, and 284.5 eV, for AuMt2 on 287.0, 286.3, and 284.7 eV, respectively. Comparing the experimental XPS curves for C 1s , we see appreciable differences between AuMt1 and AuMt2. The main difference comes from a significant decrease in AuMt1 of the signal associated with C–O group. Comparing the percentage contributions of each group, obtained from the deconvolutions (Additional file 1:Table S2), we see that in AuMt2 contribution of C–O signal is 27.8% while in AuMt1 is 16.6%. This difference can be explained in terms of the oxide-reduction reaction that gives rise to the process of AuNP formation. The synthesis of AuMt1 is added twice the metal precursor (HAuCl₄ is 0.01 M) than in synthesis of AuMt2. In both cases, the same amount of extract is used as a reducing agent, so in AuMt1, more hydroxyl groups (−C–OH) are consumed to reduce a greater number of Au ³⁺ Ionen. Thus, a decrease of C–O signal in AuMt1 confirms that hydroxyl groups participate in the synthesis reaction. High-resolution XPS of O 1s revealed that carbonyl C=O is the most abundant group (Additional file 1:Figure S4 and Table S2). In addition, the content of the C=O group is higher in the AuMt1 sample, which confirms what was previously discussed.

XPS spectra of AuMt1 and AuMt2. a , d Survey spectra, b , e Au4f high resolution, and c , f C1s high resolution

XPS and FTIR indicate that AuMtNPs interact mainly with carbonyl groups (ketones) in addition to hydroxyl groups of Mimosa tannins, saponins, and other molecules that participate in the reduction of Au ³⁺ zu Au ⁰ and stabilization of AuMtNPs [63, 67, 68].

Transmission Electron Microscopy

AuMt1 TEM micrographs are shown in Fig. 5a, b and AuMt2 in Fig. 5d, e showing products’ shape distribution. AuMt1 has the biggest diversity in shapes. AuMt shape is determined by the relationship between the variation of metal precursor concentration and Mt extract at a fixed concentration. In this case, NPs were observed without cleaning the extract to observe the interaction that forms around the AuMt. As observed in the micrographs, an extract is placed on the surface; however, NPs are kept dispersed and no aggregation is shown. Figure 5c, f show size distribution for each sample, and AuMt1 have an average size dispersion of 40 nm and AuMt2 of 150 nm.

Size distributions by TEM. a , b , c AuMt1 and d , e , f AuMt2

In Fig. 6a, AuMt TEM micrographs were also analyzed by EDS (Fig. 6b), which showed Au presence. Other chemical elements such as Cl, O, and Ca, on EDS spectrum, come from the extract that surrounds NPs. According to the crystallographic tab (JCPDS file:04-0784), the obtained distances between 2.35 and 2.03 Å (Fig. 6c) correspond to Au crystalline planes (111) and (200).

Nanostructural characterization of AuMt. a TEM, b EDS, c single HRTEM, and FFT and d XRD

X-ray Diffraction (XRD)

Figure 6d shows the characteristic AuMt XRD diffraction peak at 2Ɵ , which are in 38.17, 44.37, 64.81, and 77.66 ^o corresponding with the planes (111), (200), (220), and (311), respectively; these planes correspond with the face-centered cubic Au (space group Fm ³ m, JCPDS File No. 89-3722). High Score Plus and Origin software were used for the analysis [69].

Biological Tests

Cytotoxicity by MTT and Live/Dead Assay

To evaluate AuMt1 and AuMt2 toxicity, tests were performed on HUVEC cells using MTT. Four concentrations and two times for both materials were evaluated. In Fig. 7a, it is observed that at 24 h for AuMt1, cell viability decreases between 10 and 20%, only in concentrations higher than 25 μg/mL. For AuMt2, a similar effect is obtained in cell viability; however, the concentration of 100 μg/mL seems to have no effect on these tests. In Fig. 7b, MTT tests at 48 h for AuMt1 and AuMt2 are shown. For AuMt1, it is easy to notice that concentration with the greatest effect is 50 μg/mL, where the viability drops almost 30% compared to the control. The concentration of 50 μg/mL seems to be the concentration with the highest toxic effect; however, when the obtained data were analyzed, it is found that there is no significant difference between the obtained data on 24 and 48 h, a similar result obtained for 100 and 200 μg/mL, Fig. 7c. For AuMt2, a toxic effect between 20 and 30% is observed only on 100 and 200 μg/mL, while 25 and 50 μg/mL show no significant difference, compared to the observed effect at 24 h, Fig. 7d. This seems to correlate with AuMt2 size growth in s-DMEM (Additional file 1:Figure S2) where at a concentration of 100 μg/mL, they begin to aggregate. In the work published by Chandran et al. [70], they used gold nanoparticles coated with branched polyethyleneimine (BPEI), lipoic acid (LA), and polyethylene glycol (PEG), where they see an important toxicity in HUVEC cells by nanoparticles coated with BPEI, which have sizes of 40 and 80 nm, where viability is between 20 and 30%. When these particles are covered with human serum proteins, it is found that toxicity decreases; this is due to the corona effect. Recently, Zhaleh et al. [71] have reported the biogenic synthesis of 40-nm gold nanoparticles using leaf extracts from Gundelia tournefortii L. plant. Interestingly and in contrast to our results, the authors indicate that MTT cell viability tests for these particles in HUVEC, the cell viability was 95% at 1000 μg/mL; however, they do not establish if the low cytotoxicity is due to the fact that there is no material internalization or if the particles are harmless due to protein corona. In this sense, bioreductive compounds present in Gundelia tournefortii L extract are different from those reported for Mimosa tenuiflora extract (Additional file 1:Figure S3). Thus, the interactions of these two nanoparticle systems with proteins present in FBS are very different, which may explain the differences in cytotoxic responses.

Viability assay using MTT in HUVEC cell. a For 24 h and b 48 h. 0ne-way ANOVA analysis with (*p < 0,05). Comparison between 24 and 48 h for c AuMt1 and d AuMt2 with ANOVA analysis with Tukey tests (n.s. no significance and (*p  < 0.05))

As mentioned above, AuMt1at a 50-μg/mL concentration shows the highest toxicity and cellular uptake. We believe that toxicity may be due to the fact that the nanomaterial has a low affinity to s-DMEM proteins, since it has only 16.6% of hydroxyl groups on the surface to promote hydrogen bonding with S-DMEM proteins. The fact that the material toxicity decreases as AuMt1 concentration increases may be due to a cellular detoxification response, like an exocytosis caused by high intracellular content of gold [70]. For AuMt2, the toxicity effect at 100 and 200 μg/mL may be due to nanomaterial agglomeration, which could be attaching to the membrane causing adverse effects for the cells; however, more experiments are required to confirm this hypothesis.

Only one concentration (50 μg/mL) was chosen to be evaluated by live/dead fluorescent dye; this is due to the purpose of confirming the MTT results and later analyzing the metallic NP internalization in HUVEC cells, avoiding a field saturation by NPs. When cells were stained with live/dead fluorescent dye kit, it was found that a large part of the cell population favorably marked for calcein and just a few for ethidium homodimer, indicating that cell culture is viable, as shown in Fig. 8.

Live/dead assay in HUVEC cells. a , d , und g with calcein; b , e , und h with ethidium homodimer; und c , f , und i merge by confocal microscopy

Confocal Laser Scanning Microscopy:Fluorescence of AuMt

In Fig. 9a, d are shown micrographs of AuMt1 and AuMt2 in bright field and in Fig. 9b, e, their corresponding fluorescence, captured by confocal microscopy. Red fluorescence of AuMt (collected emission 650–700 nm) was excited employing 640 nm diode laser, and a mayor size of NPs can be appreciated in AuMt2 sample than AuMt1. In the merge images in Fig. 9c, f, it can be observed how the luminescence comes exclusively from the dark points associated with the NPs. This indicates that the cleaning process effectively removed the extract that is not complexed to the nanomaterial, so there is no background emission. It is interesting to observe that an intense fluorescence of the NPs captured by the confocal system is achieved at a very low excitation power of the laser (below 0.5 mW). So, this NPs system can be fluorescently traced efficiently in cellular systems with little risk of phototoxicity. Some authors have reported fluorescent emission about 610 nm, suggesting intrinsic Au fluorescence [72, 73]. AuNPs emission is related to the core size confinement effect that generates discreet electronic states [74]. However, in our case, the metal surface is covered with flavonoids, which show fluorescence, and when complexing with AuNPs, the fluorescence of both is enhanced. Different authors have reported that fluorescence is largely enhanced by charge transfer from the surface ligands to the metal core via S–Au bonds [75]. It has also been reported that ligands (thiol molecules, DNA oligonucleotides, dendrimers, polymers, peptides, and proteins) affect AuNPs optical and electronic properties since its fluorescent properties can be significantly affected by their surface chemistry [76].

AuMt1 and AuMt2 fluorescence. a , d Bright field. b , e Confocal. c , f Merge

Cellular Internalization

Cells were also analyzed, by confocal microscopy, after 24 h incubation, with AuMt1 and AuMt2 at a concentration of 50 μg/mL. The nucleus is shown in blue color using DAPI Fig. 10a, and the cytoskeleton structure was stained with anti-beta actin in green color Fig. 10b and merge Fig. 10c. The observed micrographs were obtained through 3 different channels on separate tracks, where the excitation wavelengths were 405, 488, and 640 nm for DAPI, anti-beta actin, and AuMt, respectively.

AuMt1 and AuMt2 cellular internalization. a , d , und g with DAPI; b , e , und h with beta-actin; und c , f , und i merge by confocal microscopy

As previously described, cells were also analyzed by confocal microscopy, for AuMt1 and AuMt2 internalization, at a concentration of 50 μg/mL. Confocal micrographs show that AuMt are internalized in HUVEC cells cytosolic space, and many of these particles are surrounding the nucleus, without being internalized in it. When not observing particles in the nucleus, a more meticulous analysis was carried out, by cell orthogonal projection and a 3-D reconstruction. Observing the micrographs of both reconstructions, it is possible to notice that AuMt is distributed differentially. In Fig. 11a, b for AuMt1, it can be observed that a material is dispersed in the cytoplasm, while in AuMt2, the material is concentrated in the nuclear periphery, as shown in Fig. 11c, d. We were not able to find NPs in the nucleus, and this suggests that the nanomaterial has little or no genotoxic potential, since it has no way of interacting with nuclear DNA, which is a quality for a nanocarrier. Efficient cellular uptake depends on NP size, shape, charge, and coating, the parameters that can affect their interactions with cell proteins. The fact that polyphenolic compounds are found on AuMt surface could facilitate the nanomaterial internalization, which would make it a candidate as a possible pharmacological nanocarrier [77,78,79].

Orthogonal projections and 3-D images. a , c AuMt1 and AuMt2 cellular internalization analysis through orthogonal projection and b , d 3-D reconstruction by confocal microscopy

The obtained results for an AuMtNP cellular uptake in HUVEC by a confocal microscopy at 50 μg/mL suggests that AuMt1 interacts with the cells in a greater quantity than AuMt2 in a 3:1 ratio, as seen in Additional file 1:Figures S5–S7. If we consider that protein corona in AuMt1 is 9.1 nm smaller than in AuMt2, we can suggest that AuMt1-efficient internalization by HUVEC cells is given by a combination of factors such as AuMt1 smaller size, the highest absolute value of z potential and the lower thickness of protein corona. This indicates a poor protein coverage that allows partial exposure of the nanoparticle surface, which is rich in extract molecules. Therefore, nanoparticles can interact by means of extract molecules with surface-specific membrane receptors that facilitate the internalization of AuMt1.

Catalytic Tests

Catalysis

Analysis of catalytic reaction was realized to calculate the degradation percentage ( %D) using the Eq. (5):

using the A ₀ absorbance at t  = 0 and A is the absorbance at time t . Langmuir-Hinshelwood equation was used to calculate the slope of the regression plot \( \ln \left(\frac{A}{A_0}\right) \) versus irradiation time [80], which is expressed in Eq. (6) and K is the first-order rate constant of the degradation ratio:

For the analysis of catalytic activity on MB degradation, the absorbance at 660 nm was monitored. Figure 12 shows the AuMt1 and AuMt2 catalytic activity, where a decrease on maximum absorption of MB is observed as time progresses Fig. 12a, d. MB degradation and its conversion to leucomethylene is confirmed by progressive decreases of the absorbance at 292, 614, and 660 nm correspond to MB and by the increase in time of the absorbance at 256 nm associated with leucomethylene. Homogeneous catalysis reaches a 50% MB degradation at 190 s Fig. 12b, while the degradation ratio K for the total process is 8.24 × 10 ⁻³ s to AuMt1 Fig. 11c. AuMt2 reaches a 50% of MB degradation in 400 s, Fig. 12e, and K takes the value of 3.54 × 10 ⁻³ /s, Fig. 12f.

AuMt1 and AuMt2 Catalysis. a , d UV-Vis spectra. b , e Percentage. c , f Ratio of MB degradation

On this way, AuMt1 have a more efficient response than AuMt2. We observed a size-dependent effect (AuMt) in degradation ratio [81], and a total surface area of NPs is inversely proportional to the NP size [37]. Table 2 shows a comparison between different green syntheses of AuNPs and their K obtained in size function.

Conclusions

In this work, we show for the first time that the extracts of bark of Mimosa tenuiflora allow the production at room temperature of gold nanoparticles by means of one-pot synthesis. AuNP sizes are easily controlled by regulating a metal precursor/reducing an extract ratio. It was observed that AuMt1 and AuMt2 cellular uptakes generate a moderate cytotoxic effect at 24 and 48 h post exposition. However, toxicity does not behave in a dose-dependent manner, which suggests different action mechanisms for AuMt1 and AuMt2. XPS and FTIR indicate that AuMtNPs interact mainly with carbonyl groups (ketones) in addition to hydroxyl groups of Mimosa tannins, saponins, and other molecules that participate in the reduction of Au ³⁺ zu Au ⁰ and stabilization of nanomaterials. Polyphenols adsorbed on AuMtNPs facilitate nanoparticle internalization. AuMt2 were located near the nuclear periphery, but for AuMt1, it was observed that nanoparticles distribute on the whole cell and present a 3 fold uptake in comparison to AuMt2. Due to the fluorescence property at low excitation power and a high cellular uptake, AuMtNPs synthesized with Mt bark extracts are candidates for its implementation as drug nanocarriers and fluorescent probes in cells. However, other strategies must be addressed, in order to reduce the nanomaterial toxicity. Finally, it was observed that AuMtNPs showed a relevant catalytic activity on MB degradation using NaBH4 as a reducing agent.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All datasets are presented in the main paper.

Abkürzungen

ANOVA:

Analysis of variance

AuMt:

Colloids formed by AuNPs and molecules of Mt

AuNPs:

Goldnanopartikel

CLSM:

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle medium

DMSO:

Dimethylsulfoxid

DPPH:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

EDS:

Energy dispersive X-rays spectroscopy

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

HAuCl₄ :

Tetracloroauric acid

HRTEM:

High-resolution TEM

HUVEC:

Endothelzellen der menschlichen Nabelvene

MB:

Methylene blue

Mt:

Mimosa tenuiflora

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NaBH₄ :

Sodium borohydride

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PdI:

Polydispersity index

PMT:

Photomultiplier tube

ROI:

Region of interest

SD:

Standard deviations

SPR:

Oberflächenplasmonenresonanz

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

UV-Vis:

Ultraviolett-sichtbar

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

XRD:

Röntgenbeugung