Hochauflösende Ground-State-Depletion-Bildgebung von Stickstoff-Fehlstellen-Zentren in Nanodiamanten

Zusammenfassung

Das negativ geladene Stickstoff-Fehlstellen-Zentrum (NV⁻) in Nanodiamanten (NDs) wurde kürzlich für Anwendungen in der Zellbildgebung untersucht aufgrund seiner besseren Photostabilität und Biokompatibilität im Vergleich zu anderen Fluorophoren. Super-Resolution-Bildgebung mit 20-nm-Auflösung von NV⁻ in NDs wurde über die Jahre mittels sub-diffraktionsbegrenzter Bildgebungsansätze wie Single-Molecule-Stochastischer-Lokalisationsmikroskopie und Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie bewiesen. Hier zeigen wir die erste Demonstration von Ground-State-Depletion (GSD) Nanomikroskopie dieser Zentren in NDs unter Verwendung von drei Strahlen: einem Probestrahl, einem Depletionsstrahl und einem Reset-Strahl. Der Depletionsstrahl bei 638 nm zwingt die NV⁻-Zentren überall in den metastabilen dunklen Zustand, außer im lokalen Minimum, während ein Gaußscher Strahl bei 594 nm die NV⁻-Zentren sondiert und ein 488-nm-Reset-Strahl verwendet wird, um den angeregten Zustand wieder zu bevölkern. Super-Resolution-Bildgebung eines einzelnen NV⁻-Zentrums mit einer vollen Breite bei halber Maximum (FWHM) von 36 nm wird demonstriert, und zwei benachbarte NV⁻-Zentren, getrennt um 72 nm, werden aufgelöst. GSD-Mikroskopie wird hier auf NV⁻ in NDs mit deutlich niedrigerer optischer Leistung im Vergleich zu Bulk-Diamant angewendet. Diese Arbeit demonstriert die Notwendigkeit, die Stickstoffkonzentration in NDs zu kontrollieren, um deren Anwendung in Super-Resolution-Bildgebungsmethoden anzupassen, und ebnet den Weg für Studien von NV⁻ in NDs nanoskaligen Wechselwirkungen.

Einleitung

Das Stickstoff-Fehlstellen-Zentrum (NV⁻) in Diamant, bestehend aus substituiertem Stickstoff mit einer benachbarten Vakanz, hat breites Interesse in mehreren wissenschaftlichen und technologischen Feldern geweckt, unter den bemerkenswertesten als Quanten-Speicher in zukünftigen Quantencomputern [1], als hochempfindlicher Magnetometer [2] mit Anwendungen in der biomedizinischen Bildgebung lebender Zellen [3] und neuronaler Aktivität [4], und als atomarer Sonden in verschiedenen Super-Resolution-Bildgebungsmethoden wie Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie und ihrer Spin-Variante, einer Variante der Ground-State-Depletion (GSD) Mikroskopie [5–7] und Single-Molecule-Stochastischer-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) mit nanometrischer Spin-Lokalisation [8]. Insbesondere Methoden, die das Beugungslimit in der Fluoreszenzmikroskopie überwinden, repräsentieren einen Paradigmenwechsel in der heutigen biomedizinischen Wissenschaft [9], und NV⁻ in Diamant hat in diesem Bereich eine relevante Rolle als neuartiger Nanoprobe gespielt. Aufgrund der Diamant-Inertheit, hoher Biokompatibilität, Robustheit und Photostabilität der NV⁻-Photolumineszenz mit hohem Quantenausbeute wurde es breit für Anwendungen in biomedizinischer Wissenschaft und Biophotonik [10, 11] und in Gehirnmikroskopie [12] erforscht, auch in seiner Nanostrukturform bekannt als Nanodiamanten (NDs) [13, 14]. NDs behalten ähnliche NV-Fluoreszenzeigenschaften des Wirts-Bulk-Diamanten mit den Vorteilen, besser kompatibel für Life-Science-Super-Resolution-Bildgebungsanwendungen zu sein [15]. Aufgrund der Inhomogenität in Formen und Material-Stickstoffdotierung der derzeit massenproduzierten fluoreszierenden NDs, die variable Eigenschaften des NV im Vergleich zu Bulk-Diamant induzieren und oft andere Verunreinigungen beherbergen, ist Super-Resolution-Bildgebung mit NDs generell anspruchsvoller im Vergleich zu Bulk-Diamant.

Einschränkungen bei der Anwendung von Super-Resolution-Methoden auf NDs im Vergleich zu höherer Reinheit Bulk-Diamant sind assoziiert mit der Variabilität der photo-physikalischen Eigenschaften des NV⁻ aufgrund von Inhomogenität der NDs Stickstoffkonzentration, Ladungsfallen und anderer Verunreinigungskonzentrationen.

Nanoskalige Bildgebung von NV⁻-Zentren in NDs wurde mit STED-Mikroskopie mit einer Depletionsstrahl-Leistung von > 650 mW demonstriert, um 20-nm-Auflösung zu erreichen [16, 17] (die maximale Auflösung in Bulk wurde mit wenigen 3,7 GW/cm² erreicht [5]); jedoch ist eine Bildgebungsmodalität, die nanoskalige Auflösung mit optischen Intensitäten in der Größenordnung von µW erreicht, notwendig für z. B. nanoskalige in-vivo-Zellbildgebung, um Phototoxizität zu reduzieren. NDs haben den Vorteil, zelluläre Markierung zu ermöglichen, was mit der Bulk-Plattform nicht möglich ist, und wurden für Super-Resolution-Bildgebung magnetischer Felder mittels SMLM [18] verwendet, was weniger phototoxisch ist als STED oder GSD-Mikroskopie. Frühere Super-Resolution-Bildgebung von NV⁻ in Bulk-Diamant mittels GSD wurde durch Entleeren seines Grundzustands mittels eines hochintensiven 532-nm-Strahls erreicht, der die Zentren in den lumineszierenden Zustand anregt; daher erfolgt die Entleerung des Grundzustands über den angeregten Zustand [7]. Dieser Ansatz erforderte jedoch ebenfalls sehr hohe optische Intensitäten, um Super-Resolution zu erreichen (mehrere GW/cm², um eine Auflösung < 10 nm zu erreichen) und einen Bildrekonstruktionsalgorithmus, um ein positives Bild zu erhalten [19]. Niedrigleistungs-Super-Resolution wurde mittels Pikosekunden-Pulslaser erreicht, der die Ladungskonversion von NV⁻ in seinen neutralen Ladungszustand (NV⁰ mit einer Null-Phononen-Linie bei 575 nm) in Bulk-Diamant induziert, bekannt als Charge-State-Depletion (CSD) Nanomikroskopie [20, 21]; jedoch betrug die durchschnittliche Depletionsstrahl-Leistung 1 mW, um 12-nm-Auflösung zu erreichen, und der Mechanismus scheint materialabhängig zu sein, d. h. ultra-niedrige Stickstoffkonzentration (unter 5 ppb [21]), allgemein in elektronischem Grad Chemical Vapor Deposition Bulk-Diamant erreicht.

Ein alternativer Ansatz zur GSD-Nanomikroskopie von NV⁻-Zentren in Bulk-Diamant nutzte den metastabilen dunklen Zustand, um den Grundzustand mit viel niedrigerer Leistung über einen langlebigen metastabilen Zustand zu entleeren, wie ursprünglich in Ref. [22] vorgeschlagen und erstmals in Ref. [23] in Säugetierzellen mit organischem Farbstoff Atto532 demonstriert.

Das Prinzip der GSD ist die Deaktivierung der Fluoreszenz eines fluoreszierenden Markers durch einen Zwei-Strahl-Ansatz. Der erste Strahl ist der Anregungs- oder Probestrahl, der den Fluorophor in den angeregten Zustand anregt, und der zweite Strahl ist der Inhibitionsstrahl, der die Fluoreszenz ausschaltet. Die Deaktivierung der Fluoreszenz wird erreicht, indem die Population eines Fluorophors transient in einen metastabilen Zustand oder einen langlebigen Triplettzustand überführt wird. Optische Übergänge zwischen Singulett-metastabilen Zuständen und Triplettzuständen erfordern einen Spin-Flip und sind daher optisch unterdrückt [23].

In Ref. [24] wurde GSD durch kontinuierliches Pumpen des Zentrums von 25 bis 200 µW optischer Leistung von einem CW-Rotlaser (638 nm) ermöglicht, der das NV⁻ in einen nicht-fluoreszierenden Zustand bringt, indem es seinen langlebigen metastabilen Zustand bevölkert, somit seinen Grundzustand entleert, während ein Blauer Laser (476 nm) verwendet wurde, um den dunklen metastabilen Zustand zu leeren, indem Übergänge zu höheren Energiezuständen induziert wurden. Hier wird der 638-nm-Laser auch verwendet, um das Zentrum anzuregen, auch wenn nicht effizient, und es dann in seinen metastabilen Zustand zu überführen. NV⁻ zeigte Lumineszenz nur, wenn es mit sowohl blauem als auch rotem Laser angeregt wurde. Eine Auflösung von 16 nm wurde mit 5 mW Depletionslaser-Leistung erreicht, was viel niedriger ist als in STED oder vorheriger GSD. Eine mögliche Limitation dieser Methode könnte die Abhängigkeit der Eigenschaften des metastabilen Zustands von verschiedenen Diamanttypen mit weniger oder mehr Stickstoffgehalt oder sogar mehr in NDs sein, was ihre Anwendbarkeit limitiert. In Ref. [24] war der Bulk-Diamant ein Typ IIa optischer Grad Diamant, der einer Stickstoffkonzentration von 500 ppm entspricht, bei weitem höher als die jüngere Arbeit zu CSD [21], die auf niedriger Stickstoffkonzentration (< 5 ppb) basiert. Die in Ref. [21] berichtete Aussage, dass der dunkle Zustand von Ref. [24] der neutrale Ladungszustand des NV⁻ ist, leidet darunter, dass nicht berücksichtigt wird, dass bei hoher Stickstoffkonzentration die NV⁻/⁰-Ladungskonversion unterdrückt wird [25] und NV predominantly in seinem negativen Ladungszustand ist; weiterhin ist die gemessene Lebensdauer des dunklen Zustands sehr lang und kann nicht einem Ladungskonversionsprozess zugeschrieben werden. Tatsächlich wurde CSD in kommerziellen fluoreszierenden NDs (abgeleitet von High Pressure High Temperature, HPHT, Diamant) aufgrund ihrer hohen Stickstoffkonzentration, Ladungsinstabilität durch andere Defekte und photo-physikalisch variablen Eigenschaften aufgrund mangelnder Materialkontrolle noch nicht bewiesen.

Der Mechanismus zur Etablierung von GSD-Nanomikroskopie wurde auch noch nicht mit NV⁻-Zentren in NDs berichtet aufgrund der Hypothese, dass CSD in NDs nicht auftreten könnte.

In diesem Papier zeigen wir, dass GSD in NDs durchgeführt werden kann, was die Abhängigkeit von GSD- und CSD-Methoden von der Diamant-Stickstoffkonzentration beweist und die Notwendigkeit von NDs-Materialengineering für spezifische Super-Resolution- und Spin-Sensing-Methoden aufzeigt.

In diesem Papier demonstrieren wir GSD-Nanomikroskopie von NV⁻-Zentren in NDs mittels eines ähnlichen An/Aus-Fluoreszenz-Schaltmechanismus, erreicht durch Überführung der Elektronen in den langlebigen metastabilen Zustand unter Verwendung eines Drei-Strahl-Ansatzes und 300 µW, um den angeregten Zustand vollständig zu entleeren und die maximale Auflösung zu erreichen. Hier zeigen wir, dass die Eigenschaften des NV⁻ in NDs die Anwendbarkeit dieser Methode nicht limitieren, wie zuvor angenommen [24]. Weiterhin waren wir in der Lage, zwei NV⁻-Zentren innerhalb derselben NDs zu unterscheiden, wie zuvor mittels SMLM [26] und STED-Mikroskopie [17] gezeigt.

Um zu belegen, dass der Mechanismus der Grundzustandsentleerung in unserer Arbeit auf einen langlebigen metastabilen Zustand zurückzuführen ist und nicht auf CSD, werden wir die wichtigsten jüngsten Ergebnisse in Bezug auf die NV⁻/⁰-Ladungszustandskonversion zusammenfassen. In Bezug auf photoinduzierte Ionisation wurde die Rekombination der NV⁻/⁰-Ladungszustände gründlich untersucht und als anregungswellenlängenabhängig befunden [27, 28], mit Ladungszustandsschaltung für Rot- (oder Blau-)Laseranregung, wobei rote Anregung verwendet wird, um NV⁻ in seinen neutralen Ladungszustand zu schalten. Diese schnelle Schaltung bei niedriger Laserleistung wurde für die Implementierung von Charge-State-Depletion-Nanomikroskopie [21] und Stochastic Optical Reconstruction Nanoscopy [8] nur in Bulk-Diamant, gezüchtet durch Chemical Vapor Deposition, verwendet, wo die Stickstoffkonzentration gut kontrolliert und generell sehr niedrig ist aufgrund von Niedertemperaturwachstum. Diese Schalt-Dynamik aufgrund der anregungswellenlängenbasierten Ladungszustandskonversion des NV wurde in NDs nicht beobachtet [18, 26, 29], wo Blinken auf Ladungsfallen zurückzuführen war, die durch mechanische Beschädigung während des Fertigungsprozesses (generell Zerkleinern von HPHT hoch-stickstoffhaltigen Mikrodiamanten) oder andere Effekte assoziiert mit Oxidation [26, 29–31] oder Nähe zu anderen Akzeptor-Verunreinigungen [18, 32] entstanden, und als solche nicht mit NV⁻/⁰-Ladungskonversion in Verbindung stehen. Es wurde auch demonstriert, dass NV⁻-Ladungskonversion stark von der Konzentration der Elektronendonator-Verunreinigungen im Diamantgitter abhängt, nämlich die Konversion des negativen Zustands in den neutralen Ladungszustand wird für hohe Konzentrationen von Donator-Verunreinigungen (Stickstoff) unterdrückt [25]. Es wurde vorgeschlagen, Donatoren und Akzeptoren in Diamant zu verwenden, um den NV-Ladungszustand zu stabilisieren [33]. Die meisten dieser Studien wurden in Bulk-Diamant durchgeführt und nur eine jüngere Arbeit [34] zeigte, dass das Wachstum von NDs bei niedriger Temperatur eine niedrigere Stickstoffeinkorporation erlaubt, und als solche verhalten sich NDs wie reiner Bulk-Diamant mit starker Ladungszustandsschaltung für Rot- (oder Blau-)Laseranregung, während Hochtemperaturwachstum, das mehr Stickstoffverunreinigungen einbaut, diese Ladungskonversion signifikant unterdrückt.

In unseren NDs haben wir keine NV⁻/⁰-Ladungskonversion durch Laserwellenlängenanregung beobachtet und führen den dunklen Zustand tatsächlich auf den metastabilen Zustand zurück, wie zuvor getan [24], auch in Anbetracht der großen Größe der hier verwendeten NDs (~ 100 nm), ohne Blinken aufgrund von Oberflächenladungszuständen, und vor allem aufgrund ihrer hohen Stickstoffkonzentration. Die hier untersuchten NDs sind kommerziell aus HPHT-Mikrodiamanten mit mindestens inhomogener 500 ppm Stickstoffkonzentration abgeleitet. Der metastabile Zustand in Ref. [24] wird auch durch seine sehr lange Lebensdauer von 150 s bewiesen.

NV⁻-Zentren werden generell am besten mit 532 oder 561 nm angeregt, da sie eine Null-Phononen-Linie bei 637 nm [35] besitzen, entsprechend dem Übergang zwischen einem Triplett-Grundzustand und angeregtem Zustand, predominantly ein Spin-erhaltender Übergang. Zusätzlich existiert ein Singulett-metastabiler Zustand [36], über den das Zentrum via nicht-radiativem Zerfall transitet. Die optische Übergangslebensdauer von NV⁻ in NDs beträgt ca. 22 ns [37], länger im Vergleich zu 12 ns in Bulk-Diamant [35].

Ein Anregungs- (Probe-) Strahl bei 594 nm fördert den Übergang vom Grundzustand zum angeregten Zustand, während ein Depletionsstrahl bei 638 nm das Elektron der NV⁻-Zentren transient vom angeregten Zustand in den metastabilen Zustand über nicht-radiativen Intersystem-Crossing überführt (Abb. 1a). Die Verwendung von 594 nm als Probe ist durch seine minimale Beeinflussung der dunklen Zustandsbevölkerung im Vergleich zu Grün (üblicherweise 532 oder 561 nm) gerechtfertigt [24]. Diese Methode sättigt den Intersystem-Crossing effektiv und leert den Grundzustand, verhindert Anregung in den angeregten Zustand von NV⁻-Zentren und anschließende Fluoreszenzemission, wenn mit 594 nm gesondert wird. Schließlich repopuliert ein blauer Laser bei 488 nm den angeregten Zustand, indem er den nachfolgenden schnellen (ns) Zerfall zum Grundzustand inhibiert [38].

Ähnlich wie bei STED wird der Depletionsstrahl in der transversalen Ebene in einen Donut-Strahl räumlich geformt, um Super-Resolution-Bildgebung zu erreichen [24]. Die Auflösung d der GSD-Nanomikroskopie folgt Gleichung [23]:

$$d \approx \frac{\lambda}{[2(NA)\sqrt{1 + I_{D}^{\max} / I_{s}}]}$$ (1)

mit NA als numerische Apertur des Objektivs, I_s die Sättigungsintensität, bei der die Hälfte der Fluoreszenz entleert wird, und I_D^max der maximale Intensitätswert am Rand des Nullpunkts.

Wir maßen eine Bildgebungsauflösung von 36 nm für ein einzelnes NV⁻-Zentrum in ND, abhängig von der Depletionsstrahl-Intensität. Weiterhin wurden zwei NV⁻-Zentren, getrennt um 72 nm, aufgelöst. Unsere Arbeit ist vielversprechend für fluoreszierende Nanomikroskopie innerhalb lebender Zellen mit NDs, die NV⁻-Zentren als Biomarker enthalten.

Experimentelle Methoden

Für dieses Experiment wurde eine Suspension von High-Pressure-High-Temperature (HPHT) NDs nominal 100 nm Größe [39, 40], säuregereinigt und in MilliQ-Lösung verdünnt, verwendet. Ein Volumen von 20 µl NDs-Lösung (1:200 verdünnt in MilliQ-Wasser) wurde auf einem mit Sauerstoff-Plasma-Asher gereinigten Borsilikat-Deckglas aufgetropft und an der Luft getrocknet [37]. Der experimentelle Aufbau für GSD-Nanomikroskopie bestand aus einem hausgebauten Konfokalmikroskop mit zwei Continuous-Wave-Diodenlasern bei Wellenlängen 488 nm und 638 nm und einem Continuous-Wave-Helium-Neon (HeNe) Laser bei 594 nm Wellenlänge. In jedem Strahlpfad wurde ein Akusto-Optischer Modulator (AOM) installiert, um optische Pulse aus den Continuous-Lichtstrahlen zu erzeugen und sie miteinander zu synchronisieren. Nach Passieren der AOMs bereinigte ein räumlicher Filter die räumlichen Strahlprofile. Eine Sekundärlinse kollimierte jeden Strahl für weitere Fortpflanzung. Zunächst wurden die Laserstrahlen bei 488 nm und 638 nm Wellenlänge mittels eines 532-nm-Long-Pass-Laser-Flach-Dichroitischen Spiegels (Semrock-LPD01 532R) räumlich überlagert. Ein sekundärer Dichroitischer Spiegel (Semrock-R405/488/543/638) überlagerte alle drei Strahlen räumlich, indem er 488 nm und 638 nm Wellenlängen reflektierte und 594 nm Wellenlänge transmittierte. Das räumliche Strahlprofil des Depletionsstrahls bei 638 nm Wellenlänge wurde mittels einer Phasenplatte in einen Donut-Strahl geformt. Weiterhin wurde eine Viertelwellenplatte vor dem Objektiv platziert, um Zirkularpolarisation des Depletionsstrahls zu gewährleisten. Ein hoch-numerische-Apertur (NA = 1,4) Öl-Immersion-Objektiv wurde verwendet, um die NDs zu bildgeben. Ein Dichroitischer Spiegel (Semrock-LP02-671RU-25) trennte die Fluoreszenz der NV⁻-Zentren von den Anregungswellenlängen und leitete sie zu einem Single-Photon-Avalanche-Dioden-Detektor (SPCM-AQRH-14FC) über eine Single-Mode-Faser, die als Pinhole fungiert. Die schematische Darstellung des optischen Aufbaus ist in Abb. 1b gezeigt.

Gold-Nanopartikel mit durchschnittlicher Größe von 40 nm wurden auf ein Glas-Deckglas aufgetropft und abgebildet, um das räumliche Profil des Depletionsstrahls zu untersuchen. Ein Donut-förmiger Point-Spread-Function mit einem Ring hoher Intensität und einem lokalen Minimum in dessen Zentrum wird beobachtet (Inset von Abb. 1b).

Zunächst untersuchten wir die zeitliche Antwort jedes Laserpulses. Die AOMs werden über LabVIEW mittels eines Multichannel-Pulsgenerators (PulseBlasterESR-PRO) gesteuert, der die individuellen zeitlichen Eigenschaften jedes Laserstrahls sowie das Timing zwischen den drei Strahlen kontrolliert. Aufgrund unterschiedlicher optischer Pfadlängen für jeden der Laser haben optische Pulse, die zur gleichen Zeit erzeugt werden, eine leicht versetzte Ankunftszeit am Detektor. Dies ermöglicht uns zeitliche Kontrolle über alle drei Laserstrahlen im Sub-Mikrosekunden-Zeitmaßstab.

Ein Anstiegs- und Abfallzeit von 60 ns wurde für die Anregungsstrahlen gemessen (Abb. 1c). Die optischen Pulse bei 594 nm und 638 nm Wellenlänge trafen mit einer Trennung von 85 ns und 155 ns bezüglich des Pulses bei 488 nm Wellenlänge ein. Jeder der Laserpulse erzeugt Fluoreszenz, die aus verschiedenen Quellen stammt, einschließlich NV⁻-Zentrum, anderen Verunreinigungen im ND und Defekten im Glas-Deckglas. Nur Fluoreszenz, die vom Anregungsstrahl erzeugt wird, ist für GSD-Bildgebung relevant. Fluoreszenz von anderen Laserpulsen trägt zum Rauschen des Fluoreszenzbildes bei. Aus diesem Grund wird Time Gating eingeführt, um Fluoreszenz, die von anderen Laserpulsen als dem Probestrahl erzeugt wird, zu eliminieren. Dies wird durch Gating der Detektion mit der Pulsankunftszeit des Probestrahls erreicht, was andere fluoreszente Quellen effektiv ausfiltert und das Signal-Rausch-Verhältnis der Bildgebung erhöht.

Eine typische Pulssequenz für GSD-Nanomikroskopie und das Detektionsfenster ist in Abb. 1d gegeben. Das Ausschalten der NV⁻-Zentren-Fluoreszenz wurde durch Überführung der Elektronen in den langlebigen Zustand mit einem Depletionspuls bei 638 nm Wellenlänge erreicht. Anregung von NV⁻-Zentren in der sub-diffraktionsbegrenzten Region wurde durch einen Puls bei 594 nm Wellenlänge bereitgestellt, während ein Puls bei 488 nm Wellenlänge die NV⁻-Zentren zurück in den angeregten Zustand resetete. Eine Pulssequenz wurde 500–1000 mal wiederholt, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten. Die Pulslängen lagen im 10–20 µs Bereich für den Probestrahl (594 nm) und den Reset-Strahl (488 nm). Die optimale Pulslänge des Depletionsstrahls betrug ~ 300 µs (Abb. 2d). Die Optimierung der Strahlpulslängen basiert auf Ref. [24]; jedoch sollte eine systematischere Optimierung durchgeführt werden, um die finale Auflösung zu verbessern. Es wird erwartet, dass die Auflösung von der Inhibitionsstrahl-Pulsdauer abhängt, die durch die Lebensdauer des metastabilen Zustands begrenzt ist.

Ergebnisse und Diskussion

Der An/Aus-Schaltmechanismus wurde untersucht, indem ein NV⁻-Zentrum unter den Laserquellen bei 638 nm und 488 nm Wellenlänge angeregt wurde (Abb. 2a). Ein Anstieg der Fluoreszenzemission von NV⁻-Zentren wurde nur detektiert, wenn die beiden Strahlen räumlich überlagert waren. Dieses Emissionsverhalten wurde verstanden, indem angenommen wurde, dass der Strahl bei 638 nm Wellenlänge Elektronen bevorzugt in den langlebigen Zustand überführt, während der Strahl bei 488 nm spontane Emission ermöglicht (Abb. 1a). Wir nahmen eine Lebensdauer für den langlebigen Zustand von NV⁻-Zentren an, die kürzer ist (die einzige Messung für NDs ist 33–127 ns aus Ref. [38], während der Singulett-Zustandsübergang 300 ns beträgt [41]) als die metastabile Zustandslebensdauer in Bulk-Diamant (gemessen 150 s) [24] und viel länger als die Lebensdauer des angeregten Zustands [37].

Ein einzelnes NV⁻-Zentrum wurde mittels Anti-Bunching (Abb. 2c) Messung ausgewählt, um die für den Depletionsstrahl erforderliche Leistung zu untersuchen, um Fluoreszenz in Donut-Form effektiv zu löschen [42]. Ein Strahl bei 594 nm Wellenlänge wurde hinzugefügt, um zu sondieren, ob das einzelne NV⁻-Zentrum in seinem An- oder Aus-Zustand war. Abbildung 2b zeigt die Fluoreszenzabhängigkeit des ausgewählten NV⁻-Zentrums von der Intensität des Depletionsstrahls. Ein schneller Abfall der Fluoreszenz wurde beobachtet. Bei Depletionsleistung von 151,2 µW wurde das NV⁻-Zentrum effektiv ausgeschaltet.

Hier demonstrieren wir zum ersten Mal, soweit uns bekannt, GSD-Nanomikroskopie angewendet auf NDs für Super-Resolution-Bildgebung einzelner NV⁻-Zentren.

Um Super-Resolution via GSD zu erreichen, werden alle Emitter, die von einem fokussierten Anregungsstrahl abgedeckt werden, transient ausgeschaltet, außer in einem sub-diffraktionsgroßen Bereich, aufgrund der Überlagerung des Donut-förmigen Depletionsstrahls, der das Zentrum in seinen langlebigen dunklen Zustand überführt. Die erzielte Auflösung kann durch das Profil in der Fokalebene quantifiziert werden, wo die Zentren "an" sind, und sie skaliert gemäß Gleichung (1), wobei I_s umgekehrt proportional zur Lebensdauer der beteiligten Zustände und zum Inhibitions-Querschnitt des optischen Ausschalt-Übergangs skaliert [43, 44].

Abbildung 3a zeigt ein super-aufgelöstes Fluoreszenzbild eines einzelnen NV⁻-Zentrums in einem ND (Abb. 2c). Die volle Breite bei halber Maximum (FWHM) beträgt 57 nm in x-Richtung und 42 nm in y-Richtung (Abb. 3c).

Die Beziehung zwischen Depletionsleistung und Auflösung ist in Abb. 3b gezeigt. Die theoretische Kurve basiert auf Gleichung (1). Die zusätzliche Leistung, die erforderlich ist, um die NV⁻-Zentrum-Fluoreszenz für die experimentellen Daten zu unterdrücken, wurde der lokalen Umgebung im ND-Wirt und einer kürzeren metastabilen Zustandslebensdauer [38] im Vergleich zu Bulk zugeschrieben. Es sei angemerkt, dass die maximale Auflösung von 42 nm bei 2,2 mW erreicht wird, während in Ref. [24] 12-nm-Auflösung mit 16 mW erreicht wurde, entsprechend einer Spitzenintensität von 12 MW/cm² für den Depletionsstrahl.

Weiterhin wandten wir GSD-Nanomikroskopie an, um nanoskalige Bildgebung von zwei eng beieinander liegenden NV⁻-Zentren zu demonstrieren. Abbildung 4a zeigt ein Konfokalbild von NV⁻-Zentren. Unter GSD-Nanomikroskopie werden zwei einzelne NV⁻-Zentren mit nanoskaliger Auflösung abgebildet (Abb. 4b). Der Zentrum-zu-Zentrum-Abstand zwischen den beiden NV⁻-Zentren beträgt 72 nm (Abb. 4c). Die FWHM für die zwei aufgelösten NV⁻-Zentren in y-Richtung beträgt 36 nm (Abb. 4d) und 38 nm (Abb. 4e). Wir führen die Fehlausrichtung zwischen der Hauptachse des NDs und den aufgelösten NV⁻-Zentren auf mechanischen Drift während des Konfokalbild-Scannens zurück.

Schlussfolgerungen

In dieser Arbeit haben wir GSD-Nanomikroskopie mittels des metastabilen Zustands von NV⁻-Zentren in Nanodiamanten implementiert, was super-aufgelöste Bildgebung von NV⁻-Zentren zeigt. Ein einzelnes NV⁻-Zentrum mit FWHM von 36 nm wird aufgelöst. Die Skalierung der Auflösung bezüglich der Intensität des Depletionsstrahls wird ebenfalls gezeigt, und die maximale Super-Resolution wird mit 2,2 mW Depletionsleistung erreicht. Weiterhin wurden zwei NV⁻-Zentren, getrennt um 72 nm, aufgelöst. Dieses Ergebnis eröffnet die Möglichkeit, dipolare Kopplung zwischen eng beieinander liegenden NV⁻-Zentren [45] zu untersuchen, die Fähigkeit für hochräumliche Quanten-Sensing basierend auf NV⁻-Spin-Eigenschaften [6, 18, 46–48] sowie andere multifunktionale Sensing-Anwendungen basierend auf Bulk-Diamant [49], erweitert auf NDs [50].

In diesem Papier haben wir auch gezeigt, dass die Stickstoffkonzentration in Diamant die Basis von GSD- und CSD-Mechanismen für Super-Resolution ist, die in hoch- und niedrig-stickstoff-dotiertem Diamant erreicht werden. Entsprechend sollten engineered NDs für die spezifische Methode folgen. Es wird verstanden, dass CSD leichter auf Spin-Sensing angewendet werden kann aufgrund niedriger Stickstoffkonzentration; jedoch würde der NV⁰-Ladungszustand die Quanten-Sensing-Eigenschaften von CSD limitieren, während die Stabilisierung des NV⁻-Ladungszustands mittels anderer Donatoren als Stickstoff eine viel höhere Sensitivität von GSD angewendet auf Spin-Quanten-Sensing bringen könnte.

GSD-Nanomikroskopie von NV⁻-Zentren in NDs nutzt niedrige Leistung (~ 300 µW) für die optischen Intensitäten im Vergleich zu Bulk-Diamant und ist besser für biologische Proben geeignet. Die GSD-Auflösung kann durch Bestimmung der optimalen Stickstoffdotierung [34], durch Untersuchung des Effekts von Oberflächenpassivierung und anderen Verunreinigungen auf die metastabile Zustandslebensdauer von NV⁻ in NDs und durch Engineering von NDs mit weniger photolumineszierenden Verunreinigungen verbessert werden.

In Bezug auf Spin-Sensing limitiert die hohe Stickstoffkonzentration in derzeit kommerziellen NDs, abgeleitet von HPHT und hoch-stickstoffhaltigen Mikrodiamanten, die Spin-Sensitivität gemäß reduziertem Optically Detected Magnetic Resonance Kontrast [34]. Als solche sollten andere Dotierstoffe für die Stabilisierung des NV⁻-Ladungszustands ohne Einführung von Dekohärenz in Betracht gezogen werden [50, 51].

Schließlich könnte die Kombination dieser Methode mit Mikrowellenanregung [18, 52–54] einen alternativen Ansatz für super-aufgelöste optische magnetische Bildgebung in Life Science bieten, wenn die aktuellen NDs-Materialeigenschaften besser für diese Anwendung engineered werden könnten.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf angemessene Anfrage beim korrespondierenden Autor verfügbar.

Abkürzungen

NDs:

Nanodiamanten

NV:

Stickstoff-Fehlstelle

STED:

Stimulated Emission Depletion

GSD:

Ground-State Depletion

CSD:

Charge-State Depletion

FWHM:

Full Width at Half Maximum (Volle Breite bei halber Maximum)

HPHT:

High Pressure High Temperature (Hochdruck-Hochtemperatur)

AOM:

Akusto-Optischer Modulator