Wasserstoffperoxid-Erfassung basierend auf der Modifikation der inneren Oberflächen von Festkörper-Nanoporen

Hintergrund

Die Nanoporen-Detektionstechnologie stammt aus dem Coulter-Zähler [1] und dem Zell-Ionenkanal [2]. Nanopore erkennt geladene Moleküle, die in einer durch ihn hindurchtretenden Lösung vorhanden sind. Das Auftreten der Moleküle in Nanoporen kann die Leitfähigkeit der Pore anscheinend ändern, folglich eine Änderung des Stromsignals. Die Änderung des Stroms liefert Informationen über die Größe und Konzentration der Moleküle in der Pore, um den dynamischen Prozess des Translokationsverhaltens der Moleküle aufzudecken [3]. Einige nanoskalige Objekte können mithilfe einer Nanopore nachgewiesen werden, z. B. Nanopartikel [4,5,6], Viren [7,8,9], Proteinmoleküle [10,11,12,13] und DNA-Sequenzen [14,15,16 ,17]. Es gibt zwei Arten von Nanoporen. Biologie-Nanopore und die Festkörper-Nanopore. Die Biologie-Nanopore hat ein niedrigeres Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und eine höhere Auflösung. Kleine und ungefaltete Proteine ​​können mithilfe von biologischen Nanoporen nachgewiesen werden [18,19,20,21,22,23]. Festkörper-Nanopore ist größenverstellbar und weist eine höhere Stabilität auf. Die Festkörper-Nanopore wird normalerweise auf einen Film gebohrt, dieser Film teilt die Fluidikzelle in zwei Teile [24]. Eine Vorspannung wird an eine dünne Membran angelegt, die eine Nanopore enthält, was zu einem Ionenstrom von einer Zelle zur anderen führt [25]. Proteinmoleküle einschließlich gefalteter und ungefalteter Strukturen werden durch Festkörper-Nanoporen nachgewiesen und analysiert [26,27,28,29]. Die Interaktion von Proteinen kann auch mit Festkörper-Nanoporen nachgewiesen werden [30, 31]. Darüber hinaus hat es die Fähigkeit, Proteinkinetiken zu erkennen [32, 33]. Um die Grenzen des Nachweisbereichs aufzulösen, wurden chemisch modifizierte Festkörper-Nanoporen in großem Umfang verwendet [34,35,36,37,38,39], chemisch modifizierte Festkörper-Nanoporen wurden verwendet, um einzelsträngige DNA nachzuweisen [40] und Proteine ​​[41].

Viele quantitative Methoden wurden bereits zum Nachweis von H₂ . eingesetzt O₂ , die meisten basieren auf Spektrometrie [42,43,44,45], Chemolumineszenz [46,47,48,49], Amperometrie [50,51,52,53] und Elektrochemie [54,55,56,57] . Die herkömmlichen spektrometrischen und Chemolumineszenzverfahren sind im Allgemeinen zeitaufwendig und teuer. Der Festkörper-Nanoporensensor hat einen geringen Verbrauch und eine einfache Struktur und kann zum Nachweis kleiner Moleküle verwendet werden.

Hier präsentieren wir eine Art Festkörper-Nanopore, die mit Meerrettichperoxidase (HRP) modifiziert wurde. Die HRPs wurden auf der inneren Oberfläche der Festkörper-Nanoporen immobilisiert, die immobilisierten HRPs blieben in der Redoxreaktion aktiv, die in Gegenwart von H₂ . innerhalb eines einzelnen Nanoporenkanals ablief O₂ [58]. Die ABTS ^•+ in der Redoxreaktion erzeugte aggregieren würde, dann das aggregierte ABTS ^•+ durch Nanopore geleitet. Die Translokationsereignisse können erkannt werden. Für den Wasserstoffperoxidnachweis ist die Struktur des Festkörpers einfach und er kann das aggregierte ABTS erkennen ^•+ durch einen geringen Reagenzienverbrauch. Diese Meerrettichperoxidase (HRP) Enzymmodifikation Festkörper-Nanopore kann das Wasserstoffperoxid (H₂ O₂ ) indirekte Wahrnehmung durch das aggregierte ABTS ^•+ Erkennung. Es hat instruktive Bedeutung für die Detektion einzelner Moleküle und den Zusammenbau der inneren Festkörper-Nanopore.

Methoden

Chemikalien und Materialien

Das Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Molekül (1 mg ml ^-1 , Enzyme Commission No.1.11.1.7, 44 kDa) wurde von Xiya Reagent (Chengdu, China) bezogen. Die Probe (HRP) wurde in 0,02 µm gefiltertem 0,1 M PBS gelöst, bei 4 °C gelagert und innerhalb von zwei Tagen nach der Herstellung verwendet. Kaliumchlorid (KCl), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) ((ABTS ), 98 %) wurden von DiBo Chemical Technology Co., LTD (Shanghai, China) bezogen. Wasserstoffperoxid (H₂ .) O₂ , 30%) wurde von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. gekauft. (3-Aminopropyl)triethoxysilan (3-APTES) wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Die Experimente wurden mit unreinem Wasser aus einem Milli-Q-Wasserreinigungssystem (Widerstand 18,2 MΩ/cm, 25 °C, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) durchgeführt und in einem FEI Strata 201 FIB-System (FEI Co., Hillsboro, OR, USA), einen Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS) und einen Axopatch 700B (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA). Die Bilder unserer gebrauchten Instrumente wurden dem Ergänzungsmaterial hinzugefügt (siehe Zusatzdatei 1:Abbildung S1).

Festkörper-Nanoporenherstellung und elektrische Messungen

Zuerst eine dünne Membran aus Si₃ N₄ (100 nm Dicke) wurde auf einem Si-Substrat mit einer Dicke von 300 µm abgeschieden. Anschließend Fotolithografie (die offene Fenstergröße beträgt 500 × 500 μm ² ). Dann wurde die Oberfläche der Membran mit Ga&spplus;+&spplus;-Ionen unter Verwendung eines FEI Strata 201 FIB-Systems (FEI Co., Hillsboro, OR, USA) bei einem Beschleunigungspotential von 30 kV beschossen, während der Strom mit 1 pA gemessen wurde. Die Mahlzeit betrug 1,5 s im Spot-Modus. Schließlich wurden die Festkörper-Nanoporen-Chips erhalten und in frisch zubereiteter Piranha-Lösung bei 80 °C für 30 Minuten gereinigt, gefolgt von Spülen mit Reinstwasser. Nach der Reinigung wurde der Chip in einer speziell angefertigten Teflonzelle mit zwei Viton-O-Ringen montiert, um die beiden Seiten des Chips zu trennen und zwei Reservoirs zu bilden, um den einzigen Weg für Ionenstrom durch die Nanopore sicherzustellen. Die Bilder unserer gebrauchten Geräte wurden dem Ergänzungsmaterial beigefügt (siehe Zusatzdatei 1:Abbildung S2). Elektroden (Ag/AgCl) wurden an die Fluidzelle und einen Patch-Clamp-Verstärker (Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA) angeschlossen, der den Ionenstrom unter konstanten Spannungen mit einer Abtastrate von 100 kHz für Signale messbar machte . Der verstärkerinterne achtpolige Bessel-Tiefpassfilter wurde auf 10 kHz eingestellt [3]. Das gesamte Instrument wurde in einem doppelten Faradayschen Käfiggehäuse untergebracht.

Ergebnisse und Diskussion

Immobilisierung von Nanoporen mit HRPs

Die ausgewählte Nanopore mit einem Durchmesser von ~50 nm wurde für 30 min in eine Piranha-Lösung bei 80 °C getaucht. Nach der Behandlung mit Piranha-Lösung konnte die innere Oberfläche der Nanopore Silizium-Hydroxylgruppen aufnehmen. Anschließend wurde der gesamte Dünnfilm mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (3-APTES) aktiviert. Als Ergebnis der Behandlung mit 3-APTES wird das Amino (-NH₂ ) wurden auf der Filmoberfläche erzeugt.

Nach Aktivierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (3-APTES) wurde der Nanoporen-Chip in eine 0,1 M PBS-Lösung von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC) (10 mM) und N-Hydroxysuccinimid ( NHS) (20 mM). Danach wurde der Nanoporenchip in Meerrettichperoxidase (HRP) (10 ng/ml) eingebracht. Nach früheren Forschungsergebnissen unserer Gruppe [3] aggregierte HRP bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen von 0,1 bis 2 M KCl, pH 7,0, nicht. Aufgrund des pI Wert der Meerrettich-Peroxidase von 4,3 ± ± 0,2, haben wir auch bewiesen, dass das HRP in 0,1 M KCl pH 6,0 und pH 7,0 nicht aggregiert. Das EDC-Reagens aktivierte die Carboxylgruppen (-COOH) von HRP zu einem hochreaktiven o-Acylisoharnstoff-Zwischenprodukt. Darüber hinaus wurde das Zwischenprodukt in Gegenwart von NHS weiter in einen stabileren Succinimidylamin-reaktiven Ester umgewandelt [58]. Daraus resultiert eine kovalente Kupplung des Zwischenprodukts mit dem (-NH₂ ) auf den inneren Oberflächen der Nanoporen erzeugt, um stabile Amidbindungen zu bilden (Abb. 1).

Durchführen eines Modifikationsprozesses in einem einzelnen Festkörper-Nanoporenkanal. a Schematische Darstellung der kovalenten Bindung von Meerrettichperoxidase (HRP) an einen einzelnen Nanoporenkanal über Carbodiimid-Kupplungschemie. Die Carboxylgruppen (-COOH) von HRP wurden durch EDC-Lösung aktiviert, wodurch das HRP mit (-NH₂ . reagieren kann ) auf der Oberfläche eines Nanoporen-Chips erzeugt. b Schema des immobilisierten HRPs-Wasserstoffperoxid-Sensors, die Innenfläche des Sensors wurde mit HRPs modifiziert. Wenn H₂ O₂ und ABTS aufgetreten ist, die ABTS ^•+ produziert. Die Kristallstruktur von HRP wurde mit Genehmigung des Autors verwendet [3]

Diese Prozesse führen uns zur Immobilisierung von HRPs auf der inneren Oberfläche einer einzelnen Nanopore. Die Realisierung des Funktionalisierungsprozesses wurde durch Messung der Strom-Spannung (I-V ) einer einzelnen Nanopore vor und nach der Modifikation (Abb. 2).

Durchführen einer typischen Strom-Spannung (I-V ) Kurven der unmodifizierten (Original) und modifizierten Nanopore in 0,1 M KCl, gepuffert bei pH 7,0 mit 0,1 M PBS. Die schwarze Linie ist das I-V Kurven der unmodifizierten Nanoporen und rote Linie ist das I-V Kurven modifizierter Nanoporen mit HRPs. Die Einsätze sind die Rasterelektronenmikroskopie (REM) einer einzelnen Nanopore (Durchmesser ~50 nm cis) und der Nanoporensensor. 100 nm ist Maßstab

Charakterisierung von HRPs modifizierten Festkörper-Nanoporen

Hier die Form eines einzelnen Si₃ N₄ Der Nanoporenkanal ist zylindrisch. Abbildung 2 zeigt die typische Strom-Spannung (I-V ) Kurven der unmodifizierten (Original) und modifizierten Nanopore in 0,1 M KCl, gepuffert bei pH 7,0 mit 0,1 M PBS. Nachdem die innere Oberfläche der Nanopore mit HRP-Enzymen modifiziert wurde, wurde die Porengröße kleiner.

Nach Wanunu et al. kann der Durchmesser der Festkörper-Nanopore unter Berücksichtigung der externen Leitfähigkeit der Nanopore durch die folgende Gleichung berechnet werden:

Wo, d und l sind der Durchmesser und die Länge der Pore,G ist offenporige Leitfähigkeit von Nanoporen, σ ist die Leitfähigkeit der Ionenlösung.

Unter Berücksichtigung geometrischer Effekte kann nach der Modifikation von Festkörper-Nanoporen mit HRP-Enzymen die effektive Größe berechnet werden. Der Durchmesser einer einzelnen Nanopore kann anhand der Gleichung (1) berechnet werden. Wobei der Leitwert (G _unverändert ) beträgt ~15 nS kann von I-V . erhalten werden Kurven der unmodifizierten Festkörper-Nanopore. Die Leitfähigkeit (σ ) der Ionenlösung 0,1 M KCl (25 °C), gepuffert bei pH 7,0 mit 0,1 M PBS, beträgt ~1,28 S/m. Daher beträgt der Durchmesser der unmodifizierten Nanopore ~51 nm, er ist dem gemessenen Durchmesser ähnlich. Mit der gleichen Methode wird der Wert des Leitwerts (G _geändert ) beträgt ~7.5 nS, und der Durchmesser (~34 nm) der modifizierten Nanopore kann berechnet werden. Eine Verringerung des Durchmessers ist aus den folgenden zwei Gründen möglich. Erstens wird die innere Oberfläche der Nanopore mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (3-APTES) behandelt, wodurch die Oberfläche der Nanopore (-NH₂ ) Aminogruppen. Der zweite Grund ist, dass der hydrodynamische Durchmesser (D _h ) des HRP-Enzyms ~8 nm beträgt [3], könnten die immobilisierten HRPs den Porendurchmesser verringern. Hier wird die HRPs-modifizierte Festkörper-Nanopore mit einem Durchmesser von ~34 nm als Wasserstoffperoxid-Detektionskanal verwendet.

Das Prinzip der Redoxreaktion

Die Redoxreaktion wurde innerhalb einer einzigen modifizierten Nanopore durchgeführt, und der nachfolgend vorgestellte Reaktionsprozess stimmt gut mit der vorgeschlagenen Redoxreaktion überein [58]. In Gegenwart von H₂ O₂ (0,5 mM) wurden HRP-Enzyme, die auf der inneren Oberfläche der Nanopore immobilisiert waren, sofort in Verbindung 1 umgewandelt. Dann nahm die Verbindung 1 ein Elektron vom reduzierenden Substratmolekül ABTS (1,5 mM) auf, um Verbindung 2 zu erzeugen. Anschließend wurde Verbindung 2 über einen Elektronentransfer von einem anderen Substratmolekül ABTS zurück zum ruhenden Enzym reduziert.

Die kationischen Produkte (ABTS ^•+ ) der Redoxreaktionen wurden in einer einzelnen Nanopore akkumuliert. Die Translokation von angesammelten Molekülen aus dem Nanoporenkanal würde die Leitfähigkeit ändern (G ) und damit die Stromänderung (ΔI _b ) gefunden werden.

Erkennung von Translokationsereignissen

Experimente wurden unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (HRP) modifizierten Nanoporen mit modifizierten Porendurchmessern (~34 nm) in 0,1 M KCl, gepuffert bei pH 7,0 mit 0,1 M PBS, durchgeführt. 2, 2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonat (ABTS) (1,5 mM) und Wasserstoffperoxid (H₂ .) O₂ ) (0.5 mM) wurden in das trans-Kompartiment der Nanopore gegeben. Nach dem Hinzufügen von ABTS und H₂ O₂ wurden die Experimente mit Vorspannungen von –100 bis –800 mV durchgeführt und sie wurden bei 100 kHz abgetastet. Es gab kein Translokationsereignis, bis die Spannung auf –400 mV anstieg. Abbildung 3 zeigt repräsentative Ionenstromspuren des Translokationsereignisses bei verschiedenen Spannungen von -400 bis -800 mV in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Die experimentellen Daten zu lang anhaltenden Translokationsereignissen unterschiedlicher Spannungen wurden dem ergänzenden Material hinzugefügt (siehe Zusatzdatei 1:Abbildung S3).

a –e Schematische Darstellung der Translokationsereignisse bei unterschiedlichen Spannungen von -400 bis -800 mV. Die Häufigkeit von Translokationsereignissen nahm zu, wenn die angelegte Spannung von –400 mV auf –800 mV anstieg. f Die Stromamplitude steigt linear mit der Spannung. h Eine exponentiell abfallende Funktion (t _d ~ e ^−v/v0 ) wurde verwendet, um die Verweilzeit in Abhängigkeit von den angelegten Spannungen anzupassen

Die Millisekunden-Stromblockadeereignisse wurden beobachtet, durchgeführt in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Durch Zugabe des Reagenzes H₂ O₂ und ABTS in das Transkompartiment, HRP-Enzyme immobilisiert auf der inneren Oberfläche eines einzelnen Nanoporenkanals, und es trat eine Redoxreaktion auf. Fülle von ABTS ^•+ Moleküle hergestellt wurden, ein einzelnes kleineres Molekül ABTS ^•+ können mit unserer Festkörper-Nanopore aufgrund der Auflösung des Systems nicht nachgewiesen werden [3]. Diese Moleküle würden jedoch nach ihrer Herstellung aggregieren. Daher ist es möglich, das ABTS ^•+ . zu erkennen Moleküle. Hier wurden die negativen Spannungen gehalten und ABTS ^•+ . aggregiert Moleküle passierten die Nanoporen. Es gab einen elektrophoretischen und elektroosmotischen Fluss, wenn eine negative Spannung angelegt wurde. HRP war in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0 [3] negativ geladen, als Ergebnis würde eine doppelte elektrische Schicht erzeugt und die Elektroosmose würde in Richtung der negativen Elektrode verlaufen. Aus diesem Grund gingen Elektrophorese und Elektroosmose in die gleiche Richtung. Die aggregierten ABTS ^•+ in dem einzelnen Nanoporenkanal würde durch die Festkörper-Nanopore transportieren und in Richtung der negativen Elektrode fließen.

Statistische Analyse von Translokationsereignissen

Da die Vorspannung eine Schlüsselrolle bei der Translokation von aggregiertem ABTS spielte ^•+ , der Einfluss aktueller Blockaden von aggregierten ABTS ^•+ der Durchgang durch die HRPs-modifizierten Nanopore im Vergleich zu den angelegten Spannungen wurde diskutiert. Die Auftrittshäufigkeit von Translokationsereignissen wurde mit steigender Spannung stark verbessert (Abb. 3f). Mit steigender Spannung steigt auch die Amplitude des Stroms. Die Translokationsereignisse verschwanden jedoch allmählich, wenn die Vorspannung unter -300 mV gehalten wurde, was darauf hindeutet, dass aggregiertes ABTS ^•+ über HRPs modifizierte Nanoporen benötigten eine Schwellenspannung von −300 mV. Abbildung 4 zeigt Histogramme der mittleren Stromamplitude von Translokationsereignissen, gemessen für aggregierte ABTS ^•+ bei unterschiedlichen Spannungen. Anhand der Anpasskurven werden die Spitzenwerte der aktuellen Blockade (ΔI _b ) 308,4 ± 27,795 pA, 419,1 ± 20,354 pA, 478,8 ± 32,857 pA, 528,1 ± 36,98 pA, 606,9 ± 40,916 pA bei –400, –500, –600, –700 bzw. –800 mV betragen, ist es wahrscheinlich, dass die Reduzierung des Stroms wird durch aggregierte ABTS induziert ^•+ Molekül, das die Nanopore mit unterschiedlichen Spannungen passiert. Die Werte der Stromamplitude wurden mit einer Polynomfunktion erster Ordnung angepasst, die eine Steigung von -0,706 und einen Achsenabschnitt von 49,262 erzeugt. Basierend auf den Anpassungskurven betragen die Werte der Verweilzeit jedoch 54,5 ± 21,374 ms, 42,8 ± 20,181 ms, 10,3 ± 3,05 ms, 6,0 ± 1,744 ms, 4,0 ± 1,441 ms bei –400, –500, –600, – 700 und –800 mV. Abbildung 3h zeigt eine exponentiell abfallende Funktion (t _d ~ e ^−v/v0 ) wurde verwendet, um die Verweilzeit in Abhängigkeit von den angelegten Spannungen anzupassen. Die Histogramme der Verweildauer von Translokationsereignissen wurden dem Ergänzungsmaterial hinzugefügt (siehe Zusatzdatei 1:Abbildung S4).

Die Histogramme der mittleren Stromamplitude von Translokationsereignissen gemessen für aggregierte ABTS ^•+ bei unterschiedlichen Spannungen (–400, –500, –600, –700, –800 mV) in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Alle Histogramme wurden mit der Gaußschen Verteilung angepasst

Die aktuelle Blockade im Vergleich zur Verweildauer der Ereignisse für jede aggregierte ABTS ^•+ bei unterschiedlichen Spannungen wurden in zweidimensionale Streudiagramme eingepasst (Abb. 5). Alle aggregierten ABTS ^•+ zeigen einen Cluster von Ereignissen von -400 bis -800 mV, die Hauptereigniscluster sind auf aggregierte ABTS zurückzuführen ^•+ Durchqueren der HRPs-modifizierten Festkörper-Nanopore.

Zweidimensionale Streudiagramme der aktuellen Blockade im Vergleich zur Verweildauer der Ereignisse für jedes aggregierte ABTS ^•+ bei unterschiedlichen Spannungen. Die entsprechenden Histogramme sind rechts und oben platziert. Alle Histogramme wurden mit der Gaußschen Verteilung angepasst

Darüber hinaus wurde das einzelne Translokationsereignis bei jeder Spannung analysiert und die Stromblockade wurde durch dieselbe Größe und geladene Substanz induziert. Es wird also angenommen, dass jedes Translokationsereignis durch das einzelne aggregierte ABTS ^•+ . induziert wurde . Um die Translokationszeit von aggregiertem ABTS zu analysieren ^•+ bei unseren Versuchen. Die aktuelle Blockadedauer t _d wird als die Verweilzeit eines einzelnen aggregierten ABTS angesehen ^•+ von der Stelle, an der es produziert wurde, bis zum Ausgang der Nanopore. Hier wurde eine weitere Bedingung in Betracht gezogen, dass einige HRP-Enzyme am Eingang der Nanopore immobilisiert sein könnten und die Redoxreaktion katalysieren könnten. Daher wurden weitere Experimente durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Redoxreaktion an der inneren Oberfläche einer einzelnen Nanopore statt am Eingang stattfand. Für die Verifizierung wurden unmodifizierte HRPs verwendet und analysiert. Diese Nanoporen wurden mit 3-APTES aktiviert. Und die gleiche Konzentration HRPs (10 ng/ml), ABTS (1,5 mM) und H₂ O₂ (0,5 mM) wurden in das trans-Kompartiment der Nanopore gegeben, die negative Vorspannung wurde in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0 angelegt, aufgrund der Elektrophoresekraft konnten HRPs die Nanopore nicht passieren. Aufgrund der Redoxreaktion wird das aggregierte ABTS ^•+ produziert, aber es wurden keine Translokationsereignisse gefunden. Es ist möglich, dass die aggregierten ABTS ^•+ verursachen elektrostatischen Effekt mit HRPs und verhindern das aggregierte ABTS ^•+ Passieren durch die Nanopore.

Abbildung 6 zeigt die zweidimensionalen Streudiagramme der Leitfähigkeitsänderung (ΔG ) im Vergleich zur Ereignisverweildauer für jedes aggregierte ABTS ^•+ bei unterschiedlichen Spannungen. Es kann festgestellt werden, dass die Änderung des Leitwerts (ΔG ) hauptsächlich konzentriert in 0,8 nS. Die Form von Translokationsereignissen ist fast gleich. Der Mittelwert von ΔG beträgt ~0,8 nS bei verschiedenen Spannungen. Es kann spekuliert werden, dass der Volumenausschluss jedes aggregierten ABTS ^•+ Molekül ist fast gleich. Es ist möglich, dass elektrostatische und sterische Effekte von aggregiertem ABTS ^•+ Moleküle können den Ionenstrom verändern. Nach der Analyse zwei typische Formen von Stromspuren mit dem positiv geladenen aggregierten ABTS ^•+ Translokation beobachtet (Abb. 7). Die Translokationsereignisse bei -700 mV als Vertreter. Der Prozentsatz von Ereignissen vom Typ zwei wurde analysiert, und es ist zu beobachten, dass der Prozentsatz von Ereignissen vom Typ 1 mit der Zunahme der Spannung zunahm, andererseits der Prozentsatz von Ereignissen vom Typ 2 abnahm. Es wurde angenommen, dass eine höhere Spannung die Translokation schneller macht als eine niedrigere Spannung.

Schematische Darstellung zweidimensionaler Streudiagramme von ΔG im Vergleich zur Verweildauer von Ereignissen für jedes aggregierte ABTS ^•+ bei unterschiedlichen Spannungen. Die entsprechenden Fitkurven wurden oben positioniert. Die Einfügung sind die Translokationsereignisse verschiedener Spannungen (von –400 bis –800 mV)

a Schema von zwei Arten von Translokationsereignissen bei -700 mV Spannung. b Der Prozentsatz von zwei Arten von Ereignissen bei unterschiedlichen Spannungen (–400, –500, –600, –700, –800 mV)

Die aktuellen Blockadesignale zeigten die Größe, Konformation und Interaktion von aggregiertem ABTS ^•+ Durchlaufen des einzelnen Nanoporenkanals. Über die Veränderung der jetzigen Form wurde über den Verlauf der Veränderungen spekuliert. Für das Ereignis 1 haben Stromsignale einen typischen Schwankungsanteil mit einer tiefen Intensität und einer kurzen Verweilzeit. Es ist möglich, dass die aggregierten ABTS ^•+ durch die Nanopore von dem Ort, an dem es hergestellt wird, passiert. Wenn die aggregierten ABTS ^•+ die Nanopore passiert hat, wird der Ionenstrom der Nanopore auf das ursprüngliche Niveau (Basislinie) wiederhergestellt (I ₀ ). Für das Ereignis 2 haben die Stromsignale einen Fluktuationsteil mit einer tiefen Intensität und dann eine horizontale Stufe. Diese Signalform kann der elektrostatischen Wechselwirkung von aggregiertem ABTS zugeschrieben werden ^•+ mit den HRPs am Ausgang der Nanopore, und der Strom wurde langsam zur Grundlinie zurückgewonnen. Um die Stromänderung besser zu verstehen, müssen wir mit der Änderung der Leitfähigkeit der offenen Poren (G _Poren ) bei Salzkonzentration (0,1 M KCl). Wie in den vorherigen Studien diskutiert wurde, eine Gleichung der offenen Porenleitfähigkeit einer negativ geladenen Nanopore mit einem Durchmesser von d und eine Länge von l bei niedriger Salzkonzentration kann beschrieben werden als

wobei μ _K und μ _Kl sind die elektrophoretischen Motilitäten von K ⁺ und Cl ⁻ , n _KCl ist die Zahlendichte von K ⁺ und Cl ⁻ , die Elementarladung ist e, σ _p ist die Oberflächenladungsdichte der Nanoporenoberflächen. In diesem Experiment wurde die Festkörper-Nanopore chemisch modifiziert und der Durchmesser der Nanopore wurde verändert. Die Oberflächenladungsdichte der Nanoporenoberfläche (σ _p ) kann nicht genau ermittelt werden. Daher ist die Leitfähigkeit der offenen Poren (G _Poren ) wurde basierend auf Gleichung (1) berechnet. Aufgrund von Gleichung (1) ist die Leitfähigkeit der offenen Poren (G _Poren ) beträgt ~7,5 nS. Es wird spekuliert, dass die Änderung des Leitwerts auf zwei Gründe zurückgeführt werden kann [15]. Der erste Grund ist, dass der Volumenausschluss von Ionen in Nanoporen durch das aggregierte ABTS ^•+ . besetzt wurde Moleküle. Als Ergebnis wurde die Leitfähigkeit der Festkörper-Nanoporen verringert (ΔG ^- ). Der zweite Grund ist, dass einige Ionen durch das aggregierte ABTS ^•+ . aus der Nanopore gebracht wurden Moleküle, die die Leitfähigkeit von Festkörper-Nanoporen erhöhen. In diesen Experimenten war der ABTS ^•+ innerhalb der Nanopore produziert, und es wurden keine Ionen mitgebracht. Daher ist die Änderung der Leitfähigkeit von Festkörper-Nanoporen (ΔG ) wurde nur durch den Volumenausschluss induziert. Die Gesamtänderung des Leitwerts kann also beschrieben werden als

Die Abnahme der Leitfähigkeit von Festkörper-Nanoporen wird durch den Volumenausschluss induziert und kann mit der folgenden Gleichung berechnet werden

wo γ ist der Partikelformfaktor, der das Oberflächenverhältnis des gleichen kugelförmigen Volumens und des Partikels ist. In dieser Arbeit werden die aggregierten ABTS ^•+ Molekül wurde zu einem globalen Objekt vereinfacht, daher der Wert von γ ist 1 und Λ ist der Volumenausschluss. Die Leitfähigkeit der Bulklösung σ ist 1,28 S/m, 0,1 M KCl (25 °C).

Für den Volumenausschluss (Λ ) können wir aus den Translokationsereignissen einiger anderer Moleküle ableiten. Zum Anschluss der Leitwertänderung (ΔG ) auf die physikalische Eigenschaft von Molekülen kann das Ohmsche Gesetz auf die Volumenänderung von Elektrolytlösungen basierend auf der Festkörper-Nanopore angewendet werden [59]. Bei einem Translokationsereignis eines Moleküls in einer zylindrischen Festkörper-Nanopore nahm der Strom augenblicklich ab. Wenn der Widerstand der Festkörper-Nanopore der gesamte Stromkreiswiderstand ist, ändert sich die Leitfähigkeit (ΔG ) kann durch die folgende Gleichung beschrieben werden

In dieser Gleichung ist A _p H _eff = V _p ist das Volumen der Festkörper-Nanopore, f (d _m /D _p , lm/H _eff ) ist ein Korrekturfaktor (er ignoriert den Oberflächenladungseffekt), in unseren Experimenten haben wir das aggregierte ABTS vereinfacht ^•+ Molekül zu einem globalen Objekt; daher beträgt der Korrekturfaktor 1. Das d _m /D _p ist das Verhältnis von Moleküldurchmesser und Nanoporendurchmesser, Die lm/H _eff ist das Verhältnis der effektiven Moleküllänge und der effektiven Länge der Naopore. Der Ausdruck (5) kann vereinfacht werden als

Der mittlere Leitwert (G _Poren ) wurde auf Translokationsereignisse analysiert. Aus Gleichung (5) wird der Mittelwert des Volumenausschlusses (Λ ) bei unterschiedlichen Spannungen (-400, -500, -600, -700, -800 mV) erhältlich. Inzwischen ist die Größe der verwendeten Nanopore bekannt, das Volumen der Nanopore (V _p ) beträgt ~90746 nm ³ . Aufgrund von Gleichung (4) ist der Wert der Leitwertänderung (ΔG ^- ) kann als ~0,6 nS berechnet werden. Der Mittelwert der Leitfähigkeitsänderung, der aus den Translokationsereignisexperimenten bei verschiedenen Spannungen (-400, -500, -600, -700, -800 mV) erhalten wurde, beträgt ~0,784 nS. Es kann festgestellt werden, dass der berechnete Wert dem experimentellen Wert nahe kommt.

In einigen früheren Untersuchungen wurde erreicht, dass Wasserstoffperoxidmoleküle mit verschiedenen Technologien nachgewiesen werden. Der Nachweis von Wasserstoffperoxid durch Nanokanäle ist jedoch selten. Tanet al. [3] differenzierte unterschiedliche Ereignissignale, wenn HRPs in Nanoporen eingefädelt wurden, gab es ABTS und H₂ O₂ in KCl-Lösung. Die verschiedenen Signaltypen mit HRPs-Translokation wurden als ABTS ^•+ . angesehen durch Nanoporen gehen. Sechs typische Ereignisse der Translokation des Produkts von Enzymkatalyse-Substraten wurden analysiert. Sie spekulierten über den wahrscheinlichen Prozess jeder Art. Jedoch nicht genügend Beweise, um auszusagen. Mubarak Aliet al. haben es geschafft, die Redoxreaktionsprodukte in einzelnen konischen Nanokanälen zu detektieren [58]. They found that the cationic radical ABTS ^•+ reduced the ion current in the HRP-nanochannel in a voltage-dependent fashion, consistent with voltage-dependent concentrations of ions in conical nanochannels. The magnitude of the current blockage was correlated with the H₂ O₂ concentration in the solution.

Schlussfolgerungen

In conclusion, we fabricated a Si₃ N₄ nanopore employing a FIB successfully, a single naonopore system whose surface was modified with covalently linked HRP enzymes. The effect of the immobilized HRPs enzymes in a single solid-state nanopore as a hydrogen peroxide (H₂ O₂ ) sensor was affirmed by investigating products (ABTS ^•+ ) of the redox reactions occurring in presence of the substrates H₂ O₂ and ABTS. The aggregated cationic radical ABTS ^•+ produced inside the solid-state nanopore and reduced the ionic current in the HRPs modified solid-state nanopore, are consistent with voltage-dependence. The current blockade trends showed linear dependence for applied biased voltages. The relationship between the dwell time versus applied biased voltage was the exponentially decaying (t _d   ~ e ^−v/v0 ). Meanwhile, the aggregated ABTS ^•+ passed through the HRPs modified nanopores needed a −300 mV threshold voltage. The change of conductance (ΔG) has been calculated analytically and compared to the measured experimental values. The translocation events were produced by the certain size aggregated cationic radical ABTS ^•+ . We expect that using solid-state nanopores will allow lowering the detection limit and improve the system sensitivity. For our solid-state nanopore system, the structure is simple; it is not susceptible to fouling and can be used multiple times.

Abkürzungen

3-APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

ABTS:

3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid

EDC:

N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide

FIB:

Focused ion beam

HRP:

Horseradish peroxidase

KCl:

Potassium chloride

NHS:

N-hydroxysuccinimide

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

SNR:

Signal to noise ratio