Optimierung der DNA-Translokation in Festkörper-Nanoporen für höhere Sequenziergenauigkeit

Zusammenfassung

Im Vergleich zu biologischen Nanoporen müssen bei Festkörper-Nanoporen noch mehrere Herausforderungen bewältigt werden, bevor sie kommerziell für die DNA-Sequenzierung eingesetzt werden können. Die beiden größten Hürden sind eine geringe räumliche und zeitliche Auflösung. Aufgrund von Beschränkungen bei der Nanoporenlänge und den Oberflächeneigenschaften besteht bei der räumlichen Auflösung noch Verbesserungspotenzial. Gleichzeitig ist die DNA-Translokation unter elektrischem Feld zu schnell, sodass nur wenige gültige Datenpunkte erfasst werden. Die zeitliche Auflösung ließe sich deutlich verbessern, wenn die Translokationsgeschwindigkeit kontrolliert werden kann. In diesem Mini-Review fassen wir kurz Methoden zur Verbesserung der räumlichen Auflösung zusammen und konzentrieren uns auf steuerbare Ansätze zur Erhöhung der Detektionsauflösung. Zudem geben wir einen Ausblick auf die Entwicklung der Nanoporen-basierten DNA-Sequenzierung.

Einleitung

In den vergangenen Jahrzehnten wurden große Fortschritte bei der DNA-Sequenzierung erzielt, um die Basensequenzen im Genom auszulesen [1, 2]. Für die Entwicklung personalisierter Medikamente suchen Forscher nach schnelleren und günstigeren Sequenziermethoden, um zielgerichtete Therapien individuell anwenden zu können [3, 4]. Seit Nanoporen-Technologie für die DNA-Detektion genutzt wird [5], gilt sie als vielversprechender Ansatz für die Next-Generation-Sequenzierung [6, 7]. Nanoporen ermöglichen hochempfindliche Einzelmolekül-Detektoren für DNA [5] oder RNA [8]. Im Grundschema wird eine elektrochemische Kammer durch eine dünne Membran mit einer Nanopore in zwei Reservoire (cis- und trans-Seite) geteilt [9], die die leitende Lösung und das Analyt verbinden. Durch Anlegen einer Spannung fließen Elektrolyt-Ionen durch die Festkörper-Nanopore und erzeugen einen Porenstrom, der mit einem Patch-Clamp-Aufbau und ultraempfindlicher Elektronik gemessen wird. Wenn ein Molekül die Nanopore passiert, verdrängt es Ionen aus dem durch die Pore definierten Volumen, was als kurzzeitige Stromänderung detektiert wird. Aus der Verweilzeit (Dwell Time) und der Stromamplitude lassen sich Informationen über das Molekül gewinnen. Die räumliche Auflösung wird durch die Nanoporenabmessungen bestimmt, was sie als Einzelsensor für kleine Moleküle mit nachweisbarer Stromsignatur qualifiziert. Zudem lassen sich Nanoporensensoren leicht in tragbare Lab-on-a-Chip-Geräte integrieren und miniaturisieren [10].

Bei der DNA-Sequenzierung mit Nanoporen wurden bedeutende Fortschritte erzielt, sowohl bei Festkörper-Nanoporen [2, 11] als auch bei Protein-Nanoporen [2, 7]. Die Sequenzierung mit Protein-Nanoporen ist bereits gelungen [7], doch diese Systeme unterliegen Einschränkungen bei der Untersuchung biologischer Moleküle. Festkörper-Nanoporen bieten weniger Restriktionen: Sie funktionieren über breitere Temperatur-, Spannungs- und Lösungsmittelbereiche und lassen sich mit subnanometer Präzision im Durchmesser abstimmen. Damit sind sie vielversprechend für die Next-Generation-DNA-Sequenzierung.

Zahlreiche Festkörper-Nanoporen aus verschiedenen Materialien und Strukturen wurden für DNA-Sensoren entwickelt. Dennoch ist die DNA-Sequenzierung mit Festkörper-Nanoporen noch nicht erreicht. Zwei Haupthindernisse – räumliche und zeitliche Auflösung – müssen überwunden werden. Die räumliche Auflösung erfordert, dass die Nanopore den winzigen Abstand zwischen zwei Nachbarnukleotiden auflöst, um Einzelbasen-Auflösung zu erreichen. Das zeitliche Problem: DNA translokiert unter elektrischem Feld zu schnell (0,01–1 µs/Base [30]), sodass kommerzielle Patch-Clamps zu wenige Datenpunkte erfassen. Dieser Mini-Review gibt einen Überblick über Methoden zur Verbesserung beider Auflösungen, mit Fokus auf das Verlangsamen der DNA-Translokation.

Räumliche Auflösung

2001 berichteten Li et al. erstmals über Siliziumnitrid-Festkörper-Nanoporen [12]. Seither wurden diverse Materialien für die DNA-Detektion demonstriert: Siliziumoxid [13], Silizium [14], Al₂O₃ [15], HfO₂ [16]. Trotz chemischer und mechanischer Robustheit leiden Festkörper-Nanoporen unter geringer räumlicher Auflösung. Aufgrund der Materialdicke passieren Dutzende Basen gleichzeitig die Pore. Der derzeit dünnste Siliziumnitrid-Nanopore (3 nm) unterscheidet die vier Basen noch nicht [17].

Interessanterweise beträgt die Dicke einzelner Lagen zweidimensionaler (2D) Materialien ca. 3,0–11,0 Å, vergleichbar mit dem Abstand benachbarter Nukleotide in ssDNA (3,2–5,2 Å) [18]. 2D-Membranen wie Graphen (3,4 Å [19]), MoS₂ (6,5 Å [18]), WS₂ (7 Å [20]) und h-BN (11 Å [21]) ermöglichen dank hohem Signal-Rausch-Verhältnis und räumlicher Auflösung DNA-Translokationsnachweise [21–23]. Reproduzierbare Wachstums- und Transferverfahren erlauben die großflächige Fertigung subnanometer Poren in 2D-Membranen.

Graphen besteht aus einer atomaren Lage Kohlenstoffatome in einem zweidimensionalen Honigwabengitter [24]. Einzelne DNA-Moleküle lassen sich mit Graphen-Nanoporen detektieren und charakterisieren [22, 25]. Allerdings führen starke hydrophobe Wechselwirkungen zwischen DNA-Nukleotiden und Graphen zu Verstopfung und Anhaftung, was die Translokationsgeschwindigkeit stark beeinflusst [26]. Eine Modifikation mit hydrophilen Gruppen [26] oder Beschichtung mit hydrophilen Materialien [25] verbessert die Hydrophilie, erhöht aber die Schichtdicke und verringert damit die räumliche Auflösung.

Übergangsmetall-Dichalkogenide (TMDs) wie MoS₂ [18, 27] und WS₂ [20] sind weitere 2D-Materialien. MoS₂-Nanoporen zeigten ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR > 10) und eine fünffache Verstärkung des Ionenstromsignals [18]. MoS₂ ist hydrophil, sodass keine Oberflächenbehandlung nötig ist. WS₂ besitzt ein direktes Bandlücke von 2,1 eV [28] und stärkere Photolumineszenz als MoS₂ [29]. Danda et al. [20] fertigten WS₂-Nanoporen mit atomar kontrollierter Porengröße mittels kurzer Lichtpulse an, was positive Effekte für die DNA-Detektion haben könnte.

Liu et al. [21] berichteten erstmals über DNA-Translokation durch h-BN-Nanoporen. Wie Graphen weist h-BN schlechte Hydrophilie auf, was Porenblockaden verursacht. Zhou et al. [23] verbesserten die Hydrophilie durch UV-Ozon-Behandlung, wobei die antioxidativen Eigenschaften und Integrität von h-BN erhalten blieben. Die isolierende Natur von h-BN könnte in hochionischen Lösungen bemerkenswerte Haltbarkeit und Isoliereigenschaften bieten – ein wettbewerbsfähiger Kandidat für Einzelbasen-Auflösung an ultradünnen Nanoporen.

2D-Materialien können die räumliche Auflösung potenziell auf Einzelnukleotid-Niveau steigern. Obwohl DNA-Detektions-Experimente für mehrere 2D-Materialien vorliegen, wurde noch keine Festkörper-Nanoporen-DNA-Sequenzierung berichtet. Die zeitliche Auflösung bleibt eine Herausforderung.

Zeitliche Auflösung

Die DNA-Translokationsgeschwindigkeit durch Festkörper-Nanoporen ist extrem hoch (0,01–1 µs/Base [30]), sodass kommerzielle Patch-Clamps kaum effektive Daten erfassen. Eine Basenunterscheidung basierend auf Blockadestrom-Signalen ist damit unmöglich. Idealerweise sollte die Translokationsgeschwindigkeit 1–100 bp/ms betragen, um jedes Nukleotid signalseitig zuverlässig aufzuzeichnen [32]. Abbildung 1 zeigt die Translokationsgeschwindigkeiten für 2D-Festkörper-Nanoporen (Graphen, MoS₂, WS₂, h-BN). Die gestrichelte rote Linie markiert 100 bp/ms.

Das Verlangsamen der Translokation ist daher ein zentrales Forschungsziel. Verschiedene Methoden nutzen experimentelle Parameter: Temperatur [33], Elektrolytviskosität [27], Anlegespannung [34], Ionenkonzentration [35], Oberflächenladungsdichte [36]. Wanunu et al. [33] verlangsamten dsDNA-Translokation durch Temperatur-, Spannungs- und DNA-Längenänderung. Feng et al. [27] nutzten einen Viskositätsgradienten auf Basis raumtemperaturer ionischer Flüssigkeiten, um die Dynamik durch MoS₂-Nanoporen zu kontrollieren, und erreichten optimale Einzel-Nukleotid-Geschwindigkeiten von 373 bp/ms.

Obwohl viele Ansätze die Translokation verlangsamen, reichen sie für Sequenzierung nicht aus. Radikalere Methoden zur Kontrolle des DNA-Durchgangs sind nötig. Hier diskutieren wir Strukturkontrolle und quantitative DNA-Bewegung zur Verbesserung der zeitlichen Auflösung.

Zwei-Nanoporen-Systeme

Forscher nutzen Zwei-Nanoporen-Systeme zur manipulatierbaren DNA-Translokation, wodurch dasselbe Molekül mehrfach detektierbar wird. Zwei gestapelte Nanoporen, getrennt durch eine mikrometergroße Kavität [37] (Abb. 2a), können DNA-Moleküle zeitweise einfangen und kontrolliert freisetzen. Die Dynamik lässt sich aus den Signalen beider Poren per Korrelationsanalyse ableiten – ein direkter elektrischer Translokationsnachweis. Durch Entropiebarrieren wird die Brownsche Bewegung eingeschränkt, was die Sequenziergenauigkeit verbessert. Im Gegensatz zu Einzelmolekül-Sensorik ermöglichen serielle Mehrfachporen mehrfache Messungen desselben Moleküls [39].

Doppel-Nanoporen-Systeme bieten eine weitere Methode zur Kontrolle des Molekültransports und zur effizienten Brückung zwischen zwei Poren – ein markierungsfreier mechanistischer Ansatz [40]. Zwei unabhängig ansteuerbare, benachbarte Nanoporen in derselben Membran erzeugen bei elektrophoretischem Durchgang ein „Tauziehen“ [38] (Abb. 2b): Kräfte wirken an beiden Enden des DNA-Moleküls, verlangsamen oder stoppen die Bewegung vollständig. Dies eröffnet neue Wege zur mechanischen DNA-Falle in Festkörper-Nanoporen – eine vielversprechende Technik für markierungsfreie Biomolekülmessungen mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis und niedrigen Kosten. Sie erlaubt effizientes Einfangen und Verlangsamen sowie die Untersuchung der Physik dieses Nanoskalen-Tauziehens [41].

Optische Fallen-Nanoporen

Optische Fallen-Nanoporen nutzen optische Pinzetten zum Einfangen von Partikeln unter zehn Nanometern. Damit lassen sich Proteine [42], DNA-Fragmente [43], andere Biomoleküle [44] und kleine Viren [45] fangen. Die Theorie basiert auf einer selbstinduzierten Rückkopplungs-optischen Falle [46]. Ein auf das Nanoporen-Array fokussierter Laserstrahl erzeugt ein lokales Hochleistungs-Lichtfeld am Rand der Metallschicht im Loch. Ein Partikel in diesem Feld ändert die lokale optische Transmission stark, was große optische und dielektrische Kräfte erzeugt. Eine Doppelnanloch-Struktur durchbricht die Größenbegrenzung gefangener Partikel. Muhammad et al. [47] demonstrierten das Potenzial mit 20-nm-Silica- und Gold-Nanopartikeln. Der hantelförmige Doppelnanloch wurde in den Goldfilm gefräst, ein 25-nm-Nanopore in die mittige SiₓNᵧ-Membran gebohrt (Abb. 3a). Die elektrophoretische Kraft treibt Nanopartikel durch die Pore; am Lochrand wirkt die selbstinduzierte plasmonische Rückkopplungskraft der elektrophoretischen Kraft entgegen und reduziert die Geschwindigkeit. Die optische Falle verlängerte die elektrophoretische Translokationszeit um vier Größenordnungen. Kim et al. [43] realisierten die optische Erfassung von Plasmid- und Lambda-DNA mittels nanoplasmonischer Einzel-Nanoporen-Strukturen. Die Technologie eignet sich für DNA-Detektion und parallele Detektion durch multiple lokale Lichtfelder. Hochfrequente Ionenstromoszillationen können jedoch die Stromdetektion beeinträchtigen – möglicherweise durch Konkurrenz zwischen elektrophoretischer und Rückkopplungskraft, wodurch Partikel an der Porenmündung auf und ab schweben.

Optische Pinzetten

Optische Pinzetten kontrollieren molekulare Translokation durch Nanoporen und sind in jüngster Zeit weit verbreitet. 2006 demonstrierten Keyser et al. [48] erstmals ein molekulares Tauziehen zwischen elektrophoretischer und mechanischer Kraft, indem sie optische Pinzetten zur Steuerung der DNA-Translokation durch SiNₓ-Nanoporen einsetzten. Das System verhält sich wie eine einfache Hooke'sche Feder; die Spannkraft auf dem Bead berechnet sich nach Hooke'schem Gesetz: F_ot = −k_trapZ, wobei F_ot die optische Kraft, k_trap die Fallensteifigkeit und Z die lineare Verformung des Beads ist [48]. Die Methode fängt einen DNA-gebundenen Polystyrol-Bead im Kreuzungspunkt eines fokussierten Laserstrahls ein, ermöglicht dreidimensionale Manipulation und Pikonewton-Kraftempfindlichkeit (Abb. 4a). Zum Einfangen der translokierenden DNA in der Nanopore wird die Spannkraft so abgestimmt, dass sie die elektrische Feldkraft (F_el) auf die DNA ausgleicht. Damit lässt sich die Translokationsgeschwindigkeit verringern und das DNA-Molekül aus der Pore ziehen [52]. Das System erlaubt simultane räumliche Abtastung und hochauflösende Kraftmessungen an Nukleinsäuren und Proteinen – ein signifikanter Fortschritt für die DNA-Sequenzierung. Doch optische Pinzetten haben fundamentale Schwierigkeiten: Skalierung auf viele Nanoporen ist schwierig; Lasererwärmung beeinflusst Ionenstrom und Rauschen stark, weshalb der optisch gefangene Bead mehrere Mikrometer von der Nanopore entfernt sein muss [53].