Verbesserte Wasserstoffperoxid-Detektion durch oberflächenmodifizierte Festkörper-Nanoporen

Zusammenfassung

Es gibt viele Techniken zum Nachweis von Molekülen. Die Detektion von Molekülen durch Festkörper-Nanoporen in Lösung ist jedoch eine der vielversprechenden, hochdurchsatzfähigen und kostengünstigen Technologien, die heute verwendet werden. In der vorliegenden Untersuchung wurde eine Festkörper-Nanoporen-Plattform für den Nachweis von Wasserstoffperoxid (H₂O₂) hergestellt, das nicht nur ein markierungsfreies Produkt, sondern auch ein signifikanter Teilnehmer an Redoxreaktionen ist. Wir haben erfolgreich Siliziumnitrid (Si₃N₄) Nanoporen mit Durchmessern von ~50 nm mittels fokussiertem Ga-Ionenstrahl gefertigt; die innere Oberfläche der Nanopore wurde mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) durch Carbodiimid-Kupplungschemie modifiziert. Die immobilisierten HRP-Enzyme können Redoxreaktionen in einem einzelnen Nanoporenkanal induzieren. Zudem wurden Echtzeit-Einzeltranslokationsereignisse von aggregiertem ABTS^•+ überwacht und untersucht. Der entworfene Festkörper-Nanoporen-Biosensor ist reversibel und kann mehrmals zum Nachweis von H₂O₂ angewendet werden.

Hintergrund

Die Nanoporen-Detektionstechnologie stammt vom Coulter-Zähler [1] und Zell-Ionenkanälen [2]. Nanoporen detektieren geladene Moleküle in Lösung, die durch sie hindurchpassieren. Das Erscheinen der Moleküle in der Nanopore kann die Leitfähigkeit der Pore deutlich verändern, was zu einer Änderung des Stromsignals führt. Die Stromänderung liefert Informationen über Größen und Konzentrationen der Moleküle innerhalb der Pore, um den dynamischen Translokationsprozess der Moleküle zu enthüllen [3]. Einige nanoskalige Objekte können mittels Nanoporen detektiert werden, wie Nanopartikel [4–6], Viren [7–9], Proteinmoleküle [10–13] und DNA-Sequenzen [14–17]. Nanoporen sind in zwei Typen unterteilt: biologische Nanoporen und Festkörper-Nanoporen. Biologische Nanoporen haben ein geringeres Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und höhere Auflösung. Kleine und ungefaltete Proteine können mit biologischen Nanoporen detektiert werden [18–23]. Festkörper-Nanoporen sind größenverstellbar und haben höhere Stabilität. Festkörper-Nanoporen werden normalerweise in einen Film gebohrt, der die fluide Zelle in zwei Teile teilt [24]. Eine Bias-Spannung wird über eine dünne Membran mit einer Nanopore angelegt, was einen Ionenstrom von einer Zelle zur anderen erzeugt [25]. Proteinmoleküle einschließlich gefalteter und ungefalteter Strukturen werden durch Festkörper-Nanoporen detektiert und analysiert [26–29]. Die Interaktion von Proteinen kann ebenfalls mittels Festkörper-Nanoporen detektiert werden [30, 31]. Zudem können Proteinkinetiken detektiert werden [32, 33]. Um die Grenzen des Detektionsbereichs zu überwinden, wurden chemisch modifizierte Festkörper-Nanoporen umfangreich angewendet [34–39], um einzelnsträngige DNA [40] und Proteine [41] zu detektieren.

Viele quantitative Methoden wurden bereits für den Nachweis von H₂O₂ angewendet, die meisten basieren auf Spektrometrie [42–44], Chemolumineszenz [46–49], Amperometrie [50–53] und Elektrochemie [54–57]. Konventionelle spektrometrische und chemolumineszente Methoden sind üblicherweise zeitaufwändig und kostspielig. Der Festkörper-Nanoporen-Sensor hat geringen Verbrauch und einfache Struktur und kann kleine Moleküle detektieren.

Hier präsentieren wir einen Typ Festkörper-Nanopore, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) modifiziert wurde. Die HRPs wurden auf der inneren Oberfläche der Festkörper-Nanopore immobilisiert; die immobilisierten HRPs blieben aktiv in der Redoxreaktion, die innerhalb eines einzelnen Nanoporenkanals in Gegenwart von H₂O₂ stattfand [58]. Das in der Redoxreaktion erzeugte ABTS^•+ würde aggregieren, dann passierte das aggregierte ABTS^•+ die Nanopore. Die Translokationsereignisse können detektiert werden. Für den Wasserstoffperoxid-Nachweis ist die Struktur des Festkörpers einfach, und sie kann das aggregierte ABTS^•+ mit geringem Reagenzienverbrauch detektieren. Dieser HRP-enzym-modifizierte Festkörper-Nanopore kann die Wasserstoffperoxid (H₂O₂) Sensorik indirekt durch Detektion des aggregierten ABTS^•+ erreichen. Er hat lehrreiche Bedeutung für Einzelmoleküldetektion und Molekülassembly innerhalb von Festkörper-Nanoporen.

Methoden

Chemikalien und Materialien

Das Meerrettich-Peroxidase (HRP) Molekül (1 mg mL⁻¹, Enzymkommissions-Nr. 1.11.1.7, 44 kDa) wurde von Xiya Reagent (Chengdu, China) bezogen. Die Probe (HRP) wurde in 0,02 µm gefiltertem 0,1 M PBS gelöst, bei 4 °C gelagert und innerhalb von zwei Tagen nach Herstellung verwendet. Kaliumchlorid (KCl), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS, 98 %) wurden von DiBo Chemical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Wasserstoffperoxid (H₂O₂, 30 %) wurde von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. erworben. (3-Aminopropyl)triethoxysilan (3-APTES) wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Experimente wurden mit ultrareinem Wasser aus einem Milli-Q-Wasseraufbereitungssystem (Widerstand 18,2 MΩ/cm, 25 °C, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) durchgeführt und durch 0,02 µm in einem FEI Strata 201 FIB-System (FEI Co., Hillsboro, OR, USA), einem Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS) und einem Axopatch 700B (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA) gefiltert. Bilder der verwendeten Instrumente wurden dem Supplementary Material hinzugefügt (siehe Additional file 1: Figure S1).

Festkörper-Nanoporen-Fabrikation und elektrische Messungen

Zunächst wurde eine dünne Membran aus Si₃N₄ (100 nm Dicke) auf einem Si-Substrat mit 300 µm Dicke abgeschieden. Es folgte Photolithografie (das offene Fenster ist 500 × 500 µm²). Dann wurde die Membranoberfläche mit Ga⁺-Ionen mittels eines FEI Strata 201 FIB-Systems (FEI Co., Hillsboro, OR, USA) bei einer Beschleunigungsspannung von 30 kV bombardiert, während der Strom mit 1 pA gemessen wurde. Die Fräszeit betrug 1,5 s im Spot-Modus. Schließlich wurden die Festkörper-Nanoporen-Chips erhalten und in frisch zubereiteter Piranha-Lösung bei 80 °C für 30 min gereinigt, gefolgt von Spülen mit ultrareinem Wasser. Nach der Reinigung wurde der Chip in einer maßgefertigten Teflon-Zelle mit zwei Viton-O-Ringen montiert, um die beiden Seiten des Chips zu trennen und zwei Reservoirs zu bilden, die den einzigen Pfad für den Ionenstrom durch die Nanopore sicherstellen. Bilder des verwendeten Apparats wurden dem Supplementary Material hinzugefügt (siehe Additional file 1: Figure S2). Elektroden (Ag/AgCl) wurden mit der fluiden Zelle und einem Patch-Clamp-Verstärker (Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA) verbunden, der den Ionenstrom unter konstanten Spannungen messbar machte, mit 100 kHz Abtastrate für Signale. Der interne 8-polige Bessel-Tiefpassfilter des Verstärkers wurde auf 10 kHz eingestellt [3]. Das gesamte Instrument wurde in einen doppelten Faraday-Käfig gestellt.

Ergebnisse und Diskussion

Immobilisierung der Nanopore mit HRPs

Die ausgewählte Nanopore mit einem Durchmesser von ~50 nm wurde 30 min bei 80 °C in Piranha-Lösung eingetaucht. Nach der Behandlung mit Piranha-Lösung war die innere Oberfläche der Nanopore in der Lage, Silanolgruppen aufzunehmen. Anschließend wurde der gesamte Dünnfilm mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (3-APTES) aktiviert. Durch die Behandlung mit 3-APTES wurden Amino-(-NH₂)-Gruppen auf der Filmoberfläche generiert.

Nach der Aktivierung mit 3-APTES wurde der Nanoporen-Chip in 0,1 M PBS-Lösung von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC) (10 mM) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) (20 mM) gebracht. Anschließend wurde der Nanoporen-Chip in Meerrettich-Peroxidase (HRP) (10 ng/ml) eingeführt. Laut früheren Forschungsergebnissen unserer Gruppe [3] aggregierte HRP nicht bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen von 0,1 bis 2 M KCl, pH 7,0. Aufgrund des pI-Werts von Meerrettich-Peroxidase von 4,3 ± 0,2 wiesen wir auch nach, dass HRP in 0,1 M KCl pH 6,0 und pH 7,0 nicht aggregierte. Das EDC-Reagenz aktivierte die Carboxyl-(-COOH)-Gruppen von HRP in ein hochreaktives O-Acylisourea-Intermediat. Weiterhin wurde das Intermediat in Gegenwart von NHS in ein stabileres Succinimid-Amin-reaktives Ester umgewandelt [58]. Resultierend in der kovalenten Kopplung des Intermediats mit den (-NH₂)-Gruppen, die auf den inneren Oberflächen der Nanopore generiert wurden, um stabile Amidbindungen zu bilden (Abb. 1).

Diese Prozesse führen uns zur Immobilisierung von HRPs auf der inneren Oberfläche einer einzelnen Nanopore. Die Realisierung des Funktionalisierungsprozesses wurde durch Messung der Strom-Spannungs-(I-V)-Kennlinien einer einzelnen Nanopore vor und nach der Modifikation bestätigt (Abb. 2).

Charakterisierung der HRP-modifizierten Festkörper-Nanopore

Hier ist die Form eines einzelnen Si₃N₄-Nanoporenkanals zylindrisch. Abbildung 2 zeigt die typischen Strom-Spannungs-(I-V)-Kurven der unmodifizierten (originalen) und modifizierten Nanopore in 0,1 M KCl, gepuffert bei pH 7,0 mit 0,1 M PBS. Nach der Modifikation der inneren Oberfläche der Nanopore mit HRP-Enzymen wurde die Porengröße kleiner.

Nach Wanunu et al. kann der Durchmesser einer Festkörper-Nanopore unter Berücksichtigung der Leitfähigkeit außerhalb der Nanopore durch folgende Gleichung berechnet werden:

$$ d=\left(1+\sqrt{1+\frac{16\sigma l}{\pi G}}\right) G/2\sigma $$ (1)

Wobei d und l der Durchmesser und die Länge der Pore sind, G die offene Porenleitfähigkeit der Nanopore, σ die Leitfähigkeit der Ionenlösung.

Unter Berücksichtigung geometrischer Effekte kann die effektive Größe nach der Modifikation der Festkörper-Nanopore mit HRP-Enzymen berechnet werden. Der Durchmesser einer einzelnen Nanopore kann basierend auf Gleichung (1) berechnet werden. Dabei kann der Wert der Leitfähigkeit (G _unmodified) von ~15 nS aus den I-V-Kurven der unmodifizierten Festkörper-Nanopore erhalten werden. Die Leitfähigkeit (σ) der Ionenlösung 0,1 M KCl (25 °C), gepuffert bei pH 7,0 mit 0,1 M PBS beträgt ~1,28 S/m. Daher beträgt der Durchmesser der unmodifizierten Nanopore ~51 nm, was dem gemessenen Durchmesser ähnelt. Mit derselben Methode wurde der Wert der Leitfähigkeit (G _modified) von ~7,5 nS erhalten, und der Durchmesser (~34 nm) der modifizierten Nanopore kann berechnet werden. Die Reduktion des Durchmessers ist auf zwei Gründe zurückzuführen: Erstens die Behandlung der inneren Oberfläche der Nanopore mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (3-APTES), wodurch die Nanoporenoberfläche (-NH₂)-Aminogruppen aufnehmen kann. Der zweite Grund ist, dass der hydrodynamische Durchmesser (D _h) des HRP-Enzyms ~8 nm beträgt [3], die immobilisierten HRPs könnten den Porendurchmesser verringern. Hier wird die HRP-modifizierte Festkörper-Nanopore mit einem Durchmesser von ~34 nm als Wasserstoffperoxid-Detektionskanal verwendet.

Das Prinzip der Redoxreaktion

Die Redoxreaktion wurde innerhalb einer einzelnen modifizierten Nanopore durchgeführt, und der folgende dargestellte Reaktionsprozess stimmt gut mit der vorgeschlagenen Redoxreaktion überein [58]. In Gegenwart von H₂O₂ (0,5 mM) wurden die auf der inneren Oberfläche der Nanopore immobilisierten HRP-Enzyme sofort in Compound 1 umgewandelt. Dann nahm Compound 1 ein Elektron vom reduzierenden Substratmolekül ABTS (1,5 mM) auf, um Compound 2 zu erzeugen. Anschließend wurde Compound 2 über ein Elektronentransfer von einem weiteren Substratmolekül ABTS zurück zum ruhenden Enzym reduziert.

Die kationischen Produkte (ABTS^•+) der Redoxreaktionen akkumulierten in der einzelnen Nanopore. Die Translokation der akkumulierten Moleküle aus dem Nanoporenkanal würde die Leitfähigkeit (G) ändern, und somit kann die Stromänderung (ΔI _b) gefunden werden.

$$ \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{3+}\right)\mathrm{Porp} + {\mathrm{H}}_2{\mathrm{O}}_2\to \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right){\mathrm{Porp}}^{\cdotp +}\left(\mathrm{Compound}\ 1\right) + {\mathrm{H}}_2\mathrm{O} $$

$$ \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right){\mathrm{Porp}}^{\cdotp +} + \mathrm{ABTS}\to \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right)\mathrm{Porp}\left(\mathrm{Compound}\ 2\right) + {\mathrm{ABTS}}^{\cdotp +} $$

$$ \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right)\mathrm{Porp} + \mathrm{ABTS}\to \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{3+}\right)\mathrm{Porp} + {\mathrm{ABTS}}^{\cdotp +} + {\mathrm{H}}_2\mathrm{O} $$

Detektion von Translokationsereignissen

Experimente wurden mit HRP-modifizierten Nanoporen mit modifizierten Porendurchmessern (~34 nm) in 0,1 M KCl, gepuffert bei pH 7,0 mit 0,1 M PBS durchgeführt. 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonat) (ABTS) (1,5 mM) und Wasserstoffperoxid (H₂O₂) (0,5 mM) wurden dem Trans-Kompartiment der Nanopore zugesetzt. Nach Zugabe von ABTS und H₂O₂ wurden Experimente mit Bias-Spannungen von −100 bis −800 mV durchgeführt, und sie wurden mit 100 kHz abgetastet. Es gab keine Translokationsereignisse, bis die Spannung auf −400 mV erhöht wurde. Abbildung 3 zeigt repräsentative Ionenstromspuren der Translokationsereignisse bei verschiedenen Spannungen von −400 bis −800 mV in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Die Experimentaldaten langdauernder Translokationsereignisse bei verschiedenen Spannungen wurden dem Supplementary Material hinzugefügt (siehe Additional file 1: Figure S3).

Milli-Sekunden-Stromblockade-Ereignisse wurden beobachtet, durchgeführt in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Durch Zugabe der Reagenzien H₂O₂ und ABTS in das Trans-Kompartiment, HRP-Enzyme immobilisiert auf der inneren Oberfläche des einzelnen Nanoporenkanals, fand die Redoxreaktion statt. Eine Vielzahl von ABTS^•+-Molekülen wurde produziert; ein einzelnes kleineres ABTS^•+-Molekül könnte möglicherweise nicht mit unserem Festkörper-Nanoporen-System detektiert werden, aufgrund der Systemauflösung [3]. Diese Moleküle würden sich jedoch nach ihrer Produktion aggregieren. Daher ist es möglich, die ABTS^•+-Moleküle zu detektieren. Hier wurden negative Spannungen gehalten, und aggregierte ABTS^•+-Moleküle passierten die Nanoporen. Es gab einen elektrophoretischen und elektroosmotischen Fluss, wenn negative Spannung angelegt wurde. HRP war in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0 negativ geladen [3], was zur Bildung einer doppelten elektrischen Schicht führte, und Elektroosmose wäre in Richtung der negativen Elektrode gerichtet. Aus diesem Grund waren Elektrophorese und Elektroosmose in die gleiche Richtung gerichtet. Die aggregierten ABTS^•+ im einzelnen Nanoporenkanal würden durch die Festkörper-Nanopore transportieren, in Richtung der negativen Elektrode fließen.

Statistische Analyse der Translokationsereignisse

Da die Bias-Spannung eine Schlüsselrolle bei der Translokation von aggregiertem ABTS^•+ spielte, wurde der Einfluss der Stromblockaden von aggregiertem ABTS^•+, die durch die HRP-modifizierte Nanopore passierten, versus angewendete Spannungen diskutiert. Die Auftretenshäufigkeit von Translokationsereignissen verbesserte sich erheblich mit der Erhöhung der Spannung (Abb. 3f). Mit steigender Spannung stieg auch die Amplitude des Stroms. Die Translokationsereignisse verschwanden jedoch allmählich, wenn die Bias-Spannung unter −300 mV gehalten wurde, was darauf hindeutete, dass aggregiertes ABTS^•+ über HRP-modifizierte Nanoporen eine Schwellenspannung von −300 mV benötigte. Abbildung 4 zeigt Histogramme der mittleren Stromamplitude von Translokationsereignissen, gemessen für aggregiertes ABTS^•+ bei verschiedenen Spannungen. Basierend auf den Anpassungskurven betragen die Spitzenwerte der Stromblockade (ΔI _b) 308,4 ± 27,795 pA, 419,1 ± 20,354 pA, 478,8 ± 32,857 pA, 528,1 ± 36,98 pA, 606,9 ± 40,916 pA bei −400, −500, −600, −700 und −800 mV, jeweils. Es ist wahrscheinlich, dass die Stromreduktion durch aggregierte ABTS^•+-Moleküle verursacht wird, die bei verschiedenen Spannungen durch die Nanopore passieren. Die Stromamplitudenwerte wurden mit einer Polynomfunktion erster Ordnung angepasst, was eine Steigung von −0,706 und einen Achsenabschnitt von 49,262 ergab. Basierend auf den Anpassungskurven betragen die Verweilzeiten 54,5 ± 21,374 ms, 42,8 ± 20,181 ms, 10,3 ± 3,05 ms, 6,0 ± 1,744 ms, 4,0 ± 1,441 ms bei −400, −500, −600, −700 und −800 mV. Abbildung 3h zeigt, dass eine exponentiell abklingende Funktion (t _d ~ e ^−v/v0) verwendet wurde, um die Verweilzeit in Abhängigkeit von den angewendeten Spannungen anzupassen. Die Histogramme der Verweilzeiten der Translokationsereignisse wurden dem Supplementary Material hinzugefügt (siehe Additional file 1: Figure S4).

Die Stromblockade versus Ereignis-Verweilzeit für jedes aggregierte ABTS^•+ bei verschiedenen Spannungen wurden in zweidimensionalen Streudiagrammen angepasst (Abb. 5). Alle aggregierten ABTS^•+ zeigen einen Cluster von Ereignissen von −400 bis −800 mV, die Hauptereignis-Cluster sind auf aggregiertes ABTS^•+ zurückzuführen, das durch die HRP-modifizierte Festkörper-Nanopore passiert.

Zusätzlich wurde das einzelne Translokationsereignis bei jeder Spannung analysiert, und die Stromblockade wurde durch die gleiche Größe und geladene Substanz induziert. Daher wird angenommen, dass jedes Translokationsereignis durch ein einzelnes aggregiertes ABTS^•+ induziert wurde. Um die Translokationszeit von aggregiertem ABTS^•+ in unseren Experimenten zu analysieren. Die Stromblockade-Dauer t _d wird als Verweilzeit eines einzelnen aggregierten ABTS^•+ vom Ort seiner Produktion bis zum Ausgang der Nanopore betrachtet. Hier wurde eine weitere Bedingung berücksichtigt: Es könnten einige HRP-Enzyme am Eingang der Nanopore immobilisiert sein, und sie könnten die Redoxreaktion katalysieren. Daher wurden andere Experimente durchgeführt, um zu verifizieren, dass die Redoxreaktion an der inneren Oberfläche einer einzelnen Nanopore stattfand und nicht am Eingang. Zur Verifizierung wurden unmodifizierte Nanoporen durch HRPs angewendet und analysiert. Diese Nanoporen wurden mit 3-APTES aktiviert. Und dieselbe Konzentration HRPs (10 ng/ml), ABTS (1,5 mM) und H₂O₂ (0,5 mM) wurden dem Trans-Kompartiment der Nanopore zugesetzt, die negative Bias-Spannung wurde in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0 angelegt. Aufgrund der elektrophoretischen Kraft waren HRPs nicht in der Lage, durch die Nanopore zu passieren. Aufgrund der Redoxreaktion wurde aggregiertes ABTS^•+ produziert, aber es wurden keine Translokationsereignisse gefunden. Es ist möglich, dass das aggregierte ABTS^•+ elektrostatische Effekte mit HRPs verursacht und das Passieren des aggregierten ABTS^•+ durch die Nanopore verhindert.

Abbildung 6 zeigt die zweidimensionalen Streudiagramme der Leitfähigkeitsänderung (ΔG) versus Ereignis-Verweilzeit für jedes aggregierte ABTS^•+ bei verschiedenen Spannungen. Es kann festgestellt werden, dass die Leitfähigkeitsänderung (ΔG) hauptsächlich bei 0,8 nS konzentriert ist. Die Form der Translokationsereignisse ist fast identisch. Der Mittelwert von ΔG beträgt ~0,8 nS bei verschiedenen Spannungen. Es kann spekuliert werden, dass der Volumenausschluss jedes aggregierten ABTS^•+-Moleküls fast gleich ist. Es ist möglich, dass elektrostatische und sterische Effekte von aggregierten ABTS^•+-Molekülen den Ionenstrom ändern können. Nach der Analyse wurden zwei typische Formen von Stromspuren mit positiv geladenem aggregiertem ABTS^•+-Translokation beobachtet (Abb. 7). Die Translokationsereignisse bei −700 mV als Repräsentant. Der Prozentsatz der zwei Ereignistypen wurde analysiert, und es kann beobachtet werden, dass der Prozentsatz von Typ-1-Ereignissen mit der Spannungserhöhung zunahm, während der Prozentsatz von Typ-2-Ereignissen abnahm. Es wurde angenommen, dass höhere Spannung die Translokation schneller macht als niedrigere Spannung.

Die Stromblockade-Signale enthüllten die Größe, Konformation und Interaktion von aggregiertem ABTS^•+, das durch den einzelnen Nanoporenkanal passierte. Für die Stromformänderung wurde der Prozess der Änderungen spekuliert. Für Ereignis 1 haben die Stromsignale einen typischen Fluktuationsteil mit tiefer Intensität und kurzer Verweilzeit. Es ist möglich, dass das aggregierte ABTS^•+ von dem Ort, wo es produziert wurde, durch die Nanopore passierte. Wenn das aggregierte ABTS^•+ durch die Nanopore passierte, wurde der Ionenstrom der Nanopore auf das ursprüngliche Niveau (Baseline) (I ₀) wiederhergestellt. Für Ereignis 2 haben die Stromsignale einen Fluktuationsteil mit tiefer Intensität und dann eine horizontale Phase. Diese Signalform kann der elektrostatischen Interaktion von aggregiertem ABTS^•+ mit den HRPs am Ausgang der Nanopore zugeschrieben werden, und der Strom erholte sich langsam zur Baseline. Für ein besseres Verständnis der Stromänderung müssen wir mit der Änderung der offenen Porenleitfähigkeit (G _pore) bei Salzkonzentration (0,1 M KCl) beginnen. Wie in früheren Studien diskutiert, kann eine Gleichung der offenen Porenleitfähigkeit einer negativ geladenen Nanopore mit einem Durchmesser d und einer Länge l bei niedriger Salzkonzentration wie folgt beschrieben werden:

$$ {G}_{p ore}=\frac{\pi {d^2}_{p ore}}{4{l}_{p ore}}\left[\left({\mu}_{K^{+}}+{\mu}_{C{ l}^{-}}\right){n}_{K Cl}\cdot e+{\mu}_K\frac{4{\sigma}_p}{d_{p ore}}\right] $$ (2)

Wobei μ _K und μ _Cl die elektrophoretischen Mobilitäten von K⁺ und Cl⁻ sind, n _KCl die Zahlendichte von K⁺ und Cl⁻, die Elementarladung e, σ _p die Oberflächenladungsdichte der Nanoporenoberflächen. In diesem Experiment wurde die Festkörper-Nanopore chemisch modifiziert, und der Nanoporendurchmesser wurde geändert. Die Oberflächenladungsdichte der Nanoporenoberfläche (σ _p) kann nicht genau ermittelt werden. Daher wurde die offene Porenleitfähigkeit (G _pore) basierend auf Gleichung (1) berechnet. Aufgrund von Gleichung (1) beträgt die offene Porenleitfähigkeit (G _pore) ~7,5 nS. Es wird spekuliert, dass die Leitfähigkeitsänderung auf zwei Gründe zurückzuführen ist [15]. Der erste Grund ist, dass der Volumenausschluss von Ionen in der Nanopore durch die aggregierten ABTS^•+-Moleküle besetzt wurde. Als Ergebnis wurde die Leitfähigkeit der Festkörper-Nanopore verringert (ΔG ^-). Der zweite Grund ist, dass einige Ionen durch die aggregierten ABTS^•+-Moleküle aus der Nanopore mitgebracht wurden, was die Leitfähigkeit der Festkörper-Nanopore erhöhte. In diesen Experimenten wurde ABTS^•+ innerhalb der Nanopore produziert, und keine Ionen wurden mitgebracht. Daher wurde die Änderung der Leitfähigkeit der Festkörper-Nanopore (ΔG) nur durch den Volumenausschluss induziert. So kann die gesamte Leitfähigkeitsänderung beschrieben werden als

$$ \varDelta G=\varDelta {G}^{-} $$ (3)

Die Verringerung der Leitfähigkeit der Festkörper-Nanopore wird durch den Volumenausschluss induziert und kann durch folgende Gleichung berechnet werden:

$$ \varDelta {G}^{-}=\sigma \frac{\gamma \varLambda}{{\left( l+0,8 d\right)}^2} $$ (4)

Wobei γ der Partikelformfaktor ist, der das Flächenverhältnis derselben Volumenkugel und des Partikels ist. In dieser Arbeit wurde das aggregierte ABTS^•+-Molekül zu einem globalen Objekt vereinfacht, daher beträgt der Wert von γ 1 und Λ ist der Volumenausschluss. Die Leitfähigkeit der Volumenlösung σ beträgt 1,28 S/m, 0,1 M KCl (25 °C).

Für den Volumenausschluss (Λ) können wir ihn aus den Translokationsereignissen einiger anderer Moleküle ableiten. Um die Leitfähigkeitsänderung (ΔG) mit der physikalischen Eigenschaft der Moleküle zu verbinden, kann das Ohmsche Gesetz auf die Volumenänderung der Elektrolytlösung basierend auf der Festkörper-Nanopore angewendet werden [59]. Wenn ein Translokationsereignis eines Moleküls in einer zylindrischen Festkörper-Nanopore stattfindet, verringert sich der Strom instantan. Wenn der Widerstand der Festkörper-Nanopore der Gesamtwiderstand des Stromkreises ist, kann die Leitfähigkeitsänderung (ΔG) durch folgende Gleichung beschrieben werden:

$$ \varDelta G(t)=-{G}_{p ore}\frac{\varLambda (t)}{H_{eff}{A}_p}\left[1+ f\left({d}_m/{D}_p,{l}_m/{H}_{eff}\right)\right] $$ (5)

In dieser Gleichung ist A _p H _eff = V _p das Volumen der Festkörper-Nanopore, f (d _m /D _p, lm/H _eff) ist der Korrekturfaktor (er ignorierte den Oberflächenladungseffekt), in unseren Experimenten vereinfachten wir das aggregierte ABTS^•+-Molekül zu einem globalen Objekt; daher ist der Korrekturfaktor 1. d _m /D _p ist das Verhältnis von Moleküldurchmesser und Nanoporendurchmesser. lm/H _eff ist das Verhältnis von molekularer effektiver Länge und Nanoporen-effektiver Länge. Der Ausdruck (5) kann vereinfacht werden zu

$$ \varDelta G/{G}_{p ore}\approx \varLambda /{V}_p $$ (6)

Der Mittelwert der Leitfähigkeit (G _pore) wurde aus den Translokationsereignissen analysiert. Aus Gleichung (5) kann der Mittelwert des Volumenausschlusses (Λ) bei verschiedenen Spannungen (-400, -500, -600, -700, -800 mV) ermittelt werden. Gleichzeitig ist die Größe der verwendeten Nanopore bekannt, das Volumen der Nanopore (V _p) beträgt ~90746 nm³. Aufgrund von Gleichung (4) kann der Wert der Leitfähigkeitsänderung (ΔG ^-) als ~0,6 nS berechnet werden. Der Mittelwert der Leitfähigkeitsänderung, der aus den Translokationsereignis-Experimenten bei verschiedenen Spannungen (−400, −500, −600, −700, −800 mV) gewonnen wurde, beträgt ~0,784 nS. Es kann festgestellt werden, dass der berechnete Wert nahe am experimentellen Wert liegt.

In einigen früheren Untersuchungen wurden Wasserstoffperoxid-Moleküle mit verschiedenen Technologien detektiert. Aber der Nachweis von Wasserstoffperoxid durch Nanochannels ist selten. Tan et al. [3] differenzierten disparate Ereignissignale, als HRPs in die Nanopore eindrangen, wobei ABTS und H₂O₂ in KCl-Lösung vorhanden waren. Die verschiedenen Typsignale mit HRP-Translokation wurden als ABTS^•+ angesehen, das durch die Nanopore passierte. Sechs typische Ereignisse der Translokation des Produkts der Enzymkatalyse-Substrate wurden analysiert. Sie spekulierten den wahrscheinlichen Prozess jedes Typs. Es gab jedoch nicht genug Beweise, um dies zu belegen. Mubarak Ali et al. gelang der Nachweis der Redoxreaktionsprodukte in einzelnen konischen Nanochannels [58]. Sie fanden, dass der kationische Radikal ABTS^•+ den Ionenstrom im HRP-Nanochannel in einer spannungsabhängigen Weise reduzierte, konsistent mit spannungsabhängigen Ionenkonzentrationen in konischen Nanochannels. Die Magnitude der Stromblockade korrelierte mit der H₂O₂-Konzentration in der Lösung.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir erfolgreich eine Si₃N₄-Nanopore mittels FIB gefertigt, ein einzelnes Nanoporensystem, dessen Oberfläche kovalent mit HRP-Enzymen verknüpft war. Der Effekt der immobilisierten HRP-Enzyme in einer einzelnen Festkörper-Nanopore als Wasserstoffperoxid (H₂O₂) Sensor wurde durch Untersuchung der Produkte (ABTS^•+) der Redoxreaktionen, die in Gegenwart der Substrate H₂O₂ und ABTS stattfanden, bestätigt. Das aggregierte kationische Radikal ABTS^•+, das innerhalb der Festkörper-Nanopore produziert wurde und den Ionenstrom in der HRP-modifizierten Festkörper-Nanopore reduzierte, ist konsistent mit Spannungsabhängigkeit. Die Stromblockade-Trends zeigten lineare Abhängigkeit für angewendete Bias-Spannungen. Die Beziehung zwischen Verweilzeit versus angewendeter Bias-Spannung war exponentiell abklingend (t _d ~ e ^−v/v0). Gleichzeitig benötigte das aggregierte ABTS^•+, das durch die HRP-modifizierten Nanoporen passierte, eine Schwellenspannung von −300 mV. Die Leitfähigkeitsänderung (ΔG) wurde analytisch berechnet und mit den gemessenen experimentellen Werten verglichen. Die Translokationsereignisse wurden durch das bestimmte Größen-aggregierte kationische Radikal ABTS^•+ produziert. Wir erwarten, dass die Verwendung von Festkörper-Nanoporen die Detektionsgrenze senken und die Systemempfindlichkeit verbessern wird. Für unser Festkörper-Nanoporensystem ist die Struktur einfach; es ist nicht anfällig für Verunreinigungen und kann mehrmals verwendet werden.

Abkürzungen

3-APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilan

ABTS:

3-Ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure

EDC:

N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid

FIB:

Fokussierter Ionenstrahl

HRP:

Meerrettich-Peroxidase

KCl:

Kaliumchlorid

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

REM:

Rasterelektronenmikroskopie

SNR:

Signal-Rausch-Verhältnis