Lyophilisierte hybride nanostrukturierte Lipidträger zur Verbesserung der zellulären Aufnahme von Verapamil:Statistische Optimierung und In-vitro-Auswertung

Hintergrund

Verapamil ist ein Kalziumkanalblocker vom L-Typ der Phenylalkylamin-Klasse und ein Antagonist des α-adrenergen Rezeptors. Es wird in großem Umfang zur Behandlung von Bluthochdruck, supraventrikulärer Tachyarrhythmie, Angina pectoris und Cluster-Kopfschmerzen eingesetzt. Nach dem biopharmazeutischen Klassifizierungssystem wird Verapamil als Arzneimittel der Klasse I eingestuft. Von den Arzneimitteln dieser Klasse ist bekannt, dass sie nach oraler Verabreichung eine gute Absorption über die Darmmembran (≤ 90 %) aufweisen. Aufgrund des schnellen First-Pass-Metabolismus durch den Pfortaderkreislauf werden jedoch nur 20–35 % der oralen Verapamil-Dosis in den Blutkreislauf abgegeben [1]. Daher ist es wichtig, geeignete Trägerstoffe zu entwickeln, die die zelluläre Aufnahme von Verapamil und möglicherweise seine Bioverfügbarkeit verbessern können.

Lipidbasierte Nanoformulierungen der zweiten Generation wie nanostrukturierte Lipidträger (NLCs) zeigten ein großes Potenzial für den Einsatz bei der Verabreichung von Therapeutika [2, 3]. Die NLCs haben eine höhere chemische und physikalische Stabilität im Vergleich zu den festen Lipid-Nanopartikeln (SLNs) und haben auch kontrollierte Freisetzungseigenschaften. Darüber hinaus weisen NLCs eine hohe Beladungskapazität für Wirkstoffmoleküle auf, indem sie ein weniger geordnetes Kristallgitter der Lipidmatrix bilden, was den Ausstoß des Wirkstoffs während der Lagerung minimieren könnte. NLCs werden aus Lipiden hergestellt, die die Chylomikronenbildung im Darm beschleunigen und die Aufnahme von NLCs erleichtern, die die Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln erhöhen können [4]. Daher wurden in der vorliegenden Studie hybride nanostrukturierte Verapamil-Dextran-Lipidträger (HVD-NLCs) entwickelt, um die zelluläre Aufnahme des Arzneimittels zu verbessern, was zu einer Erhöhung seiner Bioverfügbarkeit führen kann.

Die meisten lipophilen Medikamente können leicht in die NLCs eingebaut werden, aber es ist ziemlich schwierig, hydrophile Medikamente wie Verapamil in einer lipidbasierten Nanoformulierung einzuschließen. Daher wurden in der vorliegenden Studie Hybrid-NLCs unter Verwendung eines Gegenions Dextransulfat-Natrium hergestellt, um die Einkapselung von Verapamil zu verbessern und seine Freisetzung aus den NLCs zu verlängern (Abb. 1). Die HVD-NLCs-Formulierungen wurden nach der Heiß- und Hochscherhomogenisierungsmethode hergestellt und mit einem 2 ⁴ . statistisch optimiert vollfaktorielles Design. In der Studie wurden zwei Arten von Lipiden verwendet, das feste Lipid Compritol 888 ATO® und das flüssige Lipid Ölsäure. Die hergestellten HVD-NLCs wurden hinsichtlich ihrer Partikelgröße (PS), des Zetapotentials (ZP), des Polydispersitätsindex (PDI) und des Prozentsatzes der Wirkstoffeinschlusseffizienz (%EE) charakterisiert. Die optimierten HVD-NLCs wurden unter Verwendung von Trehalose als Kryoschutzmittel lyophilisiert. Die in vitro-Freisetzungsprofile wurden in alkalischen und sauren Umgebungen durchgeführt. Die zelluläre In-vitro-Aufnahmestudie von Verapamil aus den ausgewählten HVD-NLCs wurde unter Verwendung von Caco-2-Zelllinien durchgeführt. Die Stabilitätsstudie der optimierten Formulierung wurde 6 Monate lang bei drei verschiedenen Bedingungen (5 °C ± 3 °C, 25 °C ± 2 °C/60 % RH ± 5 % RH und 40 °C ± 2 °C/ 75% RH ± 5% RH).

Bildung eines elektrostatischen Komplexes aus dem wasserlöslichen kationischen Wirkstoff Verapamilhydrochlorid und dem Gegenion Polymer Dextransulfat Natrium

Methoden

Material

Verapamil HCl wurde von der pharmazeutischen Fabrik Wenzhou (Wenzhou, China) bezogen. Compritol 888 ATO® (Glyceroldibehenat EP-Glycerylbehenat NF) wurde von Gattefosse (Saint-Priest, Frankreich) bezogen. Ölsäure wurde von R&M Chemicals (Essex, UK) bezogen. Tween 80® (Polysorbat 80) wurde von Euro chemo-pharma Sdn. Bhd. (Penang, Malaysia). Poloxamer 188 (Pluronic® F-68) wurde von Molekula (Dorset, UK) bezogen. Trehalose, Sephadex® G-25 und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Die Caco-2-Zellinie wurde von ATCC (Virginia, USA) bezogen. Penicillin-Streptomycin-Lösung 100 X wurde von Biowest (Nuaillé, Frankreich) bezogen. Trypsin 0,25% und Dulbeccos modifiziertes Eagles-Medium (DMEM) wurden von GE Healthcare Life Sciences, Hyclone Laboratory (Utah, USA) bezogen. Passive Lysis Buffer, 5X wurde von Promega (Wisconsin, USA) bezogen.

Methoden

Vorbereitung von HVD-NLCs

HVD-NLCs wurden durch das Heiß-High-Shear-Homogenisierungsverfahren hergestellt. Die Lipidphase bestand aus Compritol ATO 888® und Ölsäure wurde durch Erhitzen auf 85 °C (10 °C über dem Schmelzpunkt des festen Lipids) geschmolzen. Die erforderliche Menge Verapamil wurde abgewogen und in der wässrigen Phase gelöst, die eine Mischung aus Tween 80® und Poloxamer 188 im Verhältnis 1:1 enthielt w /w . Die wässrige Phase wurde auf dieselbe Temperatur wie die Lipidphase erhitzt. Die wässrige Phase wurde in die Lipidphase gegossen und unter Verwendung eines digitalen T25 Ultra-Turrax®-Homogenisators, IKA® (Staaufen, Deutschland) bei 24.000 U/min, 85 °C homogenisiert. Anschließend wurde die wässrige Dextransulfatlösung (1:1 Verhältnis zu Verapamil) während des Homogenisierungsprozesses langsam in die Mischung gegeben. Die vorbereiteten HVD-NLCs wurden bei Raumtemperatur (25 ± 2 °C) abkühlen gelassen.

Statistische Optimierung der Formulierungsparameter mit 2 ⁴ Vollfaktorielles Design und Erwünschtheitsfunktionsansätze

Ein vollfaktorielles Design mit zwei Ebenen und vier Variablen wurde durchgeführt, um die Wirkung von formulierungsunabhängigen Variablen (Faktoren) auf die Merkmale (abhängige Variablen oder Antworten) zu optimieren und zu bewerten (Tabelle 1). Die wahren Höchst- und Tiefstwerte für jede unabhängige Variable wurden basierend auf den Vorstudien ausgewählt.

Die von den abhängigen Variablen erhaltenen experimentellen Antworten waren die Ergebnisse der individuellen und kombinierten Effekte der vier unabhängigen Variablen. Dieses zweistufige experimentelle Design liefert genügend Daten, um die folgende Polynomgleichung zu erfüllen.

Wo X ist eine abhängige Variable; β₀ ist ein Abfangen; β₁ , β₂ , β₃ , und β₄ sind die Koeffizienten der unabhängigen Variablen A , B , C , und D bzw. Während β₁₂ , β₁₃ , β₁₄ , β₂₃ , β₂₄ , und β₃₄ sind die jeweiligen Interaktionen (d. h. AB, AC, AD, BC, BD und CD). Die experimentellen Ergebnisse wurden mit einer Design-Expert®-Softwareversion 6.0.10 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA) analysiert, gefolgt von einer Varianzanalyse (ANOVA), um die Signifikanz von Faktoren und deren Wechselwirkungen zu bestimmen. Die statistische Analyse wurde als signifikant erachtet, wenn die p Werte waren < 0.05.

Die endgültigen Formulierungen wurden auf der Grundlage des Erwünschtheitsfunktionsansatzes ausgewählt. Die Erwünschtheitsfunktion kombiniert alle Antworten in einer Variablen, um die optimalen Niveaus der untersuchten Faktoren vorherzusagen. Daher wurde die Erwünschtheit bestimmt, die optimierten Formulierungen mit der niedrigsten Partikelgröße (PS) und dem niedrigsten Polydispersitätsindex (PDI) und den höchsten Werten für Zetapotential (ZP) und prozentuale Einschlusseffizienz (%EE) auszuwählen. Die Erwünschtheitsfunktion wandelt alle Antworten in eine gemeinsame Skala (0, 1) um und kombiniert sie mit dem geometrischen Mittel zur Optimierung der Gesamtmetrik. Der Erwünschtheitswert 1 bezeichnet einen akzeptablen Wert (erwünschter Wert) für die Antworten, während der Erwünschtheitswert 0 einen inakzeptablen Wert anzeigt.

Messungen der Partikelgröße, des Polydispersitätsindex und des Zetapotentials

Der PS und PDI der hergestellten Nanopartikel wurden unter Verwendung eines Photonenkorrelationsspektrometers (Zetasizer 1000HS/3000HS, Malvern Instrument, Malvern, UK) gemessen. Der ZP wurde unter Verwendung eines Zeta-Potential-Analysators (Zetasizer nano series, Nano Z-red badge, Malvern Instrument, Malvern, UK) bestimmt. Alle Proben wurden mit gefiltertem destilliertem Wasser (0,45 μm Nylonfilter) verdünnt und die Messungen wurden dreifach durchgeführt.

Bestimmung der prozentualen Einschlusseffizienz

Die vorbereitete Probe, die freien Verapamil-Dextran-Komplex und HVD-NLCs enthielt, wurde durch das Minisäulen-Zentrifugationsverfahren unter Verwendung von Sephadex® G25 getrennt. Ein Volumen von 1 ml der Probe wurde oben auf die Säule gegeben und dann 2 min bei 2000 U/min zentrifugiert. Der Eluent, der HVD-NLCs enthielt, wurde gesammelt und unter Verwendung eines Gefriertrockners (Labconco, Free Zone Freeze Dry Systems, Kansas City, USA) lyophilisiert.

Die lyophilisierten HVD-NLCs (10 mg) wurden in Chloroform gelöst und unter Stickstoffgas bei 40 °C eingedampft. Die getrocknete Probe wurde dann in 1 ml destilliertem Wasser gelöst, 2 Minuten gevortext und 5 Minuten bei 12.000 U/min zentrifugiert (Eppendorf, Deutschland). Der Überstand wurde gesammelt und die Menge an Verapamil wurde unter Verwendung einer validierten Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Methode bestimmt. Der %EE wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:

Die HPLC-Analyse zur Quantifizierung von Verapamil wurde unter Verwendung eines Shimadzu-Chromatographiesystems, ausgestattet mit einer LC 20AD-Förderpumpe (Kyoto, Japan) und einer Phenomenex C18-Säule (250 ×   4,6 mm) durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus 20 mM Ammoniumacetat und Acetonitril im Verhältnis 40:60 (v /v ). Der pH-Wert der mobilen Phase wurde mit Eisessig auf pH 6,5 eingestellt. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl und die Detektionswellenlänge für Verapamil wurde auf 278 nm eingestellt und die Flussrate wurde auf 1,5 ml/min festgelegt.

Lyophilisierungsstudie

Die Gefriertrocknung erfolgte bei – 40 °C für 24 h unter Verwendung eines Labconco, FreeZone Freeze Dry Systems (Kansas City, USA). Fünf Arten von häufig verwendeten Zuckern, einschließlich Mannit, Fructose, Saccharose, Lactose und Trehalose bei einem Lipid:Kryoprotektor-Verhältnis von 1:1, wurden gescreent, um ein geeignetes Kryoprotektivum für die Gefriertrocknung der HVD-NLCs auszuwählen. Das Kryoschutzmittel, das nach Rekonstitution in destilliertem Wasser den niedrigsten mittleren PS und PDI der lyophilisierten Formulierung erzeugte, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.

In der nächsten Studie wurde die HVD-NLCs-Formulierung mit dem ausgewählten Kryoschutzmittel unter Verwendung von zwei Methoden gemischt. Bei der ersten Methode wurde das Kryoschutzmittel nach der Herstellung der HVD-NLCs-Formulierung zugegeben und es wurde als „nach Homogenisierungsprozess“ bezeichnet. Bei der zweiten Methode wurde das Kryoschutzmittel während der Zubereitung der HVD-NLCs-Formulierung zugegeben und es wurde als "während des Homogenisierungsprozesses" bezeichnet. Bei der ersten Methode wurden mehrere Lipide und Kryoschutzmittel-Verhältnisse von 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 und 1:8 hergestellt und lyophilisiert. Die lyophilisierten HVD-NLCs-Formulierungen wurden in gefiltertem, destilliertem Wasser (0,45 μm Nylonfilter) erneut dispergiert und die Proben wurden auf durchschnittlichen PS, PDI und % EE bewertet. Die Lipid:Kryoschutzmittel-Verhältnisse, die den niedrigsten PS und PDI und den höchsten %EE ergaben, wurden für weitere Studien in der zweiten Mischmethode ausgewählt.

In-vitro-Release-Studie

Die In-vitro-Freisetzungsstudie von Verapamil aus NLCs wurde unter Verwendung eines Dialysebeutels durchgeführt, der in ein Medium mit simulierter Darmflüssigkeit (pH 6,8) oder simulierter Magenflüssigkeit (pH 1,2) gelegt wurde. In dieser Studie wurden 2 ml HVD-NLCs-Dispersion in den Dialysebeutel gefüllt (12.000 Da MW Cutoff). Der Beutel wurde versiegelt und dann in 150 ml vorgewärmtes Trennmedium eingetaucht. Die Freisetzungsstudie wurde auf einem Magnetrührer mit Heizplatte durchgeführt, der auf eine Rührgeschwindigkeit von 100 U/min und 37 °C eingestellt war. In geplanten Zeitintervallen von 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 und 72 h wurde 1 ml Probe entnommen und durch das gleiche Volumen frischen Mediums ersetzt. Die freigesetzte Verapamilkonzentration wurde durch HPLC bestimmt.

Differentialscanningkalorimetrie

Die Analyse der Differentialscanningkalorimetrie (DSC) wurde unter Verwendung eines Perkin-Elmer Pyris 6 DSC (Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK) durchgeführt. Die Proben wurden in eine Aluminiumpfanne eingewogen (5–7 mg) und mit einer Standard-Probenpfannen-Crimppresse (Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK) versiegelt. DSC-Kurven wurden mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/min von 0 bis 260 °C aufgezeichnet.

Weitwinkel-Röntgenstreuung

Die Weitwinkel-Röntgenstreuung (WAXS) θ/2θ-Analyse wurde bei Raumtemperatur mit einem PANalytical X’Pert PRO MRD PW3040 (Almelo, Niederlande) unter Anwendung von Cu Kα-Strahlung durchgeführt. Die Proben wurden in einem Temperaturbereich von 2–60 °C mit einer Abtastrate von 5 °C/min getestet.

Transmissionselektronenmikroskop und Rasterelektronenmikroskop

Die Morphologie (d. h. Form und Größe) von HVD-NLCs wurde durch ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) unter Verwendung von (Philips CM12, Eindhoven, Niederlande) beobachtet. Ein Tropfen verdünnter HVD-NLCs-Dispersion wurde auf ein 400-Mesh-Kupfergitter gegeben, gefolgt von einer negativen Färbung mit 2% Phosphorwolframsäure. Die vorbereitete Probe wurde vor der TEM-Untersuchung luftgetrocknet.

Die Morphologie von lyophilisierten HVD-NLCs wurde unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops (REM) (Leo Supra 50 VP Field Emission SEM, Oberkochen, Deutschland) beobachtet. Die lyophilisierte HVD-NLCs-Probe wurde auf einem Aluminium-Stub fixiert und dann mit Gold (10 nm Dicke) in einer Sputtervorrichtung bei 15 mA für 15 Minuten beschichtet. Die Probe wurde mit einem energiedispersiven Röntgenmikroanalysesystem von Oxford INCA mit einer Beschleunigungsspannung von 10 kV visualisiert.

Zelluläre Aufnahme von HVD-NLCs

Die In-vitro-Studie zur zellulären Aufnahme von Verapamil aus der Formulierung von HVD-NLCs wurde unter Verwendung einer Caco-2-Zelllinie untersucht. Die Zellen wurden in DMEM-Wachstumsmedien, ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung und 10 % FBS, in einer T-25-Gewebekulturflasche kultiviert. Dann wurden die Caco-2-Zellen gesammelt und in 48-Well-Platten mit einer Zelldichte von 60.000 pro Well mit DMEM-Vollmedium ausgesät, bis die Zellen konfluent wurden und eine Monoschicht auf dem Boden der Well-Platte bildeten. Mehrere Lösungen mit der gleichen Konzentration an Verapamil wurden durch Verdünnen von HVD-NLCs, Verapamillösung und Verapamil-Dextran-Komplex nur mit DMEM-Medium hergestellt. Als Kontrollen dienten Verapamillösung und Verapamil-Dextran-Komplex. Anschließend wurden die DMEM-Komplettmedien von Caco-2-Zellen-Monolayer in 48-Well-Platten mit verschiedenen Verdünnungen von HVD-NLCs, Verapamil-Lösung und Verapamil-Dextran-Komplex ausgetauscht und 6 h bei 37 °C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit wurden die Proben der HVD-NLCs, der Verapamillösung und des Verapamil-Dextran-Komplexes aus den Vertiefungen entfernt. Der Rückstand der Testproben und toten Zellen wurden aus den Monolayern durch dreimaliges Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Die Zellen der Monolayer wurden durch Zugabe von passivem Lysepuffer (200 μl) in jede Probenvertiefung lysiert. Die Proben wurden abpipettiert und bei 12.000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert, um das Verapamil aus den Zellen zu extrahieren. Die Überstände wurden gesammelt und die Verapamilkonzentration wurde mittels HPLC quantifiziert.

Kurzfristige Stabilitätsstudie

Die Kurzzeitstabilitätsstudie der optimierten HVD-NLCs-Formulierung wurde gemäß den Richtlinien Q1A (R2) des International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human (ICH) durchgeführt. Die frisch zubereitete lyophilisierte HVD-NLCs-Formulierung (VER-9) wurde bei drei verschiedenen Bedingungen (5 ± 3 °C, 25 ± 2 °C/60 ± 5% relative Luftfeuchtigkeit (RH) und 40 ± 2 °C/75 . gelagert ± 5%RH) für 6 Monate. Die Stabilität der optimierten HVD-NLCs-Formulierung wurde durch Messung von PS, PDI, ZP und Gesamtarzneistoffgehalt nach 0, 1, 3 und 6 Monaten untersucht.

Statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert und gefolgt von einer post-hoc Tukey-HSD. Die statistische Analyse wurde mit der Software IBM® SPSS® Statistical (Version 22, NY, USA) durchgeführt. Alle Werte wurden als Mittelwert und Standardabweichung (Mittelwert ± ± SD) ausgedrückt. Der Unterschied war statistisch signifikant, wenn p < 0.05.

Ergebnisse und Diskussion

Analyse mit 2 ⁴ Vollfaktorielles Design

Die Werte der ausgewählten unabhängigen Variablen, dh Homogenisierungszeit (A), Festlipidkonzentration (B), Flüssiglipidkonzentration (C) und Tensidkonzentration (D) und die erhaltenen Ergebnisse der ausgewählten Antworten, dh PS, PDI , ZP und %EE sind in Tabelle 2 aufgeführt. Jede unabhängige Variable und ihre Wechselwirkungen wurden mithilfe der ANOVA statistisch ausgewertet. Der Polynomkoeffizient für jede abhängige Variable wurde von der Design-Expert®-Software generiert, um die Wirkung jeder unabhängigen Variablen zu quantifizieren, wie in Gl. 3, 4, 5 und 6. Die Gleichungen stellten nur die signifikanten Faktoren und ihre Wechselwirkungen dar.

wo A ist die Homogenisierungszeit (min), B ist die feste Lipidkonzentration (mg), C ist die flüssige Lipidkonzentration (mg) und D ist die Tensidkonzentration (mg). Die positiven und negativen Vorzeichen vor jedem Faktor oder Wechselwirkungsfaktor in den Gleichungen repräsentieren entweder einen synergistischen bzw. einen antagonistischen Effekt. Die Diagramme der Antwortoberflächen wurden erstellt, um die gleichzeitige Wirkung jedes Faktors oder der Faktorinteraktionen auf die Antwortparameter zu beobachten.

Auswirkungen von Variablen auf die mittlere Partikelgröße

Wie in Gl. 3, Faktoren A , C , und D antagonistische Wirkungen auf die Partikelgröße (PS) haben. Daraus konnte geschlossen werden, dass eine Erhöhung der Homogenisierungszeit (Faktor A ) ist gleichzeitig mit einer signifikanten Abnahme des PS von NLCs (p < 0,05). Dies ist wahrscheinlich auf die hohe Scherkraft der Homogenisierung zurückzuführen, die die Lipidkügelchen effizient in kleinere Partikel aufbricht. In ähnlicher Weise erhöht sich die Flüssigkeitslipidkonzentration (C ) verringert gleichzeitig den PS der NLCs. Dies könnte der Fähigkeit von Ölsäure zugeschrieben werden, die Viskosität des Systems sowie die Oberflächenspannung in Kombination mit Compritol 888 ATO® zu verringern, wodurch eine kleinere Partikelgröße von NLCs erzeugt wurde. Die Fähigkeit des flüssigen Lipids, die Viskosität des Systems zu verringern, wenn es mit dem festen Lipid kombiniert wird, wurde auch von Jenning et al. als sie eine SLN-Dispersion herstellten [5]. Die Autoren beobachteten, dass eine Erhöhung der Flüssigkeitslipidkonzentration von 0 auf 38% in der Lipidmatrixzusammensetzung die Partikelgröße verringern würde. Darüber hinaus erhöht sich die Tensidkonzentration (D ) würde den PS verringern, da eine höhere Menge an im System vorhandenem Tensid leicht den gesamten Lipidgehalt in der Formulierung emulgiert und somit kleinere Nanopartikel bildet.

Abbildung 2 zeigt die signifikanten (p < 0,05) Wirkung von Faktoren (AC, BD und CD) Wechselwirkungen auf den PS des NLC. Der positive Einfluss des Faktors (BD) und der negative Einfluss der Faktoren (AC- und CD-Wechselwirkung) zeigten einen signifikanten Einfluss auf die Partikelgröße der NLCs. Der negative Einfluss des Faktors (AC) zeigte, dass eine längere Homogenisierungszeit und eine höhere Flüssigkeitslipidkonzentration eine Abnahme des PS verursachten. Die Wechselwirkung zwischen höheren Konzentrationen an festem Lipid und Tensid in der NLC-Formulierung (BD-Wechselwirkung) zeigte einen signifikanten positiven Einfluss auf die Partikelgröße, was zu einer größeren Partikelgröße führte. Im Gegensatz dazu zeigte die Wechselwirkung zwischen höheren Konzentrationen des flüssigen Lipids und des Tensids (CD-Wechselwirkung) einen signifikanten negativen Einfluss auf die Partikelgröße, wenn eine kleinere Größe produziert wurde.

Response-Oberflächendiagramm, das die Signifikanz (p < 0.05) Einfluss der Homogenisierungszeit, der Flüssigkeitslipidkonzentration, der Tensidkonzentration und der Interaktion zwischen a AC, b BD und c CD auf dem PS von HVD-NLCs. A Homogenisierungszeit, B festes Lipid, C flüssiges Lipid, D Tensid

Auswirkungen von Variablen auf die PDI

Wie in Gl. 4 zeigt, dass Ölsäure einen negativen Einfluss auf den PDI hat, was bedeutet, dass eine steigende Ölsäurekonzentration die PDI-Werte senken und zu einer besseren Verteilung der NLC-Partikel führen würde. Eine ähnliche Wirkung von Ölsäure auf NLC wurde auch von einigen Untersuchungen beobachtet [6]. Abbildung 3 zeigt die Wechselwirkung zwischen der Homogenisierungszeit und der Flüssigkeitslipidkonzentration (AC-Wechselwirkung). Diese Interaktion zeigte einen signifikant negativen Effekt auf den PDI. Dies bedeutet, dass eine längere Homogenisierungszeit und eine höhere Flüssigkeitslipidkonzentration zu einer Abnahme der PDI-Werte führen würden. Darüber hinaus zeigte die Wechselwirkung zwischen den flüssigen Lipid- und Tensidkonzentrationen (CD-Wechselwirkung) einen synergistischen Effekt auf die PDI-Werte. Somit würde eine gleichzeitige Erhöhung der flüssigen Lipid- und Tensidkonzentrationen die PDI-Werte erhöhen und weniger homogene HVD-NLCs-Partikel erzeugen. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass eine weitere Erhöhung der Tensidkonzentration über den optimierten Wert hinaus eine Ansammlung des Tensids an den äußeren Oberflächen der Nanopartikel verursachen kann, was wiederum die PDI-Werte erhöht. Das gleiche Muster wurde auch von Shamma et al. beobachtet, wobei eine Erhöhung der Tensidkonzentration zu einem Anstieg der PDI-Werte von NLCs führte [7].

Response-Oberflächendiagramm, das die signifikanten (p < 0.05) Wirkung der Flüssigkeitslipidkonzentration und Wechselwirkungen zwischen a AC und b CD auf PDI von HVD-NLCs. A Homogenisierungszeit, C flüssiges Lipid, D Tensid

Auswirkungen von Variablen auf ZP

Die HVD-NLCs-Formulierungen hatten die negative Ladung aufgrund der Ionisierung von Glycerylbehenat (eine Fettsäure in Compritol 888 ATO®), Ölsäure und Dextransulfat-Rest. Basierend auf Gl. 5, hatte eine Erhöhung der Ölsäuremenge einen negativen Einfluss auf die Nanopartikel und führte zu einer Erhöhung der negativen Ladung der Nanopartikel, wodurch ZP von HVD-NLCs erhöht wurde. Dies ist möglicherweise auf eine übermäßige Ionisierung der reichlich vorhandenen Carboxylgruppen in der Ölsäure (flüssiges Lipid) zurückzuführen [8]. Darüber hinaus zeigte Glycerylbehenat (festes Lipid) auch einen negativen Einfluss auf die ZP-Werte, wobei eine Erhöhung seiner Konzentration den ZP von Nanopartikeln erhöht. Dies ist auf eine höhere Ionisierung von Carbonsäuren im Glycerylbehenat zurückzuführen, die zu höheren negativen Ladungen an der äußeren Oberfläche der Nanopartikel führt.

Die BD-Interaktion hatte einen signifikanten positiven Effekt auf die ZP von NLCs, während die CD-Interaktion einen negativen Effekt zeigte (Abb. 4). Eine Erhöhung der Konzentration an festem Lipid und eine Verringerung der Konzentration des Tensids verringert die negative Ladung der Nanopartikel und verringert die ZP-Werte. Wahrscheinlich wäre zu diesem Zeitpunkt eine niedrigere Tensidkonzentration nicht in der Lage, die Gesamtmenge an festem Lipid zu ionisieren, was zu einer Verringerung der negativen Ladungen auf der Nanopartikeloberfläche und damit zur Verringerung des ZP von HVD-NLCs führen würde. Darüber hinaus würde eine gleichzeitige Erhöhung der Konzentration von flüssigem Lipid und Tensid (CD-Wechselwirkung) den ZP-Wert von HVD-NLCs signifikant erhöhen. Dies liegt daran, dass in Gegenwart einer höheren Tensidkonzentration in der Formulierung mehr Carbonsäure ionisiert würde.

Response-Oberflächendiagramm, das die signifikanten (p < 0,05) Wirkung der Flüssigkeitslipidkonzentration, Tensidkonzentration und Wechselwirkungen zwischen a BD und b CD im ZP von HVD-NLCs. B festes Lipid, C flüssiges Lipid, D Tensid

Auswirkungen von Variablen auf %EE

Gleichung 6 zeigte, dass eine Erhöhung der Homogenisierungszeit signifikant (p < 0,05) verringern den %EE des Arzneimittels. Eine längere Homogenisierungszeit könnte die an der äußeren Oberfläche der Nanopartikel haftenden Wirkstoffmoleküle ablösen oder ablösen, was zu einem niedrigeren %EE des Wirkstoffs in den HVD-NLCs führte. Im Gegensatz dazu führte eine Erhöhung der Tensidkonzentration zu einem höheren %EE des Wirkstoffs in den HVD-NLCs. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass eine höhere Tensidkonzentration die äußere Oberflächenbeschichtung von NLCs erhöhen würde, in denen ein Teil des Arzneimittels darin eingeschlossen wäre. Zhuanget al. und Daset al. schlugen vor, dass eine angemessene Tensidkonzentration für die Solubilisierung von Wirkstoffmolekülen innerhalb des Lipidgitters und an der äußeren Oberfläche von Nanopartikeln unerlässlich ist [9, 10].

Wie in Abb. 5 gezeigt, hatte die AD-Interaktion eine signifikante (p < 0,05) negative Auswirkung, wobei eine Erhöhung der Homogenisierungszeit und eine Verringerung der Tensidmenge den %EE des Arzneimittels in den HVD-NLCs senkt. Im Gegensatz dazu zeigte die Wechselwirkung zwischen festen Lipid- und Tensidkonzentrationen (BD-Wechselwirkung) einen positiven Effekt auf %EE des Arzneimittels. Daher erhöht eine Erhöhung der Konzentration von festem Lipid und Tensid den %EE des Arzneimittels in den HVD-NLCs. Dies ist wahrscheinlich auf die höhere Tensidkonzentration zurückzuführen, die die überschüssigen Wirkstoffmoleküle solubilisieren würde, und gleichzeitig hat eine höhere Menge an festem Lipid im System die überschüssigen Wirkstoffmoleküle aufgenommen, wodurch der %EE des Wirkstoffs im HVD erhöht wird. NLCs.

Response-Oberflächendiagramm, das die signifikanten (p < 0.05) Einfluss von Homogenisierungszeit, Flüssigkeitslipidkonzentration, Tensidkonzentration und Wechselwirkungen zwischen a AD und b BD auf EE von Verapamil bei HVD-NLCs. A Homogenisierungszeit, B festes Lipid, D Tensid

Auswahl optimierter HVD-NLCs unter Verwendung der Desirability-Funktion

Die HVD-NLCs-Formulierungen mit den Code-Nr. VER-9, VER-11, VER-13 und VER-15 hatten höhere Erwünschtheitswerte von 0,863, 0,852, 0,811 bzw. 0,840. Diese Formulierungen wurden für weitere Studien ausgewählt, da die Erwünschtheitswerte näher an 1 lagen. Die individuelle und kombinierte Erwünschtheitsfunktion aller Antworten für die ausgewählten Formulierungen ist in Abb. 6 dargestellt. Die mittleren PS, PDI, ZP und %EE davon Formulierungen lagen im Bereich von 173,46 ± 0,757 bis 190,3 ± 8,22, 0,451 ± 0,033 bis 0,501 ± 0,019, -  46,73 ± ± 1,13 bis -  49,16 ±   1,55 bzw. 93,95 ± ± 4,10 bis 98,81 ± ± 1,01.

Bar graph displaying the individual and combined desirability of several responses on selected HVD-NLCs formulations. a VER-9, b VER-11, c VER-13, and d VER-15

Lyophilization Study

Lyophilization is one of the commonly used methods in the pharmaceutical field to change aqueous formulation into the dried form to prolong the physical and chemical stability of the nanoparticle during storage [11, 12]. However, the lyophilization step produces various stresses to the sample during the process. So, the need of cryoprotectant is essential to avoid the stress condition and protect the sample. Among the screened cryoprotectants, trehalose was found to be the most suitable one for protecting the HVD-NLCs formulations from aggregation after the lyophilization process. The HVD-NLCs formulations protected with trehalose had the smallest particle size and lowest PDI (Table 3). Trehalose offers many advantages over other cryoprotectants including less chemical interactions and exhibit higher glass transition temperature which may help to prolong the stability of nanoparticles. Furthermore, trehalose has been demonstrated as an efficient cryoprotectant for freeze drying of Compritol 888 ATO® (Glyceryl behenate) in the lipid-based nanoparticles [13, 14]. Thus, in the present study, trehalose was selected as cryoprotectant for the HVD-NLCs formulations.

In the next study, different ratios of trehalose were used in the HVD-NLCs formulations after or during the homogenization process. Table 4 shows the effects of different ratios of trehalose added into the formulations after homogenization on PS, PDI, and %EE.

The mean PS was found in the nano size range, while PDI was < 1 in all ratios of lipids to trehalose used in the study. However, the %EE of verapamil was decreased significantly with increasing the ratio of trehalose to lipids. The %EE of lipid:trehalose at the ratio of 1:1 was significantly higher than the lipid:trehalose ratio of> 1:1. Increasing the amount of trehalose beyond the lipid trehalose ratio of 1:1 enhanced the removal of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex. This is possibly due to the interaction between trehalose and dextran at the outer surface of nanoparticles, which promotes the displacement of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex and hence, lowers the %EE of drug in the HVD-NLCs. The interaction between trehalose and dextran takes place due to the formation of sugar-salt complex (trehalose-dextran complex), in that the trehalose (sugar) competes with cationic verapamil and forms complex with polyanionic dextran [15]. Miller et al. measured the viscosity and glass transition temperature of trehalose with boric acid and proposed the formation of chemical complex between trehalose and borate ion (B(OH)₄ ⁻ ) [15]. Therefore, based on the obtained results, the lipid to trehalose ratios of 1:1 and 1:2 were selected for the next study of trehalose addition during homogenization. Table 5 shows that the results of PS, PDI, and %EE were significantly better when trehalose were added during homogenization. This could be due to better mixing of trehalose in the HVD-NLCs formulation by the homogenization process. It is evident from the data that there was no significant difference in the %EE of lipid:trehalose ratios of 1:1 and 1:2. Therefore, formulation VER-9 and VER-11 at lipid:trehalose ratio of 1:1 was selected for further studies.

In Vitro Release of HVD-NLCs

The release profile of verapamil solution from the selected HVD-NLCs formulations (VER-9 and VER-11) in SGF and SIF are shown in Fig. 7. The release profile of verapamil from the VER-9 and VER-11 formulations was significantly longer than verapamil solution in both SGF and SIF media. Verapamil was loaded as an ionic complex with dextran sulfate in the HVD-NLCs formulation. This could be the reason for the sustained release of verapamil from the HVD-NLCS. The formulations released about ~ 85% of verapamil after 48 h and the drug had a prolonged release profile up to 72 h. On the other hand, the verapamil solution released approximately 99% of verapamil within 4 h. The release profiles of the selected formulations VER-9 and VER-11 were found almost similar in SGF and SIF release media. However, the release of verapamil from VER-9 was found slightly better as compared to VER-11 in the SGF release medium. The percentage cumulative release of verapamil at 72 h from VER-9 (95.91 ± 1.40) was found significantly higher as compared to VER-11 (90.67 ± 1.16) in the SGF medium. Therefore, VER-9 was selected as a final formulation and proceeded for further investigations.

Cumulative percentage of verapamil released in a SIF (pH 6.8) and b SGF (pH 1.2) release media for 72 h

DSC Study

The DSC analysis of verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, physical mixture (including Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), lyophilized blank formulation (Placebo), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 8. Verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, and trehalose had the melting peak at 144.96 °C, 220.41 °C, 72.46 °C, 50.80 °C, and 100.13 °C, respectively. The thermograms showed that there was no significant shift in the peaks of physical mixture, lyophilized blank formulation, and HVD-NLCs formulation (VER-9) when compared to the individual peak components such as Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate. This indicated the physical compatibility between the components. The endothermic peak of verapamil at 144.96 °C was no longer seen in the thermogram of HVD-NLCs formulation (VER-9) (Fig. 8f), which could be due to verapamil that had changed to amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs matrix [16].

DSC thermograms of a Compritol 888 ATO, b Polomxamer 188, c verapamil HCl, d dextran sulfate, e trehalose, f verapamil HCl and dextran sulfate physical mixture, g physical mixture (including Compritol 888 ATO, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), h placebo, and i HVD-NLCs formulation (VER-9)

WAXS Study

The WAXS/2θ scans of pure verapamil, dextran sulfate, bulk Compritol 888 ATO®, trehalose, lyophilized blank formulation (containing Compritol 888 ATO®, oleic acid, poloxamer 188, Tween 80®, trehalose, and dextran sulfate), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 9. The diffraction peaks of pure verapamil showed specific crystalline nature of the drug at 2θ scattered angles 14.42°, 16.67°, 17.07°, 18.07°, 18.82°, 20.22°, 23.77°, and 26.27° [17]. However, the WAXS/2θ scans of HVD-NLCs formulation (VER-9) showed that the peaks of verapamil diminished indicating a decrease in the crystallinity of the drug when incorporated in the lipids of HVD-NLCs. The scan also showed the predominant peaks at 2θ scattered angles 12.47°, 15.17°, 16.87°, 21.07°, and 23.82° which possibly attributed to the crystalline structure of Compritol 888 ATO® and trehalose because none of these peaks showed similarity with any of the pure verapamil peaks [10]. The results suggested that verapamil was in the amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs formulation. The Compritol 888 ATO® revealed polymorphic crystalline transformation upon heating, whereby it changed to a more stable form, and showed reduced intensity peaks at 21.1° and 23.3° in the HVD-NLCs and blank formulations. The WAXS pattern of pure dextran sulfate indicated its amorphous form.

X-ray patterns of a lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9), b lyophilized blank formulation, c trehalose, d dextran sulfate, e verapamil HCl, and f Compritol 888 ATO

Electron Microscopic Examinations

The particle shape and size of the HVD-NLCs formulation (VER-9) were examined using the electron microscope. The liquid preparation of HVD-NLCs formulation (VER-9) observed under transmission electron microscope (TEM) showed that the particles had a spherical shape with the size less than 200 nm (Fig. 10). In contrast, observation under scanning electron microscope (SEM) revealed that the nanoparticles no longer had a spherical shape following lyophilization of the formulation without trehalose. However, the cryoprotective effect of trehalose could be seen when it was incorporated in the HVD-NLCs formulation (VER-9). The SEM image indicated that the trehalose helped to protect the structure of the nanoparticle to such extent when compared to the lyophilized formulation without the cryoprotectant (Fig. 11).

TEM image of VER-9 before lyophilization

SEM images of VER-9 formulation a without trehalose; b with trehalose

Cellular Uptake Study of HVD-NLCs

Caco-2 cells have been extensively used to study drugs intestinal cellular uptake [18]. The Caco-2 cells lines is spontaneously differentiating to form monolayer which has significant morphological and biological resemblance to the intestinal epithelium [19]. Several researchers have reported the in vitro cytotoxicity studies of Compritol ATO 888® [20], oleic acid [21, 22], Tween 80® [23, 24], and poloxamer 188 [25]. These substances were used as excipients in the optimized formulation of HVD-NLCs (VER-9). Based on their finding, these excipients were safe within the concentration used, the cell line type, and cell density that have been employed in the present study. The concentration of verapamil in the samples of VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex used in the cellular uptake study was in the range of 10.03 μg/200 μL to 30.1 μg/200 μL. It was found that the verapamil cellular uptake was increased with increasing the verapamil concentration in the samples. The cellular uptake values of verapamil from VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex were increased from 6.45 ± 2.62 to 15.92 ± 4.78 μg, 0.89 ± 0.28 to 1.46 ± 0.65 μg, and 0.064 ± 0.019 to 0.118 ± 0.003 μg, respectively (Fig. 12). The verapamil cellular uptake from the VER-9 formulation was 10.90- and 134.91-fold higher than the verapamil solution and verapamil-dextran complex, respectively. The results indicated that verapamil was passively transported from HVD-NLCs, verapamil solution, and verapamil-dextran complex in the caco2-cells. A similar finding of higher cellular uptake of drugs from a lipid-based nanoformulation was reported [26].

In vitro model of Caco-2 cell line showing cellular uptake of HVD-NLCs (VER-9), verapamil solution, and verapamil-dextran complex (mean ± SD, n  = 3)

Caco-2 cells act similarly as cell in animals when stimulated by fatty acid. van Greevenbroek et al. suggested that the incorporation of long-chain unsaturated fatty acids (e.g., oleic acid and linoleic acid) into the Caco-2 cells stimulate the secretion of very low-density lipoproteins (VLDL) and chylomicrons. In contrast, administration of saturated fatty acids primarily secretes intermediate- and low-density lipoproteins (IDL and LDL) [27]. Similar findings of increasing chylomicron secretion by the long-chain fatty acids were also reported by Caliph et al. in animal model [28]. In the present investigation, the long-chain fatty acids (Compritol 888 ATO® and oleic acid) used in the preparation of the HVD-NLCs may also stimulate the secretion of chylomicron, and hence increase the cellular uptake of the model drug.

Stability Study

The lyophilized VER-9 formulation was found stable for 6 months at refrigerated condition (5 ± 3 °C) (Table 6). There were no significant differences in the PS, PDI, ZP, and %EE after 6 months of stability study at storage temperature of 5 ± 3 °C. However, the VER-9 formulation was not stable after 1-month storage at the temperatures of 25 ± 2 °C/60 ± 5%RH and 40 ± 2 °C/75 ± 5% RH. The PS and PDI were increased significantly, while the total drug content decreased significantly. After 1 month of stability study, the samples were not measurable due to aggregation and sticky behavior of the nanoparticles.

Conclusion

The lyophilized HVD-NLCs formulation was successfully developed and optimized. The lipid carriers had prolonged the release of verapamil from the HVD-NLCs formulation. The formulation was in the nano size range and stable for 6 months at 5 ± 3 °C. The cellular uptake of verapamil lipid formulation (NLCs) was found higher than the non-lipid formulations. This suggested that the NLCs as a lipid carrier for verapamil may play an important role in improving the absorption of the drug.

Abkürzungen

%EE:

Percentage of entrapment efficiency

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagles medium

DSC:

Differenzkalorimetrie

FBS:

Fötales Rinderserum

HVD-NLCs:

Hybrid verapamil-dextran nanostructured lipid carriers

ICH:

The international council for harmonization of technical requirements for pharmaceuticals for human

IDL:

Intermediate density lipoproteins

LDL:

Low density lipoproteins

NLCs:

Nanostructured lipid carriers

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PDI:

Polydispersity index

PS:

Particle size

RH:

Relative humidity

SEM:

Rasterelektronenmikroskop

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

VLDL:

Very low-density lipoproteins

WAXS:

Wide-angle X-ray scattering

ZP:

Zeta potential