Wachsende Gold-Nanostrukturen für die formselektive Zellaufnahme

Hintergrund

Goldnanostrukturen (NSs) werden aufgrund ihrer form- und größenabhängigen optischen und elektronischen Eigenschaften in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen eingesetzt [1]. Au-NSs zeigen modifizierbare und umweltempfindliche lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) [2]. Au-LSPR im sichtbaren Bereich macht sie zu geeigneten Kandidaten für Biosensoren und gute Kontrastmittel für die Computertomographie (CT) [3, 4] sowie die photoakustische Bildgebung [5]. NS mit noch höheren Aspektverhältnissen (ARs, definiert als das Verhältnis von longitudinaler zu transversaler Dimension) streuen Licht effizienter bei der longitudinalen Plasmonenwellenlänge und können daher bei optischen Bildgebungsanwendungen besser abschneiden als sphärische NPs. Kleinere NS haben eine verbesserte Absorptionseffizienz, was zu einer verbesserten Effizienz in der photothermischen Therapie führt [6,7,8,9]. Außerdem wurden kürzlich anisotrope Strukturen verwendet, um selbstorganisierte Strukturen mit überlegenen plasmonischen Eigenschaften zu bilden, die aus einer effizienten Löschung, extrem hohen molaren Absorptionsvermögen und der Entwicklung hoch lokalisierter und intensiver elektromagnetischer Felder resultieren [10,11,12,13]. Durch die Möglichkeit, das Seitenverhältnis und die Größe von Au-NSs abzustimmen, können verschiedene Strukturen synthetisiert werden, um verschiedene Anwendungen abzudecken, darunter unter anderem lokalisiertes Erhitzen, Erfassen, Einkapseln und Freisetzen von Zielmolekülen [14,15,16].

Au-NSs werden typischerweise durch Elektrotemplatierung [17], photochemische Reduktionsverfahren [18] oder Impfwachstum – mit oder ohne Ag [19, 20] synthetisiert. In den letzten Jahren wurde die Saatwachstumssynthese weiteren Modifikationen unterzogen, indem organische Additive oder binäre Tensidmischungen verwendet wurden, um die Kontrolle über das NS-Wachstum zu ermöglichen [21,22,23,24,25]. Die verwendeten Synthesebedingungen ermöglichen es, die Eigenschaften der Au-NSs durch Abstimmung ihrer Größe und Form anzupassen, wodurch die Streu- und Absorptionsquerschnitte der NSs verändert werden. Wenn NSs in eine biologische Umgebung eingebracht werden, spielen die physiochemischen Eigenschaften dieser Au-NSs (Größe, Form und Oberflächenchemie) eine entscheidende Rolle bei der zellulären Aufnahme, d. h. der Nanopartikel-Zell-Interaktion. Das Verständnis dieser Wechselwirkung ist für die Erforschung neuer biomedizinischer Anwendungen unter Nutzung unterschiedlich geformter Au-NSs unerlässlich [26,27,28,29,30]. Au-Nanostäbchen können beispielsweise verwendet werden, um eine Zellhyperthermie in Krebszellen zu induzieren, mit der Möglichkeit, Zellfunktionen zu stören und in einigen Fällen durch Oberflächenmodifikation der Stäbchen zu verändern [30,31,32,33,34]. Chenet al. haben berichtet, dass Au-Nanokäfige zur gezielten photothermischen Zerstörung von Brustkrebszellen verwendet werden können [35]. Neuere Berichte haben auch gezeigt, dass die Form von Nanopartikeln für die zelluläre Aufnahme gleich oder wichtiger sein kann als die Größe [36, 37]. Dies erfordert das Screening mehrerer Formen (d. h. die Wechselwirkung von Au-NSs verschiedener Formen mit Zellen) unter ansonsten identischen Bedingungen, die für die Beschreibung in vitro wichtig sind. Unseres Wissens existiert keine umfassende Studie, die die Wechselwirkung von Au-NSs anderer Formen als Kugeln und Nanostäbchen mit der Zelle untersucht [38, 39].

Hier untersuchen wir die Interaktionen von fünf unterschiedlich geformten Au-NSs mit Glioblastom-Astrozytom-Zellen und deren zelluläre Aufnahme. Glioblastoma multiforme (GBM) gilt als einer der aggressivsten bösartigen Hirntumoren des Menschen. Patienten mit GBM haben eine düstere Prognose mit einer mittleren Überlebenszeit von weniger als 15 Monaten mit Chemotherapie und Standardbehandlung [40, 41]. Glioblastom-Astrozytome sind nicht nur aus medizinischer Sicht, sondern auch wegen ihres schnellen Wachstums für Aufnahmestudien besonders interessant. Zellkulturen von Glioblastom-Astrozytom haben eine Populationsverdopplungszeit von 32 h und benötigen ständig extrazelluläre Nährstoffe. Aus diesem Grund verschlingen sie mit hoher Wahrscheinlichkeit schnell Fremdkörper wie Au-NSs, die sich beispielsweise für die hyperthermische Tumorablation [42], die Zellmarkierung oder die Wirkstoffabgabe öffnen.

In der vorliegenden Arbeit wurden fünf verschiedene Formen von Au-NSs synthetisiert:vier anisotrope NSs (Nanorods––NRs, nanomakura–– NM, Tetrahexaeder––THH, Bipyramiden––BPs) durch einen keimvermittelten Wachstumsansatz mit binären Tensidmischungen und sphärischen (SP) Partikeln mit einer modifizierten Turkevich-Methode [43]. Die Form von NSs kann durch Variieren des Verhältnisses von zwei verschiedenen Tensiden maßgeschneidert werden. Wenn ein zweistufiges keimvermitteltes Wachstumsprotokoll befolgt wurde, wurde Au nanomakura (Makura ist japanisch für Kissen ) synthetisiert. Eine zweistufige Oberflächenmodifikation wurde durchgeführt, um den passivierenden Liganden durch 11-Mercaptoundecansäure (MUA) zu ersetzen, bevor die Au-NSs mit Glioblastom-Astrozytom-Zellen co-inkubiert wurden. Die Auswirkungen von Form und Konzentration auf Zytotoxizität und Aufnahme von NS in Glioblastom-Astrozytom-Zellen wurden untersucht.

Experimentell

Materialien

Ölsäure (OA, 90%) wurde von Alfa Aesar bezogen. Silbernitrat (AgNO₃ .) ), Didecyldimethylammoniumbromid (DDAB, 98%), Chlorgoldsäure (HAuCl₄ .3H₂ O, 99,999%), D-(−)-Isoascorbinsäure (AsA, 98%), Natriumborhydrid (NaBH_4, ≥  96 %), 11-Mercaptoundecansäure (MUA, 98 %) und O-[2-(3-Mercaptopropionylamino)-ethyl]-O-ethylpolyethylenglykol (PEG-SH) mit einem Molekulargewicht von 5000 Da wurden von Sigma-Aldrich bezogen . Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB, 99%+) wurde von Acros Organics und Natriumcitratdihydrat (Na-Citrat, ACS-Qualität) von Merck bezogen. Alle Chemikalien wurden wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet. Alle Lösungen wurden mit destilliertem entionisiertem Wasser (Widerstand ~ 18,2 μΩ-cm) hergestellt, das mit dem Simplicity® Millipore-Wasserreinigungssystem gereinigt wurde.

Synthese von anisotropem Au

Anisotrope Au-NSs wurden mithilfe einer Ag-unterstützten Saatwachstumsmethode unter Verwendung binärer Tenside synthetisiert (Tabelle 1). Abbildung 1a zeigt eine schematische Darstellung der Synthesemethode für das Wachstum von NRs, THH und BPs.

Schemata der Synthese von Au-NSs. a Schematische Darstellung des Ag-unterstützten Impfwachstumsmechanismus, der für die Synthese verschiedener Formen von Au-NSs verwendet wird. b Schema, das einen zweisamen Wachstumsmechanismus für NanoMakura . zeigt

Kurz gesagt, 5 ml 0,5 mM HAuCl₄ .3H₂ 0 wurde zuerst mit 5 ml 0,2 M CTAB-Lösung gemischt und rühren gelassen. Danach 1,6 ml 3,75 mM NaBH₄ wurde zu der Mischung gegeben und 2 min unter Rühren reagieren gelassen, um das Entweichen des während der Reaktion gebildeten Gases zu ermöglichen. Die Saatlösung wurde nach 30 Minuten Wartezeit für das weitere Wachstum verwendet.

In einer typischen Wachstumsreaktion wurden 15 ml einer wässrigen Mischung aus CTAB und Cotensid in verschiedenen Verhältnissen bei 80 °C hergestellt, wie in Tabelle 1 angegeben. Nach dem Abkühlen der Tensidlösung auf Raumtemperatur wurden 750 μl einer 4 mM-Lösung von AgNO ₃ wurde zugegeben und 15 min bei 35 °C rühren gelassen. Anschließend wurden 15 ml 1 mM HAuCl₄ . zugegeben .3H₂ O-Lösung gewaschen und weitere 15 Minuten unter Rühren mischen gelassen. Danach wurden 135 μl 0,063 M AsA und 96 μl Au-Keime zugegeben und die Reaktion 24 h bei 35 °C durchgeführt. Die Produkte wurden mittels Zentrifugation getrennt. Es ist wichtig zu beachten, dass sich im Fall von OA die anfängliche gelbe Farbe der Wachstumslösung innerhalb von 15 Minuten (vor der Zugabe von Saat) entlädt, was auf die Verringerung von Au ³⁺ . hinweist zu Au ⁺ . Abbildung 1b zeigt das Schema für die Synthese des NM, das auf einem zweisamen Wachstumsansatz basiert. Das befolgte Protokoll ist ähnlich wie oben beschrieben, mit Ausnahme der Zugabe einer Zwischenwachstumslösung (300 μL) (erhalten fast unmittelbar nach der Zugabe von Au-Keimen zur ersten Wachstumslösung) anstelle der regulären Impfkristalle zu einer frischen Wachstumslösung und Ermöglichen der Reaktion für 24 h bei 35 °C fortsetzen.

Synthese von kugelförmigen Au-NSs

Sphärische Au-NSs wurden mit einer modifizierten Turkevich-Methode synthetisiert [44]. Bei einer typischen Synthese wurden 10 ml einer 10 mM Natriumcitratlösung in einen 25 ml-Reaktionskolben gegeben, der bei 70 °C gehalten wurde. Zehn Milliliter 1,5 mM Chlorgoldsäure (HAuCl₄ .) . 3H₂ O) wurde tropfenweise zugegeben und 20 min unter kräftigem Rühren bei 70 °C reagieren gelassen. Die Lösung wurde etwa 8 Minuten nach der Reaktion violettrot. Danach wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und kugelförmige Au-NSs wurden von der nicht umgesetzten Lösung durch Zentrifugation bei 14.500 U/min für 10 Minuten abgetrennt.

Oberflächenfunktionalisierung von Au-NSs

Um die Liganden auf der Oberfläche der Au-NSs auszutauschen, wurde ein zweistufiges Verfahren adaptiert und modifiziert von Thierry et al. [45] folgte. Die Konzentrationen der so synthetisierten NS wurden auf 1 mg ml ⁻¹ . eingestellt vor Beginn der Funktionalisierungsschritte. Der erste Schritt hängt von der Einführung einer PEG-SH-Schicht ab, um die gebundene CTAB-Doppelschicht teilweise zu ersetzen, da Thiol eine größere Affinität zur Au-Oberfläche hat [46]. Außerdem sorgt eine PEG-SH-Schicht für eine sterische Stabilisierung des NS. Im zweiten Schritt wird das restliche CTAB ersetzt und die PEG-SH-Schicht wird weiter mit Alkanthiol, MUA, ausgetauscht. MUA ermöglicht eine vollständige Entfernung von CTAB von sterisch gehinderten PEG-SH-beschichteten Au-Oberflächen.

In einem typischen Funktionalisierungsverfahren 1 ml von 1 mg ml ⁻¹ Lösung des Au NS wurde mit 1 ml von 1 mg ml ⁻¹ . gemischt Lösung der PEG-SH-Lösung. Die gemischte Lösung wurde unter kräftigem Rühren gehalten, um den teilweisen Ersatz von CTAB durch PEG-SH für 2 h zu ermöglichen. Danach wurden PEGylierte NS durch Zentrifugation bei 14.500 U/min für 20 Minuten entfernt und in 1 ml MQ-Wasser redispergiert. Um die Au-NSs mit Carbonsäuregruppen zu funktionalisieren, wurden 500 μL der PEGylierten NS-Lösung mit 250 μL einer 10 mM-Lösung von MUA, hergestellt in Ethanol/Wasser, vermischt und in einem bei 55 °C gehaltenen Ultraschallbad 1 h lang reagieren gelassen . Danach wurden die MUA-beschichteten Au-NSs durch 20-minütige Zentrifugation bei 14.500 U/min vom freien MUA getrennt. MUA-beschichtete Au-NSs ließen sich leicht in MQ-Wasser redispergieren.

In-vitro-Studien

Glioblastom-Astrozytom-Zellkultur

Humane Glioblastom-Astrozytom-Zellen (U-87 MG, ECACC, Sigma-Aldrich, Salisbury, UK) wurden in Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) mit 1,25% Gentamicin (Sigma) und 10% fötalem Rinderserum (Autogen Bioclear, Wiltshire, VEREINIGTES KÖNIGREICH). Die Kulturen wurden mit 2 mM L-Glutamin, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, Sigma) und 1 mM Natriumpyruvat (NaP, Sigma) ergänzt.

LIVE/DEAD® Assay

Ein LIVE/DEAD-cell Viability Assay (Invitrogen, Life Technologies) bewertet die Membranintegrität von Zellen und besteht aus zwei verschiedenen Farbstoffen:Calcein AM (Anregung/Emission 494/517 nm) und Ethidium Homodimer-1 (Anregung/Emission 517/617 .). nm). In lebenden Zellen reagieren intrazelluläre Esterasen mit Calcein AM und erzeugen eine zytoplasmatische grüne Fluoreszenz. Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) diffundiert über beschädigte Zellmembranen toter Zellen, wo es an Nukleinsäuren bindet und rote Fluoreszenz emittiert. Nach der Markierung mit NSs wurde die Lebensfähigkeit von LIVE/DEAD®-Zellen an Glioblastom-Astrozytom-Zellen wie vom Hersteller beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, eine LIVE/DEAD®-Lösung wurde in 4,5 ml PBS mit 2,7 μl Calcein (Invitrogen) hergestellt und 12 μl Ethidiumhomodimer (Invitrogen) wurden im Verhältnis 1:1 (v /v )-Verhältnis und vor dem Mikroskopieren 30 min bei 37 °C reagieren gelassen. Eine Kernfärbung (Hoechst 33258, Anregung/Emission 356/465 nm, Sigma) wurde hinzugefügt (200 μg mL ⁻¹ ), um den Kern sichtbar zu machen und die Aufnahme von Au NS in den Kern aufzuklären. Die Bildgebung erfolgte auf einem Axiovert 200 M-Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Deutschland) mit einer Vergrößerung von × 40 oder × 10 unter Verwendung von AxioVision Rel. 4.3 Software. Bilder wurden später mit ImageJ 1.46 bearbeitet.

Beurteilung der Zelltoxizität anhand der Konzentration

Zellen mit 70 % Konfluenz wurden mit Au-NS in Konzentrationen von NS/Medienvolumen von 100 μg ml ⁻¹ . markiert , 200 μg ml ⁻¹ , 500 μg ml ⁻¹ , und 2 mg ml ⁻¹ und bei 37 °C für 24 h in 9-Well-Platten (Corning®) inkubiert. Für jede Konzentration wurden drei Parallelen (Wells) hergestellt. Als Kontrollen wurden unmarkierte Glioblastom-Astrozytom-Kulturen im gleichen Konfluenzstadium verwendet. Die Prozentsätze an toten Zellen wurden durch manuelles Zählen berechnet. Die stark ungeordnete Morphologie von Glioblastom-Astrozytom-Zellen macht die automatisierte Zählung weniger zuverlässig. Drei überlagerte Bilder von lebenden und toten Zellen wurden in jeder Vertiefung aufgenommen, und die durchschnittlichen lebenden und toten Zellen wurden für jede Form berechnet. Dasselbe wurde für die Blindprobe durchgeführt und die Lebensfähigkeit wurde durch Subtrahieren der durchschnittlichen Tot-/Lebensdauer der Blindprobe bewertet.

Beurteilung der zellulären Aufnahme als Funktion der Zeit für NanoMakura Au NS

Zellen mit 70 % Konfluenz wurden mit nanomakura . markiert Au NS bei Konzentrationen von NS/Medienvolumen von 2 mg ml ⁻¹ und inkubiert bei 37 °C für 2, 6, 12 und 24 h vor dem LIVE/DEAD®-Assay mit Kernfärbung. Als Kontrollen wurden unmarkierte Glioblastom-Astrozytom-Kulturen im gleichen Konfluenzstadium verwendet. Zellpellets wurden für TEM durch Trypsinierung und Zentrifugation vor der primären Fixierung in Paraformaldehyd (2 % v /v ) und Glutaraldehyd (2,5% v /v ) in PBS (0,1 M, pH = 7,4) über Nacht. Zur sekundären Fixierung wurden zwei verschiedene Fixiermittel zur optimalen Anfärbung intrazellulärer Membranen hergestellt. Beide wurden in 0,1 M Kakodylatpuffer hergestellt, einer mit 1 % Osmiumtetroxid (v /v ) und das andere mit 1 % Osmiumtetroxid (v /v ) und 1,5 % Kaliumferrocyanid (v /v ). Eine Stunde nach der sekundären Fixierung bei Raumtemperatur wurde eine schrittweise Dehydratisierung mit Alkohol durchgeführt, bevor die Dehydration mit Propylenoxid, Infiltration und Ultramikrotomschnitt von 70 nm-Scheiben durchgeführt wurde.

Charakterisierungstechniken

Hellfeld-(BF)-STEM-Bilder wurden mit einem Hitachi S-5500-Elektronenmikroskop aufgenommen, das bei einer Beschleunigungsspannung von 30 kV betrieben wurde. Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie(HRTEM)-Bilder wurden mit JEOL 2100 bei 200 kV aufgenommen. Die Größenverteilungen und Zetapotentiale der NS wurden mit einem Malvern Zetasizer Nano-ZS Instrument und der herstellereigenen Software gemessen. Messungen der dynamischen Lichtstreuung (DLS) basieren auf der Annahme sphärischer Partikel und sind nicht für die Messung der hydrodynamischen Größen anisotroper NSs ohne einen Mehrwinkelaufbau und eine rigorose Anpassung der resultierenden Daten geeignet. DLS wurde in dieser Studie jedoch als Mittel verwendet, um Größenänderungen, die aus dem Funktionalisierungsverfahren resultieren, qualitativ zu verfolgen. Als Lösungsmittel wurde in allen Fällen MQ-Wasser verwendet. Ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektren wurden mit einem UV-2401PC (Shimadzu) Spektrophotometer aufgenommen. Die Spektren wurden über den Spektralbereich von 200 bis 800 nm aufgenommen. Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS)-Analysen wurden mit einem Kratos Axis Ultra DLD-Spektrometer (Kratos Analytical, UK) durchgeführt, das mit einer monochromatisierten Aluminium-Röntgenquelle (Al, hν = 1486.6 eV) ausgestattet war, die bei 10 mA und 15 kV betrieben wurde ( 150 W). Vermessungsspektren wurden über den Bereich von 0–1100 eV Bindungsenergie mit einer Analysator-Durchgangsenergie von 160 eV aufgenommen. Ein Hybridlinsenmodus (elektrostatisch und magnetisch) wurde zusammen mit einem Analysebereich von ungefähr 300 μm × 700 μm verwendet.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung anisotroper Au-NSs

Anisotrope Au-NSs wurden über einen keimvermittelten Wachstumsansatz unter Verwendung binärer Tensidmischungen synthetisiert. Wenn CTAB-verkappte Au-Keime (~ 5 nm) zu der Wachstumslösung von binären Tensidmischungen (Molverhältnis von OA-CTAB ~ 20:1) zugegeben wurden, bildeten sich Au-NRs mit niedrigem Aspektverhältnis (Abb. 2a und Tabelle 2). Das HRTEM-Bild zeigte die einkristalline und Hundeknochenmorphologie von NRs (Einschub in Abb. 2a). OA, eine Fettsäure, die auch als schwaches Reduktionsmittel wirkt, erleichtert die Reduktion von Au ³⁺ zu Au ⁺ . Der Farbwechsel der Wachstumslösung von gelb zu transparent (~ 15 min) bestätigte unsere Beobachtung. Weitere Zugabe von Ascorbinsäure zur Wachstumslösung erhöht die Reduktionsrate von Au ⁺ . Als Ergebnis diffundieren Au-Atome schnell an den {111} [16]-Endfacetten der NRs, da die Packung der gemischten Micellenstrukturen im Vergleich zur Seite {110} und Ende {100} der NRs weniger dicht ist [25]. Daher führt das Überwachsen von NRs an den {111}-Endfacetten als an den {110}- und {100}-Seitenfacetten zur Bildung von NRs mit Hundeknochenmorphologie. Unsere Ergebnisse legen auch nahe, dass {110}-Facetten aufgrund der starken Wechselwirkung dieser Facetten mit Tensidmolekülen im Vergleich zu anderen Facetten wahrscheinlich nicht mit Au beschichtet sind. Wir bestätigten auch die Rolle von OA und Ascorbinsäure bei der Bildung von Au-NRs mit Hundeknochenmorphologie. Wenn die Konzentration von OA oder Ascorbinsäure in der Wachstumslösung verringert wurde, wurden nur Au-NRs erhalten. Diese Ergebnisse zeigen die Abnahme der Reduktionsrate und Diffusionsrate von Goldatomen, was zur Bildung von Au-NRs führt (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1, ESI†).

STEM-Bilder und UV-Vis-Spektren von Au NS s unterschiedlicher Form. a BF-STEM-Bild von Au-NRs mit Hundeknochenmorphologie und HRTEM-Bild im Einschub zeigen die einkristalline Natur von NRs. b BF-STEM-Bild von verlängerten tetrahexaedrischen Au-NSs (Einschub ist SEM-Bild). c SEM-Bild von Au-BPs (Einschub ist SEM-Bild eines einzelnen BP). d TEM-Bild von kugelförmigen Au-Partikeln (HRTEM-Bild im Einschub zeigt die polykristalline Natur von Au-Partikeln). e BF-STEM-Bild von Au-NMs. f UV-Vis-Spektren von Au-NSs verschiedener Formen

Wenn die Konzentration von OA relativ zu CTAB in der Wachstumslösung (Tabelle 1) erhöht wurde, wurden Au-NSs mit verlängerter THH-Form erhalten (Abb. 2b und Tabelle 2). Die Formänderung von Au-NSs kann durch die Modifikation gemischter Micellenstrukturen durch OA erklärt werden. Die stäbchenförmigen gemischten Micellenstrukturen werden bei einer geringen OA-Konzentration gebildet. Die erhöhte Menge an OA in den gemischten Micellenstrukturen verändert ihre Struktur in eine konvexe Form und erleichtert die Bildung von verlängerten THH Au NSs. Unsere vorherige Studie zeigte auch, dass eine Erhöhung der Konzentration des Co-Tensids die gemischten Micellenstrukturen konvexer macht [25]. Die Form von Au-NSs kann auch geändert werden, indem OA durch DDAB ersetzt wird. Wir erhielten Au-NSs der Form einer Bipyramide (BP) durch die Verwendung von CTAB und DDAB (Abb. 2c und Tabelle 2), wie in unserer früheren Arbeit berichtet [25]. Außerdem wurden kugelförmige Au-Partikel durch eine modifizierte Turkevich-Methode synthetisiert (Abb. 2d).

Wir untersuchten auch den Einfluss der Saatlösung auf die Form von Au-NSs. Die Impflösung wurde aus der Wachstumslösung von CTAB und OA (OA:CTAB ~ 20:1) nach 1 Minute der Reaktion entnommen und zu der frischen Wachstumslösung, die OA:CTAB ~ 20:1 enthielt, zugegeben. Au-NSs von NanoMakura (NM)-Morphologie wurden nach Abschluss der Wachstumsreaktion erhalten (Abb. 2e). Die Morphologie von NM ähnelt der von Hundeknochen. Da die NSs jedoch in alle Richtungen wachsen, wie in TEM-Bildern gezeigt, die unter verschiedenen Winkeln aufgenommen wurden (Abb. 3a und Tabelle 2), nennen wir diese NSs daher als NM. Um den Wachstumsmechanismus von Au-NMs zu veranschaulichen, wurde in verschiedenen Zeitintervallen ein kleines Volumen aus der Wachstumslösung entnommen und die Zwischenreaktion mittels STEM-Bildgebung analysiert (Abb. 3b). Wenn CTAB-beschichtete Keimpartikel zu der ersten Wachstumslösung zugegeben wurden, änderte sich die Farbe der Wachstumslösung schnell in ein dunkles Violett, was die Bildung anisotroper Au-NSs anzeigt. 300 μl Lösung aus der ersten Wachstumslösung wurden der zweiten Wachstumslösung zugesetzt, und danach wurden sofort einige Tropfen der Lösung in das TEM-Gitter gegeben.

Morphologie und Wachstum von Au-NM (Nanomakura ). a TEM-Bilder von NM, aufgenommen aus verschiedenen Winkeln. b BF-STEM-Bilder zeigen die Wachstumsschritte bei der Bildung von Au-NS vom NM-Typ. Die zu verschiedenen Zeitpunkten aus der Wachstumslösung entnommene Lösung wurde ohne Reinigung direkt in das TEM-Gitter gegeben.

Repräsentative STEM-Bilder zeigten ein relativ schnelleres Wachstum von Au-NM in Längsrichtung als in Querrichtung (0 s). Nach 30 s wurden NSs gesehen, die einer Fliege-Konfiguration ähnelten. NM mit endgültiger Größe wurden bereits nach etwa 3 Minuten der Reaktion beobachtet. Wir haben nach 30 Minuten und 8 Stunden keine weiteren Veränderungen in Form und Größe der NS festgestellt. Basierend auf unserer Analyse kann davon ausgegangen werden, dass das Gesamtwachstum von Au-NMs einem stochastischen, „Popcorn“-ähnlichen autokatalytischen Wachstumsmechanismus folgt, bei dem einzelne Samen einige Zeit ruhen, bevor sie plötzlich und schnell in die endgültigen Formen wachsen, wie dies der Fall ist für NRs von Cortie et al. [47]. Die NMs haben eine dreidimensionale Struktur, die durch HRTEM-Bilder der NMs gezeigt wird, die bei verschiedenen Rotationswinkeln aufgenommen wurden (Abb. 3a), im Gegensatz zu zuvor berichteten hundeknochenförmigen NSs [48, 49].

Die optischen Eigenschaften der Au-NSs unterschiedlicher Formen wurden gemessen und die Ergebnisse sind in Abb. 2f dargestellt. Au-NSs zeigen abstimmbare LSPR-Eigenschaften über den UV-Vis––sichtbaren––nahen Infrarot (IR)-Bereich. Die Plasmonenbänder spalten sich aufgrund von Resonanzschwingungen entlang verschiedener Achsen in Multipletts für anisotrope Strukturen auf – die Längs- und Querbänder. NRs zeigen mindestens drei verschiedene Bänder – 516 nm, 679 nm und 796 nm, wobei die stärkste die mittlere ist. Das Auftreten einer dritten Bande kann mit der Polydispersität der NRs in Verbindung gebracht werden, die durch den Ätzeffekt der Ölsäure verursacht wird. Dies führt zur Bildung von Nanostäbchen mit rauen Kanten. Sowohl transversale als auch longitudinale Resonanzpeaks (557 bzw. 760 nm) werden für NM beobachtet, das eine stärker gezackte Oberfläche als die Nanostäbchen hat. Bei größeren Strukturen (THH und BPs) werden jedoch einzelne und breite LSPR-Peaks bei 568 nm bzw. 593 nm beobachtet. Während die UV-Vis-Spektren für THH ähnliche Ähnlichkeiten mit früheren Studien aufweisen [50], scheinen die beiden Modi für BPs anders als sonst beobachtet zu einem breiten Peak verschmolzen zu sein [51]. Dies kann auf eine geringe Ausbeute der BP-Form oder eine nicht formselektive Zentrifugation, die auf das Au NS angewendet wurde, oder eine ungleichmäßige Beschichtung, die zu Formanisotropie in Lösung führt, zugeschrieben werden.

Oberflächenfunktionalisierung von Au-NSs

Au-NS unterschiedlicher Form wurden mit einem zweistufigen Verfahren funktionalisiert – das Doppelschicht-CTAB wurde durch O-[2-(3-Mercaptopropionylamino)ethyl]-O-methylpolyethylenglykol (PEG-SH) und anschließend durch MUA ersetzt. Abbildung 4a zeigt die hydrodynamischen Durchmesser der NS in jeder Phase der Funktionalisierung. Im Vergleich zu CTAB-beschichteten NS wird für jeden NS (außer BPs) eine sequentielle Zunahme der Größe erhalten, was eine erfolgreiche Funktionalisierung anzeigt. Da DLS-Messungen auf der Annahme kugelförmiger Partikel basieren, muss die Größenbestimmungsanalyse für die anisotropen NS an kugelförmige NS mit den gleichen Diffusionskoeffizienten wie die der anisotropen NS angenähert werden.

Größen und Zetapotentiale von Au-NSs. a Variation der DLS-Größen der Au‐NSs nach jeder Funktionalisierungsstufe. b Variation der Zetapotentiale von Au‐NSs mit jeder Funktionalisierungsstufe. X -Achse repräsentiert Au-Nanostrukturen verschiedener Formen (NR-Nanostäbchen, THH-Tetrahexaeder, NM-Nanomakura , BP-Bipyramide, SP sphärisch)

Dies verdeutlicht eine leichte Abnahme der Größe für PEG-SH-beschichtete BPs und unterstützt auch die obigen UV-Vis-Daten. Als Ergebnis der Funktionalisierung nehmen die Oberflächenladungen der NSs massiv ab, wie in Abb. 4b dargestellt. Das kationische Tensid wird leicht durch PEG-SH ersetzt, das aufgrund der höheren Affinität zur Au-Oberfläche weiter durch MUA ersetzt wird. Aufgrund der geringen Größe von MUA hat es eine höhere Flexibilität, CTAB zu verdrängen, das auf den NSs verbleibt, selbst nach PEGylierung. Die endgültigen Zeta-Potentialwerte von MUA-beschichteten NSs reflektieren negativ geladene Oberflächen für alle NSs außer für NRs. Diese Diskrepanz kann mit der ungleichmäßigen Beschichtung der kleinen NRs oder deren Polydispersität und dem angewandten Messprinzip zusammenhängen. Bei den kugelförmigen NSs ist die anfängliche negative Oberflächenladung auf die Citratbeschichtung zurückzuführen. Allerdings gewährleisten hohe Größen der Zetapotentiale für alle NSs die Stabilität der NSs in wässrigen Lösungen. XPS-Messungen, die an den Au-NSs nach jeder Funktionalisierungsstufe durchgeführt wurden, d. h. mit PEG-SH gefolgt von MUA, zeigten einen sehr geringen Bromgehalt auf der Oberfläche, was die Entfernung von gebundenem CTAB in großen Mengen von den Oberflächen der NSs bestätigte. (Tabelle 1, ESI).

Außerdem verändert eine Beschichtung der NSs mit PEG-SH und MUA ihre optischen Eigenschaften nicht dramatisch. Nach der Funktionalisierung für die anisotropen NS wird jedoch eine sequentielle Peakverbreiterung erhalten (zusätzliche Datei 1:Abbildung S3, ESI†). Dies kann an unterschiedlichen Rotationsachsen der NSs aufgrund von Anisotropie, ungleichmäßiger Beschichtung, Größenvergrößerung (DLS-Daten), einer Polydispersität der Proben oder einer Kombination der oben genannten liegen. Da die optischen Eigenschaften von Au-NSs von Form, Oberfläche, Größe und Aggregationszustand abhängen, gilt auch ihre Wechselwirkung mit Zellen. Zellinteraktionsstudien können Aufschluss darüber geben, in welchem ​​Ausmaß Au-NSs aufgenommen werden, ihre zytotoxischen Wirkungen und können auf zukünftige therapeutische und diagnostische Anwendungen hinweisen.

Zelluläre Interaktion von Au-NS unterschiedlicher Form

Im Allgemeinen gelangen Au-NSs in die Zelle durch Endozytose, die rezeptorvermittelt oder rezeptorunabhängig sein kann, durch aktinabhängige Phagozytose oder über andere derzeit unbekannte endozytische Wege [52]. Die Beschreibung der Route des NS ist von entscheidender Bedeutung, da sie letztendlich das intrazelluläre Schicksal des NS bestimmt [53]. Studien haben gezeigt, dass der Mechanismus der intrazellulären Aufnahme von den physikalisch-chemischen Eigenschaften, AR, und den Oberflächeneigenschaften der NS sowie vom Zelltyp abhängt [54,55,56,57,58]. Die Ladung der oberflächenstabilisierenden Moleküle ist effektiv die Ladung des NS [59]. Positiv geladene NS weisen eine starke Proteinadsorption in biologischen Medien auf und können die Zellmembranen stark schädigen. Aus diesem Grund ist eine neutrale oder negative Ladung vorzuziehen, um eine starke Adsorption an Zellmembranen und/oder Proteinadsorption zu vermeiden [26, 60]. Darüber hinaus bestimmt die Form der NSs, inwieweit die Oberflächenbedeckung der stabilisierenden Moleküle gleichmäßig ist oder nicht [61].

Hier wurden alle Au-NSs mit Ausnahme der kugelförmigen NSs mit dem oberflächenaktiven Mittel CTAB synthetisiert. Au-NSs wurden mit MUA funktionalisiert, um vor den Zellinteraktionsstudien eine negativ geladene Oberfläche zu erhalten. Stabile MUA-beschichtete Au-NSs wurden anschließend 24 h lang mit menschlichen Glioblastom-Astrozytom-Zellen co-inkubiert, und die Wirkung von Form und Konzentration auf die Zytotoxizität wurde mit einem LIVE/DEAD®-Assay bewertet, ergänzt durch eine Kernfärbung, um intrazelluläre Au-NS . hervorzuheben .

Der höchste Zelltod wurde mit dem NM bei hoher Konzentration beobachtet (Abb. 5a), mit einem Zelltod nahe 20 % nach der Blindwertkorrektur. Die anderen NS zeigten nicht den gleichen Trend in der Zytotoxizität, was darauf hindeuten könnte, dass NMs mit einer höheren Rate/Volumen aufgenommen werden als die anderen Formen [62]. Die Zellzählung für diese Formen zeigte eine Zytotoxizität von unter 5 % nach der Leerwertkorrektur (für Bilder aller Formen siehe Zusätzliche Datei 1:Abbildung S4, ESI†).

Effect of Au NSs on glioblastoma-astrocytoma cells. a Percentage cell death of glioblastoma-astrocytoma cells as a function of concentration of AuNSs. Incubation time was 24 h. Images b –m are acquired after incubation of makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. b TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. e Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). g Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. h TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.

Conclusions

In summary, we have synthesized five different shapes of Au NSs using a seed-mediated growth approach (nanorods, nanomakura , tetrahexahedral, bipyramidal) and the Turkevich method (spherical). These NSs have different sizes:the smallest being the NRs and the largest being the BPs, ranging from 22 to 156 nm. Their optical properties measured using UV-vis spectroscopy show LSPR span from UV, visible, to near IR. High values of zeta potential render good stability in aqueous solution. With an aim to exchange the cationic surfactant on the surface, a two-step functionalization protocol was employed to replace the CTAB with PEG thiol and MUA.

After coating, the NSs showed a decrease in surface charge, coupled with an increase in size, proving successful functionalization. In vitro studies were performed for all the synthesized NSs involving co-incubation with glioblastoma-astrocytoma cells for 24 h. The greatest cytotoxic response (~ 20%) was observed with NM at high concentration, which is consistent with higher uptake. An in––depth study with TEM revealed a time-dependent internalization in cancer cells via endocytosis and macropinocytosis. This successful internalization of the Au NM in cancer cells, coupled with their unique physicochemical properties, render them suitable for hyperthermia and drug delivery to cancer cells while being simultaneously imaged.

Abkürzungen

AgNO₃ :

Silver nitrate

Au:

Gold

BF:

Bright filed

BPs:

Bipyramids

CTAB:

Cetyltrimethylammonium bromide

DDAB:

Didecyldimethylammonium bromide

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

EMEM:

Eagle’s Minimal Essential Medium

EthD-1:

Ethidium homodimer-1

GBM:

Glioblastoma multiforme

HAuCl4:

Cholorauric aicd

HRTEM:

Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie

IR:

Infrarot

LSPR:

Lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz

MUA:

11-Mercaptoundecanoic acid

Na-citrate:

Sodium citrate dihydrate

NM:

Nanomakura

NRs:

Nanorods

Ns:

Nanostructure

OA:

Oleic acid

PEG-SH:

O-[2-(3-Mercaptopropionylamino) ethyl]-O-ethylpolyethylene glycol

STEM:

Scanning transmission electron microscopy

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

THH:

Tetrahexahedra

UV-Vis:

Ultraviolet-visible

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie