Antikörper-funktionalisierte, siliziumdioxid-beschichtete Goldnanostäbe für schnelle Diagnose und photothermale Behandlung von Cryptococcus neoformans

Zusammenfassung

Hintergrund

Cryptococcus neoformans ist ein eingekapselter Hefepilz. Es gibt noch immer keine schnelle und effektive Lösung für die Diagnose oder Behandlung von C. neoformans-Infektionen im frühen Stadium in der Klinik. Antikörper-konjugierte, siliziumdioxid-modifizierte Goldnanostäbe (GNR-SiO₂-Ab) können C. neoformans selektiv binden. Dies könnte eine Möglichkeit für eine sichere und effektive Behandlung von Kryptokokkose bieten.

Methoden

Goldnanostäbe (GNRs) wurden nach dem Seed-vermittelten, templatgestützten Protokoll synthetisiert. Anti-C. neoformans-Antikörper wurde kovalent über ein Silankupplungsmittel an der Oberfläche von GNRs verankert. In-vitro-Computertomographie-Bildgebung wurde durchgeführt, um den diagnostischen Effekt der GNR-SiO₂-Ab zu untersuchen. Die Zelllebensfähigkeit wurde bewertet, um den photothermischen Therapieeffekt von GNR-SiO₂-Ab in Kombination mit Nahinfrarot (NIR) Laserlicht zu bestätigen.

Ergebnisse

GNR-SiO₂-Ab hat potenzielle Anwendung als positiver Röntgen/CT-Bildgebungskontrastmittel. Ein Antikörper kann eine viel stärkere Aggregation von GNRs induzieren, indem er an die Oberfläche von C. neoformans-Zellen bindet, was zu viel höheren Absorptionswerten führt als je zuvor. Nach Bestrahlung erlitten C. neoformans-Zellen photothermische Schäden und die normale Zellstruktur wurde zerstört. Die Zelllebensfähigkeit verringerte sich signifikant im Vergleich zu unbehandelten Zellen.

Schlussfolgerungen

Unsere Arbeit bestätigte, dass antikörper-konjugierte, siliziumdioxid-modifizierte Goldnanostäbe die Röntgenabsorption von C. neoformans-Zellen in CT-Bildern verstärken können. Und immun-GNRs, die durch Antikörper vermittelt werden, könnten die Effekte der NIR-induzierten photothermischen Therapie in C. neoformans-Zellen erhöhen.

Hintergrund

Cryptococcus neoformans ist ein eingekapselter Hefepilz, der erstmals 1894 von Busse beschrieben wurde [1]. Infektion mit dem eingekapselten Hefepilz Cryptococcus neoformans kann zu harmloser Besiedlung der Atemwege führen, aber auch zu Meningitis oder disseminierter Erkrankung [2], besonders bei Personen mit defekter zellvermittelter Immunität. Kryptokokkose stellt eine lebensbedrohliche Pilzinfektion bei Patienten mit schwerer HIV-Infektion dar und kann auch Organtransplantation, retikuloendotheliale Malignome, Kortikosteroidbehandlung oder Sarkoidose komplizieren [3]. Kryptokokkale Meningitis im Zusammenhang mit HIV-Infektion verursacht weltweit mehr als 600.000 Todesfälle pro Jahr [4]. Kryptokokkale Meningitis und disseminierte Erkrankung waren unweigerlich fatal. 1995 berichteten Speed und Dunt eine 14%ige Sterblichkeitsrate bei Patienten mit kryptokokkaler Erkrankung, die mit Amphotericin B plus Flucytosin behandelt wurden [5]. Die Diagnostik bei Verdacht auf Kryptokokkose hing von Pilzkultur ab. Es gibt jedoch immer noch keine schnelle und effektive Lösung für die Diagnose oder Behandlung von C. neoformans-Infektionen im frühen Stadium. Zudem erhalten die meisten Patienten mit Kryptokokkeninfektionen keine prompte Behandlung, was zu hoher Sterblichkeit führt.

Unter allen Bildgebungstechniken ist Röntgen-Computertomographie (CT) eines der nützlichsten diagnostischen Werkzeuge in Krankenhäusern hinsichtlich Verfügbarkeit, Effizienz und Kosten [6]. CT kann anatomische Muster identifizieren und komplementäre anatomische Informationen einschließlich Tumorlokalisation, -größe und -ausbreitung auf endogenem Kontrast liefern [7]. Eine häufige Manifestation pulmonaler Kryptokokkose ist das Vorhandensein solitärer oder multipler pulmonaler Knoten oder Massen, Kavitation oder parenchymale Anomalien. Diese Manifestationen werden durch Computertomographie (CT) klar detektiert [8]. Mit radiologischer Bildgebung werden folgende Merkmale von Kryptokokkaler Meningitis typischerweise präsentiert: erweiterte Virchow-Robin-Räume, Meningeale Enhancement, prominente Choroidalfissur und parahippocampale Zysten [9]. Frühe Kryptokokkose kann jedoch nicht mit radiologischer Bildgebung detektiert werden. Das heißt, wir können keine prompte Behandlung im frühen Stadium durchführen. Kürzlich haben Fortschritte in der Kontrolle der Oberflächenform/Morphologie von Goldnanomaterialien die große Fähigkeit demonstriert, ihre lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz zu engineerieren [10, 11]. Hier untersuchten wir eine Art nanoskaliges Goldmaterial, Goldnanostäbe (GNRs), die selektiv mit Pilzen konjugieren können. In klinischer CT-Bildgebung sind jodierte Verbindungen die am häufigsten verwendeten Kontrastmittel. Allerdings sind die Ordnungszahl und Elektronendichte von Gold viel höher als die von Jod. Gold kann eine starke Röntgenabsorption induzieren, was es zu einem idealen Kandidaten für CT-Kontrastmittel macht [7]. Durch Konjugation von GNRs mit spezifischen Antikörpern können Wissenschaftler potenziell spezifische Gewebe und Pathogene gezielt ansprechen und abbilden [12].

Amphotericin B ist ein wichtiges Therapeutikum für die Behandlung kryptokokkaler Erkrankungen, das seit den späten 1960er Jahren eingesetzt wird [13]. Die klinische Wirksamkeit von Amphotericin B ist jedoch begrenzt, und es zeigt signifikante Nephrotoxizität [14]. Die Wirksamkeit gegenwärtiger Medikamente wird durch Toxizität, Medikamentenresistenz oder unzureichenden Aktivitätsbereich beeinträchtigt [15, 16]. Daher müssen neue selektive therapeutische Methoden für kryptokokkale Erkrankungen entwickelt werden. Kürzlich werden photothermische Behandlungen umfangreich eingesetzt, um Krebszellen, Viren und Bakterien gezielt zu zerstören [17–19]. Im Vergleich zu traditionellen therapeutischen Regimen ist der Wirkmechanismus solcher therapeutischen Substanzen völlig anders. Nahinfrarot (NIR) Laserlicht ist eine ideale photothermische Behandlungsmethode, die spezifisch von Geweben oder Materialien absorbiert werden kann. Licht kann effektiv durch Gewebe dringen bei minimaler Schädigung normaler Gewebe [20]. GNRs absorbieren Licht im NIR-Bereich (650–900 nm), und die absorbierte Lichtenergie kann in thermische Energie umgewandelt werden. Basierend auf diesem Prinzip ist es eine ideale Methode, NIR-Laserlicht mit GNRs für die Behandlung zu kombinieren. Im Vergleich zu klassischen Photosensibilisatoren haben GNRs mehrere vorteilhafte Eigenschaften: hohe Absorptionsquerschnitte, hohe Löslichkeit, exzellente biologische Kompatibilität, Hypotoxizität, große Lichtstabilität und einfache Konjugation mit Zielmolekülen [21]. Mehrere Berichte beschrieben, wie GNRs für photothermische Behandlungen genutzt werden können [22–24]. Carpin führte ein Experiment an Brustkrebszellen durch, die HER2-Gen überexprimierten und mit anti-HER2-konjugierten Siliziumdioxid-Gold-Nanoschalen inkubiert wurden. Anschließend wurden die Komplexe mit 808-nm NIR-Strahlung bestrahlt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurden die Zellen zerstört [17]. Wang berichtete, dass antikörper-konjugierte GNRs pathogene Salmonella-Bakterien bei Bestrahlung mit NIR-Strahlung gezielt ansprechen und zerstören konnten. Es gab eine hochsignifikante Reduktion der Salmonella-Zellenlebensfähigkeit [19].

Hierin verwendeten wir antikörper-konjugierte, siliziumdioxid-modifizierte Goldnanostäbe, um C. neoformans-Zellen spezifisch zu binden. Darüber hinaus können die an die Komplexe gebundenen Zellen in CT-Bildern leicht unterschieden werden. Diese Goldnanopartikel waren über Immunkonjugation mit C. neoformans-Zellen assoziiert, und photothermische Lyse verursachte eine signifikante Reduktion der Zellenlebensfähigkeit. Unsere Studie bestätigte eine brandneue Option für die Diagnose und photothermische Therapie von C. neoformans in vitro und bietet eine Möglichkeit für eine sichere und effektive Behandlung von Kryptokokkose.

Methoden

Materialien

Anti-C. neoformans-Antikörper wurde von Meridian Life Science (Memphis, TN, USA) bezogen. Chlorgoldsaure (HAuCl₄·3H₂O) wurde von Sigma (St. Louis, MO, USA) bezogen. Silbernitrat (AgNO₃), Tetraethylorthosilikat (TEOS), 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTS), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), Natriumborhydrid (NaBH₄), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC), Poly(natrium-4-styrensulfonat) (PSS) und Ascorbinsäure wurden von J & K Chemical Limited (China) bezogen. Alle oben genannten Chemikalien wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Deionisiertes Wasser (Millipore Milli-Q-Grad) mit einem Widerstand von 18,2 MΩ cm wurde in allen Präparationen verwendet.

Synthese von antikörper-konjugierten, siliziumdioxid-modifizierten Goldnanostäben

In einem typischen Experiment wurden GNRs nach dem Seed-vermittelten, templatgestützten Protokoll [25–27] synthetisiert. Der synthetische Weg zur Herstellung der antikörper-konjugierten, siliziumdioxid-modifizierten Goldnanostäbe (GNR-SiO₂-Ab) ist in Abb. 1 illustriert. 25 Milliliter der GNR-Lösung wurden bei 12000 U/min für 15 min zentrifugiert. Der Überstand, der hauptsächlich CTAB-Moleküle enthielt, wurde entfernt, und der Niederschlag wurde in 20 ml anhydrem Ethanol, auf pH 10 mit 20 µl 28% Ammoniak eingestellt, resuspendiert. Nach Ultraschallbehandlung wurden 5 ml TEOS (10 mM) hinzugefügt und das gesamte System 24 h kräftig gerührt. Siliziumdioxid-beschichtete GNRs wurden durch Zentrifugation bei 4000 U/min für 30 min gesammelt und dreimal mit Wasser und zweimal mit Ethanol gewaschen. Die gereinigten GNR-SiO₂-Proben wurden in 10 ml Ethanol für weitere Experimente redispersiert [28]. Anschließend wurden 10 ml APTS hinzugefügt, um eine Gemischlösung zu bilden und 1 h bei 60 °C unter Rückfluss reagieren zu lassen. Das Resultat wurde fünfmal mit deionisiertem Wasser gewaschen und 3 h bei 60 °C in einem Vakuumofen getrocknet, um GNR-SiO₂-NH₂ zu erhalten. Das Resultat wurde weiter mit einem Polymer (PSS) über eine Schicht-für-Schicht-Technik beschichtet, um zugängliche Aminogruppen für das Lösungsmittel bereitzustellen [29]. Diese amin-terminierten Nanostäbe reagierten 12–16 h in Gegenwart von EDC, einem wasserlöslichen Carbodiimid, das Amidbindungsbildung zwischen Carbonsäure und primärem Amin fördert [30], mit der Carbonsäure gereinigter Antikörper. Nach Inkubation wurden die Nanostab-Antikörper-Komplexe durch Zentrifugation gereinigt und in PBS resuspendiert [31].

Abb. 1. Syntheseverfahren von GNR-SiO₂-Ab.

Charakterisierung von GNR-SiO₂-Ab

Größe und Morphologie von GNR und GNR-SiO₂-Ab wurden mittels Transmissionelektronenmikroskopie (TEM; Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA) bei 120 kV Beschleunigungsspannung charakterisiert [20]. UV-Vis-Spektren wurden bei 20 °C mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (Shimadzu UV-2450, Shimadzu, Japan) mit 10-mm-Quarzzelle und 1 cm Lichtweglänge gemessen. Der 200- bis 1000-nm Wellenlängenbereich wurde gescannt, da er die Absorptionspeaks der GNRs, Anti-C. neoformans-Antikörper und GNR-SiO₂-Ab umfasst. GNR-SiO₂-Ab wurde 2 und 4 Wochen bei 4 °C inkubiert. Der 200- bis 1000-nm Wellenlängenbereich wurde an den beiden Zeitpunkten gescannt.

Messung der Hounsfield-Einheiten von GNR-SiO₂-Ab

Die wässrige Lösung von GNR-SiO₂-Ab mit verschiedenen Konzentrationen im Bereich 0,04–4 mg/ml wurde direkt mit einem Philips Brilliance 64 CT-Scanner (Philips Healthcare, Best, Niederlande) detektiert. Die Absorptionswerte wurden aus der CT-Bildgebungssoftware erhalten.

Anheftung von C. neoformans an GNR-SiO₂-Ab

C. neoformans Typ A H99-Stamm wurde vom Shanghai Key Laboratory of Molecular Medical Mycology (Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, China) bezogen. Pilze wurden 1 h vor der TEM-Analyse mit den GNRs und Antikörper-Nanostab-Komplexen inkubiert. Bilder wurden an einem TEM-Instrument (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA) bei 120 kV Beschleunigungsspannung aufgenommen.

In-vitro-CT-Scanning von Pilz-Antikörper-Nanostab-Komplexen

Materialien und Pilze wurden in drei Gruppen unterteilt: Pilzgruppe (N), GPR-SiO₂-Ab-Gruppe (G) und GPR-SiO₂-Ab-angeheftete C. neoformans-Gruppe (G+N). Die Konzentration der GNR-SiO₂-Ab wässrigen Lösung betrug 4 mg/ml. Für In-vitro-CT-Bildgebung wurden die Lösungen der drei Gruppen in 1,5-ml sterilen Ep-Röhrchen vorbereitet. Alle CT-Scans wurden mit dem oben genannten CT-System durchgeführt.

In-vitro-Photothermische Therapieeffekte

C. neoformans-Zellen, inkubiert mit und ohne GNR-SiO₂-Ab, wurden 5 min lang NIR-Laser (LWIRL 808, Laserwave Ltd., China) mit 808 nm Wellenlänge und 30 mW Intensität (4 W/cm²) bestrahlt. Bilder wurden an einem TEM-Instrument (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA) bei 120 kV aufgenommen. Nach Bestrahlung wurden Zellen 2 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. C. neoformans-Zellen, inkubiert mit und ohne GNR-SiO₂-Ab, dienten als Kontrollgruppen. Zellenlebensfähigkeit wurde durch Durchführung des CellTiter-Glo® lumineszenten Zellenlebensfähigkeitstests (Promega Corporation, Madison, WI, USA) gemäß Herstelleranweisungen bestimmt [28]. Dieser spezielle Zellenlebensfähigkeitstest war eine homogene Methode, die die Anzahl lebensfähiger Zellen bestimmen konnte. Die Luciferase-katalysierte Reaktion zwischen Luciferin und ATP wurde für die Synthese metabolisch aktiver Zellen verwendet. Alle Experimente wurden sechsmal wiederholt, und ihre Mittelwerte bestimmt.

Statistische Analyse

Alle Analysen wurden mit SPSS Version 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt. Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. P-Wert unter 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle in diesem Artikel gezeigten Abbildungen stammen aus mehr als drei unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen.

Ergebnisse

Synthese und Charakterisierung von GNR-SiO₂-Ab

Eine Methode für siliziumdioxid-beschichtete GNRs mit TEOS als Siliziumdioxidquelle und APTS als Kupplungsmittel wurde zuvor berichtet [30]. Die Form oder Größe der GPRs änderte sich nicht, als sie mit Anti-C. neoformans konjugiert wurden. Abbildung 2 zeigt das TEM-Bild von GNR-SiO₂-Ab. Diese Nanopartikel sind 18,48 ± 2,39 nm in der Breite und 57,56 ± 4,57 nm in der Länge.

Abb. 2. a, b TEM-Bild von GNR-SiO₂-Ab. Die Nanostäbe zeigten ein stäbchenartiges Aussehen. Die Form oder Größe der GPRs änderte sich nicht bei Konjugation mit Anti-C. neoformans.

Spektroskopische Eigenschaften und Stabilität von GNR-SiO₂-Ab

Bezüglich der photophysikalischen Eigenschaften von GNR-SiO₂-Ab zeigt Abb. 3 die Absorptionsspektren von GNR-SiO₂, GNR-SiO₂-Ab und Anti-C. neoformans-Antikörper. Das Spektrum von GNR-SiO₂ zeigt, dass GNR-SiO₂ zwei Absorptionsbänder aufweist: ein schwaches transversales Oberflächenplasmonenresonanzwellenlänge (TSPRW) um 520 nm und ein starkes longitudinales Oberflächenplasmonenresonanzwellenlänge (LSPRW) um 808 nm. Nach Konjugation mit Antikörpern betragen TSPRW und LSPRW von GNR-SiO₂-Ab 540 nm bzw. 835 nm. Im Vergleich zwischen dem Spektrum des Antikörpers und GNR-SiO₂-Ab haben beide den gleichen speziellen Peak bei ca. 280 nm. Dieses Ergebnis beweist, dass der Anti-C. neoformans-Antikörper erfolgreich mit GNR-SiO₂ konjugiert wurde. Nach Inkubation bei 4 °C für 2 Wochen betrugen TSPRW und LSPRW von GNR-SiO₂-Ab 540 nm bzw. 835 nm. Dieselbe Daten wurden nach 4 Wochen beobachtet. TSPRW und LSPRW von GNR-SiO₂-Ab änderten sich nach 4-wöchiger Inkubation nicht. Dies bestätigte die Stabilität von GNR-SiO₂-Ab.

Abb. 3. Absorptionsspektren von: GNR+SiO₂+Ab (A), GNR+SiO₂ (B) und Anti-C. neoformans-Antikörper (C). GNR-SiO₂ hat zwei Absorptionsbänder: schwaches TSPRW um 520 nm und starkes LSPRW um 808 nm. Nach Konjugation mit Antikörpern betragen TSPRW und LSPRW von GNR-SiO₂-Ab 540 nm bzw. 835 nm.

Messung der Hounsfield-Einheiten von GNR-SiO₂-Ab

Die Hounsfield-Einheiten (HU) von GNR-SiO₂-Ab wurden mit einem klinischen CT evaluiert. Abbildung 4 zeigt die CT-Bilder im Bereich 0,04–4 mg/ml GNR-SiO₂-Ab. Mit steigender Konzentration von GNR-SiO₂-Ab nahm die CT-Signalintensität kontinuierlich zu. Wie in Abb. 3 gezeigt, zeigen HU als Funktion der GNR-SiO₂-Ab-Konzentration eine gut korrelierte lineare Beziehung (R² = 0,9903), beschrieben durch die typische Gleichung: y = 12,52x + 11,971. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass GNR-SiO₂-Ab potenzielle Anwendung als positives Röntgen/CT-Bildgebungskontrastmittel hat.

Abb. 4. Hounsfield-Einheiten von GNR-SiO₂-Ab. a In-vitro-CT-Bilder von GNR-SiO₂-Ab in PBS suspendiert. Die Konzentration (mg/ml) in jeder Probe ist oben im jeweiligen Bild angegeben. b CT-Absorptionsplot von GNR-SiO₂-Ab bei verschiedenen Konzentrationen im Bereich 0,04 bis 4 mg/ml.

Anheftung von C. neoformans-Zellen an GNR-SiO₂-Ab

TEM-Bilder zeigen die morphologischen Merkmale von C. neoformans-Zellen und Pilz-Antikörper-Nanostab-Komplexen. Diese Zellen haben einen Durchmesser von 2 bis 20 µm. Abbildung 5a zeigt das TEM-Bild von C. neoformans-Zellen, die von einer Polysaccharidkapsel umgeben sind. Diese Zellen waren 4–6 µm im Durchmesser ohne Bindung von Strukturen. Wie in Abb. 5b gezeigt, sind C. neoformans-Zellen nach Inkubation mit Antikörper-Nanostab-Komplexen von vielen aggregierten GNR-SiO₂-Ab bedeckt. Wir inkubierten Pilzzellen mit GNR-SiO₂, um zu untersuchen, ob GNR-SiO₂ an C. neoformans anheftet. Unsere Ergebnisse zeigten, dass GNR-SiO₂ gestreut waren, wie in Abb. 5c gezeigt. Unsere Studie zeigt, dass C. neoformans-Zellen selektiv mit GNR-SiO₂-Ab konjugieren können.

Abb. 5. TEM-Bilder illustrieren die Interaktion zwischen GNR-SiO₂-Ab und C. neoformans-Zellen. a TEM-Bild von C. neoformans-Zellen. b TEM-Bild von Pilz-Antikörper-Nanostab-Komplexen. c TEM-Bild von C. neoformans-Zellen inkubiert mit GNR-SiO₂.

In-vitro-CT-Scanning von Pilz-Antikörper-Nanostab-Komplexen

Wir führten quantitative Analysen der CT-Signalintensität über das Standardanzeigeprogramm des Herstellers (Philips Portal, Philips Healthcare, Best, Niederlande) durch. Abbildung 6 zeigt Röntgenabsorptionswerte der drei Gruppen. Die Werte der G+N-Gruppe waren signifikant höher als jene der G- und N-Gruppen. Darüber hinaus waren Röntgenabsorptionswerte der G-Gruppe signifikant höher als jene der N-Gruppe. Dieses Ergebnis stimmt mit den Befunden früherer Literatur [31] überein.

Abb. 6. a, b In-vitro-CT-Scanning verschiedener Gruppen. Die Werte der G+N-Gruppe waren signifikant höher als jene der G- und N-Gruppen. Darüber hinaus waren Röntgenabsorptionswerte der G-Gruppe signifikant höher als jene der N-Gruppe.

In-vitro-Effekte der photothermischen Therapie

Wir bewerteten die Zellenlebensfähigkeit durch Durchführung des Zellenlebensfähigkeitstests in einem CellTiter-Glo® lumineszenten Instrument. Zellen ohne Bestrahlung hatten höhere Lebensfähigkeit als NIR-bestrahlte Zellen (P < 0,05). Zudem war die Lebensfähigkeit von Pilzen höher als die von Zellen, konjugiert mit GNR-SiO₂-Ab nach NIR-Bestrahlung (P < 0,05). Außerdem hatten Zellen höhere Lebensfähigkeit als Pilz-Antikörper-Nanostab-Komplexe (P < 0,05). Abbildung 7 illustriert klar die Variation der Lebensfähigkeit von C. neoformans-Zellen unter verschiedenen Behandlungen. Nach Bestrahlung erlitten C. neoformans-Zellen photothermische Schäden und die normale Zellstruktur wurde zerstört. Wie in Abb. 8 gezeigt, zeigten die Zellen atrophische, irreguläre und kollabierte Erscheinungen. Die charakteristische Polysaccharidkapsel war beschädigt.

Abb. 7. Lebensfähigkeit von Zellen, die unterschiedlich behandelt wurden. Zellen ohne Bestrahlung hatten höhere Lebensfähigkeit als NIR-bestrahlte Zellen (P < 0,05). Zudem war die Lebensfähigkeit von Pilzen höher als die von Zellen, konjugiert mit GNR-SiO₂-Ab nach NIR-Bestrahlung (P < 0,05). Außerdem hatten Zellen höhere Lebensfähigkeit als Pilz-Antikörper-Nanostab-Komplexe (P < 0,05).

Abb. 8. a, b TEM-Bilder demonstrieren photothermische Schäden von C. neoformans-Zellen, die mit GNR-SiO₂-Ab konjugiert waren. Die Zellen zeigten atrophische, irreguläre und kollabierte Erscheinungen. Die charakteristische Polysaccharidkapsel war beschädigt.

Diskussion

Siliziumdioxid hat viele Vorteile gegenüber Polymeren [32]. Die Präparationsprozesse sind recht einfach, und die Dicke einer Siliziumdioxidschale kann auf die gewünschte Größe und Porosität eingestellt werden. Darüber hinaus ist Siliziumdioxid extrem stabil und biokompatibel, zeigt keine Schwellung oder Porositätsänderungen bei pH-Änderungen und ist nicht anfällig für mikrobiellen Angriff. Zusätzlich ermöglicht Siliziumdioxid einfache Oberflächenmodifikation mit verschiedenen Funktionsgruppen mittels Silankchemie und kommerziell erhältlicher Organosiliciumreagenzien für Biotargeting. Siliziumdioxid-beschichtete GNRs behalten die überlegenen optischen Eigenschaften von GNRs und können ihre thermische Stabilität unter Hochenergiebestrahlung verbessern. In unserer Studie zeigten GNRs nach Beschichtung mit Siliziumdioxid und Konjugation mit Anti-C. neoformans-Antikörper beide eine Rotverschiebung des Oberflächenplasmonenresonanzpeaks aufgrund des Anstiegs des Brechungsindexes des umgebenden Mediums [32, 33]. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die Probengröße nach Modifikation und Konjugation immer größer wurde. Diese Daten zeigten, dass wir Goldnanopartikel erfolgreich mit einem Anti-C. neoformans-Antikörper konjugierten. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass GNR-SiO₂ nach Bindung an Antikörper eine besondere Kraft zur Konjugation von Zellen besitzt, und wir werden dies in Zukunft weiter untersuchen. In dieser Studie hefteten wir GNR-SiO₂-Ab erfolgreich an die Zellkapsel durch eine einfache Antigen-Antikörper-Reaktion an. Zudem stellten wir sicher, dass unsere Komplexe Antigene auf der Zellkapsel gezielt ansprachen.

GNRs haben in den letzten zehn Jahren breite Aufmerksamkeit erlangt. Hainfeld et al. [34] berichteten erstmals, dass GNRs als Röntgenkontrastmittel verwendet werden können. GNRs bieten mehrere Vorteile gegenüber jodierten Molekülen, einem bedingten Kontrastmittel. Aufgrund hoher Ordnungszahl und Elektronendichte weisen GNRs einen relativ hohen Röntgenabsorptionskoeffizienten auf. Die Ordnungszahl und Elektronendichte von Gold (79 und 19,32 g/cm³) sind höher als die von Jod (53 und 4,9 g/cm³) [7]. Jod als Röntgenkontrastmittel hat viele ernste Nebenwirkungen wie Nephrotoxizität und schwere allergische Reaktionen. GNRs verbleiben jedoch viel länger im Körper als Jodkontrastmittel, was bedeutet, dass genügend Zeit zur Bildbeobachtung bleibt. Darüber hinaus können GNRs Krebszellen, Viren und Bakterien über Oberflächenfunktionalisierung mit verschiedenen Molekülen wie Peptiden oder Antikörpern gezielt ansprechen. Reuveni et al. [31] zeigten, dass verschiedene Molekültypen an die Oberfläche von GNRs gebunden werden können. In dieser Studie nahm die CT-Signalintensität kontinuierlich mit steigender GNR-SiO₂-Ab-Konzentration zu, was hellere Bilder ergab. GNR-SiO₂-Ab zeigte signifikantes positives Potenzial als Röntgen/CT-Bildgebungskontrastmittel, wie auch GNRs. Die Röntgenabsorption von Goldnanostäben blieb unverändert, selbst mit Oberflächenmodifikation. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Röntgenabsorptions-Eigenschaften von GNR-SiO₂-Ab sich durch Oberflächenmodifikation nicht signifikant änderten. Dies stimmt mit Befunden früherer Literatur [35–37] überein. Oberflächenfunktionalisierung ist ein mächtiges Werkzeug, das passives oder aktives Targeting von GNRs an einen spezifischen Interessensort ermöglicht. In unserer Studie hefteten wir GNR-SiO₂-Ab erfolgreich an die Kapseln von C. neoformans an. Zudem bestimmten wir, ob diese antikörper-konjugierten Partikel als Nanoproben bei gezielter CT-Bildgebung von C. neoformans-Zellen in vitro verwendet werden konnten. Wir beobachteten, dass CT-Bilder von C. neoformans-Zellen in PBS dispergiert denen von in Wasser dispergierten Zellen sehr ähnlich erschienen. Es ist jedoch schwierig, Bilder von Pilzen von Weichgewebe zu unterscheiden. Ein Antikörper kann eine viel stärkere Aggregation von GNRs induzieren, indem er an die Oberfläche von C. neoformans-Zellen bindet, was zu viel höheren Absorptionswerten führt als je zuvor. Somit können wir erfolgreich unterscheidbare Röntgenabsorption von Pilzen erreichen. Basierend auf unseren Ergebnissen könnte die Detektion von C. neoformans durch CT-Bildgebung erreicht werden und neuartige diagnostische Möglichkeiten eröffnen.

GNRs wurden umfangreich für Tumor-Photothermische Therapie eingesetzt [22, 38, 39]. Unsere Studie zeigt, dass GNR-SiO₂-Ab ein selektives Werkzeug zur Zerstörung von C. neoformans-Zellen sein könnte. Unsere Ergebnisse bestätigten, dass die Zellmembran von C. neoformans-Zellen nach NIR-Bestrahlung irreparabel und stark zerstört wurde. Zudem verringerte sich die Zellenlebensfähigkeit signifikant im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Diese Ergebnisse zeigten, dass NIR-Strahlung allein den Tod von C. neoformans-Zellen verursacht. Allerdings wurde die Lebensfähigkeit von Zellen, inkubiert mit GNR-SiO₂-Ab, ebenfalls verringert. In Zellen, inkubiert mit GNR-SiO₂-Ab und NIR-bestrahlt, verringerte sich die Lebensfähigkeit signifikant im Vergleich zu anderen Gruppen. Wir stellen sicher, dass GNR-SiO₂-Ab selektiv mit Pilzen konjugierte und die Effekte der NIR-Strahlung verbesserte. GNR-SiO₂-Ab hat die Fähigkeit zu selektiven photothermischen Therapieeffekten auf C. neoformans-Zellen. Der Wirkmechanismus wurde bisher nicht berichtet. Wir spekulieren, dass die Disruption der Zellmembran wahrscheinlich durch bestrahlungsinduzierten Zelltod induziert wurde. Norman et al. [18] berichteten, dass die Lebensfähigkeit von Pseudomonas aeruginosa signifikant verringert wurde, wenn diese Art Bestrahlung ausgesetzt und mit Goldnanostäben gebunden war, die kovalent mit spezifischen Antikörpern konjugiert waren. Diese Zellen zeigten auch Bereiche stark gestörter Zellmembranen mit irreparablen Schäden durch NIR-Bestrahlung. Wenn Nanopartikel NIR-Strahlung ausgesetzt waren, wurde die Zellmembran durch mehrere Faktoren beschädigt, einschließlich Nanopartikel-Explosion, Schockwellen, Blasenbildung und thermischer Disintegration [40].

In dieser Studie trat Tod oder reduzierte Aktivität von C. neoformans-Zellen auf, wenn die Zellmembran durch thermische Energie disintegrert und zerstört wurde. Weitere Studien sollten jedoch durchgeführt werden, um diese Hypothese zu bestätigen. C. neoformans-Zellen werden durch folgende Faktoren beschädigt: lokalisierte Temperaturerhöhungen, Nanopartikel-Explosion, Schockwellen, Blasenbildung und thermische Disintegration durch NIR-Strahlung. Insbesondere wurden C. neoformans-Zellen substanziell geschädigt, wenn sie nur NIR-Strahlung ausgesetzt waren. Es gibt zwei mögliche Gründe, wie gezielte GNR-SiO₂-Ab NIR-Strahlung durch Auslösung photothermischer Zerstörung von C. neoformans-Zellen stimulieren. Eine Möglichkeit ist, dass in der Kapsel von C. neoformans-Zellen die gezielten GNR-SiO₂-Ab einen lokalisierten Temperaturanstieg induzieren. Die zweite Möglichkeit ist, dass aufgrund einer Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen GNR-SiO₂-Ab und der Kapsel von C. neoformans-Zellen strukturelle Veränderungen in Zellwand und Kapsel auftreten. Aufgrund solcher Veränderungen wären Zellen empfindlicher gegenüber photothermischer Behandlung [41]. Frühere Studien bestätigten die niedrige Toxizität von Goldnanostäben [22, 42, 43], und weitere Studien werden erforderlich sein, um den Effekt photothermischer Therapie in vivo zu untersuchen. Das Bedauerlichste an unserer Studie ist, dass wir die Beladungskapazität von GNR-SiO₂-Ab nicht diskutierten. Weitere Studien werden sich auf den Zusammenhang zwischen Beladungskapazität von GNR-SiO₂-Ab und photothermischem Effekt konzentrieren.

Schlussfolgerungen

Wir fertigten erfolgreich GNR-SiO₂-Ab, das auf C. neoformans-Zellen abzielte. Diese spezifischen antikörper-konjugierten Goldnanostäbe verstärkten die Röntgenabsorption von C. neoformans-Zellen in CT-Bildern. Unsere Ergebnisse zeigten, dass immun-GNRs, vermittelt durch Antikörper, die Effekte der NIR-induzierten photothermischen Therapie in C. neoformans-Zellen erhöhten. Darüber hinaus ermöglichten GNR-SiO₂-Ab einfache Manipulation und minimalinvasive Verfahren bei Diagnose und Behandlung von C. neoformans-Infektionen, mit Fokus auf die potenzielle klinische Anwendung dieses Ansatzes.