Biosicherheit und antibakterielle Wirkung von Graphen und Graphenoxid in vitro und in vivo

Hintergrund

In den letzten Jahren werden chirurgische Implantate häufig zur Behandlung von Knochenbrüchen und anderen Krankheiten verwendet, aber das Implantat benötigt sowohl eine gute biologische Sicherheit als auch antibakterielle Eigenschaften, um Abstoßung und Infektion zu vermeiden. Tatsächlich ist die orthopädische Behandlung eines infektiösen Knochendefekts immer noch ein großes Problem. Zum Aspekt der Bakterien, Staphylococcus aureus ist der häufigste Erreger in der Orthopädie und orthopädischen Implantation [1]. Aufgrund von Knochendefekten und Infektionen [2] ist die Behandlung schwierig und die Patienten brauchen lange Zeit, um geheilt zu werden. Wenn die Wunde nicht heilt, ist die letzte Behandlung die Amputation der Gliedmaßen [3, 4].

Eine gute Behandlung eines infektiösen Knochendefekts sollte gleichzeitig sowohl die Infektionskontrolle als auch die Rekonstruktion der Reparatur des Knochendefekts erfüllen. Mit der Entwicklung des Bone Tissue Engineering werden immer mehr Biomaterialanwendungen im Bereich der orthopädischen Behandlung eingesetzt. Die Heilungsrate von Infektionen in den Knochen kann daher stark verbessert werden. Zu diesen Materialien zählen hauptsächlich heterogener Knochen [5], Biokeramiken [6] (wie Hydroxyapatit [7] und Calciumphosphat [8]), Polymere [9, 10], Proteinmaterialien (wie Kollagenfasern [11]), und so weiter. Neben diesen Materialien haben Beatriz Pelaz et al. zeigte die Bedeutung und vielversprechende Perspektive der Nanotechnologie in Implantaten auf [12]; Unter diesen Nanopartikeln sind Graphen und seine Derivate weitere neuartige Materialien, die die Anforderungen für die Knochenreparatur erfüllen.

Graphen ist zweidimensional, mit einer einzelnen oder wenigen Schichten von Kohlenstoffatomen in einer Wabenstruktur [13,14,15]. Es wird aufgrund seiner hervorragenden physikalischen Eigenschaften häufig in Verbundmaterialien [16, 17], Sensoren [18, 19], Energie [16, 20] und anderen Bereichen verwendet. Graphenoxid ist ein oberflächenfunktionalisiertes Graphenmaterial, das sich in einer Schicht aus Kohlenstoffatomen befindet, die mit einer zweidimensionalen unendlichen Ausdehnung der sauerstoffhaltigen oberflächenaktiven Basisgruppen und seiner Graphenoxidform verbunden sind [21]. Graphen (G) und seine Derivate haben aufgrund seiner einzigartigen zweidimensionalen Struktur sowie seiner spezifischen physikalischen und chemischen Eigenschaften im biomedizinischen Bereich große Besorgnis erregt [22]. Funktionalisiertes Graphen und seine Derivate haben viele Funktionen wie Wirkstoffbeladung [23], antibakteriell [24], Bioimaging [25, 26] und Krebstherapie [27].

Unter dem Aspekt der antimikrobiellen Kapazität haben Li et al. zeigten, dass der antimikrobielle Mechanismus von G hauptsächlich durch Ladungstransfer [28] und bakterielle Migration verursacht wird. Bakterien werden auf die Oberfläche von scharfen Nanoblättern übertragen, die Bakterien an den scharfen Kanten zerreißen [29]. Darüber hinaus haben Tu et al. zeigten auch einen anderen potentiellen antimikrobiellen Mechanismus, dass G in die Zellen eindringen kann, was zur Extraktion großer Mengen von Phospholipiden aus den Zellmembranen führt [30]. Somit haben G und Graphenoxid (GO) Bioaktivität und antimikrobielle Kapazität, was die Voraussetzungen für eine Qualifizierung als Knochenreparaturmaterialien erfüllt.

Bei der Produktion und Anwendung im großen Maßstab sind jedoch die Fragen der biologischen Sicherheit von Graphen besonders wichtig. Arbeitnehmer können durch mehrere Medien, darunter Inhalation, Hautkontakt und gastroenterische Wege, an der Exposition gegenüber Nanopartikeln (NPs) leiden. Andrea Prodi et al. schlugen einen schrittweisen Ansatz zur Bewertung der NP-Exposition für einen weiteren Schutz vor [31]. Abgesehen von der Bewertung sind Biosicherheit und Biokompatibilität weitere Schlüsselpunkte der Forschung. Kan Wang et al. demonstrierten die Biokompatibilität von GO, das bei einer Dosis von weniger als 20 µg/ml eine Toxizität gegenüber menschlichen Fibroblastenzellen zeigt, bei einer Dosis von mehr als 50 µg/ml jedoch eine offensichtliche Zytotoxizität mit einer signifikant verringerten Zelladhäsion zeigt [32]. Gegenwärtig bestätigt eine konsistentere Ansicht, dass G und GO eine toxische Wirkung auf Bakterien haben, jedoch im Widerspruch zur toxischen Wirkung auf Zellen [33,34,35,36]. Die Funktion und Toxizität von G und GO müssen noch genauer untersucht werden. Beatriz Pelazet al. stellte die Frage, „wie Risiken reduziert und der Nutzen erhöht werden können, sind für die Entwicklung sicherer und wirksamer Nanomedikamente von entscheidender Bedeutung“, was die Studie an die Kombination der potenziellen Risiken und der antibakteriellen Fähigkeit von G und GO in vivo und in vitro erinnert und drängt [12] .

Mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks (BMSCs) sind multipotente adulte Stammzellen. Sie sind zu einer wichtigen Zellquelle für die Reparatur von Knochendefekten im Tissue Engineering geworden [37, 38]. Darüber hinaus ist die Wechselwirkung zwischen Graphen und Derivaten und Stammzellen noch wenig erforscht [39, 40].

Daher untersuchte diese Studie die Wirkung von G und GO auf BMSCs in vitro Muskelgewebe von Mäusen, Staphylococcus aureus , mit dem Ziel, die Zytotoxizität und antibakterielle Fähigkeit von G und GO in vivo und in vitro zu untersuchen und die Erforschung der Nanomedizin und Nanotoxizität von Kohlenstoffnanomaterialien zu fördern.

Ergebnisse

G- und GO-Zytotoxizität

G- und GO-Zytotoxizität in vitro

Unter dem Elektronenmikroskop zeigten G- oder GO-Nanopartikel eine unregelmäßige Form mit einer Größe von 30,41 ± 5,59 nm, und es konnte eine Partikelagglomeration festgestellt werden (Abb. 1a, b). Nach 7 Tagen Kultur wurde die Morphologie der Zelle in eine Spindelform verändert (Abb. 1c). Nach Kultivierung mit osteogenem Differenzierungsmedium wurden Calciumknötchen gebildet (Fig. 1d). Ölakkumulation wurde nach adipogener Differenzierung gebildet (Abb. 1e).

G- und GO-Zytotoxizität (a , b). TEM-Bilder von G (a ) und LOS (b ) zeigte das gebildete Nanonetzwerk. c Zytomorphologie von BMSCs. d Alizarinrot zur Kalziumablagerung. e Öl rot O für Lipid. f Zellaktivität nach G- und GO-Behandlung, *P <0,01 mit Kontrollgruppe, ^# P <0,01 mit Kontrollgruppe, ^○ P <0,05 mit G 50 μg/ml Gruppe, ^{☆, □, △} P <0,01 bei gleicher Konzentration der G-Gruppe. r 2 (G) =0,843, r 2 (GO) =0,939. Maßstabsleisten a , b 200 nm, c , d 100 μm, e 50 μm. r , Korrelationskoeffizient

Wenn die Konzentration höher als 10 µg/ml war, hemmten G oder GO das Wachstum von BMSCs. Die Zytotoxizität war in der 1000 µg/ml-Gruppe am höchsten und zeigte sich dosisabhängig. Wenn die Konzentration höher als 10 µg/ml war, war die Zytotoxizität der GO-Gruppe höher als die der G-Gruppe bei der gleichen Konzentration. Der Unterschied war mit zunehmender Konzentration signifikanter (Abb. 1f).

Unter der Beobachtung von SEM waren die BMSCs in gutem Zustand mit guter Haftung und Form, wenn die Konzentration von G oder GO 10 &mgr;g/ml betrug. Wenn die Konzentration von G mehr als 50 &mgr;g/ml betrug, wurde festgestellt, dass sich die Zellen veränderten, einschließlich einer Abnahme der Größe, einer Zunahme der Oberflächensekretion und einer Verlängerung der Mikrovillus an der Zelloberfläche. Wenn die GO-Konzentration mehr als 50 μg/ml betrug, wurden BMSCs geschrumpft und deformiert gefunden und die meisten Zellen waren tot. Diese Ergebnisse zeigten, dass GO bei gleicher Konzentration eine höhere Zytotoxizität gegenüber BMSCs hatte als G (Abb. 2).

SEM-Bilder der Kokultur von G-, GO- und BMSCs. a G-Gruppe, 10 μg/ml. Die Zellen sind in einem guten Zustand. b G-Gruppe, 50 μg/ml. Die Zellgröße nimmt ab, die Oberflächensekretion nimmt zu und die Mikrovillus auf der Zelloberfläche wird lang. c GO-Gruppe, 50 µg/ml. BMSCs schrumpfen und verformen sich. G Graphen, GO Graphenoxid, B BMSCs

Unter der Beobachtung von TEM fanden wir, dass G oder GO in BMSCs gelangen und sich auf dem Zellinneren ablagern könnten. Und wenn die Konzentration mehr als 50 μg/ml betrug, wurden Veränderungen der zellulären Mikroumgebung einschließlich Zellstrukturstörungen und Mikrovillus-Durcheinander festgestellt, was auf eine höhere Zytotoxizität von GO im Vergleich zur G-Gruppe hinweist (Abb. 3).

TEM-Bilder der Kokultur von G-, GO- und BMSCs. a G-Gruppe. b GO-Gruppe. Sowohl G als auch GO können zu Zellstrukturstörungen und Mikrovillus-Durcheinander auf der Zelloberfläche führen; GO verursacht Veränderungen der zellulären Mikroumgebung mit hoher Zytotoxizität

Basierend auf den Ergebnissen der SEM- und TEM-Beobachtung stellten wir fest, dass 10 μg/ml die sicherheitskritische Konzentration für G und GO war. Wenn die GO-Konzentration mehr als 10 µg/ml betrug, hatte GO eine höhere Zytotoxizität gegenüber BMSCs als G.

G- und GO-Zytotoxizität in vivo

Um die G- und GO-Zytotoxizität in vivo zu analysieren, wählen wir Skelettgewebe aus, um lokale Transplantationsumstände in der Orthopädie darzustellen und zu simulieren. Das Ergebnis der HE-Färbung des Skelettgewebes in der Kontrollgruppe und der G-Gruppe zeigte die normale Struktur mit Muskelmyofibrillen parallel zur vertikalen Achse. Im Querschnitt befand sich der myofibrilläre Abschnitt, der als dünne Flecken und Kern dargestellt wurde, am Rand der Zellen. Die oben erwähnten Veränderungen konnten auch in normalen Skelettzellen gefunden werden, was darauf hindeutet, dass G nur eine geringe Toxizität gegenüber Muskelgewebe hat.

Im Gegensatz dazu waren in der GO-Gruppe die Querlinien der Muskelfasern im Längsschnitt gebrochen und nicht klar, was die Atrophie und Nekrose des Muskels offenbarte. Somit hatte GO eine höhere Toxizität für Tiere (Abb. 4).

Gewebeschnitte gefärbt mit HE-Färbung. a Die Kontrolle steht für unverletztes Gewebe. b G-Gruppe. Skelettzellen als gerader Streifen vorhanden. Die Muskelmyofibrillen sind entlang der Längsachse parallel, die Querlinien sind klar und der Querschnitt besteht aus unregelmäßigen Blöcken. Der myofibrilläre Abschnitt präsentiert sich als dünne Flecken; Kern befindet sich am Rand. c GO-Gruppe. Querlinien der Muskelfasern im Längsschnitt sind gebrochen und nicht klar

Antibakterielle Eigenschaften von G und GO

Antibakterielle Fähigkeit in vitro

Im Bakteriostase-Experiment in vitro zeigte sich die Photonenintensität des ROI von G oder GO dosisabhängig. Und die Photonenintensität nahm mit steigender Konzentration ab. Im Vergleich zur G-Gruppe bei gleicher Konzentration hatte die GO-Gruppe eine geringere Photonenintensität (Abb. 5).

Intensitätsüberwachung der Biolumineszenz von S . aureus in vitro. G und GO zeigen in vitro eine dosisabhängige antibakterielle Fähigkeit. a Biolumineszenz von Xen-29 in vitro nach 0, 8 und 24 h Inkubation bei 37 °C abgebildet, mit Farbvariationen, die die Lichtintensität repräsentieren (Bin M(8), FOV12, f1, 15 s). b PI =0 h, r 2 (GO-0 h) =0,924. c PI =8 h, r 2 (G-8 h) =0,584, r 2 (GO-8 h) =0,960. d PI =24 h, r 2 (G-24 h) =0,616, r 2 (GO-24 h) =0,943.*P <0,01 mit Kontrollgruppe, ^# P <0,01 mit Kontrollgruppe, ^{☆, □, △, ○} P <0,01 bei gleicher Konzentration der G-Gruppe. r , Korrelationskoeffizient

Nach 0, 8 und 24 h, wenn die Konzentrationen von G 100, 500 und 1000 &mgr;g/ml betrugen, zeigte G im Vergleich zur Kontrollgruppe die Fähigkeit zur Hemmung des Xen-29-Wachstums. Die Photonenintensität in den 10 und 50 µg/ml Gruppen zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Wenn die Konzentrationen von GO 50, 100, 500 und 1000 μg/ml betrugen, zeigte GO nach 0, 8 und 24 h die Wirkung einer Wachstumshemmung gegenüber Xen-29. Ebenso zeigte die Photonenintensität in den 10 und 50 µg/ml-Gruppen keinen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Die Ergebnisse zeigten, dass G die antibakterielle Fähigkeit bei einer Konzentration von mehr als 100 µg/ml aufwies und GO die antibakterielle Fähigkeit bei einer Konzentration von mehr als 50 µg/ml zeigte. Die antibakterielle Fähigkeit von G oder GO war dosisabhängig. GO hatte im Vergleich zu G bei gleicher Konzentration eine stärkere antibakterielle Wirkung.

Antibakterielle Fähigkeit in vivo

Im Bakteriostase-Experiment in vivo zeigte die GO-Gruppe einen signifikant niedrigeren Photonenintensitäts-(PI)-Wert bei 0 und 24 h. Der PI-Wert war im Vergleich zur G-Gruppe und Kontrollgruppe erniedrigt. Der PI-Wert der G-Gruppe unterschied sich jedoch statistisch nicht signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe (Fig. 6). Die Ergebnisse zeigten, dass GO eine starke antibakterielle Wirkung zeigte, aber G zeigte keine offensichtliche antibakterielle Wirkung in vivo bei einer Konzentration von 100 μg/ml.

Intensitätsüberwachung der Biolumineszenz von S . aureus in vivo. GO zeigt in vivo eine dosisabhängige antibakterielle Fähigkeit. a Biolumineszenz von Xen-29 in vivo nach 0 und 24 h Inkubation, mit Farbvariationen, die die Lichtintensität repräsentieren (Bin M(8), FOV12, f1, 60 s). b PI =0 h, ^# P <0,01 mit Kontrollgruppe. c PI =24 Stunden, ^# P <0,01 mit Kontrollgruppe

Diskussion

Mit der Entwicklung des Tissue Engineering werden immer mehr Biomaterialanwendungen im Bereich der orthopädischen Behandlung eingesetzt [41]. Für Biomaterialien ist eine gute Biosicherheit erforderlich. G und GO werden aufgrund ihrer Sicherheit und ihrer einzigartigen physikalischen und chemischen Eigenschaften im medizinischen Bereich weit verbreitet verwendet. Im Hinblick auf die antibakterielle Wirkung sind G und GO die guten antibakteriellen Substanzen. Die wichtigsten antibakteriellen Mechanismen sind der Ladungstransfer [28, 29] und das Eindringen in die Zellen [30]. Somit könnte die antibakterielle Fähigkeit von G und GO die Anforderungen an Knochenreparaturmaterialien unterhalb der sicheren Bereiche erfüllen.

In dieser Studie beobachteten wir zur Identifizierung der Biosicherheitseigenschaften eine zytotoxische Wirkung von G und GO gegenüber BMSCs durch SEM und TEM, und diese Wirkung wurde dosisabhängig dargestellt. Darüber hinaus hatte GO eine höhere zytotoxische Wirkung. Im Hinblick auf die antibakteriellen Eigenschaften beobachteten wir weiterhin, dass G und GO dosisabhängig antibakterielle Eigenschaften aufwiesen und die GO-Wirkung in vivo signifikant besser war als die von G. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Konzentration im Bereich von 50 bis 100 μg/ml möglicherweise besser ist, um das Gleichgewicht zwischen geringer zytotoxischer Wirkung und großer antibakterieller Wirkung zu halten.

Diese Forschung zeigte, dass sowohl G als auch GO die zytotoxische Wirkung gegenüber BMSCs und Skelettzellen aufweisen und die GO-Toxizität höher ist als die von G. Eine Vielzahl von Studien haben die G-Nanozelltoxizität und ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften des Materials (wie z Größe, Form und funktionelle Oberflächengruppen) in Richtung Zellen [35, 42, 43]. Außerdem fanden die Forscher heraus, dass Pristine G durch die Erschöpfung des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) und die Zunahme der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) [12] Zytotoxizität induzieren kann, wodurch Apoptose durch Aktivierung des mitochondrialen Signalwegs ausgelöst wird [34, 44] . Das Phänomen, dass die Zytotoxizität von GO höher ist als die von G, kann jedoch mit den auf der Oberfläche von GO enthaltenen Gruppen in Verbindung gebracht werden [45]. Forscher haben herausgefunden, dass die Zytotoxizität von GO direkt mit dem Serumgehalt zusammenhängt. Hu W et al. zeigten, dass GO eine starke Adsorptionskapazität besitzt, die Serumprotein adsorbieren kann, um Proteineinschlüsse zu bilden [46], was die höhere zytotoxische Basis von GO im Vergleich zu G demonstriert. Unsere Experimente bestätigten die oben genannten Schlussfolgerungen. Außerdem ist die Tiertoxizität ein weiterer wichtiger Indikator für die Bewertung der biologischen Sicherheit von G und GO. In dieser Studie wurde in der GO-Gruppe eine schwerwiegende pathologische Reaktion im Muskelgewebe gefunden, was auf ihre höhere Toxizität im Vergleich zur G-Gruppe hinweist.

Zweitens stimmen die antibakteriellen Eigenschaften mit den Dosisänderungen von G und GO überein; 50~100 μg/ml GO-Konzentration könnte biologische Toxizität und antibakterielle Fähigkeit besser ausgleichen. Unsere Studien zeigten, dass sowohl die biologische Toxizität als auch die antibakterielle Fähigkeit dosisabhängig auftreten. Daher kann ein gewisser Konzentrationsbereich das Gleichgewicht zwischen geringer biologischer Toxizität und großer antibakterieller Wirkung halten.

Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl G als auch GO eine gewisse biologische Toxizität gegenüber BMSCs und Muskelgewebe aufwiesen, aber in der GO-Gruppe war die antibakterielle Fähigkeit in vivo signifikant. Basierend auf den früheren Ergebnissen der G- und GO-Toxizität haben wir festgestellt, dass die Konzentration von 50 bis 100 μg/ml möglicherweise die bessere ist, um das Gleichgewicht zwischen geringer biologischer Toxizität und großer antibakterieller Wirkung zu halten, was neue Beweise für die Biosicherheit und antibakterielle Wirkung liefert Fähigkeit von G und GO in vivo und in vitro in der klinischen Arbeit.

Obwohl GO eine starke toxische Wirkung hat, kann die Toxizität durch Modifikationen von GO vermieden werden [47, 48]. Gleichzeitig können modifizierte GO-Materialien im Körper abgebaut und ausgeschieden werden [49]; daher wird eine neue Forschungsrichtung der Modifikation für GO gedrängt. Darüber hinaus müssen die Wirkungen von G und GO auf andere wichtige Organe oder Gewebe noch weiter erforscht werden, um die ganzheitliche Medizin zu erreichen. Ob GO die Bakterien durch oxidativen Stress schädigt und ob zusätzliche antibakterielle Mechanismen vorhanden sind, muss weiter untersucht werden. Vor der Anwendung auf das Tissue Engineering müssen die Mechanismen der G- und GO-Toxizität und modifizierte Methoden zur Verringerung der Toxizität noch genauer geklärt werden.

Methoden

Tiere

Männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten und männliche Balb/C-Mäuse wurden vom Pasteur Institute of Iran bezogen und unter 12 h Hell/Dunkel-Bedingungen bei 25 °C gehalten. Zur Isolierung der BMSCs wurden SD-Ratten im Alter von 4 Wochen verwendet. Balb/C-Mäuse wurden für Tierversuche in vivo verwendet. Alle Tiere wurden im Labortierzentrum der Vierten Militärmedizinischen Universität aufgezogen, und die Operationen wurden nach dem tierexperimentellen Chirurgiestandard des Xijing-Krankenhauses durchgeführt. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Fourth Military Medical University genehmigt.

Graphen und Graphenoxid

G oder GO (Schichten 1–2) (Hengqiu Graphene Technology, China) wurde jeweils in absolutes Ethanol (verwendet für Transmissionselektronenmikroskop-Test, TEM), PBS-Puffer (verwendet für in vitro-Zellexperimente) und Kochsalzlösung (verwendet für in vivo-Tierversuche), um die G- oder GO-Lösung herzustellen (das Testergebnis der Raman-Spektroskopie wurde von Hengqiu Graphene Technology bereitgestellt). Die Anfangskonzentration der G- oder GO-Lösung betrug 1 mg/ml. G- oder GO-Lösung wurde 2 h vor den Experimenten mit Ultraschall dispergiert.

Zytotoxizität

Zellkultur

Das Zellkulturmedium enthielt 10 % fötales Rinderserum (Gibco, Carlsbad, Kalifornien, USA), DMEM/F12 (Corning, NY, USA), 100 E/ml Penicillin und 100 E/ml Streptomycin (Sigma, St. Louis, Missouri, USA). BMSCs wurden aus den 4 Wochen alten männlichen Ratten nach der Methode der Knochenmarkkultur extrahiert [50]. Nach der Hinrichtung der Ratte wurden Femur und Tibia unter aseptischen Bedingungen entfernt. Die Markhöhle wurde mit Zellkulturmedium gewaschen; dann wurde das Gemisch 10 min bei 1500 U/min zentrifugiert, um Knochenmark zu sammeln. Knochenmark wurde mit Zellkulturmedium resuspendiert und in gelatinebeschichtete Zellkulturflaschen bei 37 °C und 5% Kohlendioxid-Zellinkubator inokuliert. Das Medium in Zellkulturflaschen wurde nach 48 h gewechselt und nicht anhaftende Zellen wurden entfernt; dann wurde das Kulturmedium alle 48 h gewechselt. Zellen der dritten bis fünften Passage wurden für die nächsten Experimente verwendet.

Osteogene Differenzierung und adipogene Differenzierung auf BMSCs wurden mit Differenzierungsmedium (Cyagen, CA, USA) durchgeführt. Nach 2 Wochen Differenzierungsinduktion wurden die Zellen mit 4% Formaldehydlösung für 30 min fixiert; dann wurden eine Alizarinrot-Färbung zur osteogenen Differenzierung und eine Ölrot-Färbung zur adipogenen Differenzierung durchgeführt.

Zellenaktivität

Die Konzentration der BMSC-Suspension wurde auf 5 × 10 ⁴ . eingestellt /l und Zellen wurden in einer 96-Loch-Platte mit 100 &mgr;l in jedem Loch kultiviert. Nach 24 h wurde das Medium durch Zellkulturmedium ersetzt, das G oder GO mit den Konzentrationen 0 (als Kontrollgruppe), 10, 50, 100, 500 und 1000 µg/ml enthielt. Nach 24 h Kultur wurden 10 µl alamarBlue (Bio-rad, Hercules, CA, USA) für weitere 4 h Kultur in jedes Loch gegeben. Eine Mikrotiterplatte (Bio-rad, Hercules, CA, USA) wurde verwendet, um die OD-Werte (optische Dichte) bei 570 und 600 nm zu bestimmen, und dann wurde der kolorimetrische Rechner alamarBlue® (Bio-rad, Hercules, Kalifornien, USA) verwendet, um Bewerten Sie die Rate der Zellproliferation.

Charakterisierung mit SEM

BMSCs wurden in eine 24-Loch-Dünnglasplatte mit 0,17 mm Dicke und 14 mm Durchmesser geimpft. Nach 24 h Kultur wurde das Medium durch Zellkulturmedium ersetzt, das G oder GO mit den Konzentrationen 0 (als Kontrollgruppe), 10, 50, 100, 500 und 1000 µg/ml enthielt. Die Zellen wurden 24 h weiter kultiviert und der Überstand wurde danach entfernt. Die Zellen wurden 24 h mit 2,5% Glutaraldehydlösung fixiert. Dann wurden die Zellen nach der Dehydratisierung und Vergoldung mit einem Rasterelektronenmikroskop (Hitachi S-4800 SEM, JPN) beobachtet.

Charakterisierung mit TEM

G- und GO-Suspension wurden auf 50 µg/ml eingestellt. Die Zellen wurden 24 h mit G oder GO cokultiviert und dann mit 0,25% Trypsin verdaut. Der Überstand wurde nach Zentrifugation mit 1000 U/min für 10 min entfernt. Die Zellen wurden 24 h mit 2,5 % Glutaraldehydlösung fixiert und die Schnitte wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (FEI Tecnai G2 TEM, USA) beobachtet.

Toxizität und Identifizierung von Muskelgewebe

Um die G- und GO-Zytotoxizität in vivo zu analysieren, wählen wir Skelettgewebe aus, um lokale Transplantationsumstände in der Orthopädie darzustellen und zu simulieren. G oder GO wurde jeweils in das mediale femorale Muskelgewebe von Balb/C-Mäusen injiziert. Die Mäuse wurden nach 7 Tagen getötet und mit G oder GO injiziertes Muskelgewebe wurde 24 h lang mit 10 % neutraler Formaldehydlösung fixiert. Nach der Alkoholdehydratation wurde das Gewebe in Paraffin gewickelt und in Scheiben geschnitten, um eine Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbung durchzuführen. Die Schnitte wurden unter einem inversen Mikroskop (Leica DMI6000B inverses Mikroskop, RBT) betrachtet.

Antibakterielle Fähigkeit

Bakterienkultur

Wir haben Xen-29 aufgrund seiner Lumineszenzreaktion für die Kultivierung ausgewählt. Xen-29 war ein biolumineszierendes Bakterium von Staphylococcus aureus (Caliper, LS, USA), abgeleitet von ATCC-12600. Bakterien wurden in Luria Bertani-Medium (LB, Sigma, St. Louis, MO, USA), das 200 &mgr;g/ml Kanamycin (Sigma, St. Louis, MO, USA) enthielt, bei 37 °C kultiviert. Eine einzelne Kolonie wurde in LB-Brühe bei 37 °C unter Schütteln für 2–3 h bei einer Geschwindigkeit von 200 U/min aufgenommen. Als die Extinktion bei 600 nm 0,5 erreichte (entspricht ungefähr 1,44 × 108 KBE/ml) verglichen mit der Extinktion in der LB-Bouillon-Blindprobe, wurden die Bakterien für das nächste Experiment verwendet.

Biolumineszenz-Bildgebung

Um die biolumineszente Bildgebung zu präsentieren, verwendeten wir das gekühlte optische makroskopische CCD-Bildgebungssystem IVIS Lumina II (Caliper, LS, USA). Bakterielles Biolumineszenzsignal wurde in Photonenintensität (PI) umgewandelt. Die Software Living Image® 4.2 (Caliper, LS, USA) wurde zur Quantifizierung von PI in Regionen von Interesse (ROI) verwendet. Um eine Bewegung der Mäuse während des Bildgebungsprozesses zu verhindern, wurden die Mäuse anästhesiert, um eine Instabilität des empfangenen Signals zu vermeiden.

Antibakterielle Fähigkeit in vitro

Xen-29 wurde in die 24-Loch-Platte gegeben und die Konzentration in jedem Loch betrug 10 ⁷ cfu. Dann wurde G- oder GO-Suspension zugegeben, um die Konzentration auf 0 (Kontrolle), 10, 50, 100, 500 und 1000 &mgr;g/ml einzustellen. Das konstante Volumen in jedem Loch betrug 500 &mgr;l. Um die antibakterielle Fähigkeit von G und GO zu analysieren, wurde der bakterielle PI im ROI sequenziell 0, 8 und 24 Stunden nach der Intervention gemessen.

Antibakterielle Fähigkeit in vivo

Basierend auf den obigen Versuchsergebnissen wurde eine 100 &mgr;g/ml-Gruppe ausgewählt, um die antibakterielle Fähigkeit zu identifizieren. Xen-29-Suspension (200 &mgr;l) wurde in das mediale Oberschenkelmuskelgewebe von Balb/C-Mäusen injiziert. PI des ROI wurde 0 und 24 Stunden nach der Operation festgestellt.

Datenanalyse

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Schüler t Test wurde zum Vergleich zwischen G und GO mit der gleichen Konzentration verwendet. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen G und GO mit jeweils unterschiedlicher Konzentration zu vergleichen. P <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass G und GO dosisabhängig eine gewisse biologische zytotoxische Wirkung haben. G und GO haben antibakterielle Eigenschaften und wirken auch dosisabhängig; die antibakteriellen Eigenschaften von GO sind signifikant besser als die von G in vivo. Die Konzentration von 50~100 μg/ml kann besser sein, um das Gleichgewicht zwischen geringer biologischer Toxizität und großer antibakterieller Wirkung zu halten. Darüber hinaus müssen Modifikationen von GO zur Verringerung der Toxizität geklärt werden, um zu G- und GO-Anwendungen in der Nanomedizin beizutragen.

Abkürzungen

BMSCs:

Mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks

G:

Graphen

GO:

Graphenoxid

ER:

Hämatoxylin und Eosin

LB:

Luria Bertani mittel

NPs:

Nanopartikel

PI:

Photonenintensität

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

SEM:

Rasterelektronenmikroskop

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie