Materialien der Graphenfamilie in der Knochengeweberegeneration:Perspektiven und Herausforderungen

Einführung

Opfer einer schweren maxillofazialen Infektion, eines Traumas, eines Tumors und einer angeborenen Deformität mit Kieferknochendefekten benötigen normalerweise eine längere Rekonvaleszenz. Im Gegensatz zu vielen anderen Geweben besitzt der Knochen eine hervorragende Regenerationsfähigkeit, wenn er geschädigt ist [1, 2]. Die begrenzte Selbstregenerationskapazität des menschlichen Skeletts macht die Rekonstruktion von ausreichend großen oder kritischen Knochendefekten jedoch zu einer erheblichen Herausforderung für die klinische Therapie [3]. In einigen Fällen benötigen die schweren Patienten sogar umfangreiche Knochenaufbauoperationen. Aktuelle Therapien zur Knochenregeneration bestehen aus Autotransplantaten, Allotransplantaten und Xenotransplantaten [4]. Autologer Knochen gilt als „Goldstandard“-Knochentransplantatmaterial mit den Fähigkeiten der Osteokonduktion, Osteoinduktion und Osteogenese, auch ohne Immunogenität. Die Gründe, warum Autotransplantate jedoch immer noch auf die klinische Anwendung beschränkt sind, sind das Risiko einer Spenderinfektion und die lange Genesungszeit [5]. Allograft, das von einer anderen Person gewonnen wurde, wird oft als die nächstbeste Option angesehen. Die Verwendung von Allotransplantaten birgt jedoch potenzielle Risiken wie ein dramatisch erhöhtes Infektionsrisiko und eine Immunabstoßung [4, 6]. Xenotransplantatmaterialien, wie säureverdaute demineralisierte Knochenmatrix und Rinderkollagen, können leicht erhalten und hergestellt werden. Xenograft ist heute ein Hauptansatz in der klinischen Praxis. Es hat jedoch geringe osteoinduktive Kapazitäten [7]. Im Vergleich zum Knochen gibt es derzeit keine heterologen oder synthetischen Knochenersatzstoffe mit überlegenen oder gar gleichen biologischen oder mechanischen Eigenschaften [5]. Obwohl sich diese Therapien als nützlich erwiesen haben, leiden sie unter inhärenten Herausforderungen. Daher muss eine adäquate Knochenregenerationstherapie noch erforscht und entwickelt werden. Zugegeben, Knochengewebe-Engineering und regenerative Medizinforschung eröffnen Wege zur Verbesserung der Ergebnisse und zur Beschleunigung der Genesung von Patienten mit Knochendefekten [8]. Tissue-Engineering Knochenkonstrukte haben das Potenzial, die Nachfrage zu mindern, die sich aus der Knappheit an geeigneten autologen und allogenen Transplantatmaterialien zur Augmentation der Knochenheilung ergibt [9]. Um das Knochenvolumen in Knochendefektbereichen zu erhöhen, wurden verschiedene Methoden zur Knochenregeneration entwickelt, darunter Scaffolds [1, 6], Beschichtungen [10] und Barrieremembranen für die geführte Knochenregeneration (GBR) [11, 12].

Gegenwärtig hat das Potenzial von Materialien der Graphenfamilie als 2D-Planarbeschichtung oder 3D-poröse Gerüste für die Differenzierung verschiedener Arten von Stammzellen in Richtung neurogen [13,14,15], chondrogen [16, 17], myogen [18] enorme Aufmerksamkeit erregt. , adipogene [19] und osteogene Abstammungslinien [20, 21]. Daher sind Materialien der Graphenfamilie eher ein Kandidat der Wahl für die nächsten Materialien zur Knochenregeneration. Graphen, definiert als einzelne oder wenige Schichten von sp ² -hybridisierten Kohlenstoffatomen, wurde erstmals 2004 von Novoselov und Geim aus Graphit isoliert [22]. Mit zunehmendem Forschungsinteresse werden Materialien der Graphenfamilie, einschließlich Graphenoxid (GO), Carboxylgraphen (CXYG), reduziertes Graphenoxid (rGO) und Graphenquantenpunkte (GQDs), intensiv untersucht. Graphen besitzt außergewöhnliche mechanische, leitfähige, thermische und optische Eigenschaften [23,24,25], die in der Elektronik, Biotechnologie und Polymerwissenschaft weit verbreitet sind [26]. Es ist anerkannt, dass leitfähige Materialien mit vielversprechender Leitfähigkeit die Zellaktivitäten verbessern und die Knochengewebereparatur stimulieren [27, 28], wobei sie auch eine gute antibakterielle Aktivität aufweisen [29]. Graphenoxid (GO) und Carboxylgraphen (CXYG) sind beides Derivate von Graphen. Aufgrund des Vorhandenseins von sauerstoffhaltigen funktionellen Gruppen (Epoxid-, Carboxyl- und Hydroxylgruppen) weisen GO und CXYG eine bessere Dispersion in hydrophilen Lösungsmitteln auf, was für biomedizinische Anwendungen unerlässlich ist [30, 31]. Reduziertes Graphenoxid (rGO) kann durch Reduktion von GO mit spezifischen Reduktionsmitteln unter bestimmten Bedingungen synthetisiert werden. Dank der Reduzierung einiger spezieller chemischer -π-Wechselwirkungen besitzt rGO bestimmte bessere physikalische und chemische Eigenschaften als Graphen und GO [32, 33]. Der Rohstoff für Graphen-Quantenpunkte (GQDs) ist GO. GQDs haben starke Quanteneinschränkungen und Photolumineszenzeigenschaften [34]. Die starke Fluoreszenz der GQDs macht sie für die zelluläre Bildgebung nützlich. Aufgrund der hervorragenden Eigenschaften der Materialien der Graphenfamilie besitzen sie ein enormes Potenzial für die Wirkstoff-/Genabgabe, biologische Sensorik-/Bildgebungsanwendungen und Tissue Engineering [35,36,37,38,39]. Es bestehen jedoch immer noch Herausforderungen hinsichtlich der langfristigen Biosicherheit und der Fähigkeit, die osteogene Differenzierung der Zellen von Materialien der Graphenfamilie zu induzieren. Hier geben wir einen umfassenden Überblick über die jüngsten Fortschritte und Errungenschaften bei Graphen und seinen Derivaten. Gleichzeitig analysieren wir kritisch die Biosicherheit in vitro und in vivo und diskutieren die Machbarkeit verschiedener biomedizinischer Anwendungen von Materialien der Graphenfamilie für die Regeneration von Knochengewebe.

Herausforderungen bei der Bestimmung der Biosicherheit von Materialien der Graphenfamilie

Herausforderungen bei der Bestimmung der In-vitro-Biosicherheit

Bevor Materialien der Graphenfamilie für klinische Studien in Betracht gezogen werden, sollten sie streng auf ihre Zytotoxizität und Biokompatibilität untersucht werden [38]. „Ist Graphen ein biokompatibles Material?“ Die Antwort ist noch umstritten. Das rohe Graphen ohne jegliche Funktionalisierung ist hydrophob und agglomeriert leicht in wässrigen Medien [34, 40]. Auf hydrophoben Oberflächen kann eine dichte Schicht unspezifischer Proteine ​​Wasser von der Oberfläche verdrängen und sich sofort auf den Materialien anlagern, was zu einer immunologischen Erkennung der Nanopartikel führt [41]. Daher ist eine chemische Funktionalisierung, einschließlich Oxidation, Reduktion und Einführung funktioneller Gruppen, eine Voraussetzung für Graphen, das in biomedizinischen Anwendungen verwendet wird, was die Hydrophilie von Graphen erhöht. Materialien der Graphenfamilie mit unterschiedlichen Funktionalitäten und unterschiedlichen chemischen Eigenschaften üben unterschiedliche Toxizitäten aus [13]. Soumen et al. fanden heraus, dass rGO weniger toxisch ist als GO. Es war interessant zu sehen, dass oxidativer Stress mit zunehmender Dichte der funktionellen Sauerstoffgruppen auf der rGO-Oberfläche zunahm. Sie kamen zu dem Schluss, dass die Dichte der funktionellen Gruppen auf dem GO-Faltblatt einer der Schlüsselfaktoren bei der Vermittlung der zellulären Zytotoxizität ist [31]. Abgesehen von der Oberflächenfunktionalisierung wurde die Zytotoxizität von Materialien der Graphenfamilie von zahlreichen Faktoren beeinflusst, einschließlich ihrer Konzentration, Größe und Form [42].

Erstens zeigten einige Untersuchungen, dass Materialien der Graphenfamilie eine dosisabhängige Zytotoxizität mit oder ohne zeitabhängiger Zytotoxizität aufweisen. Chang et al. berichteten, dass bei hohen Konzentrationen von GO (≥ 50 μg/ml) ein leichter Verlust der Zelllebensfähigkeit beobachtet wurde und GO eine intrazelluläre Akkumulation induzieren und einen dosisabhängigen oxidativen Stress in einer Lungenkarzinom-Epithelzelllinie verursachen kann (A549) [43]. Weiet al. zeigten, dass reines GO die Proliferation von mesenchymalen Knochenstammzellen (BMSCs) bei einer hohen Konzentration von 10 μg/ml hemmte, während es die Proliferation von BMSCs bei einer niedrigen Konzentration von 0,1 μg/ml verstärkte [44]. Ebenso wurde bei 200 µg/ml GO eine deutliche Abnahme der Zellzahl und bei 300 µg/ml GO eine stärkere zytotoxische Wirkung berichtet [45]. Darüber hinaus haben Kim et al. fanden heraus, dass die Lebensfähigkeit von Präosteoblasten (MC3T3-E1) durch rGO bei Konzentrationen von < 62,5 μg/ml leicht beeinflusst wurde, jedoch signifikant (p <  0,05) bei höheren Konzentrationen (≥  100 μg/ml) verringert [23]. Darüber hinaus zeigten CXYG und GQDs beide ein geringes zytotoxisches Potenzial, wenn sie in niedrigen Konzentrationen verabreicht wurden [34, 46]. Einfach ausgedrückt, Materialien der Graphen-Familie sind bei niedrigen Konzentrationen zytokompatibel mit geringem negativen Einfluss auf Zellmorphologie, Lebensfähigkeit und Proliferation, aber die Konzentration ist nicht der einzige relevante Faktor.

Zweitens wird darauf hingewiesen, dass die unterschiedlichen Formen wie Schichten, Nanoblätter und -flocken, Bänder und Punkte auch zur Komplexität der Zytotoxizität der Graphenfamilie beitragen [40]. Talukdaret al. untersuchten die Zytotoxizität von Graphen-Nano-Zwiebeln (GNOs), GO-Nanobändern (GONRs) und GO-Nanoplättchen (GONPs). Die CD₅₀ Werte folgten dem Trend GNOs> GONRs> GONPs, was darauf hindeutet, dass GONRs im Vergleich zu GONPs zytotoxischer waren [47]. Daher ist die Form der Nanomaterialien der Graphenfamilie auch eine Schlüsselkomponente bei der Vermittlung von Zytotoxizität. Graphen und mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren (MWNTs) haben beispielsweise unterschiedliche Formen (flache Atomblätter für Graphen und röhrenförmige für Nanoröhren), aber ihre chemische Zusammensetzung und kristalline Struktur sind ähnlich. GO zeigte die zellwachstumshemmende Aktivität von SK-N-SH-Zellen erst bei 50 μg/ml. Im Vergleich dazu hemmten MWCNTs die Proliferation der Zelle bei niedriger Konzentration (6,7 μg/ml), was auf ihre akute Zytotoxizität hinweist. Bei HeLa-Zellen zeigte GO selbst bei Konzentrationen von bis zu 50 μg/ml eine geringe wachstumshemmende Aktivität, während MWCNTs eine mäßige Zytotoxizität auf HeLa-Zellen aufwiesen [48]. Sie beruhten dieses Phänomen auf ihrer unterschiedlichen Form und unterschiedlichen physikalisch-chemischen Vorgehensweisen. Es wurde erwartet, dass Materialien der Graphen-Familie aufgrund der flachen Formen eine geringe Wechselwirkung mit den Zellmembranen aufweisen. Die röhrenförmige Form von MWCNTs förderte die Penetration von Membranen, was zu Zytotoxizität führte [48,49,50]. Eine weitere wichtige Information ist, dass die Zytotoxizität von nanostrukturierten Graphenderivaten neben der Funktionalisierung, Konzentration, Größe und Form auch vom Zelltyp abhängt. Als neurale Zelllinie zeigten SK-N-SH-Zellen eine höhere Empfindlichkeit als HeLa-Zellen gegenüber den nachteiligen Wirkungen nanostrukturierter Graphen-Derivate [48].

Drittens spielt die Größe auch eine wichtige Rolle für die Biosicherheit von Materialien der Graphenfamilie. Yoon et al. bewerteten die größenabhängige zytotoxische Wirkung von Graphen-Nanoflocken über einen zellbasierten elektrochemischen Impedanz-Biosensor. Sie fanden heraus, dass die kleineren Graphen-Nanoflocken (30,9 ± 5,4 nm) aufgrund der höheren Aufnahme durch Zellen Apoptose induzierten, während die größeren Graphen-Nanoflocken (80,9 ± 5,5 nm), die sich hauptsächlich auf Zellmembranen aggregierten, eine geringere Toxizität verursachten [51]. Es ist bekannt, dass die zellulären Aufnahmeeigenschaften von Nanomaterialien die Zellproliferation, -differenzierung und -ausscheidung von Nanopartikeln beeinflussen können [52]. Muet al. erarbeiteten die wahrscheinlichen größenabhängigen Aufnahmemechanismen von proteinbeschichteten GO-Nanoblättern und beobachteten, dass größere Nanoblätter (860 ± 370 nm) zuerst an der Zelloberfläche hafteten, gefolgt von Membraninvagination, Ausbreitung von Pseudopodien und schließlich hauptsächlich durch Phagozytose in die Zellen gelangten, während kleinere Nanoblätter ( 420 ± 260 nm) traten hauptsächlich durch Clathrin-vermittelte Endozytose in Zellen ein [33]. Daset al. humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) in 10 μg/ml GO und rGO mit unterschiedlich großen Blättern (800 nm und 400 nm) aussäen. Die Ergebnisse zeigten, dass die kleineren Blätter im MTT-Assay toxischer waren als die größeren. Anschließend wurden die größeren GO und rGO (800 nm) mit Ultraschall behandelt, um sie in kleinere Größen (70 nm) aufzuteilen. Nach der Ultraschallbehandlung wurde eine erhöhte Zytotoxizität beobachtet, was darauf hindeutet, dass die kleineren GO und rGO eine höhere Toxizität aufwiesen [31]. In ähnlicher Weise wurden MCF7-Zellen vier großen Proben von GO ausgesetzt (744 ±   178 nm, 323 ±   50 nm, 201 ±   28 nm und 100 ±   10 nm). Im Vergleich zu den unbehandelten Zellen wurde in vitro selbst nach 72-stündiger Exposition gegenüber den größeren GO-Dispersionen (744 ± 178 nm) keine Zytotoxizität beobachtet, während die Behandlung mit 100 ± 10 nm großen GO-Dispersionen zu einer Abnahme der Zellproliferation führte auf etwa 50 % der unbehandelten Zellen [53]. Aus den obigen Ergebnissen wurde ein breites Größenspektrum von Materialien der Graphenfamilie von 30 bis 860 nm untersucht. Und wir scheinen zu dem Schluss zu kommen, dass Materialien der Graphenfamilie kleinerer Größe giftiger sind als größere. Aber ein anderes Team hat einen anderen Standard, um die Größenskala von Graphen und seinen Derivaten zu definieren. Daher ist diese Schlussfolgerung möglicherweise umstritten. Inzwischen wurde berichtet, dass Materialien der Graphenfamilie in Nanogröße für biomedizinische Anwendungen viel sicherer sind [54]. Die größenkontrollierte Synthese von Materialien der Graphenfamilie muss in nachfolgenden Forschungen mit Bedacht berücksichtigt werden.

Daraus wird geschlossen, dass die Zytotoxizität von Graphen entscheidend mit der Vielfalt der Graphenfamilie, der chemischen Funktionalisierung, Konzentration, Form und Größe zusammenhängt. In Zukunft wollen wir biokompatible Geräte mit besseren Interaktionen mit Zellen, Geweben oder Organismen durch bessere Kontrolle von Konzentration und Größe herstellen, indem wir die Graphenfamilie mit verschiedenen Arten von funktionellen Gruppen modifizieren.

Herausforderungen bei der Bestimmung der Biosicherheit und Bioverteilung in vivo

Um weiter zu erkennen, ob Materialien der Graphenfamilie biokompatible Materialien sind, und um die vorgeschlagene Verwendung in weit verbreiteten Anwendungen zu verbessern, sind In-vivo-Experimente eine unverzichtbare Methode. Viele Untersuchungen zur Biokompatibilität und Bioverteilung von Materialien der Graphenfamilie in vivo stimmen fast mit ihren zellulären Studien überein. Chowdhuryet al. applizierten Zebrafischembryonen auf größere GO-Dispersionen und fanden keine erhöhte Mortalität des Embryos im Vergleich zur Kontrollgruppe, während in den kleineren GO-Dispersionen eine reduzierte Lebensfähigkeit des Embryos beobachtet wurde [53]. GO führte zu keinem signifikanten Anstieg der Apoptose im Embryo, während MWCNTs selbst bei relativ niedrigen Konzentrationen von 25 mg/L zu schwerwiegenden morphologischen Defekten in sich entwickelnden Embryonen führten [48]. Diese Studien zeigten ferner, dass die in-vivo-Toxizität stark von den Größen, Konzentrationen und Formen von Graphen und seinen Derivaten abhängt. Darüber hinaus werden Materialien der Graphen-Familie in der Regel Tiermodellen durch intravenöse Injektion, Inhalation oder subkutane Implantation ausgesetzt. Daher variieren die Veränderungen der Toxizität, der allgemeinen Histologie und der Bioverteilung. Liet al. untersuchten die Toxikologie von nanoskaligem GO bei Mäusen durch intravenöse Injektion und fanden heraus, dass GO hauptsächlich in Leber, Lunge und Milz zurückgehalten wurde und Schäden, chronische Hepatitis und Lungenfibrose verursachte. Eine Polyethylenglykol (PEG)-Beschichtung von GO (GO-PEG) könnte die Retention von GO in Leber, Lunge und Milz reduzieren und die akuten Gewebeverletzungen lindern [55]. Duch et al. untersuchten Strategien zur Verringerung der toxischen Wirkung von Graphen-Nanomaterialien in der Lunge, da sie fanden, dass GO bei direkter Verabreichung in die Lunge von Mäusen eine höhere Toxizität aufwies als aggregiertes Graphen und Pluronic-dispergiertes Graphen, was schwere und anhaltende Lungenschäden verursachte. Die Toxizität wurde durch die Herstellung von reinem Graphen durch Flüssigphasen-Exfoliation signifikant gemildert und wurde durch Dispergieren mit dem Blockcopolymer Pluronic weiter minimiert [56]. Zhaet al. identifizierten die kurzzeitige (erste 2 Wochen nach der Implantation) und die langfristige (7 Monate) In-vivo-Toxizität und -Leistung von 3D-Graphenschaum (GFs) oder Graphenoxidschaum (GOFs) in einem Rattenmodell der subkutanen Implantation. Die Blutanalyse zeigte, dass GFs und GOFs nach der Implantation keine nennenswerte hämatologische, hepatische oder renale Toxizität hervorriefen und nach mindestens 7 Monaten der Implantation kein signifikanter Abbau beobachtet wurde. Es wurden nur Granulome beobachtet, die lange Zeit an der Implantationsstelle vorhanden waren. HE-gefärbte Bilder zeigten eine bessere In-vivo-Biokompatibilität (Abb. 1) [40]. Der Grund, warum Zha et al. positivere Ergebnisse als andere Studien erzielten, da die oben erwähnten unterschiedlichen Verabreichungswege wahrscheinlich sind. Subkutane Experimente waren der sehr direkte und effektive Weg, um die In-vivo-Biokompatibilität von implantierten Materialien zu beurteilen [57], die einen Einfluss auf die Kontaktmuster, Ablagerungsorte und sogar die Abbauwege der Nanomaterialien der Graphenfamilie in vivo haben können [58]. Die Kontrolle des Abbaus von Verbundwerkstoffen ist beim Tissue Engineering von entscheidender Bedeutung,

Repräsentative HE-gefärbte Bilder der wichtigsten Organe (Implantationsregion, Leber und Niere von Ratten), denen Graphenschaum, GO-Schaum oder nichts am Tag 14 nach der Implantation implantiert wurde. Es wurde kein offensichtlicher Organschaden oder -läsion beobachtet. Reproduziert aus Ref.-Nr. [40] mit Genehmigung des Journal of Nanoparticle Research

Im Allgemeinen sind zelluläre Forschungen hervorragend für eine vorläufige Zytotoxizitätsanalyse, um den wahrscheinlichen Mechanismus der Interaktion mit Zellen zu verstehen. Aber es ist eine viel kompliziertere Mikroumgebung in vivo. Das Verständnis des Verhaltens von Materialien der Graphenfamilie in feuchten korrosiven Mikroumgebungen ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Die Biokompatibilität von Materialien der Graphenfamilie hängt nicht trivial von der Konzentration, der Vielfalt der funktionellen Gruppen, den Arten der Graphenfamilie, den Größen und Formen ab. Der Mechanismus muss jedoch noch im Detail und gründlich untersucht werden. Allerdings ist die Bewertung der In-vivo-Biosicherheit vergleichsweise wenig, insbesondere die langfristige Biokompatibilität und Bioverteilung, denen wir mehr Aufmerksamkeit schenken müssen. Obwohl einige Veröffentlichungen Bedenken hinsichtlich der Biosicherheit aufkommen lassen, hat die potenzielle Vielseitigkeit, die die Graphenfamilie einzigartig bietet, sie zu einem wettbewerbsfähigen Kandidaten für biomedizinische Anwendungen gemacht.

Antibakterielle Aktivität von Materialien der Graphenfamilie

Knochenumformung und Knochenneubildung können ohne eine sterile Mikroumgebung des Knochendefekts nicht vollständig gelingen. Tatsächlich stellt die Behandlung infektiöser Knochendefekte noch immer eine große Herausforderung dar [59]. Aufgrund des großen Knochendefekts und des Infektionsproblems ist die Behandlung schwierig und die Patienten benötigen eine langfristige Erholungsphase. Daher hilft die Fähigkeit der Bakterien, Materialien der Graphenfamilie zu hemmen, sehr. Es wird angenommen, dass Materialien der Graphen-Familie antibakterielle Fähigkeiten besitzen (Tabelle 1). Liuet al. schlugen einen dreistufigen antimikrobiellen Mechanismus vor, der (1) anfängliche Zellablagerung auf Graphen-basierten Materialien, (2) Membranspannung durch direkten Kontakt mit scharfen Nanoblättern und (3) die anschließende von Superoxidanionen unabhängige Oxidation umfasst [60]. Mangadlao et al. dachte, dass die Oberfläche von Graphen in erster Linie für die antimikrobielle Aktivität verantwortlich ist und nicht die Kanten. Bei Kontakt mit Bakterien diente Graphen als Elektronenakzeptor, der das Elektron von der Membran des Bakteriums wegpumpte und einen unabhängigen oxidativen Stress erzeugte [61]. Inzwischen haben Li et al. lieferte neue Erkenntnisse zum besseren Verständnis der antibakteriellen Wirkung von Graphenfilmen. Sie vertreten die Meinung, dass die antibakterielle Aktivität von Materialien der Graphenfamilie nicht von einer Schädigung durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) herrührt, sondern über eine Elektronentransfer-Wechselwirkung von der mikrobiellen Membran auf Graphen [62], während Panda et al. bewiesen, dass ein synergetischer Einfluss des nichtoxidativen Elektronentransfermechanismus und des daraus resultierenden ROS-vermittelten oxidativen Stresses auf die Bakterien eine verstärkte antimikrobielle Aktivität natürlich gewonnener GO-Metallfilme induzierte [63].

Obwohl ungewiss bleibt, wie die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Graphen-basierten Schichten ihre antimikrobielle Aktivität beeinflussen, lohnt es sich, die antibakterielle Wirkung von Materialien der Graphen-Familie zu untersuchen und weiter zu nutzen.

Materialien der Graphen-Familie vermitteln Zellen zur osteogenen Differenzierung und fördern die Knochenregeneration in vivo

Viele Wissenschaftler haben darauf hingewiesen, dass Graphen nicht nur die Anheftung und Vermehrung von Zellen ermöglichen kann (z ], humane Osteoblasten [69], Fibroblastenzellen [70], Tumorzellen [43]) ohne Anzeichen einer offensichtlichen Zytotoxizität, können aber auch die Osteoblastendifferenzierung der frühen Zellen induzieren und einen hohen Mineralisationsgrad erzielen [20, 64, 65, 66, 67, 68]. Gegenwärtig haben zahlreiche Teams sorgfältig zahlreiche Studien durchgeführt, um neue Strategien für die Anwendung von Nanomaterialien der Graphenfamilie als Gerüst oder Additiv auf das Gerüst, als Beschichtung auf der Oberfläche des Substratmaterials, als Leitmembran für die Knochenregeneration und als Vehikel für die Wirkstoffabgabe zu entwickeln (Abb. 2). Sie versuchten, Materialien der Graphen-Familie zu verwenden, um bestimmte Eigenschaften des Substratmaterials noch weiter zu verbessern und den substratbasierten Verbundwerkstoffen einen bioaktiven Charakter zu verleihen.

A. Materialien der Graphen-Familie als Gerüst oder Verstärkungsmaterial in Gerüsten für die Knochenregeneration. B. Materialien der Graphen-Familie als Beschichtung, die auf das Substrat zur Knochenregeneration übertragen wird. C. Graphen-Familie als Additiv in der geführten Knochenmembran. D. Materialien der Graphen-Familie als Wirkstoffabgabesystem erleichtern die Knochenregeneration

Materialien der Graphenfamilie als Gerüst oder Verstärkungsmaterial im Gerüst

Die gängigste Strategie für das Knochengewebe-Engineering besteht darin, den natürlichen Prozess der Knochenumformung und -regeneration zu simulieren. Die Strategie kann durch ein dreidimensionales (3D) biokompatibles, biologisch abbaubares und osteokonduktives oder osteoinduktives Gerüst erfüllt werden [3]. Diese Art von Gerüst kann eine ideale Mikroumgebung bieten, um die extrazelluläre Matrix (ECM) für die Anheftung, Migration, Proliferation und Differenzierung osteogener Zellen sowie für die Träger von Wachstumsfaktoren nachzuahmen [6]. Graphen als vielversprechendes biokompatibles Gerüst kann die große Oberfläche für die Zellausbreitung und sogar die osteogene Differenzierung im Substrat zur Verfügung stellen [20]. Beispielsweise lieferten 3D-Graphenschäume, die als Kultursubstrate für humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) verwendet wurden, den Beweis, dass sie die Lebensfähigkeit von Stammzellen erhalten und die osteogene Differenzierung fördern können [66]. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass 3D-Graphen (3DGp)-Gerüst sowie 2D-Graphen (2DGp)-Beschichtung in der Lage sind, die Differenzierung von Parodontalligament-Stammzellen (PDLSC) zu reifen Osteoblasten durch die höhere Mineralisierung und das hochregulierte knochenbezogene Gen zu induzieren und Proteine ​​auf Graphen, mit oder ohne Verwendung chemischer Induktoren [68].

Die vielfältigen Biomaterialien, die als Gerüste dienen, sprießen heute wie Pilze aus dem Boden. Zu den potentiell geeigneten synthetischen Gerüsten für den Einsatz in der Knochenregeneration gehören Calciumphosphat, wie Hydroxyapatit (HA) [71]; β-Tricalciumphosphat (β-TCP) [72]; synthetische oder Biopolymere, wie Polymilchsäure (PLA) [73], Polyglykolsäure (PLGA) [74], Polycaprolacton (PCL) [75], Chitosan (CS) [1] und Kollagen [76 ]; und Komposite aus den oben genannten Materialien [77, 78]. Aber jetzt sind die mechanischen Eigenschaften von Gerüsten eines der wichtigsten Anliegen. Da natürlicher Knochen superelastische biomechanische Eigenschaften mit einem Young-Modul-Wert im Bereich von 7–27 GPa aufweist [79], sollten die idealen Gerüste die Festigkeit, Steifigkeit und das mechanische Verhalten von natürlichem Knochen nachahmen. Materialien der Graphen-Familie können als verstärktes Material in Gerüsten eingesetzt werden, um die mechanischen Eigenschaften zu verstärken und die physikalisch-chemische Charakterisierung zu verbessern. Das reine PCL-Gerüst hatte beispielsweise eine Zugfestigkeit von 1,61 MPa, eine Dehnung von 122 % und einen Young-Modul von 7,01 MPa. Die Zugabe von GO (2 %) führte zu einer erheblichen Erhöhung der Zugfestigkeit auf 3,50 MPa, der Dehnung auf 131 % und des Young-Moduls auf 15,15 MPa [80].

Angeregt durch den Erfolg der Verwendung von Materialien der Graphenfamilie als Verstärkungsmaterial, kombinierten viele Teams die von synthetischen oder Biopolymeren bereitgestellte Biokompatibilität mit bemerkenswerten physikalischen Eigenschaften von Materialien der Graphenfamilie. Sie erwarteten, ein ideales Verbundgerüst mit verbesserten mechanischen Eigenschaften, geeigneter Porosität, strukturellem Design und ausgezeichneter Biokompatibilität zu erreichen, um die Knochenneubildung zu unterstützen und zu induzieren.

Graphen-Familie mit Calciumphosphat-basierten Materialien

Der menschliche Knochen besteht zu 30 % aus organischer Substanz, hauptsächlich Kollagen, und zu 70 % aus anorganischer Substanz, hauptsächlich aus Hydroxyapatit (HA; Ca₁₀ .). (PO₄ )₆ (OH)₂ ) [81, 82]. Synthetische Materialien auf Calciumphosphatbasis wie HA, β-Tricalciumphosphat (β-TCP) und Calciumphosphatzemente (CPC) sind aufgrund ihrer ähnlichen Zusammensetzung und Struktur wie die natürliche Mineralphase des Knochens und ihrer guten Knochenbildung beliebte Gerüstmaterialien Fähigkeiten [83,84,85]. Insbesondere aufgrund der guten Osteokonduktions- und Osteoinduktionsfähigkeit von HA [86] wird es seit langem als künstliche Knochentransplantate in der orthopädischen oder maxillofazialen Chirurgie zur Reparatur von Knochendefektbereichen verwendet [11, 71]. Die inhärenten Nachteile von HA-Material sollten jedoch verbessert werden, wie z. B. Formgebungsschwierigkeiten, besondere Sprödigkeit und geringe Bruchzähigkeit [87, 88]. Es wurde berichtet, dass werkstoffverstärkte HA-Verbundwerkstoffe der Graphen-Familie entwickelt wurden und die Bruchzähigkeit und die biologische Leistung deutlich verbesserten. HA/Graphen-Komposite wurden beispielsweise durch Spark Plasma Sintering (SPS) hergestellt, was eine akzeptable HA-Festigkeit verlieh [89]. Raucciet al. kombinierten HA mit GO in zwei verschiedenen Ansätzen:in situ Sol-Gel-Ansatz und biomimetischer Ansatz. Das durch einen in situ Sol-Gel-Ansatz erhaltene HA-GO verbesserte die Zelllebensfähigkeit von hMSCs und induzierte die osteoblastische Differenzierung ohne Verwendung osteogener Faktoren. Das über einen biomimetischen Ansatz gebildete HA-GO unterstützte die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen [90]. Darüber hinaus kann das reduzierte Graphenoxid (rGO) auch als Verstärkungsmaterial für HA verwendet werden. Die Bruchzähigkeit der HA-rGO-Verbundwerkstoffe erreichte 3,94 MPa m ^1/2 , eine Steigerung von 203% im Vergleich zu reiner HA. Das HA-rGO verstärkte die Zellproliferation und osteoblastische Differenzierung, die anhand der Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) der menschlichen Osteoblastenzellen bewertet wurde [91]. Darüber hinaus haben Nie et al. synthetisierten erfolgreich rGO und Nano-Hydroxyapatit (nHA) 3D poröses Verbundgerüst (nHA@rGO) durch Selbstorganisation. Die GO-Lösung wurde mit nHA-Wassersuspension vermischt, die erhitzt wurde, um den Selbstorganisationsprozess zu induzieren. Zuletzt wurden die Reaktionsprodukte gefriergetrocknet, um das poröse 3D-Gerüst zu erhalten. Das nHA@rGO-Gerüst kann die Zellproliferation, die ALP-Aktivität und die osteogene Genexpression von mesenchymalen Stammzellen aus Rattenknochen (rBMSCs) signifikant erleichtern. Und in-vivo-Experimente zeigten, dass ein poröses Gerüst von 20% nHA-inkorporiertem rGO (nHA@rGO) die Heilung der kreisförmigen Schädeldachdefekte bei Kaninchen beschleunigen kann [92]. Außerdem hatten nicht nur Doppelkomponenten, sondern auch Trikomponenten ausgezeichnete Leistungen mit guter Zytokompatibilität und verbesserten hydrophilen und mechanischen Eigenschaften [93,94,95].

Tricalciumphosphat, ein Analogon von Calciumphosphat, ist ein tertiäres Calciumphosphat, auch bekannt als Knochenasche [Ca₃ (PO₄ )₂ ]. Es dient als reichliche Quelle für Kalzium und Phosphor, die leicht aufgenommen werden können. Beta-Trikalziumphosphat (β-TCP) ist hoch biokompatibel und bildet ein resorbierbares ineinandergreifendes Netzwerk innerhalb der Defektstelle, um die Heilung zu fördern [96]. Wuet al. synthetisierten erfolgreich 2D-β-TCP-GO-Scheiben und 3D-β-TCP-GO-Gerüste. Im Vergleich zu β-TCP und Blindkontrolle steigerten die 2D-β-TCP-GO-Scheiben die Proliferation, ALP-Aktivität und osteogene Genexpression von hBMSCs durch die Aktivierung des Wnt-bezogenen Signalwegs signifikant, was auf die ausgezeichnete in vitro-Osteostimulationseigenschaft von GO- hindeutet. modifiziertes β-TCP [85]. Es ist bekannt, dass der kanonische Wnt-Signalweg eine nicht triviale Rolle bei der Regulierung zellulärer Aktivitäten wie Zellproliferation, Differenzierung und Morphogenese spielt [97, 98]. In-vivo-Studien zeigten, dass 3D-β-TCP-GO-Gerüste eine stärkere Knochenneubildung in den Schädeldachdefekten aufwiesen als reine TCP-Gerüste (Abb. 3) [85]. Ein neuartiges Gerüst mit Calciumphosphatzement-inkorporierten GO-Cu-Nanokompositgerüsten (CPC/GO-Cu) erleichterte die Adhäsion und osteogene Differenzierung von rBMSCs, von denen bestätigt wurde, dass sie die Expression von Hif-1α in rBMSCs durch Aktivierung des Erk1/2 . hochregulieren können Signalweg und induzierte die Sekretion des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) und des BMP-2-Proteins. Darüber hinaus wurden die CPC/GO-Cu-Gerüste in Ratten mit Schädeldefekten kritischer Größe transplantiert und die Ergebnisse zeigten, dass die Gerüste (CPC/GO-Cu) die Angiogenese und Osteogenese in den Defektbereichen signifikant förderten [99].

Schemadarstellung für β-TCP- und β-TCP-GO-Gerüste stimulierten die in-vivo-Osteogenese. Mikro-CT-Analyse und histologische Analyse der in-vivo-Knochenbildungsfähigkeit für die β-TCP- und β-TCP-GO-Gerüste nach 8 Wochen Implantation in Schädelknochendefekte von Kaninchen. Reproduziert aus Ref.-Nr. [85] mit Genehmigung des Journal of Carbon

Graphen-Familie mit Chitosan

Chitosan (CS), a highly versatile biopolymer, derived from the shells of crustaceans [1, 87], has a hydrophilic surface that promotes cell adhesion and proliferation and its degradation products are nontoxic. Chitosan is biocompatible, osteoconductive, hemostatic, and can be easily converted into the desired shapes [2]. Besides, chitosan can promote bone matrix of mineralization [1] and minimize the inflammatory response after implantation [100]. All properties above make chitosan especially attractive as a bone scaffold material. But the most challenging part is the obtainment of CS-based scaffolds with good mechanical properties and processability [101]. Interestingly, CS/GO scaffolds have high water-retention ability, porosity, and hydrophilic nature [101, 102]. The CS-based 3D materials were enriched with GO in different proportions (0.5 wt% and 3 wt%). The new developed CS/GO 3 wt% scaffold was expected to be ideally designed for bone tissue engineering applications in terms of biocompatibility and properties to promote cell growth and proliferation [103]. Another CHT/GO scaffold with 0, 0.5, and 3 wt.% GO were prepared by freeze-drying method. Similarly, the CS/GO 3 wt% scaffolds significantly enhanced the ALP activity in vitro and the new bone formation in vivo, suggesting a positive contribution of 3 wt% GO to the efficiency of osteogenic differentiation process (Fig. 4) [3]. All results proved that CS/GO scaffolds could be a feasible tool for the regeneration of bone defects, and the addition of a 3 wt% of GO to material composition could have a better impact on cell osteogenic differentiation.

a ALP activity in mice calvaria defects implanted with CHT/GO and b histomophometric analysis of Masson Goldner trichrome-stained sections. ###p < 0.001 vs CHT; **p  < 0.01 vs control; ***p  < 0.001 vs control. Reproduced from ref. [3] with permission from the Journal of Scientific Reports

Moreover, some tricomponent composites, such as CS, GO, and HA can release more Ca and P ions compared to the pure HA nanoparticles, displaying a high bioactivity of the composite scaffold [87]. Ravichandran et al. fabricated a unique composite scaffold, GO–CS–HA scaffold, and the incorporation of GO enhanced the tensile strength of CS up to 8.2 MPa and CS–HA to 10 MPa. And the results demonstrated that GO–CS–HA scaffolds facilitated cell adhesion and proliferation, meanwhile showed improved osteogenesis in in vitro tests [2]. Another tricomponent composite scaffold, containing CS, gelatin (Gn), and different concentrates of graphene oxide (0.1%, 0.25%, 0.5%, and 1% (w /v ) GO) showed better physic-chemical properties than CS/Gn scaffolds. The addition of GO at the concentration of 0.25% to CS/Gn scaffolds exhibited enhanced absorption of proteins, extensive apatite deposition. The 0.25% GO/CS/Gn scaffolds were cyto-friendly to rat osteoprogenitor cells, and they enhanced differentiation of mouse mesenchymal stem cells into osteoblasts in vitro (Fig. 5). The tibial bone defect filled with 0.25% GO/CS/Gn scaffolds showed the growth of new bone and bridging the defect area, indicating their biocompatible and osteogenic nature [104]. Thus, no matter bicomponent or tricomponent composites scaffolds, the addition of graphene family materials to chitosan can favorably improve the mechanical properties and regulate the biological response of osteoblasts, promoting osteogenic differentiation.

a MTT assay after incubation of CS/Gn scaffolds and 0.25% GO/CS/Gn scaffolds with media for 48 h. The asterisk indicates a significant increase versus control, and the pound sign indicates a significant decrease versus control (p < 0,05). b , c Expression of osteogenic-related genes (RUNX2, ALP, COL-1, and OC) in mMSCs cultured on CS/Gn scaffolds and 0.25% GO/CS/Gn scaffolds for 7 and 14 days measured by quantitative RT-PCR. Reproduced from ref. [104] with permission from the Journal of International Journal of Biological Macromolecules

Graphene Family with Other Synthetic or Bio-polymers

Sponge scaffolds of type I collagen, the major organic component of bone [81], have been clinically applied as scaffolds to regenerate bone tissue [105, 106]. Because collagen scaffolds (elastic moduli:14.6 ± 2.8 kPa) are relatively soft, the combination with GO is expected to enhance the elastic modulus of collagen scaffolds and to improve the osteogenic differentiation of MSCs for bone regeneration. The covalent conjugation of GO flakes to 3D collagen scaffolds (elastic moduli:38.7 ± 2.8 kPa) increased the scaffold stiffness by threefold and did not negatively affect the viability of BMSCs. The enhanced osteogenic differentiation observed on the stiffer scaffolds were likely mediated by BMSCs mechanosensing because the molecules involved in cell adhesion to stiff substrates were either upregulated or activated [107]. Moreover, the development of new biomaterials utilizing graphene family materials with high osteogenic capacity is urgently pursued (Table 2).

Up to now, these improved tricomponent systems for bone tissue engineering scaffolds possess good biocompatibility, which can promote cell attachment, proliferation, and have been reported mechanical properties matchable to those of natural bone. But the response to specific biological signals expressing, as well as the capabilities of enhancing cell differentiation and finally bone tissue regeneration, still needs to be explored further. Moreover, it has been reported that the pore structure (pore size, pore morphology, and pore orientation) and the elasticity of scaffolds were manipulated to regulate osteogenesis [108,109,110]. However, due to the complicated structure of porous and different elasticity accurately controlled of the scaffolds, it remains a major challenge to individually design specific pore architectures and elasticity 3D porous scaffolds that can stimulate bone regeneration. With the rapidly development of the science and technology, the emerging of the 3D-printing method may overcome this problem and open an avenue for bone tissue regeneration [85]. The in vitro bioactivity and excellent in vivo bone-forming ability of graphene family nanomaterials present a new prospect of developing a broad new type of multifunctional scaffolds for biomedical applications. Thus, we believe that the unraveled the molecular mechanisms behind will be revealed soon and graphene family materials still have attractive potential of applications in bone regeneration waiting us to explore.

Graphene Family Materials as Coating

Graphene family materials have been widely applied in diverse forms of medical applications for bone regeneration. As a coating, graphene family materials can be transferred on two dimensional (2D) flat non-metal or metal substrates to induce spontaneous osteogenic differentiation of several types of mesenchymal stem cells (MSCs) [64]. Nayak et al. transferred graphene to four 2D non-metal substrates (polydimethylsiloxane (PDMS), polyethylene terephthalate (PET), glass slide, and silicon wafer with 300 nm SiO₂ (Si/SiO₂ ).) and investigated the influence of graphene on BMSCs differentiation. They summarized that the graphene coating was cytocompatible and contributed to enhance the osteogenic differentiation of BMSCs at a rate comparable to differentiation under the influence of BMP-2 in the osteogenic medium [20]. Similarly, Elkhenany et al. found that goat BMSCs, seeded on 2D graphene-coated plates underwent osteoblastic differentiation in culture medium without the addition of any specific growth factors [8]. Simultaneously, Lee et al. tried to explain the origin of how graphene coating could accelerate stem cell renewal and differentiation. They deemed that the strong noncovalent binding abilities of graphene allowed it to serve as a preconcentration platform for osteoblastic inducers, which facilitated BMSCs osteogenic differentiation [67]. The capability of graphene in modulating osteogenic differentiation is evident. How about its derivatives? GO coatings and rGO coatings all showed favorable cytocompatibility and enhanced spontaneous osteogenic differentiation by upregulating levels of ALP activity [111, 112].

Since titanium (Ti) and medical-grade Ti alloy have been extendedly applied in the orthopedic and dental fields [113,114,115], satisfactory osseointegration for titanium and its alloys is still a major challenge and need to be explored deeply in order to help the clinicians to promote the success or survive rate of implants and diminish the likely complications encountered after their placement [114, 116, 117]. Graphene family materials coated titanium and its alloys, serving as a new method to improve their capabilities of osseointegration at the tissue-implant interface, attracted widespread attention. For example, GO-coated titanium enhanced cell proliferation, upregulated levels of ALP activity and gene expression level of osteogenesis-related markers, and promoted the protein expression of BSP, Runx2, and OCN [117]. Qiu et al. made different thickness GO coatings on the pure titanium surfaces respectively by cathodal electrophoretic deposition. Interestingly, with the increasing thickness of GO, the ALP-positive areas improved, ECM mineralization increased [118]. Moreover, Zeng et al. firstly fabricated GO/HA composite coatings by electrochemical deposition technique on Ti substrate. The addition of GO facilitated both the crystallinity of deposited apatite particles and the bonding strength of the as-synthesized composite coatings [119]. It is well known that hydrophilic surface is biocompatible compared to hydrophobic surface. In the case of rGO coating, the rapid adsorption of serum protein improves hydrophilia of graphene surface and enhances cell adhesion. Jia et al. used evaporation-assisted electrostatic assembly and one-pot assembly to fabricate 2D GO-coated Ti and rGO-coated Ti, with tailored sheet size and surface properties. Compared to the contact angle of titanium (60.4°), the contact angle of GO-coated Ti and rGO-coated Ti were 20° and 14.2°, respectively, indicating the successful interfacial assembly of graphene and excellent wettability properties. The rGO-coated Ti elicited better cell adhesion and growth than bulk GO, while the latter evoked higher activity of osteogenic differentiation [120].

Osseointegration is a complicated biological process determined by the surface properties of implants [114]. The graphene-based coatings above all lack 3D morphology. The 3D porous surface structure of coating can mimic the special macrostructures of the nature bone tissues [115]. Qiu et al. first synthesized 3D porous graphene-based coating on the pure titanium plates (GO@Ti and rGO@Ti). Water contact angles showed super hydrophilic surfaces of GO@Ti and rGO@Ti. Surface wettability exerts great effect on the biocompatibility of materials, which is strongly related to biomolecules adsorption [121]. GO@Ti and rGO@Ti both showed the excellent cytocompability and the optimal capability of osteoinduction [39]. Morin and his co-workers even transferred single or double chemical vapor deposition (CVD) grown graphene coatings onto 3D objects with differences in 3D geometries and surface roughness, such us dental implant, locking compression plate and mandible plate (Fig. 6) [64]. CVD is a very stable coating fabrication method, with substrate-independent properties and versatile surface functionalization. Besides, surface active CVD coatings are good platforms for immobilizing biomolecules, which is very important to bone regeneration [122].

a The calvarial defects of rats were enclosed with a GO-Ti membrane. b New bone formation of the rat calvarial defects after the implantation of Ti or GO-Ti membrane at postoperative week 8. *p < 0.05 vs control; #p < 0.05 vs Ti. c Images of HE staining of the rat calvarial defects after the implantation of Ti or GO-Ti membrane at postoperative week 8. Reproduced from ref. [128] with permission from the Journal of Applied Spectroscopy Reviews

Overall, the strategy of applying graphene family materials as coating onto a surface is charming. Through currently available techniques or methods, such as CVD [123], electrochemical deposition [119], with diverse substrates (e.g. polymers, metals), graphene, and its derivatives can be obtained efficiently, with dimensions ranging from nanometer to macroscopic scales [120]. Then, graphene family nanomaterials can be transferred onto the substrate, either as 2D coatings/films/sheets or 3D porous structures of coating, to enable the binding of biomolecules, absorb the serum protein, and facilitate osteogenic differentiation of stem cells. But the different physical and chemical properties of the substrates and the type or frequent use of chemical inducers for osteogenic differentiation (e.g., dexamethasone, bone morphogenetic protein-2) that may cover up the effects exerted by graphene family materials alone [65]. Therefore, these methods still require to be well-directly improved and further studied.

Graphene Family as an Additive in Guided Bone Membrane

Barrier membranes are standardly used in oral surgical procedures, applying in guided tissue regeneration (GTR) and guided bone regeneration (GBR), for the treatment of periodontal bone defects and peri-implant defects, as well as for bone augmentation [124, 125]. GBR is considered to be one of the most promising methods for bone tissue regeneration. The concept of GBR is using a non-resorbable or absorbable membrane serving as a barrier to prevent the ingrowth of soft connective tissue into the bone defect and offer a space to “guide” the bone reconstruction [126, 127]. An ideal GBR membrane should have excellent biocompatibility and mechanical property to promote the regeneration of bone tissues and prevent soft-tissue ingrowth. Ti membrane is a non-resorbable membrane with excellent mechanical properties for the stabilization of bone grafts. Parket al. fabricated GO-coated Ti (GO-Ti) membranes, with increased roughness and higher hydrophilicity. GO endowed the pure Ti membranes better biocompatibility and enhanced the attachment, proliferation, and osteogenesis of MC3T3-E1 in vitro. Moreover, GO-Ti membranes were implanted into rat calvarial defects (Fig. 6) and new bone formation significantly in full-thickness calvarial defects without inflammatory responses was observed [128].

However, non-resorbable membranes need to be removed by a second operation. Thus, a resorbable membrane is recommended owing to avoid a second intervention during operation, which can diminish the risk of infection and the loss of the regenerated bone. But the resorbable membranes made of collagen or chitosan usually has poor mechanical property. The addition of graphene family materials improves the weaknesses of resorbable membrane. For instance, De et al. attempted to prepare absorbable collagen membranes enriched with different concentrations of GO. The presence of GO on the membrane altered the mechanical features of the membrane, by conferring lower deformability, improving stiffness, and increasing roughness [129]. Tian et al. made 3D rGO (3D-rGO) porous films, which can accelerate cell viability and proliferation, as well as significantly enhanced ALP activity and osteogenic-related gene expressions [130].

Although pristine graphene is basically incompatible with organic polymer to form homogeneous composite, and even decrease the cell viability in some cases if the amount of graphene is excessive [131]. The incorporation of graphene family materials can enhance the bioactivity and mechanical properties of composite membranes. Because of the potent effects on altering mechanical drawbacks, stimulating osteogenic differentiation, and exhibiting superior bioactivity, graphene family material-modified membranes can be applied effectively to GBR.

Graphene Family Materials as Drug Delivery System (DDS)

Due to their small size, intrinsic optical properties, large specific surface area, low cost, and useful noncovalent interactions with aromatic drug molecules, graphene family materials exhibit excellent efficacy as delivery vehicles of genes and biomolecules. Moreover, simple physisorption via π-π stacking, hydrogen bonding, and electrostatic interaction is able to assist in high drug loading of hydrophobic drugs without compromising potency or efficiency [38]. The therapeutic efficacy of drugs is always related to the drug delivery carrier, which should enable the loading of large doses, controlled release, and retention of the bioactivity of the therapeutic proteins [132]. At present, anticancer drugs, including doxorubicin [133,134,135,136,137], paclitaxel [138, 139], cisplatin [140], and methotrexate [141, 142] loaded by graphene family nanomaterials showed amazing cancerous effect for the selective killing of cancer cells.

For better bone regeneration, we sometimes need the help of osteogenic drug or macromolecular osteogenic protein. It was reported that the adsorbed drugs or loaded growth factors on graphene or its derivatives could enhance the osteogenic differentiation of cells due to the increased local concentration [143]. For example, simvastatin (SIM) chosen as a model drug was loaded on the 3D porous scaffolds, which were made of silk fibroin (SF) and GO. SIM is an inhibitor of the competitive 3-hydroxy-3-methyl coenzyme A (HMG-CoA) reductase [144]. The effects of SIM on bone formation are associated with an increase in the expression of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) mRNA and enhanced the vascular endothelial growth factor (VEGF) expression [145, 146]. SIM can release sustainedly (30 days), and the release rate was relevant to the GO content within the scaffolds. In vitro, compared with the blank scaffolds, the SF/GO/SIM showed better biocompatibility, and the cells cultured on them exhibited faster proliferation rate [147]. Dexamethasone (DEX) is an osteogenic drug for which can facilitate osseointegration. Jung et al. firstly loaded DEX on rGO-coated Ti by π-π stacking. The loading efficiency of DEX on rGO-Ti was 31% after drug loading for 24 h and only 10% of total loaded DEX was released for 7 days, indicating that the drug delivery system can induce a long-term stimulation of stem cells for osteogenic differentiation. The DEX/rGO-Ti significantly facilitated MC3T3-E1 cells growth and differentiation into osteoblasts [143]. Similarly, Ren et al. also employed the GO-Ti and rGO-Ti as drug vehicles to absorb DEX. The presence of DEX-GO and DEX-rGO helped to promote the cell proliferation and largely enhanced osteogenic differentiation [115]. The graphene family materials coating on Ti alloys with controlled drug delivery can stimulate and enhance cellular response around implant surface to reduce the osseointegration time, expected to be applied for various dental and biomedical applications [143].

Not only small molecular osteogenic drug, but also macromolecular proteins can be loaded by graphene family materials for bone regeneration. Bone morphogenetic proteins (BMPs) are the most potent osteoinductive protein for bone regeneration. Thus, BMP-2 was loaded on the surface of Ti/GO through π-π stacking and the interaction between negatively charged carboxylic groups at the edges of GO and positively charged amino acid residues of BMP-2 [132]. Ti/GO/BMP-2 exhibited the high loading and the sustained release of BMP-2 with preservation of its 3D conformational stability and bioactivity. In vitro, the capability of Ti/GO/BMP-2 is to enhance osteogenic differentiation of hBMSCs. In a mouse calvarial defect model, compared to Ti/BMP-2 implants, Ti/GO/BMP-2 implants around had much more extensive bone formation [132]. Xie et al. used GO-modified hydroxyapatite (HA) and GO-modified tricalcium phosphate (TCP) as an anchor for adsorbing BMP-encapsulated BSA- nanoparticles (NPs) respectively. The charge balance and BMP-2 sustained release capability of the new scaffolds synergistically improved BMSCs proliferation, differentiation, and bone regeneration in vivo [148]. Poor osteointegration and infection are the most serious complications leading to failures of Ti implantation [10]. Han et al. incorporated GO onto polydopamine (PDA)-modified Ti scaffolds. Then, BMP-2 and vancomycin (Van) were separately encapsulated into gelatin microspheres (GelMS). After that, drug-containing GelMS were loaded on GO/Ti scaffolds and anchored by the functional groups of GO (Fig. 7). The new scaffolds were endowed with dual functions of inducing bone regeneration and preventing bacterial infection [149]. Substance P (SP) is a highly conserved 11 amino acid neuropeptide [150], involved in many processes, such as the regulation of inflammation, wound healing, and angiogenesis, and it is expected to promote MSC recruitment to the implants [151]. Therefore, apart from BMP-2, La et al. added this peptide, SP, on the surface of GO-coated Ti. The dual delivery system via GO-coated Ti showed sustained release of BMP-2 and SP and the potential of SP for inducing migration of MSCs. In vivo, Ti/GO/SP/BMP-2 group showed the greater new bone formation in the mouse calvaria than Ti/GO/BMP-2 group may be due to the MSCs recruitment by SP to the implants [152].

Schematics and scanning electron micrographs of the preparation the new GO/Ti scaffold:BMP2- and Van-loaded CGelMS were immobilized on the GO/Ti scaffold through electrostatic interactions between the functional groups of GO and CGelMS. Reproduced from ref. [149] with permission from the Journal of Biomaterials Science

Currently, more and more teams get down to designing new drug delivery system to improve the practical applications. The loading of large doses, controlled release, and retention of the bioactivity of the therapeutic proteins are still difficulty in research on drug delivery system.

Schlussfolgerungen

Studies on the graphene family materials on biological applications is emerging rapidly, especially their potential applications for bacteria inhibition and inducing stem cell osteogenic differentiation. Before their biological applications are considered for clinical trial, the biocompatibility of graphene family materials is of vital importance. However, the challenges exist and must be overcome. These challenges include a thorough understanding of the graphene-cell (or tissue, organ) interaction and cellular uptake mechanism as well as mechanism(s) of potential toxicity. We summarize and analyze several articles and conclude that the cytotoxicity and in vivo biocompatibility of graphene family materials are influenced by numerous factors, including surface functionalization, concentration, size, and shape. At low concentration, graphene family materials are cytocompatible, with little negative influence on cell morphology, viability, and proliferation. Furthermore, it was reported that graphene family materials with flat shapes having better biocompatibility, because the flat shape materials were expected to have minor interaction with the cellular membranes [47]. Although the different criteria were used to define the size scale and shape of graphene and its derivatives, it was true that nano-sized graphene family materials were much safer for biomedical applications [54]. Size-control synthesis of graphene family materials needs to be considered prudently in subsequent researches. Moreover, the major challenge for researchers lies in understanding how graphene family materials behave in complicated microenvironment and establishing the long-term biocompatibility of graphene and its derivatives. Thus, researchers should spare no efforts to keeping studying the bio-safety of graphene family materials in vivo, as well as in vitro, to further understand the intricate interaction between cells and the materials. Although some papers raise concerns about bio-safety, after better control of the modifying of graphene family materials during synthesis, the potential versatility that graphene family uniquely offers has made it a competitive candidate of option for biomedical applications.

On the one hand, a lot of researches have pointed out that graphene family materials possess the capability of bacteria inhibition, due to their functional chemical groups, sharp edges, and synergistic effect with other drugs. Besides, bone remolding and regenerating successfully in an infective bone defect area is challenging. Peri-implant infection and poor osseointegration are also major challenges we confront. The use of graphene family materials in the design and development of antimicrobial bone regeneration application will capture tremendous attention in the future.

On the other hand, lots of teams painstakingly did researches to design and fabricate the new strategies of applying graphene family materials in bone tissue engineering. 3D graphene-based scaffold is a promising biocompatible scaffold, which can enhance pre-osteoblasts or stem cells osteoblastic differentiation. Graphene family materials also can be added as a reinforced material aiming to strengthen the composite scaffold mechanical properties and improve physicochemical characterization. In addition, the strategy of applying graphene or its derivatives as coating onto a surface is charming, which is expected to possess the antibacterial activity and better osseointegration, especially the 3D coating. It has been generally hypothesized that the surface characteristics of graphene family materials including nanostructures, surface roughness, protein absorption ability, electrostatic interactions, and surface hydrophilicity, exert an enormous effect on the molecular pathways which control the fate of stem cells [39, 115]. The 3D structure of scaffold or coating allows nutrients to be freely delivered, which influences the biocompatibility of the graphene family. But the manufacturing method of 3D scaffold or coating is relatively difficult and complicated. However, with the rapidly development of the science and technology, the emerging of the 3D-printing method may overcome this problem and open an avenue for bone tissue regeneration.

Moreover, graphene family materials show great potential in GBR and DDS as well. Graphene family materials improve poor mechanical property of the resorbable membranes made of collagen or chitosan without compromising their intrinsic property. Osteogenic drug or macromolecular osteogenic protein can be adsorbed on graphene or its derivatives via π-π stacking, hydrogen bonding, and electrostatic interaction with high loading and good efficiency. Taking the varied merits into consideration, graphene family materials hold great potential to bone tissue regeneration.

Considering that many supreme properties graphene and its derivatives have, especially in vitro osteogenesis enhancing ability and excellent in vivo bone-forming ability, although they still have drawbacks, graphene family materials still are promising candidates used for bone regeneration applications.

Abkürzungen

ALP:

Alkaline phosphatase

BMP-2:

Bone morphogenetic protein-2

BMSC:

Bone mesenchymal stem cells

CPC:

Calcium phosphate cements

Lebenslauf:

Chemische Gasphasenabscheidung

CXYG:

Carboxyl graphene

DEX:

Dexamethasone

ECM:

Extracellular matrix

GBR:

Guided bone regeneration

GelMS:

Gelatin microspheres

GNOs:

Graphene nano-onions

GO:

Graphenoxid

GONPs:

Graphene oxide nanoplatelets

GONRs:

Graphene oxide nanoribbons

GQDs:

Graphen-Quantenpunkte

HA:

Hydroxyapatite

HUVEC:

Human umbilical vein endothelial cells

MC3T3-E1:

A murine pre-osteoblastic cell line

MWNTs:

Multi-walled carbon nanotubes

OPE:

Oxygen plasma etching

PCL:

Polycaprolactone

PDA:

Polydopamin

PDLLA:

Poly (d, l-lactic acid)

PDLSC:

Periodontal ligament stem cells

PDMS:

Polydimethylsiloxane

PEG:

Polyethylenglykol

PET:

Polyethylene terephthalate

PLA:

Poly-lactic acid

PLGA:

Poly-glycolic acid

PPY:

Polypyrrol

rGO:

Reduziertes Graphenoxid

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

SIM:

Simvastatin

SP:

Substance P

SPS:

Spark plasma sintering

Ti:

Titanium

Van:

Vancomycin

VEGF:

Vaskulöser endothelialer Wachstumsfaktor

β-TCP:

β-Tricalcium phosphate