SPIO verbessert die Cross-Präsentation und Migration von DCs und anionische SPIO beeinflussen die nanoadjuvanten Effekte von Interleukin-1β

Hintergrund

Adjuvantien wurden in großem Umfang für klinische und experimentelle Zwecke verwendet und wurden lange Zeit entweder als immunstimulierende Mittel, passive Depots oder Vehikel betrachtet, die in der Lage sind, die erforderlichen Immunantworten zu fördern [1, 2]. In den letzten Jahrzehnten wurden viele verschiedene Verbindungsklassen als Adjuvantien verwendet, darunter Nanopartikel, mikrobielle Produkte, Emulsionen, Zytokine, Polymere und Liposomen [3,4,5]. Die Entwicklung von Nanopartikeln als Immunadjuvantien (Nanoadjuvantien) stellt einen bemerkenswerten Bereich der Antigenabgabe dar, der auf der Verstärkung der Immunantworten beruht. Unter allen Arten von Nanopartikeln weisen superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIO) eine große Biokompatibilität, eine geeignete Oberflächenarchitektur und eine flexible Ligandenkonjugation auf [6]. Diese Eigenschaften machen sie in vielen verschiedenen biomedizinischen Bereichen anwendbar, wie zum Beispiel Magnetresonanztomographie (MRT), gezielte Wirkstoffabgabe und Hyperthermietherapie [7, 8].

Dendritische Zellen (DCs), die wichtigsten professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), spielen eine entscheidende Rolle bei der zellvermittelten adaptiven Immunität, bei der ein immunologisches Gedächtnis nach einer primären Reaktion auf ein spezifisches Antigen erzeugt wird und dieses Gedächtnis zu einer verstärkten Reaktion führt zu späteren Begegnungen mit diesem Antigen [9, 10]. Darüber hinaus können DCs die Präsentation exogener Antigene durch den Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (MHC-I), einen als Kreuzpräsentation bezeichneten Prozess, fördern und dann zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) aktivieren [11]. Lösliche Antigene, die für die Kreuzpräsentation bestimmt sind, werden durch rezeptorvermittelte Endozytose internalisiert und dann zum proteasomalen Abbau und zur Peptidbeladung in das Zytoplasma transferiert. Herkömmliche DC-Impfstoffe führen aufgrund des relativ unbefriedigenden Transports von löslichen Antigenen zu einer moderaten Immunantwort. Daher wurden Nanoadjuvantien in vielen Forschungsstudien als Träger löslicher Antigene zur Verbesserung der Kreuzpräsentation in DCs untersucht [12,13,14].

Beschichtungsmaterialien spielen eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung und anschließenden Funktionalisierung wässriger SPIO-Suspensionen [15]. In früheren Studien wurde gezeigt, dass positiv geladene SPIO die Fähigkeit von DCs zur Kreuzpräsentation zur Verstärkung der Immunantwort erleichtern, und sie übertrafen die Wirkung ihrer entgegengesetzt geladenen Gegenstücke [16, 17]. Der Mechanismus, durch den unterschiedlich geladenes SPIO die Antigen-Kreuzpräsentation von DCs beeinflussen kann, ist nicht geklärt. Interleukin-1β (IL-1β), ein prototypisches proinflammatorisches Zytokin, das an der angeborenen Immunität beteiligt ist, kann von Immunzellen, wie z. 18]. Die Produktion von IL-1β wird ausschließlich durch Inflammasomen vermittelt, insbesondere durch NLRP3 (NACHT, LRR und PYD-Domänen enthaltendes Protein 3). Die Aktivierung von NLRP3 induziert die Produktion von Caspase-1, die dann inaktives pro-IL-1β in die aktive Form IL-1β spaltet [19]. Bestimmte anorganische Nanopartikel wie Siliziumdioxid, doppelwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen und Titandioxid können die Bildung von Entzündungsreaktionen induzieren [20,21,22]. Frühere Studien haben einen Zusammenhang zwischen der Oberflächenladung von Magnetit-Nanopartikeln und ihrer zellulären Effizienz berichtet [23]. Hier spekulieren wir, dass unterschiedliche Oberflächenladungen auf SPIO-beladenen DCs auch die Sekretion von IL-1β beeinflussen können, und unser Ziel ist es, die Beziehung zwischen diesen Oberflächenladungen und der Kreuzpräsentationsfunktion von DCs zu untersuchen.

Methoden und Materialien

Vorbereitung des SPIO

Zur Herstellung von SPIO wurde eine einfache Copräzipitationsmethode verwendet, wie zuvor berichtet [24]. Kurz gesagt, eine gemischte Lösung von FeCl₃ und FeSO₄ (Molverhältnis Fe ³⁺ :Fe ²⁺ =2:1) wurde unter Stickstoffatmosphäre hergestellt und 30 min bei 37 °C energisch gerührt. Ein schwarzer Niederschlag von Fe₃ O₄ Nanopartikel gebildet und sofort fünfmal mit destilliertem Wasser mittels magnetischer Trennung gewaschen. Das Fe₃ O₄ wurde dann in destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 3 mg/ml bei einem pH-Wert von 3 dispergiert. Schließlich wurde die Suspension bei 95 °C belüftet (mit Luft) und das braune SPIO wurde abgetrennt.

SPIO beschichtet mit DMSA (SPIO/D ⁻ ) und SPIO beschichtet mit APTS (SPIO/A ⁺ ) wurden durch Beschichten von SPIO mit meso-2,3-Dimercaptobernsteinsäure (DMSA) bzw. 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTS) hergestellt. Für SPIO/D ⁻ , wurde eine wässrige Lösung von DMSA in einem Molverhältnis von 1:40 zu 100 ml SPIO-Lösung gegeben. Nach einer 4-stündigen Reaktion unter ständigem Rühren ist das SPIO/D ⁻ wurde mit einer Geschwindigkeit von 500 U/min bei 50 °C abgeschieden. Für SPIO/A ⁺ , APTS wurde der SPIO-Lösung in einem Molverhältnis von 0,2:1 unter kräftigem Rühren für 5 h zugegeben. Dann wurde der Niederschlag mit einem Permanentmagneten herausgelöst und mit entionisiertem Wasser gewaschen, und die Lösung wurde unter Verwendung von Ultraschallwellen behandelt. Die resultierende Lösung wurde wiederholt mit Wasser gewaschen und das SPIO/A ⁺ wurden schließlich bei 37 °C unter Vakuum zu einem Pulver getrocknet.

Mäuse

C57BL/6-Mäuse und transgene C57BL/6-Mäuse mit verstärktem grün fluoreszierendem Protein (EGFP) wurden vom Model Animal Research Center der Nanjing University gekauft und unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen im Central Laboratory der Nanjing University untergebracht. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Animal Care and Use Committee der Medical School, Nanjing University, China, genehmigt wurden.

Zellkultur

Murine DCs wurden wie zuvor beschrieben aus Mausknochenmark erzeugt [25]. Kurz gesagt, Knochenmarkmonozyten von 8 Wochen alten C57BL/6-Mäusen wurden von ihren Oberschenkelknochen und Schienbeinen getrennt. Anschließend wurden die Zellen in RPMI-1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) zusammen mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 10 ng/ml Maus-Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF .) kultiviert; Gibco, USA) und 1 ng/ml Maus-Interleukin-4 (IL-4, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA). Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage durch frisches Medium ersetzt. Unreife DCs wurden im Allgemeinen am Tag 6 gesammelt. Die EGFP-DCs wurden von EGFP-transgenen C57BL/6-Mäusen gemäß dem oben erwähnten Verfahren abgeleitet.

Aufgetaute gefrorene mononukleare humane periphere Blutzellen (PBMCs) wurden über Nacht in Vollmedium, d. h. X-VIVOTM 15 (Lonza Group Ltd., Basel, Schweiz) =1:1, ruhen gelassen. Nach der Dichtegradientenzentrifugation wurden die PBMCs 4 h in Medium suspendiert. Humane DCs aus den adhärenten Zellen wurden bei 37 °C in Medium kultiviert, das humanes GM-CSF (100 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) und humanes IL-4 (10 ng/ml; PeproTech, Rocky Hill, New Jersey, USA). Die Hälfte des Mediums wurde an den Tagen 2 und 4 gewechselt. Unreife menschliche DCs wurden am Tag 5 geerntet. Cytomegalovirus Epstein-Barr-Virus und Influenzavirus (CEF)-spezifische T-Zellen wurden aus suspendierten Zellen gewonnen, die in CMX-Medien, die MHC . enthielten, kultiviert wurden -Ich habe das CEF-Peptid (20 ng/ml, Panatecs, Heilbronn, Deutschland, PA-CEF-002) für ungefähr 48 h eingeschränkt. CEF-spezifische T-Zellen wurden 12 Tage lang mit 1000  U/ml humanem IL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA, 200–02) in CMX-Medium vermehrt. Bei IL-2 wurde das Medium alle 3 Tage durch frisches Medium ersetzt.

Charakterisierung

Die Morphologie und Größe des SPIO wurden unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM, Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA) bestimmt. Ein Röntgenbeugungsmuster (XRD) wurde verwendet, um die Spektren des Katalysators zu identifizieren. Der Zeta-Potential-Assay wurde auch gemessen, um die Oberflächenladungen der mit verschiedenen Polymeren beschichteten Nanopartikel zu bestimmen. Das SPIO/A ⁺ und SPIO/D ⁻ Nanopartikel wurden mit pH-Werten im Bereich von 3 bis 8 hergestellt. Zeta-Potentialmessungen wurden mit einem Zetasizer Nano ZS90-Potentialanalysator (Malvern, UK) durchgeführt. Die magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel wurden bei 37 °C mit einem Vibrationsprobenmagnetometer (Lakeshore 7407) analysiert.

CPRG-Assay

Die B₃ Z-T-Zelllinie (eine CD8 ⁺ T-Zell-Hybridom) kann das LacZ-Gen exprimieren, wenn sein T-Zell-Rezeptor ein Ovalbumin (OVA) 258–265-Epitop in Gegenwart des H-2Kb-MHC-I-Moleküls angreift. DCs (2 × 10 ⁴ ) und OVA (100 μg/ml, Sigma-Aldrich) wurden mit SPIO, SPIO/A ⁺ . kultiviert , oder SPIO/D ⁻ bei 37 °C. Sechs Stunden später wurden die DCs mit B₃ . cokultiviert Z (2 × 10 ⁵ ) über Nacht. Ein Chlorphenolrot-β-Galactosidase-Assay (CPRG, Sigma-Aldrich, USA) wurde durchgeführt, um die β-Galactosidase-Produktion von B₃ . zu bestimmen Z-Zellen. In diesem Assay zeigt die optische Dichte (OD) bei 595 nm die Fähigkeit der DCs zur Antigen-Kreuzpräsentation an.

Zellen-Apoptose-Assay

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FCS) wurde verwendet, um die Auswirkungen unterschiedlicher Konzentrationen von SPIO auf die Lebensfähigkeit von DCs zu untersuchen. Kurz gesagt wurden unreife DCs mit SPIO inkubiert, die mit Annexin V und PI (Biouniquer, CHN) markiert waren, und die Expression von Annexin V und PI in den DCs wurde mittels FCS untersucht.

In-vivo-Fluoreszenz-Intensitätsbildgebung

Um die Migration von DCs in vivo zu untersuchen, wurde TNF-α (60 ng/Maus) in die Fußballen beider Hinterbeine vorinjiziert (n = 8). Nach 24 Stunden SPIO-markierte EGFP-DCs (2 × 10 ⁶ ) in 40 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden in die linken Fußballen von C57BL/6-Mäusen injiziert, und die gleiche Anzahl unmarkierter EGFP-DCs wurde in die rechte Seite injiziert. Um das Ausmaß der zu den Lymphknoten wandernden EGFP-DCs zu untersuchen, wurde ein Maestro-Bildgebungssystem (CRi, Woburn, MA, USA) verwendet. Die sezierten Lymphknoten wurden mit 484 nm-Anregungsfiltern und 507 nm-Emissionsfiltern beobachtet. Die grün fluoreszierenden Fluoreszenzbilder wurden dann mit der Living Image-Software (v 2.50; Caliper Corporation, Newton, MA, USA) analysiert. Konfokalmikroskopische Analysen wurden verwendet, um die Immunhistochemie zu bestimmen. Gefrorene Lymphknoten wurden in 5 &mgr;m dicke Schnitte geschnitten und dann fixiert, und die Schnitte wurden mit grün fluoreszierendem Protein (GFP)-Antikörper (Invitrogen) inkubiert, wobei der Alexa Fluor 488 nm-Antikörper der Ziege (Invitrogen) als sekundärer Antikörper verwendet wurde. Zur Beobachtung der Proben wurde ein konfokales Laserscanning-Mikroskop (Fluoview, Fv10i; Olympus) verwendet.

Human DC Antigen Cross-Presentation Assay In Vitro

Die kultivierten menschlichen DCs (2 × 10 ⁴ ) wurden in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden ausgesät, auf die SPIO/A ⁺ und SPIO/D ⁻ Nanopartikel (100 μg/ml) kombiniert mit Cytomegalovirus (CMV) pp65-Protein (1 μg/ml, MACS) wurden hinzugefügt, und das CMV pp65-Protein und das CEF-Peptid (1 μg/ml, Think-Peptide) wurden separat als Kontrollen verwendet. Nach 6 h CEF-spezifische T-Zellen (2 × 10 ⁵ ) wurden den menschlichen DCs für 12 h hinzugefügt. Brefeldin A (10 μg/ml, Sigma-Aldrich, USA) wurde weitere 6 h im Medium gehalten. Nach Stimulation und Aktivierung wurden CEF-spezifische T-Zellen gesammelt und mit menschlichen Antikörpern gegen CD3, CD4, CD8 und IFN-γ (Invitrogen, USA) gefärbt. Nach der Färbung wurden die Proben mit einem speziell angefertigten LSR II-Durchflusszytometer (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) analysiert. Die gesammelten Daten wurden von der FlowJo-Software (Tree Star, Ashland, OR, USA) analysiert.

Enzym-Linked Immunosorbent Assay

Ein IL-1β Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Ready SET-Go-Kit (eBioscience, USA) und ein ELISA-Kit für Human-IL-1β (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) wurden verwendet, um die Sekretion von IL . zu bestimmen -1β durch DCs. Eine mit 100 μL/Well IFN-γ beschichtete ELISA-Platte (Costar, USA) wurde zum Einfangen von Antikörpern über Nacht bei 4 °C verwendet und mit ELISA-Puffer blockiert. Anschließend wurden Proben und Standards in die Wells gegeben und 2 h bei 37 °C inkubiert. Biotinyliertes IFN-γ wurde nachgewiesen. Die Proben wurden mit einem Mikroplatten-Lesegerät mit einer OD-Einstellung von 450 nm (BioTek, USA) gemessen.

Statistische Analyse

Die Daten wurden mit dem Statistical Package for Social Science (SPSS 13.0, Chicago, IL, USA) ausgewertet. Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte  ± SD dargestellt, und die Unterschiede zwischen der Kontroll- und der Testgruppe wurden durch eine einseitige Varianzanalyse, zweiseitige Student's t . bewertet Tests und die zweifaktorielle Varianzanalyse. Unterschiede bei *P < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Charakterisierung von SPIO

Die Morphologie und Größe des synthetisierten SPIO wurden mittels TEM beobachtet. Das TEM-Bild zeigte, dass SPIO eine mittlere Größe von 8,7 nm und eine Kugelform aufwies (Abb. 1a). Die XRD-Analyse zeigte sechs Peaks, die deutlich mit dem Standard γ-Fe₂ . übereinstimmten O₃ Reflexionen (Abb. 1b). Die Ergebnisse des Vibrationsmagnetometers zeigten, dass das erhaltene SPIO ein superparamagnetisches Verhalten mit einer Sättigungsmagnetisierung von 60,4 emu/g besser als Fe₃ . aufwies O₄ (Abb. 1c). Der DLS-Plot zeigte, dass die Größenverteilung des SPIO in Lösung 22 nm beträgt (Abb. 1d). Um zu bestätigen, dass die DCs SPIO enthielten, wurde eine Preußisch-Blau-Färbung durchgeführt, um zu bestätigen, dass die DCs Eisen enthielten (Abb. 1e).

Charakterisierung von SPIO. a TEM-Bild des erhaltenen SPIO. b XRD-Muster des Nanopartikel-Katalysators, der anzeigt, dass das Material γ-Fe₂ . ist O₃ . c Magnetisierungskurven der erhaltenen SPIO und Fe₃ O₄ Nanopartikel. d Hydrodynamischer Durchmesser von SPIO. e Morphologie der mit 50 μg/ml SPIO markierten DCs nach 12 h Inkubation:unmarkierte DCs und mit Preußisch-Blau-Färbung markierte DCs

SPIO aktivierte Cross-Präsentation von DCs

Um die Wirkung von SPIO-markierten DCs auf die T-Zell-Aktivierung in einem Maussystem weiter zu untersuchen, wurde der B₃ .-Spiegel Die Z-T-Zell-Aktivierung wurde bestimmt, indem die Produktion von β-Galactosidase durch einen CPRG-Assay untersucht wurde. In dieser Studie wurden eine feste Konzentration von 100 μg/ml OVA und fünf Dosisverhältnisse von SPIO (1, 5, 10, 25 und 50 μg/ml nach 6 h) verwendet. Mit steigender SPIO-Konzentration stieg der Aktivierungsgrad von B₃ Z-Zellen nahmen allmählich zu und erreichten eine Stabilität bei 25 μg/ml (Abb. 2a). Um zu untersuchen, ob die Lebensfähigkeit von DCs, die mit den verschiedenen Konzentrationen von SPIO markiert waren, beeinflusst wurde, wurden die DCs und SPIO-markierten DCs nach Annexin-V- und PI-Färbung über FCS analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass sich der Gesamtprozentsatz der Annexin V/PI-DCs bei SPIO-Konzentrationen von 10, 25 und 50 μg/ml nicht signifikant unterschied, während der Anteil apoptotischer Zellen nach Beladung mit 100 μg/ml SPIO zunahm (Abb. 2b ). Die mit verschiedenen SPIO-Konzentrationen markierten Oberflächenmoleküle der DCs wurden durch FCS beobachtet. Die Expression von CD80 und CD86 war bei 25 μg/ml im Vergleich zu denen ohne SPIO-Markierung nachweisbar (Abb. 2c). Mit 25 μg/ml SPIO markierte DCs zeigten zu verschiedenen Zeitpunkten keine Veränderungen der Zellapoptose (Abb. 2d). In den folgenden Experimenten haben wir 25 μg/ml verwendet.

Einflüsse der DC-Kreuzpräsentation und Biokompatibilität nach Markierung mit SPIO. a Kreuzpräsentation von DCs bei verschiedenen SPIO-Konzentrationen verbessert. b Apoptotische DCs und SPIO-markierte DCs, die mit FCS in verschiedenen Konzentrationen untersucht wurden (10, 25, 50 und 100 μg/ml). c Phänotypen der DCs, einschließlich CD11c ⁺ CD80 ⁺ und CD11c ⁺ CD86 ⁺ nach Markierung mit SPIO (10, 25, 50 μg/ml). Als Positivkontrollen wurden mit LPS (1 μg/ml) stimulierte DCs verwendet. d Apoptotische DCs, die mit 25 μg/ml SPIO beladen waren, wurden von FCS zu verschiedenen Zeitpunkten (6, 12, 18 und 24 h) untersucht.

Kennzeichnung von EGFP-DCs mit SPIO-verstärkten EGFP-Signalen in sekundären Lymphknoten

EGFP-DCs wurden in vitro erfolgreich aus EGFP-transgenen Mäusen gewonnen, und konfokale Fluoreszenzmikroskopiebilder zeigten, dass fast alle EGFP-DCs grüne Fluoreszenz aufwiesen (Abb. 3a). Um zu untersuchen, ob die grüne Fluoreszenz der EGFP-DCs durch SPIO beeinflusst werden könnte, wurde FCS durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression der EGFP-Fluoreszenz nach der SPIO-Markierung nicht abgeschwächt wurde (Abb. 3b, c). Dann wurden die 25 μg/ml SPIO-markierten EGFP-DCs in die rechten Hinterpfoten von C57BL/6-Mäusen und unmarkierte EGFP-DCs in die gegenüberliegende Seite injiziert. Die EGFP-Signale wurden in den Lymphknoten poplitea (PLN) und inguinalen Lymphknoten (ILN) gemessen, die die Sentinel-Lymphknoten bzw. sekundären Lymphknoten sind. Die Ergebnisse zeigten, dass die Migration von SPIO-markierten EGFP-DCs und unmarkierten EGFP-DCs in den Sentinel-Lymphknoten am Tag 7 einen Höhepunkt erreichte. Signifikante Unterschiede im EGFP-Signal wurden zwischen den beiden Gruppen nicht beobachtet, während eine signifikante Reduktion festgestellt wurde in der PLN-Gruppe am 14. Tag. Die in der ILN-Gruppe nachgewiesenen EGFP-Signale stimmten mit denen der SPIO-markierten EGFP-DC-Gruppe am 4. und 7. Tag überein, was darauf hinwies, dass die SPIO-markierten DCs in die sekundären Lymphe wanderten Knoten (Abb. 3d–f).

Migration und Ortung von EGFP-DCs nach der Kennzeichnung mit SPIO. a Konfokale Laserscanning-Mikroskopie von EGFP-DCs, die nach 12 h Inkubation mit 25 μg/ml SPIO-Nanopartikeln markiert waren. b , c Fluoreszenzintensität der SPIO-markierten EGFP-DCs nach 12 h. Optische In-vitro-Bildgebung von Drainage-Lymphknoten nach der Rücktransfusion von SPIO-markierten EGFP-DCs an verschiedenen Tagen. TNF-α wurde zuerst in die Maus-Fußballen injiziert, um die Migration von EGFP-DCs zu fördern. d –e Optische In-vitro-Bildgebung und Signalintensitätsanalyse von Lymphknoten an verschiedenen Tagen nach Injektion von EGFP-DCs mit oder ohne SPIO. f EGFP-positive Zellen aus drainierenden Lymphknoten wurden durch konfokale Lasermikroskopie nachgewiesen

Unterschiedlich aufgeladene modifizierte SPIO-betroffene Murine DCs Cross-Präsentation

Die SPIO wurden mit APTS oder DMSA beschichtet. Um die Oberflächenladung des SPIO zu überprüfen, haben wir die Zeta-Potential-Charakteristik gemessen. Die Zetapotentiale des SPIO/A ⁺ und SPIO waren positiv, während das Zetapotential von SPIO/D ⁻ zeigte eine negative Ladung in Lösung, wenn der pH-Wert 7 betrug (Abb. 4a). Die Ultrastruktur der mit unterschiedlich geladenen Polymeren beschichteten SPIO-markierten DCs wurde mittels TEM beobachtet. Die mit SPIO behandelten DCs erschienen im Vergleich zu unbehandelten Zellen elektronendicht, und zahlreiche SPIO waren im Zytoplasma geclustert. Das SPIO/A ⁺ wurden von Endosomen im Zytoplasma verschlungen, während eine höhere Menge an SPIO/D ⁻ wurden im Zytoplasma der DCs gefunden, und fast alle diese Nanopartikel waren von mehrschichtigen Membranstrukturen umgeben, die an Lysosomen erinnerten (Abb. 4b). Wir untersuchten, ob das entgegengesetzt geladene SPIO unterschiedliche IL-1β-Spiegel auslösen könnte. Unseren Ergebnissen zufolge sind DCs mit SPIO/A ⁺ . geladen und SPIO/D ⁻ induzierte eine dosisabhängige Sekretion von IL-1β. Unabhängig von der Konzentration haben wir festgestellt, dass SPIO/D ⁻ induzierte signifikant höhere IL-1β-Spiegel als SPIO/A ⁺ (Abb. 4c). Aufgrund der offensichtlichen Korrelation zwischen IL-1β und dem TLR3-Weg wurden DCs von TLR3-Knockout-Mäusen abgeleitet und mit SPIO/A ⁺ . kokultiviert, um die Wirkung von IL-1β auf die T-Zell-Aktivierung weiter zu untersuchen , SPIO/D ⁻ , und OVA. Die DCs geladen mit SPIO/A ⁺ + OVA könnte B₃ . effektiv aktivieren Z-T-Zellen, was bedeutet, dass das TLR3-Molekül in den DCs definitiv für die Kreuzpräsentation notwendig war (Abb. 4d).

Mit unterschiedlichen Ladungen beschichtete SPIO beeinflussten die DC-Kreuzpräsentation und die IL-1β-Sekretion. a Das pH-abhängige Zetapotential von SPIO beschichtet mit unterschiedlich geladenen Molekülen. b Positionen von Nanopartikeln mit unterschiedlichen Ladungen in DCs unter TEM. c IL-1β induziert durch SPIO beschichtet mit unterschiedlich geladenen Molekülen. d Cross-Präsentation von SPIO/A ⁺ +OVA und SPIO/D ⁻ + OVA durch DCs über den TLR3-Pfad

SPIO, das mit entgegengesetzt geladenen Beschichtungen modifiziert wurde, förderte die Antigen-Kreuzpräsentation durch menschliche DCs und wurde von IL-1β beeinflusst

Um die Beziehung zwischen IL-1β und Kreuzpräsentation zu untersuchen, haben wir den Caspase-1-Inhibitor YVAD ausgewählt und festgestellt, dass er die IL-1β-Sekretion menschlicher DCs nach einer Vorbehandlung mit 50 μM Lipopolysaccharid (LPS) für 3 h signifikant hemmen kann (Abb . 5a). Darüber hinaus fanden wir, dass YVAD die Sekretion von IL-1β aus menschlichen DCs hemmen kann, die durch SPIO/A ⁺ . verursacht wird und SPIO/D ⁻ (Abb. 5b). Wir untersuchten dann, ob menschliche DCs als wirksame APCs verwendet werden könnten und CMV pp65 an CEF-spezifische T-Zellen kreuzpräsentieren könnten. Um die Antigen-Kreuzpräsentation zu messen, wurde die intrazelluläre Färbung (ICS) eingeführt, um den Prozentsatz an Antigen-spezifischem CD3 ⁺ . zu bestimmen CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ und CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ T-Zellen durch FCS. DCs geladen mit SPIO/A ⁺ kombiniert mit dem CMV-pp65-Protein induzierte mehr CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ und CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ T-Zellen als DCs, die mit SPIO/D ⁻ . beladen sind . Unsere Daten zeigten, dass der Caspase-1-Inhibitor YVAD die durch SPIO/D ⁻ . induzierten T-Zell-Antworten signifikant steigerte + CMV-pp65-Protein, während es die durch SPIO/A ⁺ . induzierten T-Zell-Antworten teilweise hemmte + CMV-pp65-Protein (Fig. 5c, d). Diese Ergebnisse zeigten, dass eine mäßige IL-1β-Aktivierung für eine effiziente Kreuzpräsentation erforderlich ist und dass eine hohe IL-1β-Aktivierung die Kreuzpräsentation in DCs unterdrückt.

Mit entgegengesetzten Ladungen beschichtete SPIO beeinflussen die Funktion menschlicher DCs über den IL-1β-Weg. a Nach einer Vorbehandlung mit LPS für 3 h wurden menschliche DCs mit steigenden Konzentrationen von YVAD (1, 10, 25 und 50 μM) inkubiert und dann wurden die Überstände für einen ELISA von IL-1β gesammelt. b YVAD kann die Sekretion von IL-1β aus menschlichen DCs über SPIO/D ⁻ . hemmen . SPIO/A ⁺ , und SPIO/D ⁻ die durch IL-1β beeinflusste DC-Kreuzpräsentation beeinflussen. c CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ und d CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ T-Zellen wurden durch intrazelluläre Färbung mit FCS analysiert

Diskussion

Die Immuntherapie ist seit der Entwicklung der Biotechnologie ein Forschungsschwerpunkt in klinischen und experimentellen Studien. Allerdings haben frühere klinische Studien mit traditionellen DC-Impfstoffen, die eine Immunität hervorrufen sollen, keine ausreichenden Immunantworten induziert [26]. Nanopartikel stellen eine Art Adjuvans dar und können die Funktion von DCs zur Aktivierung von T-Zellen fördern [27]. Zu den charakteristischsten Merkmalen unserer SPIO zählen ihre Biokompatibilität und ihre Anwendung der Markierung von DCs als Immunadjuvans. Die TEM-Bilder zeigen, dass unsere SPIO im trockenen Zustand eine mittlere Größe von 8,7 nm und eine Kugelform aufweisen (Abb. 1a). Die Preußisch-Blau-Färbung zeigte, dass die SPIO anfällig dafür sind, von DCs phagozytiert zu werden (Abb. 1e), was die Aufnahmeeffizienz anzeigt.

Es wurde berichtet, dass SPIO breite biomedizinische Anwendungen hat, wie z. B. bei der Zellmarkierung, der Wirkstoffabgabe, der MRT und der magnetischen Hyperthermie [28], die alle Anwendungen sind, die Biokompatibilität erfordern. Daher muss untersucht werden, ob mit SPIO markierte DCs einen Einfluss auf die DC-Apoptose haben. Unsere Daten deuteten darauf hin, dass es keinen signifikanten Unterschied in der DC-Apoptose gab, wenn DCs mit weniger als 50 μg/ml SPIO markiert waren (Abb. 2b). In der folgenden Studie wählten wir OVA-Protein als Modellprotein und B₃ Z-T-Zellen als effektive T-Zellen, um zu beobachten, ob SPIO die Kreuzpräsentation von DCs beeinflussen kann. Unsere Ergebnisse zeigen, dass SPIO-markierte DCs die Kreuzpräsentation von OVA und die Aktivierung von B₃ . deutlich erleichtern können Z-T-Zellen. Die Oberflächenmoleküle CD80 und CD86, die Marker für reife DCs sind, sind zwei kritische kostimulatorische Faktoren, die für die T-Zell-Aktivierung notwendig sind. Bei 25 μg/ml ist das aktivierte B₃ Z-T-Zellen nahmen mit der Nanopartikel-Dosis zu und stabilisierten sich schließlich (Abb. 2a). Darüber hinaus erreichte die Expression von CD80 und CD86 auf der Oberfläche von DCs ein Maximum (Abb. 2c). Daher haben wir die Konzentration von 25 μg/ml angenommen und festgestellt, dass die Apoptose von DCs zeitunabhängig ist (Abb. 2d), was die hervorragenden nanoadjuvanten Funktionen und die Biokompatibilität von SPIO bewies.

Um den Einfluss von SPIO auf die DC-Migration zu untersuchen, verwendeten wir EGFP-DCs, die unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop grüne Fluoreszenz zeigten, um 12 h lang mit 25 μg/mL SPIO zu kokultivieren. Wir beobachteten, dass die Expression der EGFP-Fluoreszenz nach der SPIO-Markierung nicht abnahm. Letztlich ist die Migration von DCs in die sekundären lymphatischen Organe der Schlüsselparameter zur Beurteilung der Wirksamkeit von DC-basierten Impfstoffen. In unserer vorherigen Studie wurden in den ersten 24 h keine SPIO-markierten DCs in signifikanter Menge in den sekundären Lymphknoten nachgewiesen [29]. Um weiter zu bestimmen, ob sich dieses Phänomen mit der Zeit änderte, wurden sowohl markierte als auch unmarkierte EGFP-DCs gesammelt und in die Fußballen von Mäusen injiziert, um das Potenzial von SPIO bei der Migration von DCs zu bewerten. Unsere Ergebnisse zeigten, dass an den Tagen 4 und 7 grüne Fluoreszenz im ILN auftrat (Abb. 3d–f), was zeigt, dass SPIO die Migration von EGFP-DCs zu den sekundären Lymphknoten erleichtern kann. Diese Eigenschaft kann angewendet werden, um die Metastasierung von Tumoren einzuschränken und eine größere Menge an CTL-Zellen in mehr Lymphknoten zu aktivieren.

In unserer Studie haben wir die adjuvanten Eigenschaften von entgegengesetzt geladenen SPIO und den möglichen Mechanismus untersucht, der den Veränderungen der Funktion von DCs zugrunde liegt. Es wurde gezeigt, dass die Oberflächenladung der Eisenoxid-Nanopartikel einen Einfluss auf die zelluläre Aufnahmeeffizienz hat [30, 31]. In unserer früheren Forschung berichteten wir, dass kationische SPIO die Antigen-Kreuzpräsentation und dementsprechend die T-Zell-Aktivierung verstärken könnten, während anionische SPIO mit Autophagie in Verbindung gebracht wurden. [16] Mehrere Metallnanopartikel können Entzündungsreaktionen auslösen [32, 33]. Es wurde berichtet, dass Eisenoxid-Nanopartikel NLRP3 aktivieren, die Membranen von Lysosomen aufbrechen, Cathepsin B freisetzen und die IL-1β-Sekretion induzieren [34]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die entgegengesetzt geladenen SPIO-Nanopartikel unterschiedliche Funktionen bei der Stimulierung der Produktion von IL-1β sowohl in murinen als auch in menschlichen DCs erfüllen könnten. In 4a zeigte unsere Zetapotentialanalyse, dass APTS-beschichtetes SPIO positive Ladungen trug, während DMSA-beschichtetes SPIO negative Ladungen trug. Unter dem TEM fanden wir, dass unterschiedlich geladene SPIO an verschiedenen Positionen im Zytoplasma geclustert waren (Abb. 4b). Um den Unterschied zwischen der Kreuzpräsentation von SPIO/A ⁺ . zu untersuchen und SPIO/D ⁻ untersuchten wir die IL-1β-Sekretion in Maus-DCs, die durch unterschiedlich geladene Nanopartikel induziert wird. Wir haben das Ansprechen von Maus-DCs nach der Behandlung mit SPIO/A ⁺ . untersucht und SPIO/D ⁻ . Exposition gegenüber SPIO/D ⁻ induzierte die offene Aktivierung der IL-1β-Sekretion im Vergleich zur Exposition gegenüber SPIO/A ⁺ (Abb. 4c). Dieses Phänomen zeigte teilweise, dass die durch SPIO/D ⁻ . induzierte Antigen-Kreuzpräsentation ist nicht so effizient wie die von SPIO/A ⁺ . Zusätzlich zur CPRG-Analyse von steigendem B₃ Z-T-Zell-Aktivierung nach der Kokultur von Maus-DCs mit SPIO/A ⁺ +OVA zeigte, dass positiv geladene Nanopartikel eine bessere Leistung erbringen können, wenn sie als Immunadjuvantien verwendet werden. Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind für die Auslösung von Immunantworten wie TLR3 von Bedeutung und können letztendlich zur Produktion von Inflammasomen, der Aktivierung des Caspase-1-Proteins und der Sekretion des Zytokins IL-1β führen [35]. Um zu zeigen, ob TLR3 mit der durch unser Nanoadjuvans beeinflussten Antigen-Kreuzpräsentation zusammenhängt, wurden in unserer Studie TLR3-Knockout-DCs eingesetzt. TLR3 ^−/− DCs loaded with SPIO/A ⁺ +OVA and SPIO + OVA effectively stimulated the B₃ Z T cell activation (Fig. 4d), which indicates that the TLR3 molecule in DCs was necessary for cross-presentation. Collectively, these results elucidated that differently charged polymers on the surface of nanoparticles should be considered when investigating their synergistic effects on activated immune responses.

Our data show that the oppositely charged nanoparticles could induce the production of IL-1β, whereas SPIO/D ⁻ could hyperactivate the secretion of IL-1β. However, compared with SPIO/A ⁺ , SPIO/D ⁻ induced a lower level of B₃ Z T cell activation. Therefore, we speculate that aberrant IL-1β production may contribute to cellular dysfunction in DCs. Most studies on nanomaterial adjuvants exploit DCs from mice, whereas few have used DCs from humans [36, 37]. To further verify our hypothesis, we used YVAD, which has been proven to be an effective caspase-1 inhibitor (Fig. 5a, b), to suppress IL-1β secretion from human DCs. CMV pp65 protein was selected as the model antigen, and CEF-specific T cells expanded in vitro were used as responder cells. The CMV pp65 protein is an immunological dominant protein that readily activates CD8 ⁺ and CD4 ⁺ T cells to produce cytokines, particularly IFN-γ [38]. CEF peptide was used as a positive control to verify that the addition of YVAD would not affect the activation of T cells because it can be presented to the T cells directly. Intriguingly, with the use of YVAD, the T cell responses in the SPIO/A ⁺ group were slightly restrained, while the responses in the SPIO/D ⁻ group increased (Fig. 5c, d). The influence of IL-1β on DC cross-presentation provided conclusive evidence that a low level of IL-1β induced by SPIO/A ⁺ is needed for antigen cross-presentation, and a high level of IL-1β in the cytosol will inhibit the function of DCs.

Conclusions

As shown in the graphical abstract in Fig. 6, SPIO can promote the maturation, migration, and cross-presentation of DCs. Moderate IL-1β activity is partly related to the antigen cross-presentation of DCs. In addition, negatively charged nanoparticles can activate excessive IL-1β and subsequently inhibit the functions of DCs. In summary, our results indicate that SPIO exhibit many biological properties and have promising adjuvant potential. These findings will help identify the optimal choice of nanoadjuvants for the development of DC vaccines in the future.

Graphical abstract of SPIO as a nano-adjuvant for DCs. SPIO enhances the function of DCs by promoting the loading of DCs; thus, SPIO-labeled DCs can migrate to the ILNs active in an immune organ and may offer a new approach in cancer immunotherapy. Anionic-charged SPIOs activate protective IL-1β responses by triggering caspase-1 in DCs, thereby impairing antigen presentation to active T cells

Abkürzungen

APCs:

Antigen-presenting cells

APTS:

3-Aminopropyltrimethoxysilane

ATP:

Adenosine triphosphate

CPRG:

Chlorophenol red-β-d-galactopyranoside

CTL:

Cytotoxic T cell

DAMPs:

Damage-associated molecular patterns

DC:

Dendritic cell

DMSA:

Meso-2, 3-dimercaptosuccinic acid

EGFP:

Enhanced green fluorescent protein

IL-1β:

Interleukin-1β

MHC-I:

Major histocompatibility complex class I

NLRP3:

NACHT, LRR, and PYD domains-containing protein 3

OVA:

Ovalbumin

PAMPs:

Pathogen-associated molecular patterns

SPIO:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

SPIO/A ⁺ :

SPIO coated with APTS

SPIO/D ⁻ :

SPIO coated with DMSA

TLRs:

Toll-like-Rezeptoren