Ein neuartiges Kontrastmittel auf Basis magnetischer Nanopartikel für den Cholesterinnachweis als Alzheimer-Biomarker

Hintergrund

Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Anwesenheit einer angemessenen Menge an Cholesterin (CHO) in der neuronalen Plasmamembran eine Schlüsselrolle beim Schutz der Nervenzellen vor der Toxizität des β-Amyloid-Proteins bei der Alzheimer-Krankheit (AD) spielt und der übermäßigen Produktion dieses Proteins entgegenwirkt [1,2,3]; mit CHO angereicherte Neuronen sind resistenter gegen oxidativen Stress und die Toxizität des β-Amyloid-Proteins [4, 5].

Daher kann davon ausgegangen werden, dass die in der neuronalen Plasmamembran vorhandene CHO-Menge und nicht nur deren Plasmaspiegel eine Rolle bei der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen spielen [6]. Tatsächlich unterstützen experimentelle Daten die Idee, dass eine optimale Menge an CHO in Zellmembranen notwendig ist, um eine Schutzbarriere gegen toxische Stoffe zu schaffen. Eine reduzierte Menge an zellulärem CHO in der Plasmamembran verändert diese Schutzbarriere und verringert den Schutz gegen toxische Stoffe, einschließlich des β-Amyloid-Proteins [7]. Interessanterweise enthalten Neuronen in der Großhirnrinde transgener AD-Mäuse weniger CHO in der Plasmamembran als die von Wildtyp-Mäusen [8].

Mori et al. [9] zeigten, dass CHO sowohl beim Menschen als auch bei transgenen Amyloid-Precursor-Protein (APP)-Mäusen abnormal in reifen Amyloid-Plaques akkumuliert wird, aber nicht in diffusen oder unreifen Plaques, was darauf hindeutet, dass CHO eine Rolle bei der Bildung und Progression von senilen Plaques spielen könnte. Andere nachfolgende Studien fanden heraus, dass CHO und Apolipoprotein E im Kern der fibrillären Plaques vorhanden waren, jedoch nicht in den diffusen Plaques in einem frühen Stadium. In fortgeschritteneren Stadien der Erkrankung wurde eine höhere Zahl fibrillärer Plaques beschrieben, die immunpositiv für Cholesterinoxidase sind [10]. Die durch Massenspektrometrie bestimmte Menge an freiem CHO pro seniler Plaque war ähnlich der β-Amyloid-Proteinbelastung [8]. Diese gegenseitige Erhöhung der Konzentration von CHO und senilen Plaques bei AD könnte auf einen neuen pathogenetischen Mechanismus der Erkrankung hinweisen [11]. Darüber hinaus wurden im Hirngewebe von AD-Patienten Lipidablagerungen beschrieben, die mit fibrillären senilen Plaques kolokalisieren, indem Anti-Stokes-Raman-Streuung und 2-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie in Thioflavin-S-gefärbten Proben verwendet wurden [10]. Zwei Lipidmorphologien können beobachtet werden:lamellare Strukturen und koaleszierende Makroaggregate von Submikrometergrößen. Da die Lipidzusammensetzung/-organisation über die Plaques hinweg variiert, gibt es klare Hinweise auf ein enges Amyloid-Lipid-Wechselspiel in fibrillären senilen Plaques, was ihnen dynamischere Zusammensetzungen verleiht als bisher angenommen [12].

Um Biomarker von AD in frühen Stadien der Krankheit zu erkennen, haben mehrere Studien die Verwendung funktionalisierter magnetischer Eisenoxid-Nanopartikel (MNPs) als spezifische Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRT) für senile Plaques vorgeschlagen [13,14, 15] und Ferritinprotein [16] Nachweis. Der hypointense Effekt dieser Partikel in T2- und T2*-gewichteten Sequenzen sorgt für einen höheren Kontrast in MRT-Bildern. Daher ist die Verwendung von MNPs als Kontrastmittel für die MRT eine vielversprechende Methode zur Früherkennung von AD.

Die vorliegende Arbeit stellt die Hypothese der Verwendung eines neuen Kontrastmittels basierend auf biofunktionalisierten MNPs zum Nachweis von abnormalen Ansammlungen von CHO in den senilen Plaques durch MRT vor, das als potenzieller Biomarker für AD verwendet werden kann.

Die vorliegende Arbeit präsentiert nach unserem Kenntnisstand zum ersten Mal das Design eines neuen Kontrastmittels basierend auf biofunktionalisierten MNPs zum Nachweis von abnormalen Ansammlungen von CHO in den senilen Plaques mittels MRT, das als potentieller Biomarker für AD . verwendet werden kann .

Die Hypothese

Aufgrund der hohen Inzidenz von AD in der Weltbevölkerung im Laufe der Jahre [17] und der damit verbundenen Kosten der Pathologie in gesundheitlicher und sozialer Hinsicht für die Länder [17] ist es dringend erforderlich, nicht-invasive Instrumente zu entwickeln, die den Nachweis von frühen Biomarkern für Diagnose und Entwicklung der Krankheit.

Innerhalb der Frühdiagnostik kommt der Entwicklung von Kontrastmitteln für die molekulare Bildgebung (MI) besondere Bedeutung zu. MI kombiniert konventionelle Bildgebungstechnologien mit molekularen Sonden, die entwickelt wurden, um Aspekte der Biochemie und Zellbiologie zu erkennen, die dem Krankheitsverlauf und dem Ansprechen auf die Behandlung zugrunde liegen [18,19,20].

Wir schlagen die Synthese eines Kontrastmittels auf Basis von MNPs vor, die mit Polyethylenglykol (PEG) beschichtet und mit Streptavidin funktionalisiert sind (Abb. 1a), um die gerichtete Verknüpfung eines biotinylierten Antikörpers zu ermöglichen, der spezifisch das in den senilen Plaques vorhandene CHO (NANOCHOAD) erkennt ( Abb. 1b). Der Antikörper erkennt auch das in der zellulären Plasmamembran vorhandene CHO, wodurch die Abnahme von CHO in neuronalen Plasmamembranen nachgewiesen wird. MNPs werden mit PEG-Ketten beschichtet, um die kolloidale Stabilität der Nanoplattform zu verbessern und ihre Verteilung im Blutkreislauf und den Durchgang durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​zu erleichtern [21].

Schematische Darstellung der entworfenen Nanoplattform und ihres Wirkmechanismus. a die Struktur von MNP und Funktionalisierung mit Anti-CHO-Antikörper (NANOCHOAD), b Strategien zur Durchdringung der Nanoplattform durch BBB, c Kreuzungsmechanismus durch die BBB von NANOCHOAD. d Nanokonjugat Anti-CHO-MNP, das auf CHO-Ablagerungen auf Amyloid-Plaques abzielt

Die BBB stellt eine der exklusivsten biologischen Barrieren bei der Behandlung und Diagnose neurologischer Erkrankungen dar und schränkt den systemischen Zugang der meisten diagnostischen und therapeutischen Mittel zum Gehirn ein [22, 23]. Daher besteht die Herausforderung bei der Diagnose und Behandlung einer großen Anzahl von Hirnerkrankungen darin, die Schwierigkeit zu überwinden, Therapeutika und Kontrastmittel durch die BHS an konkrete Hirnregionen zu verabreichen. Glücklicherweise zeigen kapillare Endothelzellen des Gehirns einige spezifische rezeptorvermittelte Transportmechanismen. Es wurde dokumentiert, dass eine große Anzahl von Transferrinrezeptoren von kapillaren Endothelzellen des Gehirns exprimiert wird, die an der rezeptorvermittelten Transzytose durch die BBB beteiligt sind [24].

Um das Problem des Durchgangs des Kontrastmittels durch die BHS zu lösen, schlagen wir daher drei alternative Strategien vor:(i) die Anti-CHO-MNPs mit Transferrin zu konjugieren [25], wodurch sie die BHS passieren können; (ii) die intranasale Verabreichung des Anti-CHO-MNPs-Konjugats. Der intranasale Weg, der nicht invasiv ist und die BHS umgeht, ist ein alternativer Weg, um Nanokonjugate an das Gehirn zu liefern [26, 27]; und (iii) das Anlegen externer Magnetfelder, um dem Nanokonjugat das Überqueren der BBB zu erleichtern (Abb. 2c). Diese neuartige Verabreichungstechnik kann dem Gehirn (Geruchsregion, Kortex, Hippocampus…) eine klinisch relevante Dosis über die BHS zuführen [28,29,30] (Abb. 1c). Darüber hinaus würde die Passage des Nanokonjugats durch die BHS sowohl durch die Verwendung von PEG-beschichteten MNPs als auch durch die Verschlechterung der BHS aufgrund der Pathologie selbst begünstigt. Das Nanokonjugat erkennt spezifisch abnormale Ablagerungen von CHO in senilen Plaques anhand der Antigen-Antikörper-Affinität (Abb. 1c, d). Die Ansammlung von Nanopartikeln in pathologischen Strukturen im Hirnparenchym als senile Plaques würde auf Veränderungen der CHO-Lokalisierung im AD-Hirnparenchym hinweisen. Daher zeigt das Vorhandensein von Anti-CHO-MNPs, die mit den senilen Plaques assoziiert sind, in der T2*-gewichteten MRT hypointense Signale, was den Nachweis von CHO, das mit anderen etablierten Kennzeichen der AD, wie senilen Plaques, verbunden ist, und somit die MR-Bildgebung ermöglicht von CHO im Gehirn könnte ein neuer Biomarker der Krankheit werden. Darüber hinaus werden Veränderungen im MRT aufgrund einer Abnahme der CHO-Plasmamembran erwartet.

Experimentelles Design zum Testen der Hypothese. Zuerst in vitro (a ):Bestimmung der Biokompatibilität des synthetisierten Nanokonjugats. Ex-vivo-Test (b ):Testen der Spezifität von Anti-CHO-MNPs-Nanokonjugat durch Inkubation der Nanoplattform auf fixierten Hirnschnitten von 5XFAD-transgenen Mäusen. In-vivo-Studien (c ):Die Nanoplattform wird intravenös oder auf alternativen Wegen als intranasale Verabreichung/externe Magnetfeldanwendung injiziert und ihre Wirksamkeit (Targeting) wird durch MRT bewertet

Die Clearance des Kontrastmittels aus dem Hirnparenchym konnte durch die Internalisierung der MNPs durch Mikrogliazellen und deren anschließende lysosomale Verarbeitung erreicht werden, wie in früheren Studien gezeigt wurde [16, 31, 32]. MNPs werden auf den üblichen Wegen eliminiert, die für den Stoffwechsel von endogenem Eisen verwendet werden. Dennoch werden die Eliminationswege der Kontrastmittel, basierend auf ihrer Größe und Oberflächenladung, sowie ihre potenzielle Toxizität während der Entwicklung der vorgeschlagenen Hypothese bestimmt, wie unten beschrieben.

Testen der Hypothese

Synthese und Charakterisierung magnetischer Nanopartikel

Die Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln wird unter Verwendung einer kontrollierten Co-Präzipitationsmethode durch Mischen von Eisen(II)-(Fe2+) und Eisen(III)-Ionen (Fe3+) in alkalischer Lösung nach den Arbeiten von Predescu et al. [33]. MNPs werden nach dem zuvor von Liu et al. entwickelten Protokoll mit einer PEG-Hülle beschichtet. [34].

Struktur, Morphologie und Magnetismus der mit PEG beschichteten Eisennanopartikel werden mittels Röntgenbeugung (XRD), Rasterelektronenmikroskopie (REM), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) und Supraleitende Quanteninterferenzvorrichtung (SQUID) Magnetometrie.

Nach der Charakterisierung des synthetisierten magnetischen Nanomaterials wird es mit (1) Streptavidin-Protein durch die NHS/EDC-Methode funktionalisiert. Danach wird es an einen biotinylierten Anti-CHO-Antikörper und (2) Transferrin-Protein gekoppelt. Die Transferrin-Konjugation wird durchgeführt, indem eine Carboxylgruppe, die auf der Oberfläche des Liganden vorhanden ist, und eine Hydroxylgruppe, die auf der PEG-Beschichtung vorhanden ist, gekoppelt werden [35].

In-vitro-Tests

In einem ersten Schritt wird die Biokompatibilität der Nanoplattform in vitro getestet (Abb. 2a). Das Nanokonjugat wird Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten sowie Endothelzellkulturen zugesetzt [36], um die Kompatibilität des Nanokonjugats mit typischen Gehirnzellen zu bestimmen. Bei korrekter Zytokompatibilität der funktionalisierten MNPs wird die Wirksamkeit des Systems in einem Ex-vivo-Modell der Erkrankung getestet (Abb. 2b). Das ausgewählte Modell ist eine doppelt transgene APP/(Presenilin-1)-PS1-Maus, die fünf familiäre AD-Mutationen (5XFAD) koexprimiert und eine ähnliche Amyloid-Plaque-Pathologie wie bei AD aufweist [37].

Die Ansammlung von CHO um die senilen Plaques im transgenen 5XFAD-Modell wird immunhistochemisch untersucht.

Wenn das Modell gültig ist, wird vorgeschlagen, die Spezifität des synthetisierten Nanokonjugats zu testen, sobald die Akkumulation von CHO in den senilen Plaques nachgewiesen ist. Dafür werden zunächst fixierte Hirnschnitte von den 5XFAD-transgenen Mäusen gewonnen, und dann wird an ihnen die Vereinigung des Nanokonjugats versucht, indem die Anti-CHO-MNPs auf den fixierten Hirnschnitten von 5XFAD-Mäusen inkubiert werden. Die Spezifität des Nanokonjugats wird bestimmt, indem die Kolokalisation der Anti-CHO-MNPs mit den CHO-Ablagerungen und den senilen Plaques in den 5XFAD-Hirnschnitten bewertet und die entsprechenden Kontrollen durchgeführt werden. Für den Fall, dass keine offensichtlichen Cholesterinansammlungen in 5XFAD nachgewiesen wurden, eine alternative schwedische Mutation am Amyloid-Vorläuferprotein-Mausmodell (APP_sw ), Mausmodell der AD, verwendet werden, da in diesem Modell eine eindeutig mit Amyloidplaques assoziierte Ansammlung von CHO im Hippocampus beschrieben wurde [9].

In-vivo-Tests

Sobald die Spezifität des Konjugats nachgewiesen ist, werden die Biokompatibilitätsanalysen des Nanocojugats in vivo durchgeführt. Die Nanoplattform würde in unterschiedlichen Dosen (im Bereich von 25 bis 100 mg/kg [38]) intravenös injiziert (Abb. 2c), und die subakute Toxizität im Verlauf der Studie wird durch Beobachtung der Mortalität und der Anzeichen von Atrophie analysiert , Stauung, Entzündung oder irgendwelche groben Verhaltensänderungen bei Mäusen. Der Gewichtskoeffizient jedes Organs zum Körper wird berechnet. Die Nierentoxizität wird durch die Konzentrationen von Harnstoffstickstoff und Kreatinin im Blut bestimmt. Die Spiegel von Gesamtbilirubin und alkalischer Phosphatase im Blut könnten als Maß für die Leber- und Gallenfunktionalität getestet werden. Darüber hinaus werden der Harnsäurespiegel und hämatologische Studien zur Beurteilung von Veränderungen der roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen und Hämoglobin bestimmt. Um schließlich genauer nach möglichen toxischen Wirkungen zu suchen, werden histologische Untersuchungen verschiedener Gewebe (Niere, Leber, Milz, Gehirn oder Lunge) durchgeführt [39]. Die Position der funktionalisierten MNPs in Blut, Urin und verschiedenen Organen würde 24 Stunden, 72 Stunden, 1 Woche, 2 Wochen und 1 Monat nach der Injektion von Anti-CHO-MNPs analysiert.

Sobald die geeignete Konzentration von MNPs bestimmt ist, wird die Nanoplattform Kontroll- und 5XFAD-Mäusen injiziert und ihre Wirksamkeit wird durch MRT bewertet (Abb. 2c). Wenn der Antikörper der Nanoplattform das Antigen im In-vivo-System nicht erkennt, könnten die MNPs mit Phenyl-Diin-Cholesterin funktionalisiert werden, einer Verbindung, die in früheren Studien in der Lage war, in vivo an CHO-Ansammlungen zu binden [40] . Die Biokompatibilität dieses Nanokonjugats wird wie oben für das MNP-CHO-Nanokonjugat beschrieben bewertet. Wenn der intravenöse Verabreichungsweg beim Überqueren der BHS nicht wirksam ist, werden alternative Verabreichungswege wie die intranasale Verabreichung oder die Anwendung externer Magnetfelder vorgeschlagen (Abb. 2c).

Implikationen der Hypothese

Die Verwendung von biofunktionalisierten MNPs zum Nachweis von AD in vivo durch MRT wurde in zahlreichen früheren Studien umfassend demonstriert, indem die MNPs an verschiedene Peptide konjugiert wurden:Aβ 1-40 [41], Aβ1-30 [42], Aβ1-42 [15] , und Anti-Aβ-1-42-Antikörper [43]. Nach intravenöser Verabreichung in Tiermodellen von AD wurden sowohl senile Plaques als auch vaskuläre Amyloidablagerungen (kongophile Angiopathie) durch MRT nachgewiesen. Diese Nanokonjugate sind jedoch an sich toxisch, da die verwendeten Fragmente des Amyloidpeptids neurotoxisch sind (Aβ1-40, Aβ 1-42). Darüber hinaus erfordern sie aufgrund ihrer Größe die gleichzeitige Verabreichung von Verbindungen, die ihre Passage durch die BHS erleichtern.

NANOCHOAD würde als Kontrastmittel wirken, das die gleichzeitige Lokalisierung von zwei AD-spezifischen Biomarkern ermöglichen würde:Amyloid-Plaques und Verlust von CHO in der weißen Substanz des Gehirns [44], wodurch Toxizität vermieden wird. Aufgrund des Vorhandenseins von PEG in seiner Struktur würde es auch den Durchgang der Nanoplattform durch die BBB erleichtern [43].

Wie zu sehen ist, zielen die meisten Studien zu diesen Merkmalen auf den Nachweis von senilen Plaques ab, einem der wichtigsten Biomarker der AD, aber nicht der einzige. Kürzlich wurde eine Arbeit veröffentlicht, in der Ferritin- und damit Eisenablagerungen durch Nanokonjugate auf Basis von MNPs nachgewiesen wurden [16]. Dieses Kontrastmittel zum Nachweis von Ferritin weist jedoch eine geringe Sensitivität auf, da es nicht durch MRT und nur durch Quantifizierung an bestimmten Stellen des Gehirns nachgewiesen wird. Der Verlust der weißen Substanz im Gehirn ist ein massives Phänomen [44], das nicht lokalisiert ist; Daher wird angenommen, dass das vorgeschlagene Kontrastmittel empfindlicher für die Früherkennung von AD-Biomarkern sein könnte. Es ist notwendig, die Entwicklung neuer Kontrastmittel zu fördern, die andere mit AD assoziierte Biomarker in frühen Stadien der Krankheit effizient erkennen können.

Andererseits könnte die Zusammensetzung des vorgeschlagenen Nanokonjugats zwei der Haupthindernisse bei der Überwindung der Wirksamkeit von intravenös injizierten Kontrastmitteln lösen:die kolloidale Stabilität im Blutkreislauf und die Fähigkeit, die BHS erfolgreich zu passieren, um das Ziel zu erreichen. Die Funktionalisierung der Nanoplattform mit PEG-Ketten wird die kolloidale Stabilität der Nanokonjugate im Blutkreislauf sicherstellen [15, 21]. Andererseits wird die Konjugation der MNPs mit dem Peptidtransferrin [25] als Strategie zur Überquerung der BHS die Erkennung von Transferrin durch spezifische Rezeptoren in der BHS erleichtern, sodass das Nanokonjugat die BHS passieren und an sein endgültiges Ziel binden kann . Diese Tatsache in Kombination mit der reduzierten Größe des Nanosystems und der Veränderung der BHS bei Patienten mit AD würde die Passage des Nanokonjugats durch die BHS erleichtern.

Aufgrund der Neuheit im Design des beschriebenen Nanokonjugats ist es erforderlich, die Biokompatibilität und die verabreichte Dosis der Nanoplattform eingehend zu untersuchen, insbesondere um die Eliminationswege des Kontrastmittels des Organismus zu bestimmen.

Abkürzungen

AD:

Alzheimer-Krankheit

BBB:

Blut-Hirn-Schranke

CHO:

Cholesterin

MI:

Molekulare Bildgebung

MNPs:

Magnetische Eisenoxid-Nanopartikel

MRT:

Magnetresonanztomographie

PEG:

Polyethylenglykol