Chemische Amin-Aldehyd-Konjugation auf einer mit Kaliumhydroxid behandelten Polystyrol-ELISA-Oberfläche zur Nanosensorik eines HIV-p24-Antigens

Hintergrund

Der Nachweis von Krankheitsbiomarkern und Oberflächenantigenen auf intakten Krankheitserregern ist im Bereich der medizinischen Diagnostik notwendig, um die Lebenserwartung des Menschen zu verlängern und ein gesünderes Leben zu unterstützen. Zur Diagnose von Krankheitserregern und lebensbedrohlichen Krankheiten, einschließlich Krebs, stehen verschiedene Nachweissysteme zur Verfügung [1,2,3,4]. Das Spektrum an Sonden und Sensing-Strategien kann nachweislich mehrere Krankheiten identifizieren [5, 6]. Unter diesen Ergebnissen ist der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) eine etablierte Strategie zum Nachweis und zur Diagnose von schweren Krankheiten, einschließlich HIV, und ELISA wurde als Qualitätskontrolltest angesehen [7,8,9,10]. Als Immunoassay weist ELISA das Antigen mit dem entsprechenden Antikörper nach. Um diese Rolle zu erfüllen, wird das Antigen auf einer Polystyrol (PS)-Oberfläche immobilisiert und interagiert dann mit dem Partnerantikörper (Primärantikörper), gefolgt von dem wirtsspezifischen Antikörper (Sekundärantikörper) mit dem konjugierten Enzym, das an der primäre Antikörper. Schließlich werden diese molekularen Wechselwirkungen durch ein geeignetes Substrat überwacht. Forscher haben verschiedene ELISA-basierte Ansätze verwendet, einschließlich der Sandwich-Methode mit geeigneten poly- und monoklonalen Antikörpern oder Aptamer-Antikörper-Kombinationen, um die Nachweise zu verbessern [11,12,13,14].

Die Sensitivität eines ELISA hängt von Parametern wie der Interaktion zwischen Antigen und Antikörper, der Temperatur, dem pH-Wert und der Effizienz der Antigenanlagerung an die PS-Oberfläche ab. Unter diesen Faktoren spielt die Immobilisierung des Antigens oder Antikörpers auf der PS-Platte eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung der Nachweisgrenze. Darüber hinaus beeinflusst die Beschränkung durch die Anlagerung und die ungleichmäßige Verteilung des Proteins auf der PS-Oberfläche die Assay-Sensitivität stark [5]. Eine höhere Menge mit der richtigen Immobilisierung von Protein hilft beim Erreichen der richtigen Orientierung auf der PS-Oberfläche für mögliche Verbesserungen beim Nachweis. Es wurden verschiedene Strategien verwendet, um Proteine ​​richtig auf der PS-Oberfläche zu immobilisieren. Ein Protein oder Antikörper hat die Fähigkeit, sich einfach durch chemische oder physikalische Adsorption oder elektrostatische Wechselwirkung auf der PS-Platte zu immobilisieren. Bora et al. [15] immobilisierten Protein auf der PS-Oberfläche mithilfe von Photochemie und fanden bis zu 1,5- bis 2-fach höhere Verbesserungen im Vergleich zur unbehandelten Oberfläche. In einer anderen Studie wurde die effiziente Immobilisierung von Protein auf der PS-Platte mit einem Polymer namens Polyvinylbenzyllactonoylamid (PVLA) gezeigt [16]. Polymere auf der Basis von Polyethylenglycol (PEG) haben auch für die effiziente Immobilisierung von Biomolekülen auf Sensoroberflächen gesorgt. Lakshmipriyaet al. [17] entwickelten einen verbesserten Nachweis des Gerinnungsproteins Faktor IX durch Immobilisierung seines thiolierten Oligomers zusammen mit zwei Polymeren (PEG-b-PAAc und N6-PEG) auf einer goldbeschichteten Oberfläche.

Auf der Oberfläche der ELISA-Platte besteht PS aus einer aliphatischen Kohlenstoffkette mit anhängenden Benzolringen an jedem Kohlenstoff und bietet eine hydrophobe Oberfläche. Die Carboxylgruppe auf der PS-Oberfläche bindet das Antigen oder den Antikörper durch eine elektrostatische Wechselwirkung mit seinen exponierten Amingruppen. Diese Bindungsstrategie hat jedoch Nachteile, wie die geringere Bindung von Protein und unregelmäßige Positionierung der Moleküle. Die kleineren Proteine ​​und Peptide mit einer geringeren Anzahl von Aminosäurezusammensetzungen sind aufgrund der Verfügbarkeit von weniger Epitopen besonders schwierig an die PS-Oberfläche zu binden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass, wenn die Moleküle auf dem Sensorsubstrat überfüllt sind, der Abstand zwischen den Sonden zu gestört wird, um eine echte Wechselwirkung einzugehen. Aus diesem Grund verbessert die Erhöhung der Bindung eines Proteins oder Antikörpers auf der PS-Platte mit der richtigen Orientierung die Nachweisgrenze. Im Allgemeinen werden Proteine ​​direkt auf der ELISA-Oberfläche immobilisiert, und die Forscher konzentrieren sich auf die Verbesserung der Proteinimmobilisierung auf der ELISA-Oberfläche, um einen Hochleistungsnachweis zu entwickeln. Insbesondere die Immobilisierung von Protein durch chemische Funktionalisierung auf der PS-Oberfläche wurde von mehreren Forschern beobachtet, um diese Strategie zu verbessern. Die chemische Modifikation auf Aminbasis ist wirksam bei der Immobilisierung verschiedener Antikörper durch den geeigneten Crosslinker. 3-(Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) wird üblicherweise verwendet, um die Sensoroberfläche für die Verwendung mit Aminen zu modifizieren. Der Antikörper kann über seine COOH-Gruppe auf der aminmodifizierten APTES-Oberfläche immobilisieren. Die Immobilisierung von Protein kann jedoch nicht wie der Antikörper direkt an die Aminoberfläche gebunden werden; insbesondere erfordern kleinere Proteine ​​ein geeignetes Vernetzungsmittel. Hier haben wir eine einfache Schrittimmobilisierung für Protein unter Verwendung einer chemischen Modifikation mit APTES und Glutaraldehyd (GLU) eingeführt. Wir immobilisierten die Proteine ​​kovalent auf der aminmodifizierten Oberfläche und verknüpften sie mit GLU. GLU ist eine organische Verbindung mit der Formel CH₂ (CH₂ CHO)₂ , und es hat sich als eines der wirksamsten Proteinvernetzungsmittel erwiesen [4, 18, 19, 20]. Es hat zwei Aldehydgruppen an seinen Enden; ein Ende bindet an die aminmodifizierte ELISA-Oberfläche und das andere Ende ist frei, um das Protein oder den Antikörper zu binden. Im Allgemeinen ist die Immobilisierung kleinerer Proteine ​​oder Peptide auf der ELISA-Oberfläche eine echte Herausforderung, da weniger Amine auf der Oberfläche vorhanden sind. Bei der chemischen Funktionalisierungsstrategie besteht die Möglichkeit, das Material mit kleineren Proteinen oder Peptiden stark auf der ELISA-PS-Platte zu immobilisieren. Für unsere Methode haben wir APTES-GLU als Linker verwendet; Mit dieser Modifikation können wir alle Arten von Antikörpern, Proteinen und Peptiden immobilisieren. Die Signal- und Empfindlichkeitsverbesserungen bei dieser Strategie sind höher als bei anderen in der Vergangenheit untersuchten chemischen Strategien [3, 4].

Um den Vorteil dieser Chemie zu demonstrieren, haben wir uns für den Nachweis eines der wichtigsten Proteine ​​des humanen Immunschwächevirus (HIV) (p24) entschieden, das in einem früheren Stadium der HIV-Infektion exprimiert wird. Das p24-Antigen besteht aus dem viralen Kern und ist während der ersten Infektionswoche in einer höheren Konzentration vorhanden. Daher ist es ideal, ein sensitives System unter Verwendung von p24 für einen früheren HIV-Nachweis zu erzeugen. Dabei wurde der Nachweis von p24 unter Verwendung der oben erwähnten chemisch modifizierten ELISA-Oberfläche generiert. Diese chemische Funktionalisierungsstrategie hat den p24-Nachweis auf der PS-ELISA-Oberfläche um ein Vielfaches verbessert und kann zum Nachweis anderer wichtiger klinischer Biomarker empfohlen werden.

Materialien und Methoden

Reagenzien und Biomoleküle

Rekombinante HIV-p24- und Tat-Proteine ​​und p24-Antikörper wurden von Abcam (Malaysia) bezogen. 3-(Aminopropyl)triethoxysilan (APTES), Glutaraldehyd (GLU) und Humanserum wurden von Sigma-Aldrich (USA) bezogen. Anti-Maus-IgG-konjugierte Meerrettichperoxidase (Anti-Maus-Immunglobulin HRP) wurde von Thermo Scientific (USA) bezogen. Eine ELISA-Platte wurde von Becton Dickinson (Frankreich) bezogen. Ein ELISA 5X Beschichtungspuffer wurde von Biolegend (UK) bezogen. Rinderserumalbumin (BSA) und HRP-Substrat [3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)] wurden von Promega (USA) bezogen. Der analytische ELISA-Reader wurde von Fisher Scientific (Malaysia) bezogen.

Optimale APTES- und GLU-Level für die Funktionalisierung auf der PS-Oberfläche

Die Optimierung der APTES- und GLU-Spiegel zur Verwendung auf der PS-Oberfläche wurde mit dem zielgerichteten HIV-p24-Antigen durchgeführt. Um die geeigneten Konzentrationen von APTES und GLU zu bestimmen, wurde die ELISA-Oberfläche zuerst mit 1% Kaliumhydroxid für 10 min aktiviert. Dann ließ man drei verschiedene Mengen APTES (0,5, 1 und 2 %) an die ELISA-Oberfläche binden und sie wurden über Nacht bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Danach wurden zwei unterschiedliche Mengen GLU (1 und 2 %) auf die aminmodifizierte PS-Oberfläche aufgetragen. An diesem Punkt wurde HIV-p24 in einer Konzentration von 250 nM an die GLU-modifizierte Oberfläche binden gelassen und die verbleibende GLU-Oberfläche wurde mit 2% BSA blockiert. Der p24-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:1000 eingeführt und dann wurde Anti-Maus-IgG-HRP an den p24-Antikörper binden gelassen. Schließlich wurden diese Wechselwirkungen durch Zugabe des Substrats (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin, TMB) für HRP überwacht. Nach Zugabe der optimalen Substratmenge (100 µM) wurde die Extinktion mit einem ELISA-Lesegerät bei 405 µm abgelesen. Kontrollexperimente wurden in Abwesenheit des Ziel-HIV-p24 durchgeführt.

Optimierung der Aldehydbindung an die Amingruppe

Um die geeignete Inkubationszeit für GLU zu bestimmen, um die aminmodifizierten Oberflächen zu verbinden, wurden zwei verschiedene Inkubationszeiten beobachtet. Nachdem die ELISA-PS-Oberfläche mit APTES modifiziert worden war, wurde die GLU 3 h lang immobilisiert und über Nacht unabhängig inkubiert, und dann wurden 250 nM HIV-p24-Antigen auf den GLU-modifizierten Oberflächen immobilisiert. Die verbleibenden Schritte wurden wie im vorherigen Experiment gezeigt befolgt.

Vergleichende Nachweise zwischen HIV-p24-Antigen auf der GLU-modifizierten Oberfläche und den GLU-vorgemischten HIV-p24-Antigen-Anhängen

Um das HIV-p24-Antigen auf der ELISA-Oberfläche nachzuweisen, haben wir zwei verschiedene Ansätze zur Oberflächenmodifikation unter Verwendung von GLU verglichen. Bei der ersten Methode (Methode 1:Amin-GLU-p24) wurde die PS-Oberfläche zunächst mit einem Amin unter Verwendung von 2% APTES modifiziert, 2% GLU wurde der Oberfläche hinzugefügt, um die Plattenoberfläche mit einer Aldehydgruppe zu verbinden, und dann 100 nM HIV-p24-Antigen wurde zugegeben. Im zweiten Ansatz (Methode 2:Amin-GLU vorgemischtes p24) wurde GLU-p24 (2% GLU wurde mit 100 µnM HIV-p24-Antigen gemischt und 30 Minuten bei RT gehalten) nach der Modifizierung der Oberfläche mit einem Amin hinzugefügt. Schließlich wurde der Nachweis mit dem p24-Antikörper durchgeführt. Die anderen Schritte wurden wie oben erläutert durchgeführt. Die Kontrollexperimente wurden in Abwesenheit des Ziel-HIV-p24 durchgeführt.

Nachweisgrenze:Konventioneller vs. chemisch modifizierter ELISA

Um die Nachweisgrenze zu überprüfen, wurden verschiedene Konzentrationen von p24 von 0,5 bis 500 µm titriert und mit den herkömmlichen Methoden und Methoden 1 und 2 ausgewertet.

Herkömmliche Methode

HIV-p24-Antigen wurde anfänglich mit 1 % ELISA-Beschichtungspuffer verdünnt, auf die ELISA-Oberfläche gegeben und über Nacht bei 4 °C gehalten, und dann wurden die verbleibenden Bereiche mit 2 % BSA für 1 Stunde bei RT blockiert. Danach wurde eine 1:1000-Verdünnung des p24-Antikörpers zugegeben und 1 Stunde lang inkubiert, und dann wurde eine 1:1000-Verdünnung von Anti-Maus-IgG-HRP auf die ELISA-Oberfläche gegeben und 1 Stunde lang stehen gelassen. Schließlich wurde das HRP-Substrat (TMB) hinzugefügt und mit dem ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.

Methode 1

Den APTES- und GLU-modifizierten Oberflächen wurden unterschiedliche Konzentrationen von HIV-p24-Antigen zugesetzt. Nachdem das Antigen immobilisiert war, wurden die verbleibenden Schritte wie im herkömmlichen ELISA angegeben befolgt. Zwischen jedem Immobilisierungsschritt wurde fünfmal gewaschen. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm unter Verwendung des ELISA-Lesegeräts aufgezeichnet und es wurden Fotos gemacht.

Methode 2

Auf der APTES-modifizierten ELISA-Platte wurden verschiedene Konzentrationen von p24 vorgemischt mit GLU immobilisiert. Alle anderen Schritte, die für den herkömmlichen ELISA verwendet wurden, wurden befolgt. Zwischen jedem Immobilisierungsschritt wurde fünfmal gewaschen. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 405  nm unter Verwendung des ELISA-Lesegeräts aufgezeichnet und Fotografien wurden aufgezeichnet. Kontrollexperimente wurden in Abwesenheit des Ziel-HIV-p24 durchgeführt.

Spezifischer Nachweis des HIV-p24-Antigens auf der APTES-modifizierten Oberfläche

Um die Assay-Spezifität zu überprüfen, führten wir zwei verschiedene Kontrollexperimente durch. Anstelle des HIV-p24-Antigens verwendeten wir Humanserum oder HIV-TAT-Protein vorgemischt mit 1% GLU und fügten sie der APTES-modifizierten Oberfläche hinzu. Alle anderen Schritte wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Kontrollexperimente wurden in Abwesenheit des Ziel-HIV-p24 durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist ein effektiver Immunassay, der Forschern hilft, verschiedene Biomoleküle mit geeigneten Antikörpern zu identifizieren. Eine hohe Immobilisierung von Analyten (Proteine, Peptide, Antikörper und Aptamere) [21,22,23] und die Fähigkeit zum Einfangen von Molekülen (monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper und Fc-Regionen von Antikörpern) [24, 25] können die Nachweisgrenze und unterstützen die Spezifität der Analyse. Vor diesem Hintergrund konzentrieren sich verschiedene Arten der Forschung auf die chemische Modifizierung der ELISA-Oberfläche, um die richtig ausgerichtete Sonde oder den richtig ausgerichteten Analyten in einer höheren Menge einzufangen. Im Allgemeinen wird ein Antikörper oder Protein auf der ELISA-PS-Oberfläche durch eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen der Carboxylgruppe des PS und den Amingruppen des Proteins oder Antikörpers immobilisiert. Diese Methode ist jedoch aufgrund ihrer Bindungslimitierung nicht effizient genug, um eine höhere Sensitivität und Spezifität zu erreichen. Um dieses grundlegende Problem zu lösen, haben wir während der vorliegenden Untersuchung eine chemisch funktionalisierte ELISA-Oberfläche mit 3-(Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und Glutaraldehyd (GLU) für eine effiziente Proteinimmobilisierung hergestellt. Wie in Abb. 1a gezeigt, wurde eine mit Kaliumhydroxid aktivierte PS-Oberfläche durch ein Amin unter Verwendung von APTES modifiziert und dann mit GLU vernetzt, um das Protein zu binden. Ohne Kaliumhydroxidbehandlung ist die optimale Menge an APTES an der PS-Oberfläche deutlich niedriger, da kein polarer Wasserstoffbrücken-Akzeptor vorhanden ist, der die anfängliche Adsorption verstärkt und die stärkere Bindung von APTES auslöst. Abbildung 1b zeigt den vorgeschlagenen Nachweis von immobilisiertem Protein auf der chemisch modifizierten ELISA-Oberfläche mit seinem Partnerantikörper.

Schematische Darstellung des chemisch modifizierten ELISA (a ). Die ELISA-Oberfläche wurde nach Kaliumhydroxidbehandlung mit APTES und GLU chemisch modifiziert. Das Antigen wurde auf der GLU-modifizierten Oberfläche immobilisiert. b Das immobilisierte Antigen wurde von seinem Partner-Antikörper nachgewiesen

Um Beweise für diese Nachweisstrategie zu sammeln, wollten wir ein wichtiges Protein des humanen Immunschwächevirus (HIV) namens p24 verwenden. Das HIV-p24-Antigen ist eines der Proteine, das im frühen Stadium einer HIV-Infektion exprimiert werden könnte, und es vermehrt sich im Wirtssystem, wie in anderen Virussystemen nachgewiesen wurde (Abb. 2). Intaktes HIV hat Glykoproteine ​​auf der Hülle, die das Kapsid bedeckt, und das HIV-p24-Antigen befindet sich in der Kapsidregion (Abb. 3a). Vor dem Nachweis des HIV-p24-Antigens optimierten wir zunächst die Konzentration des chemischen Linkers, um das HIV-p24-Antigen auf der ELISA-Oberfläche einzufangen. Wir untersuchten verschiedene Konzentrationen und Kombinationen von APTES und GLU auf der ELISA-Oberfläche und werteten die Ergebnisse mit einer konstanten Konzentration von 250 µm HIV-p24-Antigen aus. Wie in Abb. 3b und c gezeigt, zeigte die Anwendung von APTES und GLU bei 1 % ein gesättigtes Niveau der HIV-p24-Antigenbindung. Wenn APTES mit weniger als 1 % vorhanden war, war die Bindungsabsorption (OD) aufgrund einer Zunahme der Unspezifität (in Bezug auf das Kontrollexperiment) niedriger, gleichzeitig mit der von 2 % APTES. Für GLU zeigt der 2%-Wert einen guten Nachweis des HIV-p24-Antigens bei einer Extinktion von 0,25, und gleichzeitig zeigt das Kontrollexperiment (ohne HIV-p24) die höchste Extinktion (0,16). Die optimalen 1% APTES und GLU zeigen die niedrigste Extinktion im Kontrollexperiment (0,08) und die höchste Extinktion (0,22) während des spezifischen Nachweises des HIV-p24-Antigens. Dieses Ergebnis trat auf, weil es mit der Zunahme von APTES und GLU möglich ist, den Antikörper auf den verbleibenden freien Aminoberflächen (von APTES stammend) und Aldehydoberflächen (von GLU stammend) einzufangen. Dieses Ergebnis ist das gleiche, selbst wenn die freien Oberflächenbereiche in den obigen Fällen mit BSA blockiert wurden. Um die Methode weiter zu verfeinern, haben wir auch versucht, die BSA-Konzentration zu erhöhen, um das Hintergrundsignal zu minimieren. Selbst bei höheren APTES- und GLU-Konzentrationen kam es jedoch zu Biofouling. Basierend auf diesen Ergebnissen beträgt die optimierte Bedingung 1% APTES und GLU, wie in den Experimenten verwendet.

Interaktion zwischen HIV und Wirtszelle. Die allgemeine Strategie der HIV-Vermehrung wird gezeigt

a Intakte HIV-Struktur. Das p24-Antigen ist angegeben. b Die Optimierung von APTES und GLU. APTES (0,5, 1 und 2 %) und GLU (1 und 2 %) wurden mit verschiedenen Kombinationen verwendet, um die konstante Konzentration (250   nM) des HIV-p24-Antigens nachzuweisen

Nach der APTES- und GLU-Optimierung haben wir auch die Inkubationszeit für die Verknüpfung der GLU mit der APTES-modifizierten Oberfläche angepasst. Wie in Abb. 4a gezeigt, führt die Inkubation der GLU über Nacht zu der höchsten Absorption im Vergleich zur kürzeren Inkubationszeit (3 h). Dieses Ergebnis tritt aufgrund der unzureichenden Inkubationszeit für GLU auf, um sich mit der APTES-modifizierten Oberfläche zu verbinden; schließlich ist der Antikörper in der Lage, die verbleibenden APTES-Oberflächen zu binden. Mit einer verlängerten Inkubationszeit für GLU hat diese Verbindung die Chance, die APTES-Oberfläche vollständig zu bedecken. Diese Sättigung erhöht die Proteinimmobilisierung auf der GLU-Oberfläche und erhöht die Assay-Empfindlichkeit. Bei einer HIV-p24-Konzentration von 250 nM gibt es bei der Inkubation von GLU über Nacht eine fast zweifach höhere Absorption (Abb. 4a).

Optimierung der Inkubationszeit für GLU. a Optimiert für eine Inkubationszeit von 3 h und eine Inkubation über Nacht mit 1% GLU auf einer 1% APTES-modifizierten Oberfläche. b Nachweis von 125 nM p24 durch drei verschiedene Ansätze, konventionell, APTES-GLU-p24 (Methode 1) und APTES-GLU-vorgemischtes p24 (Methode 2)

Aufgrund des höheren echten Signals nach der Inkubation von GLU über Nacht mit der erhöhten Extinktion und dem spezifischen Nachweis von p24 verwendeten wir eine ähnliche Bedingung für weitere Experimente. In diesem Fall immobilisierten wir die GLU auf der APTES-modifizierten Oberfläche und befestigten dann das Protein (Methode 1). Wir haben auch einen anderen Ansatz ausprobiert; Zuerst vermischten wir 1% GLU mit 125 µm HIV-p24-Antigen und fügten dann diese Mischung auf die aminmodifizierte PS-Oberfläche (Methode 2). Überraschenderweise gab es eine erhöhte Absorption bei der gleichen Konzentration des HIV-p24-Antigens (von OD 0,161 bis 0,23) wie bei der in Methode 2 verwendeten Konzentration. Als wir das Protein als Vormischung an die GLU binden ließen, waren fast alle Proteine in der Lage, die GLU zu binden, und dann adsorbierte diese Mischung leicht an der aminmodifizierten Oberfläche. Wenn das Protein jedoch an die präimmobilisierte GLU-Oberfläche binden konnte, waren die meisten Aldehydgruppen der GLU nicht verfügbar. Abbildung 4b zeigt, dass die Mischmethode den Nachweis einer ähnlichen Konzentration (125 nM) des HIV-p24-Antigens mit einer höheren Absorption zeigt. Außerdem zeigten die Methoden 1 und 2 im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden bei gleicher Konzentration des HIV-p24-Antigens eine höhere Extinktion.

Nach der vollständigen Optimierung der Nachweisschritte, um die Nachweisgrenze zu ermitteln, titrierten wir das HIV-p24-Antigen von pikomolaren bis nanomolaren Bereichen (500 pM bis 500 nM). Wir verglichen drei verschiedene Methoden, nämlich die konventionelle APTES-GLU-p24 (Methode 1:p24 immobilisiert auf APTES, gefolgt von GLU-Modifikation) und APTES-GLU-vorgemischtes HIV-p24 (Methode 2:die Vormischung von p24 und GLU folgte) durch Immobilisierung auf APTES) mit der gleichen Konzentration von p24. Wie in Fig. 5 gezeigt, wurde die Nachweisgrenze für p24 für den herkömmlichen ELISA bei 30 nM gefunden. Bei Methode 1 wurde die Nachweisgrenze im Vergleich zum herkömmlichen ELISA um das Achtfache (4 nM) verbessert. Dieses Ergebnis trat auf, weil bei Verwendung der chemisch modifizierten PS-Oberfläche die Proteinimmobilisierung unter der einheitlichen Anordnung stabil war und die Immobilisierungsrate auch im Vergleich zur herkömmlichen Adsorption von Proteinen auf der ELISA-Oberfläche recht hoch war. Vashistet al. [12] zeigten bereits, dass die höhere Immobilisierung eines Antikörpers auf der APTES-modifizierten ELISA-Oberfläche mit einer dramatisch verbesserten Nachweisgrenze im Vergleich zu herkömmlichen ELISAs einhergeht [12]. In ihrer Arbeit kann das Amin in APTES Carboxylgruppen am Antikörper binden und so immobilisieren sie den Antikörper chemisch auf der ELISA-Oberfläche. Mit dieser Methode können wir die Antikörper nur über ihre Carboxylgruppen auf der ELISA-Oberfläche immobilisieren, eine proteinbasierte Antigenimmobilisierung ist jedoch auf APTES nicht möglich. Zu diesem Zweck haben wir den GLU-Linker eingeführt, um das Protein auf der ELISA-PS-Oberfläche zu immobilisieren. Mit diesen chemischen Linkern wurde nicht nur Protein, sondern auch ein Antikörper chemisch durch Aminkopplung an den Aldehyd am Glutaraldehyd gebunden. Die unspezifische Anlagerung von Biomolekülen an das ELISA-Substrat wurde unter Verwendung der Kontrollexperimente überwacht. Ein Kontrollexperiment wurde ohne das Zielmolekül (HIV-p24) durchgeführt. Ohne das Target kann der spezifische Antikörper für p24 nicht an der Oberfläche binden und somit wird der enzymkonjugierte Sekundärantikörper auch nicht auf der ELISA-Oberfläche immobilisiert. In diesem Fall können wir bei der Zugabe des Substrats (TMB) keine Änderungen der Absorption feststellen.

Nachweisgrenze für das HIV-p24-Antigen. Das p24 wurde von 0,5 bis 500 &mgr;nM titriert. Es wurden drei verschiedene Ansätze verfolgt, konventionelle und Methoden 1 und 2

Um die Nachweisgrenze zu verbessern, haben wir versucht, GLU und das HIV-p24-Antigen vor dem Immobilisierungsschritt auf der APTES-modifizierten Oberfläche vorzumischen. Es wurde erwartet, dass sich die Vormischung von GLU und HIV-p24-Antigen mit der stärkeren Immobilisierung von Proteinen auf der ELISA-Oberfläche verbessern würde. Wenn wir GLU mit dem HIV-p24-Antigen vormischen, ist das Bindungsverhältnis von Aldehyd zu GLU hoch. Wenn wir dieses Gemisch der ELISA-Oberfläche hinzufügen, verbessert es die Immobilisierungsrate. Dixit et al. fanden, dass, wenn sie den Antikörper und APTES vor der Immobilisierung auf der ELISA-Platte vormischten, ihr Ansatz die Immobilisierung des Antikörpers auf der ELISA-Oberfläche verstärkte und die Nachweisgrenze erhöht wurde [12]. In unserer Studie, als wir GLU und HIV-p24-Antigen vor der Immobilisierung vormischten, war die Nachweisgrenze erwartungsgemäß auf 1 nM verbessert und lag damit 30-mal höher als die des herkömmlichen ELISA, der eine Nachweisgrenze von 30 aufwies nM. Unsere Strategie hatte nicht nur eine verbesserte Nachweisgrenze, sondern verbesserte auch die Absorption für alle Konzentrationen des HIV-p24-Antigens. Bei 250 nM p24 beobachteten wir, dass die Extinktion 0,35 betrug, was fast das Doppelte des herkömmlichen ELISA mit der gleichen Konzentration an HIV-p24-Antigen ist. Bei allen HIV-p24-Antigenkonzentrationen wurde ein großer Unterschied in der Extinktion im Vergleich zum herkömmlichen ELISA festgestellt (Abb. 5), wie aus dem vertrauenswürdigen Nachweis des HIV-p24-Antigens ersichtlich ist.

Um die Assay-Spezifität zu bewerten, führten wir den Test mit zwei verschiedenen Kontrollexperimenten durch. Wir wählten Humanserum und HIV-TAT und vermischten es mit GLU anstelle von HIV-p24-Antigen vor der Verwendung und bewerteten ihre Spezifität. Wie in Fig. 6 gezeigt, gibt es im Fall von Humanserum und HIV-TAT keine signifikante Absorption; 250 nM HIV-p24-Antigen zeigte jedoch eine deutliche Zunahme der Absorption. Dieses Ergebnis bestätigt den spezifischen Nachweis des HIV-p24-Antigens auf der chemisch modifizierten ELISA-Oberfläche mit einer höheren Sensitivität.

Spezifischer Nachweis des HIV-p24-Antigens. Anstelle von HIV-p24 wurden Humanserum und HIV-TAT-Protein verwendet, um die Spezifität zu überprüfen

Schlussfolgerungen

Eine höhere und richtige Immobilisierung eines Proteins oder Antikörpers auf der ELISA-Oberfläche verbessert die Nachweisgrenze dramatisch. Hier haben wir eine interessante chemische Funktionalisierungsmethode vorgestellt, um die Protein- oder Antikörpermenge zu immobilisieren, die an die ELISA-PS-Oberfläche bindet, unterstützt durch APTES und GLU. Um den Nachweis zu demonstrieren, verwendeten wir das p24-Antigen von HIV. Die Nachweisgrenze wurde im Vergleich zum herkömmlichen ELISA um das 30-Fache verbessert. Weiterentwicklungen aus der vorliegenden Untersuchung könnten zu ähnlichen chemikalienbasierten Verbesserungen auf anderen Sensoroberflächen führen und wären nützlich, um verschiedene Antigene in geringerer Menge nachzuweisen, was einen Fortschritt in der medizinischen Diagnose darstellen würde.

Abkürzungen

APTES:

3-(Aminopropyl)triethoxysilan

BSA:

Rinderserumalbumin

COOH:

Carboxyl

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Fc:

Fragment kristallisierbar

GLU:

Glutaraldehyd

HIV:

Humanes Immunschwächevirus

HRP:

Meerrettichperoxidase

IgG:

Immunglobulin

OD:

Eine optische Dichte

PEG:

Polyethylenglykol

PS:

Polystyrol

PVLA:

Polyvinylbenzyllactonoylamid

TMB:

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin