DNA-Tetraeder-Nanoträger verstärken Doxorubicin-vermittelte Apoptose in HT-29 Darmkrebszellen

Zusammenfassung

Als nanoskaliger Wirkstoffträger mit dem Vorteil der Modifizierbarkeit und guter Biokompatibilität verspricht DNA-Tetraeder (DNA-Tetra)-Lieferung die hemmende Effizienz nicht-zielgerichteter Antikrebsmedikamente zu steigern. In dieser Untersuchung wurde Doxorubicin (Dox) über Click-Chemie an einen Folsäure-modifizierten DNA-Tetra assembliert, um ein zielgerichtetes Antitumor-Agent zu präparieren. Zelluläre Aufnahmeeffizienz wurde via Fluoreszenzbildgebung gemessen. Zytotoxizität, Hemmeffizienz und entsprechender Mechanismus an der Darmkrebszelllinie HT-29 wurden durch MTT-Assay, Zellproliferationskurve, Western Blot und Durchflusszytometrie evaluiert. DNA-Tetra induzierte keine Zytotoxizität, aber die zelluläre Aufnahmerate stieg offensichtlich durch DNA-Tetra-facillierte Penetration durch die Zellmembran. Entsprechend steigerte Folsäure-DNA-Tetra-Dox die Antitumor-Effizienz markant mit erhöhten Apoptose-Leveln. Im Detail war 100 µM die effektive Konzentration und eine 6-h-Inkubationsperiode notwendig für Apoptoseinduktion. Zusammenfassend war der nanoskalige DNA-Tetraeder ein sicheres und effektives Lieferungssystem für Dox und steigerte entsprechend die Antikrebs-Effizienz.

Hintergrund

Doxorubicin (Dox) ist eines der am häufigsten verwendeten Antineoplastika, und zahlreiche klinische Studien demonstrierten, dass Dox das Wachstum von Tumorzellen in verschiedenen Zellzyklusphasen durch Hemmung der RNA- und DNA-Synthese signifikant behindern kann [1, 2]. Frühere Studien legten nahe, dass die Proliferation von Tumorzellen effektiv in der G1-Phase blockiert wurde und Metastasen durch Dox bei bestimmter Konzentration ebenfalls inhibiert wurden [3]. Zudem kann effektive Hemmung bei relativ geringerer Dosis im Vergleich zu anderen Antikrebsmedikamenten erreicht werden [4]. Allerdings induziert Dox üblicherweise Nebenwirkungen aufgrund mangelnder spezifischer Targeting für Tumorzellen und nicht-selektiver Hemmung von DNA und RNA, was klinische Anwendungen stark limitiert [5, 6]. Gleichzeitig reduziert die geringe zelluläre Aufnahmemenge die Akkumulation von Dox in Tumorzellen [7]. Daher sollte ein effizientes Lieferungssystem für Dox entwickelt werden, um Dox spezifischer und effektiver zu targeten, leichter einzukapseln und mit exzellenter Aufnahmekapazität und Biokompatibilität auszustatten.

Nanoskalige Wirkstoffträger wie Liposomen und anorganische Nanopartikel können Dox beim Penetrieren der Tumorzellmembran unterstützen und die Targeting-Effizienz verbessern [8]. Dennoch kann liposomenbasierte Lieferung die Nebenwirkungen auf normale Zellen nicht reduzieren aufgrund relativ schlechter Targeting; anorganische Träger wie mesoporöse Silica-Nanopartikel können in vivo nicht vollständig biologisch abgebaut werden, was weitere Wirkstoffaufnahme behindert und potenzielle Bio-Toxizität birgt. Für diese funktionalen Lieferungssysteme behindern Vorbereitungskomplexität, Inhomogenität der Nanopartikelstrukturen und niedrige Einkapselungseffizienz die klinische Expansion [9–11]. Als nanoskaliger Wirkstoffträger mit exzellenter Leistung bei Wirkstofflieferung können DNA-basierte Strukturen wie DNA-Tetraeder (DNA-Tetra) die Membran durch Umgehung der Inkompatibilität zwischen elektro-negativem DNA und Plasmamembran penetrieren [12–17]. Medikamente und Targeting-Moleküle können beide kovalent an DNA-Tetraeder angehängt werden. Darüber hinaus vermeiden einfache Absorption und Biodegradation von DNA-tetraedrischen Sequenzen Langzeitretention. Guanin-reiche Aptamer-Wirkstoffe wie AS1411 wurden erfolgreich in A549-Tumorzellen geliefert und fungierten als Targeting-Agenten und Inhibitoren [18]. Immunregulatorische Faktoren wie CpG und siRNA können ebenfalls über DNA-Tetra-Träger in Tumorzellen geliefert werden, um Immunantworten zu regulieren [19]. Mit den Vorteilen niedriger Toxizität, guter Biokompatibilität und einstellbarem Targeting zeigte DNA-Tetra Bio-Sicherheit und Potenzial für Dox-Lieferung.

In dieser Studie wurden funktionale Partikel von DNA-Tetraedern, assembliert mit Dox als Antikrebsmedikament und Folsäure als spezifische Erkennungsmoleküle [20], designed, synthetisiert und charakterisiert. Die Antikrebs-Effizienz wurde an Darmkrebszellen evaluiert, unter Berücksichtigung signifikant hochregulierter Folsäurerezeptoren auf der Zelloberflächenmembran. Speziell wurden zelluläre Aufnahmemenge, Grad der Dox-induzierten Apoptose und Hemmung der zellulären Proliferation an HT-29-Zelllinien gemessen.

Methoden

Reagenzien und Geräte

DNA-Oligonukleotidketten wurden von TAKARA in Dalian, China, bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und fötales Kälberserum stammten von Gibco in NY, USA. Penicillin und Streptomycin kamen von Beyotime Biotechnologie in Shanghai, China. Folsäure, Doxorubicin, 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) und Agarose wurden von Sigma-Aldrich in MO, USA, gekauft. Alle Antikörper stammten von Abcam in Shanghai, China. Andere Reagenzien kamen von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China.

UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo Evolution 201) und Konstanttemperatur-Inkubator kamen von Thermo Fisher, USA; Zentrifuge (GT10-1) von Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd.; Fluoreszenz-Spektrophotometer (UV-1800) von Shimadzu Corporation. Konfokal-Laser-Scanning-Mikroskopie (Visitech) von Leica; Polymerase-Kettenreaktions-Gerät (PCR, T100), Protein- und Nukleinsäure-Elektrophorese-Apparaturen von Bio-Rad; Dynamischer Lichtstreuungs-Partikelgrößenanalysator von Beckman; Zellkulturplatten mit 96- oder 24-Wellen von Dow Corning Corporation. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, Agilent 1200) mit C18-Säule von Agilent Technologies.

Die menschliche Darmkrebszelllinie HT-29 wurde in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin in einer feuchten Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid bei 37 °C kultiviert.

Synthese und Reinigung von DNA-Tetraedern

In dieser Untersuchung folgte die Synthese den schematischen Verfahren in Abb. 1, und die Einzelstrang-DNA (ssDNA)-Sequenzen des DNA-Tetraeders sind in Abb. 1 angegeben. Im Detail wurde jeder ssDNA in 0,5× TE-Puffer gelöst, und der entsprechende optische Dichte (OD)-Wert der DNA wurde durch UV-Spektrophotometer bei 260 nm bestimmt. Zusätzliches TE-Puffer wurde supplementiert, um vier Ketten auf gleiche Konzentration zu bringen. Das Mischungsverhältnis der vier ssDNAs betrug 1:1:1:1 bei 1 µM in 100 µL. Die Reaktion wurde in einem PCR-Gerät mit Zyklusbedingungen durchgeführt: 95 °C, 10 min, natürlich abgekühlt auf 4 °C. Alle Einzelstrang-DNAs wurden durch HPLC mit 260 nm als charakteristische Absorptionspeaks gereinigt. Im HPLC-Spektrum war die Peakzeit des DNA-Tetras schneller als die des Einzelstrangs, und das Produkt wurde zum entsprechenden Zeitpunkt gesammelt.

Schematisches Diagramm von Folsäure-DNA-Tetra-Dox, DNA-Tetra-Dox und Folsäure-DNA-Tetra. Die Einzelstrang-DNA-Sequenzen des DNA-Tetraeders wurden bereitgestellt. Der Prozess des Targetings für Tumorzellen, Penetration durch die Zellmembran und Einfügen der DNAs wurde dargestellt.

Synthese und Charakterisierung von Folsäure-DNA-Tetra-Dox

Freie Wasserstoffgruppen von Dox und Folsäure wurden mit Azidgruppe modifiziert und dann über Click-Chemie-Reaktion [21] mit 3′-OH von ssDNA gekoppelt. Bei Zugabe unterschiedlicher Mengen funktionalisierter ssDNA konnte das Verhältnis funktionaler Gruppen stöchiometrisch über spezifische Hybridisierung von Seitenketten kontrolliert werden. Für die Synthese von Folsäure-DNA-Tetra wurde das Molverhältnis von Folsäure und DNA-Tetraeder auf 1:1 gesetzt. Für DNA-Tetra-Dox betrug das Molverhältnis von Dox und DNA-Tetraeder 4:1. Für Folsäure-DNA-Tetra-Dox wurden die Molverhältnisse von Folsäure, DNA-Tetraeder und Dox jeweils auf 1:1:3 gesetzt. Alle Synthesen wurden auf Mikromolarniveau bei 37 °C durchgeführt und dann bei 4 °C gelagert [22].

In dieser Studie wurde die Serie der DNA-Tetra-Komplexe durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit 8 % Trenngel (39 % Acr-Bis) charakterisiert, um Reinheit und relative Molekülgrößen zu prüfen. Die Proben bestanden aus den verschiedenen DNA-Tetra-Strukturen und 6× Ladepuffer mit Mischungsverhältnis 2:1. Die Proben wurden gefärbt und nach 90 min Gelelektrophorese bei 110 V analysiert. Um Unterschiede in Teilchengrößen zu ermitteln, wurden DNA-Tetra-Proben auch mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) gescannt.

DNA-Tetra-facillierte zelluläre Aufnahme

Für die verschiedenen Kopplungsstrukturen dieser Forschung wurden die Aufnahmeraten durch HT-29-Zellen verglichen, um die Wirkstofflieferungseffizienz zu ermitteln. Zelluläre Aufnahmeeffizienz wurde evaluiert und quantifiziert mittels der charakteristischen Fluoreszenzspektren von Dox, d.h. Anregungslicht bei 470 nm und Emissionslicht bei 590 nm. HT-29-Zellen bei 2 × 10⁵/mL wurden in 24-Well-Platten gesät und 24 h kultiviert. Zellen wurden mit verschiedenen DNA-Tetra-Strukturen bei 10 µM für weitere 24 h inkubiert. Das Medium wurde dann verworfen, und die Zellen wurden dreimal mit PBS gespült. Für Zellfixierung wurde 4 % Paraformaldehyd sofort bei Raumtemperatur für 30-min Co-Inkubation zugegeben, und die Zellen wurden erneut dreimal mit PBS gespült. Schließlich wurden die 24-Well-Platten mit Laserkonfokalmikroskopie beobachtet, um die zelluläre Aufnahmeeffizienz basierend auf der Lichtintensität des Emissionslichts zu vergleichen.

Zytotoxizität und Antikrebs-Effizienz

Zytotoxizität und Antikrebs-Effizienz wurden mittels MTT-Assay evaluiert, bei dem eine Redoxreaktion zwischen MTT in DMSO und intrazellulärer Succinat-Dehydrogenase stattfindet. HT-29-Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten gesät und 24 h kultiviert.

Für die Zytotoxizität von DNA-Tetra als Wirkstoffträger wurde Medium mit DNA-Tetra-Strukturen bei 0–100 µM für weitere 24- oder 48-h-Inkubation zugegeben. Dann wurden 100 µL MTT-Lösung (5 mg/mL) je Well zugegeben, und das Gemisch wurde 4 h bei 37 °C inkubiert. Die Flüssigkeit wurde entfernt, und die Zellen wurden mit 200 µL DMSO lysiert und gelöst. Die Absorption des Überstands wurde bei 570 nm mit einem Mikroplate-Reader gemessen. Unbehandelte HT-29-Proben dienten als Kontrollgruppe.

Für DNA-Tetraeder gekoppelt mit Folsäure oder Dox fokussierte die Forschung einerseits auf Stabilität, Bio-Sicherheit und Hemmeffizienz; andererseits wurde erforscht, ob Dox von DNA-Tetra-Dox vergleichbare Antitumor-Eigenschaften wie zuvor besitzt. Daher wurden Zytotoxizität und Antitumor-Effizienz von DNA-Tetra-Komplexen evaluiert. Komplexe jeweils bei 100 µM wurden mit HT-29-Zellen inkubiert. Zellproben wurden alle 6 h gesammelt und mittels MTT-Assay detektiert, um den Effekt der Inkubationsperiode zu evaluieren. Besondere Aufmerksamkeit galt dem Unterschied in Antikrebs-Effizienz resultierend aus Strukturschwankungen. Weiterhin wurden Konzentrationseffekte auf Hemmung von HT-29 nach Behandlung mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox bei 0–200 µM via MTT-Assays evaluiert.

Western Blot und Durchflusszytometrie

Um die durch DNA-Tetra-Lieferung facillierte Dox-induzierte zelluläre Apoptose zu charakterisieren, wurden Proteinproben aus behandelten Zellen erhitzt und mit Pyrolyseflüssigkeit gecrackt, mittels 12 % SDS-PAGE unter 100 V konstantem Strom separiert und dann auf 0,22-µm-PVDF-Membranen für 1 h geblottet. Die Proben wurden 1 h mit entrahmter Milch geblockt. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden Proben über Nacht mit Kaninchen-Anti-Caspase-3 inkubiert. Dann wurden Proben 1 h mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper probiert und dann mit PBST gewaschen und via Bio-Rad-Protein-Imaging-System abgebildet. Weiterhin wurde GAPDH als internes Referenzprotein gewählt aufgrund seiner stabilen Expression in Zellen.

Durchflusszytometrie wurde weiter genutzt, um Apoptose-Level an der gewählten Konzentration und Zeitpunkt via MTT-Assays zu quantifizieren. HT-29-Zellen wurden für eine Periode mit Inhibitoren inkubiert und dann mittels quantitativer Durchflusszytometrie mit Annexin V-PI-Doppelfärbungsmethode gemessen.

Zellproliferations-Quantifizierung

Zählverfahren wurde verwendet, um Zellproliferation zeitlich zu quantifizieren. Im Detail wurden Zellen nach Behandlung mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox für eine Periode bei 100 µM mit 0,25 % Trypsin für 30 s verdaut, und dann gleiches Volumen Vollmedium zur Reaktionsbeendigung zugegeben. Überstand wurde nach Zentrifugation bei 1000 rpm für 3 min verworfen, und Zellen wurden mit Vollmedium resuspendiert. Die Zellzahl an jedem Detektionspunkt wurde unter Optischem Mikroskop mit Zählkammern erfasst, um die zelluläre Proliferationskurve zu zeichnen.

Statistische Analyse

In dieser Forschung wurden Signifikanzunterschiede mittels Student's t-Test (zweiseitig; zwei-Stichproben gleiche Varianz) bestimmt. P < 0,05 bedeutet signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen.

Ergebnisse

Präparation von Folsäure-DNA-Tetra-Dox

Im spezifischen Syntheseprozess wurde Dox mit DNA-Tetraeder in verschiedenen Verhältnissen gemischt, um Beladung und Assemblierung von Dox (w_m = 543,52) und Folsäure (w_m = 441,4) abzuschließen. Wie in Abb. 2a gezeigt, da Dox und Folsäure Monomere mit relativ niedrigem und ähnlichem Molekulargewicht sind, hatten DNA in einem Tetraeder und die Konjugate mit einem funktionalen Molekül grob äquivalente Molekulargewichte. Allerdings erhöhte Dox oder Folsäure, die mit allen vier DNA-Ecken des Tetraeders assembliert waren, die Molekulargröße des DNA-Tetras offensichtlich. Wie in Abb. 2b gezeigt, war die meisten DNA-tetraedrischen Monomergröße unter 15 nm. Mit Zunahme der Kopplungsgruppen wurde die symmetrische Struktur des DNA-Tetras zerstört und der Mittelwert der Teilchengrößen der Komplexe signifikant erhöht. Insbesondere erweiterte die Größenausdehnung von Folsäure-DNA-Tetra-Dox den mittleren Durchmesser auf 20 nm.

Charakterisierung von DNA-Tetra mit verschiedenen Bestandteilen. a Links nach rechts: DNA-Leiter, DNA-Tetra, Folsäure-DNA-Tetra, Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox abgebildet in 8 % SDS-PAGE. b Größenverteilung von DNA-Tetra, Folsäure-DNA-Tetra, Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox detektiert via dynamischer Lichtstreuung.

Wirkstofflieferungseffizienz

Nach 24 h Inkubation mit verschiedenen DNA-Tetra-Strukturen wurde die intrazelluläre Effizienz von Dox mittels Fluoreszenzbildgebung evaluiert, wobei die intrazelluläre rote Fluoreszenz die charakteristische Fluoreszenz von Dox ist; daher zeigten Zellen, inkubiert mit DNA-Tetra, kein Fluoreszenzsignal wie in Abb. 3a, und die roten Signale von Zellen, inkubiert mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox-Komplexen, waren offensichtlich höher als bei Dox allein, was die signifikant gesteigerte zelluläre Aufnahmeeffizienz von Dox durch DNA-Tetra-facillierte Penetration durch die Membran sowie die intrazelluläre Stabilität der Konjugate zwischen Dox und DNA-Tetra belegt.

Aufnahmeeffizienz von HT-29-Zellen nach Inkubation mit verschiedenen Komplexen für 24 h. a Konfokalmikroskopie-Detektion (rot ist Fluoreszenz-Anregungslicht von Dox, Skalenbalken = 10 µm). b Intensität der zellulären Fluoreszenz. **P < 0,05 im Vergleich zur DNA-Tetra-Gruppe.

Die weitere quantitative Analyse der Fluoreszenzintensität (Abb. 3b) belegte die visuellen Befunde, und es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox-Komplexen (P < 0,05). Die Methode der Co-Inkubation von Medikamenten und Zellen behindert die vollständige Entfaltung der Targeting-Fähigkeit von Folsäure. Die relativ hohe Konzentration bestätigte die spezifische Erkennung von Folsäurerezeptoren, was theoretisch in vivo-Anwendungen mit dem komplexen Zirkulationssystem offensichtlicher ist. Kurz gesagt, die DNA-Tetra-Lieferung garantierte die Antikrebs-Effizienz von Dox.

Zytotoxizität und Antikrebs-Effizienz

Zunächst wurde die Vitalität von HT-29-Zellen, ko-inkubiert mit verschiedenen Konzentrationen von DNA-Tetra, mittels MTT-Assay untersucht. Es gab keine offensichtliche Zytotoxizität der DNA-Tetra-Behandlung in HT-29-Zellen bei 0–100 µM für 24 und 48 h (Abb. 4a). Daher bot der nanoskalige DNA-Tetraeder eine bio-sichere Wirkstoffträger-Plattform.

Zytotoxizität und Antitumor-Effizienz von Dox-Komplexen und DNA-Tetra für HT-29-Zellen. a Vitalität von HT-29-Zellen inkubiert mit DNA-Tetra bei verschiedenen Konzentrationen für 24 oder 48 h. b Antitumor-Effizienz von Dox-Komplexen bei 100 µM. c Vitalität von HT-29-Zellen inkubiert mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox bei verschiedenen Konzentrationen für 24 oder 48 h.

Zweitens zeigten Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox aufgrund der unterschiedlichen Dox-Lieferungseffizienz signifikantere Hemmeffizienz innerhalb von 48 h (Abb. 4b). Aufgrund fehlender effektiver Antikrebs-Komponenten führte DNA-Tetra-Folsäure zu vernachlässigbarer Vitalitätsabnahme (< 10 %) während der 48-h-Co-Inkubation. Da Dox die Membran nicht objektiv penetrieren kann, war die Dox-induzierte Vitalitätsabnahme geringer als in anderen Gruppen. Besonders zeigte Folsäure-DNA-Tetra-Dox einen früheren und signifikanten Abfall bei 6 h post Inkubation, was beweist, dass Folsäure-Targeting die Medikamente an der Membran lokalisiert und Dox zeitnah wirken lässt. Im Gegensatz dazu begann DNA-Tetra-Dox erst bei 12 h post Inkubation offensichtlich zu wirken, was die Wichtigkeit von Targeting-Gruppen demonstriert.

Weiterhin wurden HT-29-Zellen mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox bei 0–200 µM behandelt, um die effektive Konzentration zu detektieren (Abb. 4c). Die zelluläre Vitalität von HT-29 sank rapide mit steigender Konzentration (0–100 µM) des Komplexes, aber es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen 100 und 200 µM, was eine dosisabhängige Wirkung von Folsäure-DNA-Tetra-Dox anzeigt, wobei 100 µM als effektive Konzentration für Antitumor-Effekt betrachtet werden kann. Zusätzlich änderte sich die zelluläre Vitalität signifikant von 24 auf 48 h für die Gruppen 10, 20 und 50 µM, was anzeigt, dass die Inkubationszeit auch ein Faktor für die Folsäure-DNA-Tetra-Dox-basierte Antikrebs-Effizienz ist.

Durch Folsäure-DNA-Tetra-Dox induzierte Apoptose

Entsprechend zeigten Western-Blot-Assays (Abb. 5a) signifikante Erhöhung der Caspase-3-Expression induziert durch Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox, was beweist, dass Apoptose der Hauptweg des Dox-induzierten Zelltods war.

Zelluläre Expression von Apoptose-bezogener Caspase-3 nach Behandlung mit verschiedenen Komplexen (a) und Durchflusszytometrie von HT-29-Zellen nach Inkubation mit DNA-Tetra, Dox, DNA-Tetra-Dox und Folsäure-DNA-Tetra-Dox (b–e).

Die Durchflusszytometrie (Abb. 5b–e) bewies weiter, dass 6-h-Inkubation mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox bei 100 µM 68,7 % Apoptose induzierte. Gleichzeitig betrugen die durch Dox und DNA-Tetra-Dox induzierten Apoptose-Level nur 32,8 % und 60,5 % unter gleichen Inkubationsbedingungen.

Hemmung der Zellproliferation

Basierend auf MTT-Assays war 100 µM die effektive Konzentration für Apoptoseinduktion und wurde im zellulären Proliferationsexperiment ausgewählt. Wie durch die zelluläre Proliferationskurve gezeigt (Abb. 6), war die Hemmung der Zellproliferation aufgrund des zeitaufwendigen Prozesses der zellulären Aufnahme nicht vollständig im frühen Stadium der Co-Inkubation sichtbar. Ein signifikanter hemmender Effekt trat nach Inkubation mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox für mehr als 6 h auf, was die Existenz von DNA-Tetra-verstärkter Endozytose beweist. Gleichzeitig ist 6 h ein vergleichbarer Zeitraum mit der effektiven Periode, die in Abb. 4b detektiert wurde.

Hemmung der Zellproliferation induziert durch Inkubation mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox bei 100 µM für verschiedene Zeitperioden.

Diskussion

Als gängiges Mittel der DNA-Modifikation bot die Click-Chemie-Reaktion Vorteile hoher Reaktionsseffizienz, guter Kontrollierbarkeit und einfacher Handhabung [21]. Das Elektrophoretogramm zeigte eine einzelne Bande (Abb. 2a), was anzeigte, dass Produkte mit hoher Reinheit durch kovalente Kopplung via Click-Chemie erhalten wurden. Die fluoreszierende Eigenschaft von Dox macht es in vitro und in vivo nachvollziehbar; gleichzeitig bewies die Fluoreszenz im Tumorzellinneren indirekt die Stabilität von Folsäure-DNA-Tetra-Dox während der Penetration durch die Zellmembran. Daher war Folsäure-DNA-Tetra-Dox fähig und stabil für biomedizinische Anwendungen.

DNA-Tetra hat die Fähigkeit, Wirkstoffe in Zellen zu liefern. Alle in dieser Forschung verwendeten DNA-Sequenzen kodierten keine genetische Information. Daher wurden keine Nebenwirkungen auf Genexpression und Zellmetabolismus in allen Untersuchungen berichtet. Aufgrund der hohen Expression von Folsäurerezeptoren auf Tumorzelloberflächen wurde Folsäure als spezifisches Targeting-Molekül des Wirkstofflieferungssystems gewählt, um die Aufnahmeeffizienz von DNA-Tetra-Komplexen zu steigern. Allerdings wurde der Vorteil des Folsäurerezeptor-Targetings bei relativ hoher DNA-Tetra-Konzentration in vitro nicht vollständig reflektiert. Entsprechend war Folsäure für in vivo-Anwendungen potenziell geeignet, die Targeting-Effizienz im komplexen Zirkulationssystem zu steigern.

Derzeit bringen Antikrebsmedikamente häufig unerwartete Nebenwirkungen mit sich, sodass Forschung zur Steigerung der Tumorzell-Targeting-Fähigkeit und Lieferungseffizienz ein heißes Thema ist [23–25]. Frühere Studien zeigten, dass die Kapazität von DNA-Tetraedern für Wirkstofftransport auf ihrer guten Kompatibilität basiert. DNA-Tetraeder ist ein künstlicher Behälter mit günstiger Modifizierbarkeit und guter Biokompatibilität. In dieser Studie erreichte die erfolgreiche Kopplung von Dox und Folsäure mit DNA-Tetraeder zufriedenstellende hemmende Effekte und führte zu offensichtlicher Apoptose von HT-29-Zellen. Da DNA-Tetra modifiziert und mit Wirkstoffen und Targeting-Molekülen gekoppelt werden kann, wurde die Anreicherung lokaler Wirkstoffkonzentration in Tumorzellen realisiert. Die obigen Ergebnisse bewiesen die gute Erkennung von Tumorzellen und entsprechende gesteigerte hemmende Effekte via DNA-Tetra-Lieferung, und dieses nanoskalige Wirkstofflieferungssystem kann umfangreicher eingesetzt werden.

Schlussfolgerungen

Als neu entwickelte Wirkstofflieferungsstrategie sind nanoskalige DNA-Strukturen kostengünstig, hochstabil und synthetisch machbar; gleichzeitig sind sie bio-sicher aufgrund fehlender exogener Immunaktivität. DNA-Tetraeder-Kopplungsstrategie faciliert zielgerichtete Lieferung von Dox, steigert die Antikrebs-Effizienz von Dox an Darmkrebszellen und liefert eine vielversprechende Inspiration und Idee für Wirkstoffdesign.