Ligandendotierte Kupfer-Oxo-Hydroxid-Nanopartikel sind wirksame antimikrobielle Mittel

Hintergrund

Mikrobielle Infektionen tragen weltweit zu Millionen von Todesfällen bei [1]. Die Ineffizienz einer antimikrobiellen Behandlung ist häufig auf eine mikrobielle Resistenz gegenüber herkömmlichen Antibiotika zurückzuführen [2,3,4,5]. Daher werden neue antimikrobielle Mittel eifrig gesucht. Kupfer ist seit langem für seine antimikrobiellen Wirkungen bekannt und kann das Potenzial für eine längere klinische Lebensdauer als Standardantibiotika haben, da es über eine Vielzahl von Mechanismen gegen Bakterien zu wirken scheint, einschließlich der Interaktion mit bakteriellen Proteinen und DNA, der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). und Störung der Membranintegrität [6, 7]. Aus dem gleichen Grund wird vermutet, dass das Potenzial einer antimikrobiellen Resistenz pathogener Bakterienstämme gegenüber Kupfer und anderen Metallen begrenzt ist [7,8,9]. Darüber hinaus ist Kupfer relativ billig und für den Menschen von geringer Toxizität, da seine Essenzität in Spurenkonzentrationen die Entwicklung einer strengen homöostatischen Kontrolle gewährleistet hat [10,11,12]. Daher wird dieses Metall häufig zur Infektionsprävention eingesetzt, vor allem zur Vermeidung von bakterieller Biofilmbildung auf Oberflächen in Hochrisikobereichen wie Krankenhäusern und Pflegeheimen [13, 14]. Im Gegensatz zu Silber, das weithin verwendet wird, hat Kupfer in topischen antimikrobiellen Formulierungen keinen signifikanten therapeutischen Nutzen gefunden [15].

Bakterien sind anfällig für Kupferbelastung in ihrer intrazellulären Umgebung, und die Wirksamkeit einer Kupferquelle hängt mit ihrer Fähigkeit zusammen, Kupferionen freizusetzen [16, 17]. In dieser Hinsicht besteht eine wesentliche Herausforderung für antimikrobielle Mittel auf Kupferbasis darin, eine konzentrierte Formulierung zu erreichen, die die anhaltende Freisetzung von antimikrobiellem Kupfer in wirksamen Konzentrationen in Flüssigkeiten wie Wundexsudat ermöglicht. Dies liegt daran, dass Kupfer ein hydrolytisches Metallion ist, und da seine Konzentration beim pH-Wert typischer topischer Formulierungen (d. Bei physiologischen pH-Werten sind diese Oxohydroxide keine guten Substrate für die Freisetzung von löslichen oder daher potenziell wirksamen Kupferionen [16, 19, 20].

Kürzlich wurde mit dem Ziel, ein bioverfügbares Eisenpräparat zu finden, das Problem der effektiven Freisetzung von Eisen(III)-Ionen aus einer konzentrierten Oxohydroxidquelle unter physiologischen Bedingungen durch strukturelle Modifikation der Primärpartikel gelöst. In dieser Arbeit wurde Eisen in Gegenwart von kristalldotierenden GRAS-Liganden, nämlich Adipin- und Weinsäure, ausgefällt, um die endgültige Eisenoxid-Hydroxid-Struktur gezielt zu destabilisieren. Diese Strategie hatte den Vorteil, (a) eine irreversible Agglomeration der Eisen(III)-oxo-hydroxid-Partikel zu verhindern und (b) ihre Labilität (leichte Löslichkeit) unter geeigneten physiologischen Bedingungen stark zu erhöhen. Dieses Material wurde als „Eisen-[oxo-]hydroxidadipattartrat“ oder IHAT bezeichnet [21, 22]. Analog haben wir hier überlegt, ob Kupfer[oxo-]hydroxidadipattartrat (CHAT) in hohen Konzentrationen synthetisiert und formuliert werden kann, aber dennoch Kupferionen in wirksamen antimikrobiellen Mengen freisetzt. Ziel dieser Arbeit war es insbesondere, einen kostengünstigen und skalierbaren Syntheseprozess zu entwickeln, der Kupfer-Oxo-Hydroxid-Nanopartikel produziert, die im Gegensatz zu zuvor berichteten Materialien leicht biozide Konzentrationen von Kupferionen in einer simulierten Wundumgebung freisetzen sollten.

Daher synthetisierten wir in dieser Studie CHAT und charakterisierten seine Fähigkeit, bioverfügbares Kupfer zu liefern und somit antimikrobielle Aktivität zu demonstrieren. Wir haben uns auf Stämme von Escherichia coli konzentriert als „Indikator“-Spezies für Gram-negative Bakterien [19, 23], aber zusätzlich nachgewiesene Wirkungsnachweise gegen Staphylococcus aureus , als Gram-positive Bakterien, die oft Multiresistenzen entwickeln. Daher zielte die Studie darauf ab, den Wert der Weiterentwicklung von CHAT für klinische Anwendungen in der topischen antimikrobiellen Therapie zu bewerten.

Methoden

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Experimente mit ultrahochreinem (UHP) Wasser (Reinigung durch Umkehrosmose; 18,2 ΩM/cm) bei Raumtemperatur (20 ± 2 °C) durchgeführt und alle Reagenzien wurden von Sigma Aldrich bezogen.

Kupferformulierungen und CHAT-Nanopartikel

Kupferchloridvorräte (40 mM Kupfer) wurden durch Auflösen von CuCl₂ . hergestellt ·2H₂ O in Wasser. Kupferoxid-Nanopartikel (CuO-NPs; Sigma 544868) wurden aus einem handelsüblichen Pulver hergestellt, das frei von Verunreinigungen war, eine Primärpartikelgröße von 34 nm (Bereich 10–50 nm) aufwies und zuvor als antimikrobielles Mittel getestet wurde [24, 25,26]. Diese Stammlösungen wurden mit 1,3 g/l Kupfer hergestellt, indem das Pulver unter kräftigem Rühren in Wasser dispergiert wurde. Kolloidale Suspensionen von CHAT-Nanopartikeln wurden unter Verwendung einer Copräzipitationsmethode synthetisiert [27]. Kurz gesagt wurden Kupferchlorid, Weinsäure und Adipinsäure in Wasser gelöst, um ein Molverhältnis von Kupfer/Weinsäure/Adipinsäure in der Endsuspension von 2:1:1 und eine Kupferkonzentration von 2,5 g/l zu erreichen. Der anfängliche pH-Wert der Mischung lag immer unter 2,5 und das Kupfer war vollständig solubilisiert. Der pH-Wert wurde dann langsam durch tropfenweise Zugabe einer konzentrierten NaOH-Lösung (5 M) unter ständigem Rühren auf einen pH-Wert von 8,2 ± ± 0,2 erhöht.

Kupfergehalt und Phasenverteilung von CHAT-Suspendierungen

Der Kupfergehalt in kolloidalen Suspensionen wurde durch induktiv gekoppelte Plasma-optische Emissionsspektrometrie (ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba) bestimmt. Alle Proben wurden auf Konzentrationen unter 100 mg/l in 5 % HNO₃ . verdünnt (v /v ) mindestens 24 h vor der Analyse, um die vollständige Löslichkeit des Kupfers sicherzustellen. Kalibrierstandards (0,1 bis 100 mg/l Kupfer) wurden in 5 % HNO₃ . matrixangepasst , und die Kupferquantifizierung wurde bei 324,754 nm durchgeführt. Die Fraktionierung des Kupfers in Prozentsätze von agglomeriertem, nanopartikulärem und löslichem Kupfer wurde durch Filtration und Ultrafiltration von CHAT-Vorräten erreicht. Suspensionen wurden filtriert (200 nm Cut-off) und das Retentat wurde als agglomerierte Fraktion betrachtet. Um das lösliche Kupfer zu isolieren und von nanopartikulärem Kupfer zu unterscheiden, wurde die kolloidale Suspension durch einen 3-KDa-Filter (Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16.000×g .) ultrafiltriert , 5 min), da dies einem Cut-Off unter 1 nm entspricht (Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). Der Kupfergehalt aller Fraktionen (Gesamt, 200 nm-Filtrat, 3 KDa-Ultrafiltrat) wurde durch ICP-OES bestimmt, und die Fraktionen in Prozent im Verhältnis zum Gesamtkupfergehalt sind wie folgt:

Bestimmung des Kupfergehalts und des Verhältnisses von Kupfer zu Liganden in trockenen CHAT-Nanopartikeln

CHAT-Nanopartikel wurden agglomeriert und ausgefällt, um die Rückgewinnung und Entfernung ungebundener Komponenten zu ermöglichen. Um dies zu ermöglichen, wurde Ethanol zu kolloidalen Suspensionen von CHAT (2,5 g/l Kupfer) im Verhältnis 2:1 Ethanol/Suspension (v /v ) und die resultierenden CHAT-Agglomerate wurden durch Zentrifugation (4500×g × 15 Minuten in einem Mistral 6000). Die Lösungsphase, die ungebundene Ligandenspezies enthielt, wurde verworfen. Die Bestimmung des Kupfergehalts im Festphasen-CHAT war wie folgt. Durch Ofentrocknung des ethanolisch ausgefällten Pellets bis zur Gewichtskonstanz bei 45 °C wurde ein Pulver hergestellt. Dies wurde dann gemahlen und 35,2 ± 0,3 mg (n = 2) wurde in 11 ± 1 g 70 % HNO₃ . verdaut , mit genauen Gewichten aufgezeichnet. Nach vollständiger Verdauung wurde diese Lösung 20-fach in Wasser verdünnt und die Kupferkonzentration durch ICP-OES bestimmt. Ligand-zu-Kupfer-Verhältnisse wurden direkt aus getrockneten, mit Ethanol ausgefällten CHAT-Agglomeraten bestimmt. Die Agglomerate wurden zunächst in Wasser auf ihr ursprüngliches Volumen resuspendiert, um die Auflösung mit geringeren Mengen an HCl zu erleichtern – eine Voraussetzung für die Analyse mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Aliquote wurden entweder in 5% HNO₃ . gelöst für die ICP-OES-Analyse von Kupfer (wie oben beschrieben) oder in 80 mM HCl für die HPLC-Analyse von Liganden (Weinsäure und Adipinsäure). Die Ligandenanalyse wurde in einem Standard-Umkehrphasen-Chromatographiesystem (C18-Säule in einem Waters Alliance 2690/5, ausgestattet mit einem 2998-PDA-Detektor; weitere Details sind in Zusatzdatei 1) angegeben.

Physikochemische Charakterisierung von CHAT-Suspensionen

Die hydrodynamische Partikelgrößenverteilung wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd.) bestimmt. Aliquots der kolloidalen CHAT-Suspensionen (2,5 g/l Kupfer) wurden in eine 1-ml-Einwegküvette überführt und die Messungen (n = 3) wurden bei 25 ± 2 °C durchgeführt. Auch hier sind die genauen Einstellungen in Zusatzdatei 2 aufgeführt. Das Zeta-Potential von CHAT-Suspensionen wurde durch Laser-Doppler-Mikroelektrophorese (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) unter Verwendung von gefalteten Einwegkapillarzellen (DTS1070) und unter Annahme einer Dielektrizitätskonstante von 78,5 und bestimmt eine Viskosität von 0,89 cP. Die Charakterisierung durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde durchgeführt, indem ein Tröpfchen der CHAT-Suspension auf löchrige Kohlenstoff-Lochgitter aufgetragen und über Nacht bei 50 °C getrocknet wurde. Die Gitter wurden dann auf dem TEM (FEI-Philips CM100) bei 120 kV im Hellfeldmodus abgebildet.

Antimikrobielle Aktivität von Kupferformulierungen

Die Assays wurden in Schwermetall-MOPS-(HMM-)Medium durchgeführt, einem anerkannten metallionenkompatiblen Medium (Zusatzdatei 3), das mit 0,4 % Glucose und 0,1 % Caseinsäurehydrolysat ergänzt wurde und der pH auf 7,2 ± ± 0,2 eingestellt war [28] . Vor der Zugabe von Kupferverbindungen Escherichia coli (NCTC11100) und Staphylococcus aureus RN4220 [29] wurden über Nacht bei 30 °C unter konstantem Schütteln in einem Infors HT Minitron-Inkubator bei 80 U/min gezüchtet. Anschließend wurden die Bakteriensuspensionen auf eine optische Dichte von 0,05–0,1 (ca. 10 ⁶ Zellen/ml) bei 595 nm für E. coli ( Multiskan RC 351 Labsystem) oder 600 nm für S. aureus (Multiskan-Plattenleser, ThermoFisher Scientific). Als nächstes wurden Vorräte an Kupferchlorid und kolloidalem CHAT in HMM verdünnt und zu den Bakteriensuspensionen hinzugefügt, um Kupferendkonzentrationen zwischen 0,4 und 100 mg/l zu erhalten. Anschließend erfolgte die Inkubation über einen Zeitraum von 6 bis 9 Stunden und das Bakterienwachstum wurde durch Überwachung der optischen Dichte als Maß für die Bakterienbiomasse bestimmt.

Die Kupferlöslichkeit im Zeitverlauf in Bakterienwachstumsmedium wurde bestimmt, indem Kupferchlorid und kolloidale CHAT-Vorräte in HMM auf 12,5, 25 und 50 mg/l Kupfer verdünnt wurden und der Anteil an löslichem Kupfer nach 0, 2, 4 und 8 h durch Ultrafiltration bestimmt wurde (3 KDa) und ICP-OES-Analyse, wie oben beschrieben.

Intrazelluläre Bioverfügbarkeit von Kupferformulierungen

Rekombinante biolumineszierende Cu-sensorische Bakterien, E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), die auf subtoxische Mengen an bioverfügbarem Kupfer mit einer Erhöhung ihrer Biolumineszenz reagieren, wurden verwendet, um die Bioverfügbarkeit von Kupferverbindungen zu quantifizieren [30]. Bakteriensuspensionen wurden wie für den antimikrobiellen Aktivitätsassay beschrieben hergestellt und mit einer Reihe von Verdünnungen von Kupferchlorid und CHAT (0 bis 50 mg/l Kupfer) auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen 4 h lang inkubiert. Die Biolumineszenz wurde mit einem Orion II Plate Luminometer (Berthold Detection Systems) gemessen und die Induktion der Biolumineszenz wurde wie folgt berechnet:

Intrazellulärer Stress induziert durch Kupferformulierungen

Die Fähigkeit von Kupferverbindungen, intrazelluläre Superoxidanionen und DNA-Einzelstrangbrüche zu induzieren, wurde mit rekombinanten biolumineszenten Bakterien untersucht, E. coli K12::soxRSsodAlux und E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) bzw. [17]. Bakterienkulturen wurden wie für den antimikrobiellen Test beschrieben hergestellt, und Bakterien wurden einer Reihe von Verdünnungen von Kupferchlorid und CHAT (0 bis 50 mg/l Kupfer) auf weißen 96-Well-Mikrotiterplatten über 4 h ausgesetzt. Die Leistung der Biosensoren wurde kontrolliert, indem Bakterien der Superoxidanionen-induzierenden Chemikalie Menadion (0,04–30 μg/l) oder Wasserstoffperoxid (0,1–150 mg/l) als Positivkontrollen für E ausgesetzt wurden. coli K12::soxRSsodAlux oder E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) bzw. Wieder wurden Bakterien auf weißen 96-Well-Mikroplatten inkubiert und die Biolumineszenz wurde mit einem Orion II Plate Luminometer gemessen und die Induktion der Biolumineszenz wurde wie in Gl. 5.

Einarbeitung von Kupferformulierungen in Hydroxyethylcellulosegele

Vorräte an Kupferchlorid, CHAT und kommerziellen, unmodifizierten Kupferoxid-Nanopartikeln (CuO-NPs) wurden in UHP-Wasser auf 250 mg/l Kupfer verdünnt. Die resultierenden Suspensionen von CHAT- und CuO-NPs hatten einen nahezu neutralen pH-Wert und konnten direkt in das Gel eingearbeitet werden, aber die Kupferchloridlösung war nach der Verdünnung immer noch sauer und wurde daher auf pH 7,0 ± 0,2 eingestellt. Hydroxyethylcellulose (HEC) wurde dann direkt gelöst (2% w /v ) mit einem Walzenmischer (Denley Spiramix 5) in die verschiedenen verdünnten Stammlösungen, bis sich homogene Gele bildeten. Zehn Gramm jedes Gels wurden in Falcon-Röhrchen überführt und über Nacht absetzen gelassen. Als nächstes 10 ml frisch zubereiteter 50 mM Natriumbicarbonatpuffer (gelöst aus NaHCO₃ Pulver und auf pH 7,0 ± 0,2 eingestellt) wurde in jedes Röhrchen überführt, um Störungen an der Gel-Flüssigkeits-Grenzfläche zu minimieren (spezifische Oberfläche 7,1 cm ² .). ). Aliquots wurden dann gesammelt und durch ICP-OES analysiert, um die Kupferfreisetzung im Laufe der Zeit zu bestimmen.

Ergebnisse

Wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben, wurde CHAT in ähnlicher Weise wie sein Eisenanalogon IHAT [21, 22] durch Dotieren von Kupferoxohydroxid (2,5 g/L Kupfer) mit Weinsäure und Adipinsäure synthetisiert. Dies erzeugte stabile kolloidale Suspensionen, in denen das gesamte Kupfer einen 200-nm-Filter passierte, aber sehr wenig (5%) einen 3-KDa-Filter passierte. Dies zeigte, dass das meiste Kupfer nanopartikulär war (95%; Abb. 1a) mit wenig „freiem“ Kupfer und keinen nachweisbaren großen Agglomeraten – wiederum wie beim IHAT-Analogon [21, 22]. In Ethanol ausgefällt, um ungebundene Ligandenspezies zu entfernen, und dann getrocknet, enthielt CHAT 31 ± 1% Kupfer (w /w ) durch ICP-OES-Analyse. Die Molverhältnisse von Kupfer zu Ligand, letzteres bestimmt durch HPLC, betrugen 2:1 für Kupfer zu Tartrat und 2:0,3 für Kupfer zu Adipat. CHAT-Partikel erschienen in der TEM-Bildgebung mit Durchmessern von 2–3 nm fast monodispers (Abb. 1b). Diese Ergebnisse stimmten mit hydrodynamischen Größendaten für CHAT plus einer Hydratationshülle überein, da der mittlere Volumendurchmesser in UHP-Wasser 3,4 nm betrug (Abb. 1c) und die Größenverteilung eng war (2,4–5,6 nm für 80 % des Volumens), wenn mit dynamischer Lichtstreuung bewertet. Das durchschnittliche Zetapotential betrug − 39 mV (Abb. 1d), was mit den Nanopartikeln übereinstimmt, die eine stabile aquatische Dispersion bilden [27], und tatsächlich wurde gezeigt, dass die CHAT-Stammsuspension mehrere Jahre lang stabil war (Zusatzdatei 4).

Charakterisierung der CHAT-Stammlösung. a Kupferphasenverteilung bei 2,5 g/L CHAT:löslich (< 3 KDa) und Nanopartikelanteil. b Nanopartikel-Dispersionsbildgebung durch TEM. c Hydrodynamische Partikelgrößenverteilung frisch hergestellter Partikel, bestimmt durch dynamische Lichtstreuung. d Zeta-Potenzialverteilung (n = 3; Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar)

Als nächstes betrachteten wir die antimikrobielle Aktivität von CHAT, wenn Stammsuspensionen in Bakterienwachstumsmedien auf Konzentrationen verdünnt wurden, die mit der antimikrobiellen Aktivität von Kupfersalzen verbunden sind. Für CHAT und Kupferchlorid war die Wachstumshemmungskurve für beide E sehr ähnlich. coli und S. aureus wobei die meiste Aktivität bei Gesamtkupferkonzentrationen zwischen 12,5 und 50 mg/l auftritt (Abb. 2). Vervollständigen Sie E. coli Wachstumshemmung wurde bei Inkubation mit 18,8 (CuCl₂ ) und 25 (CHAT) mg/L Kupfer, während für S. aureus , vollständige Wachstumshemmung wurde bei 75 (CuCl₂ ) und 100 (CHAT) mg/l Kupfer (Abb. 2; prozentuale Wachstumshemmung vs. Kupferkonzentration ist in zusätzlicher Datei 5) angegeben.

Escherichia coli (oben) und Staphylococcus aureus (unten) Wachstumskurven, hier als optische Dichte dargestellt, bei Exposition gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen von Kupferchlorid (links) oder CHAT (rechts) in ergänztem HMM.

Tatsächlich wurden bei diesen antimikrobiellen Konzentrationen mindestens 94 % des CHAT schnell (innerhalb von 15 Minuten) solubilisiert, wiederum wie durch Ultrafiltration und ICP-OES-Analyse beurteilt (Abb. 3a). Wir gingen daher davon aus, dass die antimikrobielle Wirksamkeit von CHAT mit dieser chemischen Labilität zusammenhängt, wobei die schnelle Auflösung der Nanopartikel eine intrazelluläre Aufnahme von Kupferionen durch Bakterien ermöglicht. Um dies zu testen, haben wir den Cu-Sensor E herausgefordert. coli , MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), bei dem die Biolumineszenz als Reaktion auf subtoxische Konzentrationen von intrazellulären Kupferionen zunimmt [30], mit 0 bis 50 mg/L Kupfer als CHAT oder Kupferchlorid. Steigende Konzentrationen im Kulturmedium beider Kupferquellen führten zu einer zunehmenden Biolumineszenz im E. coli Kupfersensordehnung (Abb. 3b), im Einklang mit dem Anstieg des intrazellulären Kupfers. Die Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurve war bis zu 6,25 mg/l für beide Kupferquellen identisch, was bestätigt, dass bioverfügbares Kupfer aus CHAT mit einer vollständig solubilisierten Quelle vergleichbar war. Danach nahm die Lumineszenz bei Konzentrationen bis zu 50 mg/L Kupfer aufgrund der Toxizität beider Kupferverbindungen nicht zu (Abb. 3b).

a Auflösungsprofil von CHAT in ergänztem HMM bei 12,5, 25 und 50 mg/l Kupfer. Dosis-Reaktion der Biolumineszenz-Induktion rekombinanter Leuchtbakterien:b intrazellulär auf Kupferionen reagierende E. coli MC1061 pSLcueR/pDNPcopAlux-Bakterien, c Auf DNA-Schäden reagierend E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) und d auf Superoxid-Anionen reagierende E. coli K12::soxRSsodAlux nach 4-stündiger Exposition in ergänztem HMM gegenüber Kupferchlorid, CHAT (Konzentration in mg Cu/L) und entsprechenden Kontrollen (Menadion in c und H₂ O₂ in d )

Parallel zur Untersuchung von intrazellulärem Kupfer in E. coli Exposition gegenüber Lösungen, die mit CHAT oder Kupferchlorid hergestellt wurden, testeten wir auch die Fähigkeit dieser Lösungen, intrazelluläre Superoxidanionen auszulösen oder bakterielle DNA-Schäden in verschiedenen E. coli -basierte Biosensoren. In keinem Fall gab es einen signifikant beobachtbaren Effekt, obwohl die Sensoren auf relevante Positivkontrollen, nämlich Wasserstoffperoxid bzw. Menadion, reagierten (Abb. 3c, d). Zusammengenommen stützen die äquivalenten Reaktionen der drei bakteriellen Biosensoren auf Lösungen, die aus verschiedenen chemischen Formen von Kupfer hergestellt wurden, stark die Annahme, dass Bakterien in beiden Fällen dem gleichen löslichen Kupfer ausgesetzt waren, obwohl eine Formulierung als Nanopartikel begann.

Schließlich wäre, wie oben erwähnt, der Vorteil von CHAT gegenüber löslichen Kupfersalzen nur dann offensichtlich, wenn eine konzentrierte Formulierung es ersteren erlaubt, ihre chemische Labilität im Gegensatz zu letzteren beizubehalten. Unter Verwendung von Hydroxyethylcellulose (HEC), einer üblichen wässrigen Basis für topische Formulierungen [31,32,33], haben wir 250 mg/l Kupfer entweder als Kupferchlorid, CHAT oder als kommerzielle CuO-NPs eingearbeitet. Wenn 10 ml 50 mM NaHCO₃ Puffer, als vereinfachtes Wundexsudat, zu 10 g jedes der kupferhaltigen HEC-Gele (dh 2,5 mg Kupfer) zugegeben wurden, wurde Kupfer aus dem CHAT-haltigen Präparat nachhaltig auf mehr als 60 mg/l freigesetzt um 24 h (Abb. 4). Darüber hinaus erfolgte die Freisetzung relativ schnell, wobei die antimikrobiell wirksamen Konzentrationen nach 2–4 h erreicht wurden. Im Gegensatz dazu war pH-neutralisiertes Kupferchlorid ein schlechtes Substrat für die Kupferfreisetzung, wie durch seine Tendenz zur Hydrolyse und Bildung von Agglomeraten von Kupferoxohydroxiden erwartet wurde, sodass nach 24 h nur 10 ± 7 mg/L Kupfer in Lösung erreicht wurden (Abb. 4). Die kommerziellen CuO-NPs ergaben überhaupt keine erkennbare Kupferfreisetzung (Abb. 4).

Kupferfreisetzung aus HEC-Matrizen, die CHAT, Kupferchlorid oder Kupferoxid-Nanopartikel (CuO-NPs) enthalten, alle mit 250 mg/l Kupfer

Diskussion

Wir zeigen hier, dass ein kupferbasiertes Nanomaterial, nämlich CHAT, im Gegensatz zu zuvor beschriebenen kupferbasierten Nanopartikeln [34, 35] in hohen Konzentrationen formuliert werden kann, während es seine Eigenschaften als labile Quelle für bioverfügbares Kupfer mit antimikrobieller Wirksamkeit behält. Wie oben erwähnt, wurde die Synthese von CHAT durch viele Jahre frühere Arbeiten am Eisenanalogon IHAT inspiriert [21, 22]. Dies wiederum wurde durch die Lösung der Natur zum schnellen Mineralumsatz in vivo für das effiziente Recycling essentieller Metallionen inspiriert, wobei organische Moleküle verwendet werden, um die Kristallstruktur von primären Mineralpartikeln zu destabilisieren [21, 22]. In den synthetischen Versionen werden GRAS-Liganden in Metalloxohydroxide eingebaut, wie sie sich in Lösung aus vernetzenden Polymeren bilden [21, 22]. Dies sorgt durch strukturelle Destabilisierung für die Labilität der finalen Mineralphase und erzeugt zudem – wie durch die Zetapotential-Messung gezeigt – stark negative Nanopartikel, die Agglomeration und Aggregation abwehren und so jahrelang stabile Nanopartikelsuspensionen erzeugen. Hier, und wie bereits für IHAT gezeigt, war Tartrat der dominierende Ligand bei der Erzielung dieser physikalisch-chemischen Veränderungen der Kupfer-Oxo-Hydroxid-Struktur, da sein Einbau ca. 3-fach größer als die von Adipat – letzteres verhält sich während der Synthese eher als Puffer [21, 22].

Ohne Modifizierung agglomerieren und aggregieren frisch ausgefällte Metalloxohydroxide und beginnen zu altern, wobei sie kondensieren und ihre Kristallinität allmählich erhöhen. Diese Größen- und Mineralphasenübergänge verringern die Fähigkeit der Strukturen, an der Rückreaktion teilzunehmen, d. h. sich wieder aufzulösen. Es war daher nicht überraschend, dass bei frischer Bildung von Kupferoxohydroxid durch pH-Neutralisation einer Kupferchloridlösung zumindest etwas lösliches Kupfer in unserem Gelfreisetzungsassay freigesetzt wurde (Abb. 4), während bei den kommerziellen CuO-NPs, die agglomeriert und enthielt eine stärker kondensierte mineralische Phase (dh Kupferoxid), und es wurde nicht nachweisbares Kupfer freigesetzt. Das Fehlen einer Auflösung von kommerziellen 30 nm-Nanopartikeln – die unabhängig von ihrem Aggregatzustand eine große Auflösungsoberfläche geboten hätten – zeigt, dass die Mineralphase ein wichtiger Treiber für die Freisetzung von Kupferionen ist und dass, wie oben erwähnt, Modifikation der hier durch Ligandendotierung erzielten Primärpartikel des Minerals ist eigentlich erforderlich, um eine deutliche Verschiebung des Auflösungsverhaltens zu bewirken. Darüber hinaus wurde die Synthese von CHAT bei Raumtemperatur durchgeführt, da eine hohe Synthesetemperatur weniger amorphe Phasen begünstigt, was folglich die Auflösungsgeschwindigkeiten verringern kann. Außerdem hat die Synthese bei Raumtemperatur den Vorteil, dass bei der Herstellung im Maßstab die Energiekosten gesenkt werden.

Auch wenn es andere Wege gibt, hohe, stabile Kupferkonzentrationen zu formulieren, die bei Bedarf eine verzögerte Freisetzung und schnelle Auflösung von Ionen ermöglichen, können wir uns keine andere Synthese vorstellen, die so einfach ist und die Warenkosten (für die Reaktanten) so niedrig ist. Dies sind wichtige Faktoren, da das Thema topische Infektionen und bakterielle Resistenzen keineswegs auf Industrieländer beschränkt ist. Entwicklungsländer werden zunehmend von Problemen mit bakteriellen Resistenzen geplagt, so dass dringend bezahlbare wirksame Lösungen benötigt werden [36, 37]. Obwohl es keine ausreichenden Studien gibt, um zu konkreten Lösungen zu gelangen, gibt es Hinweise darauf, dass Bakterien eine Resistenz gegen toxische Metallionen schwerer erreichen als eine Resistenz gegen konventionelle Antibiotika [7]. Die Theorie basiert auf der Idee, dass Kupfer und Silber wahrscheinlich keine getrennten Wege der antimikrobiellen Aktivität haben, sondern vielmehr mehrere Ziele, einschließlich verschiedener Enzymsysteme, beeinflussen und somit die gesamte bakterielle Zellstruktur destabilisieren können [17, 19, 38]. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass Bakterien trotz jahrhundertelanger Exposition gegenüber Kupfer und bestimmten anderen Metallionen empfindlich bleiben [6, 7, 39]. Interessanterweise gibt es neuere Hinweise darauf, dass antimikrobielle Metalle auf Metallbasis trotz vorheriger Resistenzen sogar eine bakterielle Sensibilität gegenüber herkömmlichen Antibiotika zurückgeben können [40, 41].

Schlussfolgerungen

Hier haben wir gezeigt, dass das Problem bioverfügbarer Kupferionen bei physiologischen pH-Werten und hohen Konzentrationen durch Dotieren eines Kupfer-Nanominerals mit organischen Säuren gelöst werden kann, in einer ähnlichen Strategie wie zuvor für Eisenanaloga verwendet [21, 22]. Diese kupferbasierten Nanopartikel (als CHAT bezeichnet) lösen sich leicht im bakteriellen Medium auf und zeigen eine äquivalente intrazelluläre Kupferaufnahme und antibakterielle Aktivität wie lösliche Kupfersalze. Entscheidend ist jedoch, dass CHAT im Gegensatz zu einfachen Kupfersalzen in einer pH-neutralen Formulierung konzentriert werden kann und seine Labilität in Bezug auf die Kupferionenfreisetzung behält. Tatsächlich setzte CHAT Kupferionen im bakteriziden Bereich frei und könnte somit die Grundlage für ein neues, topisches antimikrobielles Mittel sein, entweder allein oder zur Verstärkung der Wirksamkeit resistenter Antibiotika. Mit zunehmender Antibiotikaresistenz werden neue topische antimikrobielle Mittel benötigt und CHAT ist kostengünstig, leicht zu synthetisieren und verwendet Komponenten, die allgemein als sicher anerkannt sind (GRAS). In-vivo-Studien sind sinnvoll.

Abkürzungen

CHAT:

Kupfer-[oxo]-hydroxid-adipattartrat-Nanopartikel

CuO-NPs:

Kupferoxid-Nanopartikel

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

Escherichia coli :

E. coli

GRAS:

Allgemein als sicher anerkannt

HEC:

Hydroxyethylcellulose

HMM:

Schwermetall MOPS mittel

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

ICP-OES:

Induktiv gekoppelte plasmaoptische Emissionsspektrometrie

IHAT:

Eisen [oxo]-hydroxid-adipattartrat-Nanopartikel

MOPS:

3-(N -morpholino) Propansulfonsäure

Staphylococcus aureus :

S. aureus

UHP:

Ultrahohe Reinheit