Ligand-dotierte Kupfer-Oxo-Hydroxid-Nanopartikel: Effektive antimikrobielle Strategie

Zusammenfassung

Bakterielle Resistenz gegen antimikrobielle Therapien ist ein zunehmendes klinisches Problem. Dies gilt für topische Anwendungen ebenso wie für systemische Therapie. Topisch können Kupferionen effektive und kostengünstige Antimikrobielle sein, die über mehrere Wege wirken und damit Bakterien Resistenzentwicklung erschweren. Die Chemie von Kupfer eignet sich jedoch nicht für einfache Formulierungen, die Kupferionen bei biologisch verträglichen pH-Werten bereitwillig freisetzen. Hier haben wir nanopartikuläres Kupferhydroxid-Adipat-Tartrat (CHAT) als günstiges, sicheres und leicht synthetisierbares Material entwickelt, das antimikrobielle Kupferionenfreisetzung in einer infizierten Wundumgebung ermöglichen sollte.

Zunächst synthetisierten wir CHAT und zeigten, dass dies dispergierte aquatisierte Partikelgrößen von 2–5 nm und ein mittleres Zeta-Potenzial von –40 mV aufwies. Als Nächstes zeigte CHAT, verdünnt in bakteriellem Medium, ähnliche Wirksamkeit wie Kupferchlorid gegen Escherichia coli und Staphylococcus aureus, mit dosisabhängiger Aktivität meist um 12,5–50 mg/L Kupfer. Tatsächlich lösten sich CHAT bei diesen Konzentrationen sehr schnell auf und zeigten, wie durch einen bakteriellen Kupfer-Biosensor bestätigt, identische intrazelluläre Beladung wie Kupferionen aus Kupferchlorid. Wenn jedoch bei 250 mg/L in einer topisch applizierten Matrix, nämlich Hydroxyethylcellulose, formuliert, war der Vorteil von CHAT gegenüber Kupferchlorid offensichtlich. Erstere ergab schnelle anhaltende Freisetzung von Kupfer im bakteriziden Bereich, während Kupferchlorid, der bei solcher Konzentration und pH unlösliche Niederschläge bildete, maximal 10 ± 7 mg/L Kupfer nach 24 h freisetzte.

Wir liefern eine praktische Formulierung für topische kupferbasierte antimikrobielle Therapie. Weitere Studien, insbesondere in vivo, sind verdient.

Hintergrund

Mikrobielle Infektionen tragen zu Millionen Todesfällen weltweit bei. Oft ist die Ineffizienz einer antimikrobiellen Behandlung auf mikrobielle Resistenz gegen konventionelle Antibiotika zurückzuführen. Daher werden neuartige Antimikrobielle dringend gesucht. Kupfer wird seit langem für seine antimikrobiellen Effekte erkannt und könnte potenziell größere klinische Langlebigkeit als Standardantibiotika haben, da es über eine Vielzahl von Mechanismen gegen Bakterien wirkt, einschließlich Interaktion mit bakteriellen Proteinen und DNA, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Störung der Membranintegrität. Aus demselben Grund wird angenommen, dass das Potenzial für antimikrobielle Resistenz pathogener Bakterienstämme gegen Kupfer und andere Metalle begrenzt ist. Zudem ist Kupfer relativ kostengünstig und für Menschen wenig toxisch, da seine Essenzialität in Spuren die Evolution strenger homöostatischer Kontrolle sicherte. Daher gibt es gemeinsame Verwendung dieses Metalls für präventive Infektionsmaßnahmen, meist zur Vermeidung bakterieller Biofilmbildung auf Oberflächen in Hochrisikobereichen wie Krankenhäusern und Pflegeheimen. Im Gegensatz dazu hat Kupfer keine signifikante therapeutische Verwendung in topischen antimikrobiellen Formulierungen gefunden, im Gegensatz zu Silber, das weit verbreitet eingesetzt wird.

Bakterien sind anfällig für Kupferbeladung in ihrer intrazellulären Umgebung, und die Wirksamkeit einer Kupferquelle hängt von ihrer Fähigkeit ab, Kupferionen freizusetzen. In dieser Hinsicht ist eine bedeutende Herausforderung für kupferbasierte Antimikrobielle das Erreichen einer konzentrierten Formulierung, die anhaltende Freisetzung antimikrobiellen Kupfers bei effektiven Konzentrationen in Flüssigkeiten wie Wundexsudat ermöglicht. Dies liegt daran, dass Kupfer ein hydrolytisches Metallion ist und mit steigender Konzentration bei pH typischer topischer Formulierungen (nahe neutral) seine Tendenz zur Hydrolyse und Bildung unlöslicher Oxo-Hydroxide zunimmt. Bei physiologischen pH-Werten sind diese Oxo-Hydroxide keine guten Substrate für Freisetzung löslicher oder daher potenziell wirksamer Kupferionen.

Kürzlich wurde, zum Zweck der Findung eines bioverfügbaren Eisensupplements, das Problem der effektiven Freisetzung von Ferritionen aus einer konzentrierten Oxo-Hydroxidquelle unter physiologischen Bedingungen durch strukturelle Modifikation der Primärpartikel gelöst. In jener Arbeit wurde Eisen in Gegenwart von kristalldotierenden GRAS-Liganden, nämlich Adipinsäure und Weinsäure, gefällt, um die finale ferrische Oxo-Hydroxidstruktur gezielt zu destabilisieren. Diese Strategie hatte den Vorteil (a) irreversibles Agglomerieren der ferrischen Oxo-Hydroxidpartikel zu verhindern und (b) deren Labilität (Löslichkeit) unter geeigneten physiologischen Bedingungen stark zu erhöhen. Dieses Material wurde „Iron [oxo-]hydroxide adipate tartrate“ oder IHAT genannt. Analog dazu betrachteten wir hier, ob Kupfer [oxo-]hydroxid adipat tartrat (CHAT) synthetisiert und in hohen Konzentrationen formuliert werden könnte, aber dennoch Kupferionen bei effektiven antimikrobiellen Niveaus freisetzt. Insbesondere zielte diese Arbeit darauf ab, einen günstigen und skalierbaren synthetischen Prozess zu entwickeln, der Kupfer-Oxo-Hydroxid-Nanopartikel produziert, die im Gegensatz zu zuvor berichteten Materialien biozide Konzentrationen von Kupferionen in einer simulierten Wundumgebung bereitwillig freisetzen sollten.

Daher synthetisierten wir in dieser Studie CHAT und charakterisierten seine Fähigkeit, bioverfügbares Kupfer bereitzustellen und damit antimikrobielle Aktivität zu demonstrieren. Wir konzentrierten uns auf Stämme von Escherichia coli als „Indikator“-Spezies für gram-negative Bakterien, demonstrierten aber zusätzlich Proof-of-Prinzip-Effekte gegen Staphylococcus aureus als gram-positive Bakterien, die oft Multiresistenz erlangen. Daher zielte die Studie darauf ab, den Wert der Weiterentwicklung von CHAT für klinische Anwendungen in topischer antimikrobieller Therapie zu bewerten.

Methoden

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Experimente mit ultrahochreinem (UHP) Wasser (Umkehrosmose-Reinigung; 18,2 ΩM/cm), bei Raumtemperatur (20 ± 2 °C) durchgeführt, und alle Reagenzien wurden von Sigma Aldrich bezogen.

Kupferformulierungen und CHAT-Nanopartikel

Kupferchlorid-Stocks (40 mM Kupfer) wurden durch Lösen von CuCl₂·2H₂O in Wasser hergestellt. Kupferoxid-Nanopartikel (CuO NPs; Sigma 544868) Stocks wurden aus einem kommerziellen Pulver hergestellt, das frei von Verunreinigungen war, eine Primärpartikelgröße von 34 nm (Bereich 10–50 nm) aufwies und zuvor als antimikrobielles Mittel getestet wurde. Diese Stocks wurden bei 1,3 g/L Kupfer durch Dispergieren des Pulvers in Wasser mit starker Agitation hergestellt. Kolloidale Suspensionen von CHAT-Nanopartikeln wurden durch eine Co-Fällungsmethode synthetisiert. Kurz: Kupferchlorid, Weinsäure und Adipinsäure wurden in Wasser gelöst, um ein Molverhältnis von Kupfer/Weinsäure/Adipinsäure in der finalen Suspension von 2:1:1 und eine Kupferkonzentration von 2,5 g/L zu erreichen. Der initiale pH der Mischung war immer unter 2,5, und Kupfer war vollständig gelöst. Der pH wurde dann langsam durch tropfenweise Zugabe einer konzentrierten NaOH-Lösung (5 M) unter konstanter Agitation auf 8,2 ± 0,2 erhöht.

Kupfergehalt und Phasenverteilung von CHAT-Suspensionen

Kupfergehalt in kolloidalen Suspensionen wurde durch induktiv gekoppelte Plasma-optische Emissionsspektrometrie (ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba) bestimmt. Alle Proben wurden auf Konzentrationen unter 100 mg/L in 5 % HNO₃ (v/v) mindestens 24 h vor Analyse verdünnt, um vollständige Löslichkeit von Kupfer zu gewährleisten. Kalibrierstandards (0,1 bis 100 mg/L Kupfer) wurden in 5 % HNO₃ matrix-angepasst, und Kupferquantifizierung erfolgte bei 324,754 nm. Fraktionierung des Kupfers in Prozente agglomerierten, nanopartikulären und löslichen Kupfers wurde durch Filtration und Ultrafiltration von CHAT-Stocks erreicht. Suspensionen wurden filtriert (200 nm Cut-off), und das Retentat wurde als agglomerierte Fraktion betrachtet. Um lösliches Kupfer zu isolieren und von nanopartikulärem Kupfer zu unterscheiden, wurde die kolloidale Suspension durch einen 3-kDa-Filter (Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16.000×g, 5 min) ultrafiltriert, da dies einem Cut-off unter 1 nm entspricht (Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). Der Kupfergehalt aller Fraktionen (total, 200 nm Filtrat, 3 kDa Ultrafiltrat) wurde durch ICP-OES bestimmt, und Fraktionen als Prozente in Relation zum Gesamtkupfergehalt ausgedrückt.

Bestimmung von Kupfergehalt und Kupfer-zu-Ligand-Verhältnissen in trockenen CHAT-Nanopartikeln

CHAT-Nanopartikel wurden agglomeriert und gefällt, um Rückgewinnung und Entfernung ungebundener Komponenten zu ermöglichen. Dazu wurde Ethanol zu kolloidalen Suspensionen von CHAT (2,5 g/L Kupfer) im Verhältnis 2:1 Ethanol/Suspension (v/v) zugegeben, und die resultierenden CHAT-Agglomerate wurden durch Zentrifugation (4500×g × 15 min in Mistral 6000) zurückgewonnen. Die Lösungsphase, enthaltend ungebundene Ligandenspezies, wurde verworfen. Bestimmung des Kupfergehalts in festphasigem CHAT: Ein Pulver wurde durch Ofentrocknung des ethanolfällenden Pellets auf konstantes Gewicht bei 45 °C hergestellt. Dieses wurde vermahlen und 35,2 ± 0,3 mg (n = 2) in 11 ± 1 g 70 % HNO₃ verdaut, mit genauen Gewichten aufgezeichnet. Nach vollständiger Verdauung wurde diese Lösung 20-fach in Wasser verdünnt und Kupferkonzentration durch ICP-OES bestimmt. Ligand-zu-Kupfer-Verhältnisse wurden direkt aus getrockneten, ethanolfällenden CHAT-Agglomeraten bestimmt. Die Agglomerate wurden zunächst in Wasser auf ihr ursprüngliches Volumen wiederaufgelöst, um Auflösung mit geringeren HCl-Mengen zu erleichtern – eine Anforderung für Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Analyse. Aliquots wurden entweder in 5 % HNO₃ für ICP-OES-Analyse von Kupfer (wie oben beschrieben) oder in 80 mM HCl für HPLC-Analyse von Liganden (Wein- und Adipinsäure) gelöst. Ligandanalyse wurde in einem Standard-Umkehrphasen-Chromatographiesystem (C18-Säule in Waters Alliance 2690/5 mit 2998 PDA-Detektor) durchgeführt; weitere Details in Zusatzdatei 1.

Physikochemische Charakterisierung von CHAT-Suspensionen

Hydrodynamische Partikelgrößenverteilung wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) bestimmt. Aliquots von CHAT-kolloidalen Suspensionen (2,5 g/L Kupfer) wurden in eine 1-mL-Einwegküvette übertragen, und Messungen (n = 3) wurden bei 25 ± 2 °C durchgeführt. Zeta-Potenzial von CHAT-Suspensionen wurde durch Laser-Doppler-Mikroelektrophorese (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) mit Einweg-Faltkapillarzellen (DTS1070) bestimmt, unter Annahme einer Dielektrizitätskonstante von 78,5 und Viskosität von 0,89 cP. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Charakterisierung erfolgte durch Auftragen eines Tropfens CHAT-Suspension auf löchrige Kohlenstoffgitter und Trocknen bei 50 °C über Nacht. Gitter wurden dann am TEM (FEI-Philips CM100) bei 120 kV im Hellfeldmodus abgebildet.

Antimikrobielle Aktivität von Kupferformulierungen

Assays wurden in Heavy Metal MOPS (HMM) Medium durchgeführt, einem anerkannten Metallionen-kompatiblen Medium (Zusatzdatei 3), supplementiert mit 0,4 % Glucose und 0,1 % Caseinsäurehydrolysat, pH auf 7,2 ± 0,2 eingestellt. Vor Zugabe von Kupferverbindungen wurden Escherichia coli (NCTC11100) und Staphylococcus aureus RN4220 über Nacht bei 30 °C unter ständigem Schütteln in einem Infors HT Minitron Inkubator bei 80 rpm gezüchtet. Danach wurden Bakteriensuspensionen auf optische Dichte 0,05–0,1 (ca. 10⁶ Zellen/mL) bei 595 nm für E. coli oder 600 nm für S. aureus verdünnt. Anschließend wurden Stocks von Kupferchlorid und kolloidalem CHAT in HMM verdünnt und zu den Bakteriensuspensionen gegeben, um finale Kupferkonzentrationen zwischen 0,4 und 100 mg/L zu erhalten. Inkubation erfolgte dann für 6 bis 9 h, und Bakterienwachstum wurde durch Überwachung optischer Dichte als Maß für Bakterienbiomasse bestimmt.

Kupferlöslichkeit über Zeit in bakteriellem Wachstumsmedium wurde bestimmt, indem Kupferchlorid- und kolloidale CHAT-Stocks in HMM auf 12,5, 25 und 50 mg/L Kupfer verdünnt und der lösliche Kupferanteil bei 0, 2, 4 und 8 h durch Ultrafiltration (3 kDa) und ICP-OES-Analyse bestimmt wurde, wie oben beschrieben.

Intrazelluläre Bioverfügbarkeit von Kupferformulierungen

Rekombinante biolumineszente Cu-sensierende Bakterien, E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), die auf sub-toxische Mengen bioverfügbaren Kupfers mit Erhöhung ihrer Biolumineszenz reagieren, wurden verwendet, um Bioverfügbarkeit von Kupferverbindungen zu quantifizieren. Bakteriensuspensionen wurden wie für antimikrobiellen Aktivitätsassay beschrieben hergestellt und mit einer Reihe von Verdünnungen von Kupferchlorid und CHAT (0 bis 50 mg/L Kupfer) auf 96-Well-Mikrotiterplatten für 4 h inkubiert. Biolumineszenz wurde mit einem Orion II Plate Luminometer (Berthold Detection Systems) gemessen, und Induktion der Biolumineszenz wurde wie folgt berechnet: Biolumineszenz-Induktion, Fold Change = Biolumineszenz bei Cu-Exposition / Biolumineszenz ohne Cu.

Intrazellulärer Stress durch Kupferformulierungen

Die Fähigkeit von Kupferverbindungen, intrazelluläre Superoxid-Anionen und Einzelstrang-DNA-Brüche zu induzieren, wurde mit rekombinanten biolumineszenten Bakterien, E. coli K12::soxRSsodAlux und E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), bewertet. Bakterienkulturen wurden wie für antimikrobiellen Assay beschrieben hergestellt, und Bakterien wurden einer Reihe von Verdünnungen von Kupferchlorid und CHAT (0 bis 50 mg/L Kupfer) auf weißen 96-Well-Mikrotiterplatten über 4 h ausgesetzt. Die Biosensorleistungen wurden durch Exposition der Bakterien gegenüber Superoxid-Anionen-induzierendem Chemikalien Menadion (0,04–30 µg/L) oder Wasserstoffperoxid (0,1–150 mg/L) als positive Kontrollen für E. coli K12::soxRSsodAlux bzw. E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) kontrolliert. Wiederum wurden Bakterien auf weißen 96-Well-Mikrotiterplatten inkubiert und Biolumineszenz mit Orion II Plate Luminometer gemessen und Induktion der Biolumineszenz wie in Gl. 5 berechnet.

Einbindung von Kupferformulierungen in Hydroxyethylcellulose-Gele

Stocks von Kupferchlorid, CHAT und kommerziellen, unveränderten Kupferoxid-Nanopartikeln (CuO NPs) wurden in UHP-Wasser auf 250 mg/L Kupfer verdünnt. Die resultierenden Suspensionen von CHAT und CuO NPs waren bei nahe neutralem pH und konnten direkt in das Gel eingebunden werden, aber Kupferchlorid-Lösung war nach Verdünnung noch sauer und wurde daher auf pH 7,0 ± 0,2 eingestellt. Hydroxyethylcellulose (HEC) wurde dann direkt (2 % w/v) in die verschiedenen verdünnten Stocks mit einem Rollenmischer (Denley Spiramix 5) gelöst, bis homogene Gele gebildet waren. Zehn Gramm jedes Gels wurden in Falcon-Röhrchen überführt und über Nacht abgesetzt. Anschließend wurden 10 mL frisch hergestellter 50 mM Natriumbicarbonat-Puffer (gelöst aus NaHCO₃-Pulver, pH auf 7,0 ± 0,2 eingestellt) mit Sorgfalt in jedes Röhrchen gegeben, um Störungen an der Gel-Flüssigkeit-Grenzfläche (spezifische Oberfläche 7,1 cm²) zu minimieren. Aliquots wurden dann entnommen und durch ICP-OES analysiert, um Kupferfreisetzung über Zeit zu bestimmen.

Ergebnisse

Wie im „Methoden“-Abschnitt beschrieben, wurde CHAT ähnlich seinem Eisen-Analogon IHAT durch Dotieren von Kupfer-Oxo-Hydroxid (2,5 g/L Kupfer) mit Wein- und Adipinsäure synthetisiert. Dies erzeugte stabile kolloidale Suspensionen, in denen alles Kupfer einen 200-nm-Filter passierte, aber sehr wenig (5 %) einen 3-kDa-Filter passierte. Dies zeigte, dass der meiste Kupfer nanopartikulär war (95 %; Abb. 1a) mit wenig „freiem“ Kupfer und keinen detektierbaren großen Agglomeraten – wieder wie das IHAT-Analogon. Bei Fällung in Ethanol, um ungebundene Ligandenspezies zu entfernen, und anschließender Trocknung enthielt CHAT 31 ± 1 % Kupfer (w/w) per ICP-OES-Analyse. Kupfer-zu-Ligand-Molverhältnisse, letztere durch HPLC bestimmt, betrugen 2:1 für Kupfer zu Tartrat und 2:0,3 für Kupfer zu Adipat. CHAT-Partikel erschienen fast monodispers mit Durchmessern von 2–3 nm per TEM-Bildgebung (Abb. 1b). Diese Befunde waren konsistent mit hydrodynamischen Größendaten für CHAT plus Hydrathülle, da der Mediandurchmesser nach Volumen in UHP-Wasser 3,4 nm betrug (Abb. 1c) und die Größenverteilung eng war (2,4–5,6 nm für 80 % des Volumens) bei Bewertung mit dynamischer Lichtstreuung. Der durchschnittliche Zeta-Potenzial betrug –39 mV (Abb. 1d), konsistent mit Nanopartikeln, die eine stabile aquatisierte Dispersion bilden, und tatsächlich war die CHAT-Stock-Suspension über mehrere Jahre stabil (Zusatzdatei 4).

Als Nächstes betrachteten wir die antimikrobielle Aktivität von CHAT, wenn Stock-Suspensionen in bakteriellen Wachstumsmedien auf Konzentrationen verdünnt wurden, die mit der antimikrobiellen Aktivität von Kupfersalzen assoziiert sind. Für CHAT und Kupferchlorid war die Wachstumsinhibitions-Kurve sehr ähnlich für sowohl E. coli als auch S. aureus, mit meiste Aktivität bei Gesamtkupferkonzentrationen zwischen 12,5 und 50 mg/L (Abb. 2). Vollständige E. coli Wachstumsinhibition wurde bei Inkubation mit 18,8 (CuCl₂) und 25 (CHAT) mg/L Kupfer beobachtet, während für S. aureus vollständige Wachstumsinhibition bei 75 (CuCl₂) und 100 (CHAT) mg/L Kupfer erzielt wurde (Abb. 2; Prozentuale Wachstumsinhibition vs. Kupferkonzentration in Zusatzdatei 5).

Tatsächlich lösten sich bei diesen antimikrobiellen Konzentrationen mindestens 94 % von CHAT schnell auf (innerhalb 15 min), wieder beurteilt durch Ultrafiltration und ICP-OES-Analyse (Abb. 3a). Wir erwarteten daher, dass die antimikrobielle Wirksamkeit von CHAT mit dieser chemischen Labilität verknüpft war, wobei schnelle Auflösung der Nanopartikel intrazellulären bakteriellen Erwerb von Kupferionen ermöglichte. Um dies zu testen, forderten wir Cu-sensierende E. coli, MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), in denen Biolumineszenz als Reaktion auf sub-toxische Konzentrationen intrazellulärer Kupferionen zunimmt, mit 0 bis 50 mg/L Kupfer als CHAT oder Kupferchlorid heraus. Steigende Konzentrationen im Kulturmedium beider Kupferquellen führten zu steigender Biolumineszenz in der E. coli Kupfer-Sensor-Stamm (Abb. 3b), konsistent mit Anstiegen intrazellulären Kupfers. Die Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurve war bis 6,25 mg/L für beide Kupferquellen identisch, was bestätigte, dass bioverfügbares Kupfer aus CHAT vergleichbar mit einer vollständig gelösten Quelle war. Danach, bei Konzentrationen bis 50 mg/L Kupfer, stieg die Lumineszenz nicht mehr aufgrund der Toxizität beider Kupferverbindungen (Abb. 3b).

Parallel zur Untersuchung intrazellulären Kupfers in E. coli exponiert gegenüber Lösungen aus CHAT oder Kupferchlorid testeten wir auch die Fähigkeit dieser Lösungen, intrazelluläre Superoxid-Anionen auszulösen oder bakterielle DNA-Schäden in verschiedenen E. coli-basierten Biosensoren zu verursachen. In keinem Fall war ein signifikant beobachtbarer Effekt feststellbar, obwohl die Sensoren auf relevante positive Kontrollen, nämlich Wasserstoffperoxid und Menadion, reagierten (Abb. 3c, d). Zusammen genommen unterstützen die äquivalenten Reaktionen der drei bakteriellen Biosensoren auf Lösungen, hergestellt aus verschiedenen chemischen Formen von Kupfer, stark die Vorstellung, dass in beiden Fällen Bakterien dem gleichen löslichen Kupfer ausgesetzt waren, obwohl eine Formulierung als nanopartikulär begann.

Schließlich, wie oben angemerkt, wäre der Vorteil von CHAT über lösliche Kupfersalze nur offensichtlich, wenn eine konzentrierte Formulierung es dem Ersteren erlaubte, seine chemische Labilität zu behalten, im Gegensatz zum Letzteren. Mit Hydroxyethylcellulose (HEC), einer häufigen wässrigen Basis für topische Formulierungen, inkorporierten wir 250 mg/L Kupfer als entweder Kupferchlorid, CHAT oder kommerzielle CuO NPs. Als 10 mL 50 mM NaHCO₃-Puffer, als vereinfachtes Wundexsudat, zu 10 g jedes kupferhaltigen HEC-Gels (d.h. 2,5 mg Kupfer) gegeben wurden, gab es anhaltende Freisetzung von Kupfer aus der CHAT-haltigen Präparation auf über 60 mg/L bis 24 h (Abb. 4). Zudem war Freisetzung relativ schnell, mit antimikrobiell aktiven Konzentrationen erreicht bis 2–4 h. Im Gegensatz dazu war pH-neutralisierter Kupferchlorid ein schlechter Substrat für Kupferfreisetzung, wie erwartet durch seine Tendenz zur Hydrolyse und Bildung von Agglomeraten von Kupfer-Oxo-Hydroxiden, so dass bis 24 h nur 10 ± 7 mg/L Kupfer in Lösung erreicht wurden (Abb. 4). Kommerzielle CuO NPs ergaben keine nachweisbare Kupferfreisetzung (Abb. 4).

Diskussion

Wir zeigen hier, dass ein kupferbasiertes Nanomaterial, nämlich CHAT, in hohen Konzentrationen formuliert werden kann, anders als zuvor beschriebene kupferbasierte Nanopartikel, während es seine Eigenschaften als labile Quelle bioverfügbaren Kupfers mit antimikrobieller Wirksamkeit behält. Wie oben angemerkt, wurde die Synthese von CHAT inspiriert nach vielen Jahren vorheriger Arbeit am Eisen-Analogon IHAT. Dies wiederum war inspiriert durch die Natur-Lösung für schnellen Mineralumsatz in vivo, für effizientes Recycling essentieller Metallionen, wobei organische Moleküle verwendet werden, um die Kristallstruktur primärer Mineralpartikel zu destabilisieren. In den synthetischen Versionen werden GRAS-Liganden in Metall-Oxo-Hydroxide eingebaut, während sie sich in Lösung aus vernetzenden Polymeren bilden. Durch strukturelle Destabilisierung wird Labilität der finalen Mineralphase sichergestellt und auch hochnegative Nanopartikel erzeugt – wie durch Zeta-Potenzial-Messung demonstriert –, die Agglomeration und Aggregation abstoßen, wodurch Nanopartikelsuspensionen erzeugt werden, die über Jahre stabil waren. Hier, und wie zuvor für IHAT gezeigt, war Tartrat der dominierende Ligand für diese physikochemischen Änderungen an der Kupfer-Oxo-Hydroxid-Struktur, da seine Inkorporation ca. 3-fach größer war als die von Adipat – letztere verhielt sich mehr als Puffer während der Synthese.

Ohne Modifikation werden frisch gefällte Metall-Oxo-Hydroxide agglomerieren und aggregieren und beginnen zu altern, wobei sie kondensieren und allmählich ihre Kristallinität erhöhen. Diese Größen- und Mineralphasenübergänge reduzieren die Fähigkeit der Strukturen, an der umgekehrten Reaktion teilzunehmen, d.h. sich wieder aufzulösen. Es war daher nicht überraschend, dass beim frischen Bilden von Kupfer-Oxo-Hydroxid aus pH-Neutralisation einer Kupferchlorid-Lösung zumindest etwas lösliches Kupfer in unserem Gel-Freisetzungsassay freigesetzt wurde (Abb. 4), während für kommerzielle CuO NPs, die agglomeriert waren und eine stärker kondensierte Mineralphase (Kupferoxid) aufwiesen, kein nachweisbares Kupfer freigesetzt wurde. Das Fehlen von Auflösung kommerzieller 30 nm Nanopartikel – die unabhängig von ihrem Aggregationszustand eine große Oberfläche für Auflösung präsentieren würden – zeigt, dass Mineralphase ein Schlüsselfaktor für Freisetzung von Kupferionen ist und dass, wie oben angemerkt, Modifikation der primären Partikel des Minerals, hier durch Liganddotierung erreicht, wirklich erforderlich ist, um eine markante Verschiebung in Auflösecharakteristika herbeizuführen. Darüber hinaus wurde die Synthese von CHAT bei Raumtemperatur durchgeführt, da hohe Synthesetemperaturen weniger amorphe Phasen begünstigen, die folglich Auflöseraten reduzieren könnten. Auch Raumtemperatursynthese hat den Vorteil, Energiekosten bei Skalierung der Herstellung zu reduzieren.

Obwohl es andere Wege geben mag, hohe, stabile Kupferkonzentrationen zu formulieren, die anhaltende Freisetzung und schnelle Auflösung von Ionen bei Bedarf ermöglichen, können wir keine andere Synthese vorstellen, die so unkompliziert ist und die Warenkosten (für Reaktanten) so niedrig sind. Dies sind wichtige Faktoren, da das Problem topischer Infektionen und bakterieller Resistenz keineswegs auf entwickelte Länder beschränkt ist. Entwicklungsländer werden zunehmend von bakteriellen Resistenzproblemen geplagt, und erschwingliche wirksame Lösungen sind dringend erforderlich. Obwohl es unzureichende Studien gibt, um konkrete Lösungen zu erreichen, gibt es Hinweise, dass Resistenz gegen toxische Metallionen für Bakterien schwieriger zu erreichen ist als Resistenz gegen konventionelle Antibiotika. Die Theorie basiert auf der Idee, dass Kupfer und Silber wahrscheinlich keine diskreten Wege antimikrobieller Aktivität haben, sondern vielmehr multiple Ziele einschließlich verschiedener Enzymsysteme beeinflussen und damit die gesamte bakterielle Zellstruktur destabilisieren können. Tatsächlich wurde gezeigt, dass Bakterien trotz Expositionen über Jahrhunderte empfänglich für Kupfer und bestimmte andere Metallionen bleiben. Interessanterweise gibt es neuere Belege, dass metallbasierte Antimikrobielle sogar bakterielle Empfindlichkeit gegenüber konventionellen Antibiotika trotz vorliegender Resistenz wiederherstellen können.

Schlussfolgerungen

Hier haben wir demonstriert, dass das Problem bioverfügbarer Kupferionen bei physiologischen pH-Werten und hohen Konzentrationen durch Dotieren eines Kupfer-Nanominerals mit organischen Säuren gelöst werden kann, in einer ähnlichen Strategie wie zuvor für Eisen-Analoga genutzt. Diese kupferbasierten Nanopartikel (bezeichnet CHAT) lösten sich im bakteriellen Medium bereitwillig auf, zeigten äquivalente intrazelluläre Kupferaufnahme und antibakterielle Aktivität wie lösliche Kupfersalze. Kritisch jedoch, und im Gegensatz zu einfachen Kupfersalzen, kann CHAT in einer pH-neutralen Formulierung konzentriert werden und behält seine Labilität in Bezug auf Kupferionenfreisetzung. Tatsächlich setzte CHAT Kupferionen im bakteriziden Bereich frei und könnte somit Basis für ein neuartiges topisches Antimikrobiell sein, entweder allein oder zur Steigerung der Wirksamkeit resistenter Antibiotika. Mit zunehmender Antibiotikaresistenz werden neue topische Antimikrobielle benötigt, und CHAT ist kostengünstig, leicht synthetisierbar und verwendet Komponenten, die allgemein als sicher (GRAS) anerkannt sind. In-vivo-Studien sind verdient.

Abkürzungen

CHAT

Kupfer [oxo]-hydroxid adipat tartrat Nanopartikel

CuO NPs

Kupferoxid-Nanopartikel

DLS

Dynamische Lichtstreuung

Escherichia coli

E. coli

GRAS

Allgemein als sicher anerkannt

HEC

Hydroxyethylcellulose

HMM

Heavy Metal MOPS Medium

HPLC

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie

ICP-OES

Induktiv gekoppelte Plasma-optische Emissionsspektrometrie

IHAT

Eisen [oxo]-hydroxid adipat tartrat Nanopartikel

MOPS

3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure

Staphylococcus aureus

S. aureus

UHP

Ultrahochrein