Biogene Au@Ag Kern-Schale-Nanopartikel synthetisiert mit Rumex hymenosepalus-Extrakt für antimikrobielle Anwendungen

Einleitung

In den letzten 25 Jahren wurden mehrere chemische Methoden für die Nanomaterialsynthese untersucht; jedoch verwenden die meisten dieser Methoden Substanzen, die umweltunfreundlich sind und hohe Temperaturen oder teure Geräte erfordern. In dieser Arbeit führten wir die Synthese von Gold-Silber-Nanostrukturen durch Verwendung der grünen Synthesemethode durch. Diese Methode minimiert Verschmutzung von Anfang an. Durch Verwendung „sauberer“ Prozesse, Vermeidung der meisten Abfälle und Verwendung gefährlicher Schadstoffe bei der Entwicklung „sauberer“ Nanomaterialien, die keine Bedrohung für Gesundheit oder Umwelt darstellen.

Die grüne Synthese von Metallnanopartikeln strebt einen positiven Einfluss der Interaktion mit biologischen Systemen an, was bedeutet, dass Nanopartikel und ihre Selbst-Funktionalisierung mit Polyphenol-Molekülen biologische Interaktionen erzeugen, die mit Systemen wie Zellen und Makromolekülen kompatibel sind. Im Allgemeinen werden diese biologischen Interaktionen als Nanomedizin für Krankheiten wie Krebs, Diabetes und neurodegenerative Erkrankungen verwendet. Die Synthese von Silber (Schale) und AuNPs als Kern-Schale-System hat Anwendungen wie optische Diagnose-Sensoren, Molekularsensoren [1, 2], photothermische Therapien, Antimikrobielle und verbessert den katalytischen Prozess [3, 4, 5, 6] im Vergleich zu monometallischen NPs.

Insbesondere werden sequenzielle oder simultane Methoden in verschiedenen Reaktoren, chemische und physikalische Methoden [7] für die bimetallische Synthese verwendet: Ultraschall-Spray-Pyrolyse [8], sonochemische Methode [5], mikrofluidischer Chip [9], sequenzielle nanofluide Nanopräzipitation [10, 11] Mikroemulsionen [12], Liposomen [13], verwendete Reduktionsmittel sind chemische oder grüne chemische Typen.

Trockene Materialien werden in der Nanopartikelsynthese als Metalloxide [14], Kohlenstoffnanoröhren [15, 16] verwendet, andere verwenden gedruckte weiche elektronische Geräte [17]. Nasse Nanopartikel werden in biologischen Systemen [18, 19, 20], Wirkstoffträger [21, 22], Antimikrobielle [23, 24], Sensoranwendungen [25] und Computationale Nanotechnologie als moderne Klassifizierung [26] verwendet, um Anwendungen zu definieren.

Khatami et al. rezensierten die grüne Synthese von Kern-Schale-Nanopartikeln mit Pflanzen, insbesondere wurden Antigonon leptopus, Diospyros kaki, Azadirachta indica, Potamogeton pectinatus, Anacardium occidentale für die Synthese von Au@Ag-Nanopartikeln mit Größen zwischen 5 und 500 nm (a) verwendet, wurden für verschiedene Anwendungen (nicht-antibakteriell) getestet, und Asparagus racemosus Wurzelextrakt wurde für die Synthese von Au-Ag-Legierungs-Nanopartikeln verwendet, wobei eine MHK bei 480 µg/mL gefunden wurde, getestet in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus [27]. Au@Ag NPs, die durch chemische Synthese erhalten wurden, haben Anwendungen als antibakteriell, und die berichtete MHK liegt bei etwa 2,5 µg/mL für Silbergehalt (Schale) [28], Lu et al. berichteten eine chemische Synthese von Au/AgNPs@Van, die mit NaBH₄ und Zugabe von Vancomycin hergestellt wurden, und MHK war 60 nmol/mL für bimetallische Nanopartikel, getestet in Gram-positiven und negativen Bakterien [29].

Antibakterielle Eigenschaften von bimetallischen Nanomaterialien [30, 31, 32, 33, 34] verbessern sich als Funktion der Ag-Konzentration. Im Gegensatz dazu verringert ein Anstieg der Au-Konzentration die antibakteriellen Eigenschaften, reduziert aber den zytotoxischen Effekt, d.h., das bimetallische Material wird biokompatibler [35]. Beim Vergleich des Effekts von Au- und Ag-monometallischen Materialien mit bimetallischen Materialien [36, 37, 38, 39, 40] wurde demonstriert, dass ein synergistischer Effekt [41] zwischen bimetallischen Materialien auftritt, der bifunktionale Effekte erzeugt [28, 42].

Nanomaterial-Funktionalisierung hat besonderes Interesse, da die chemische Umgebung [43, 44, 45] (pH, Gegenwart von Schwefel, biokompatible Moleküle usw.) um das System Auswirkungen auf die Interaktion mit Zellen oder Mikroorganismen haben wird; daher der Schwerpunkt auf der Erzeugung von Biomaterialien mit grüner Chemie [46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55].

Die chemische Zusammensetzung der bimetallischen Partikel [56, 57, 58] wird ein bestimmender Faktor in ihren optischen Eigenschaften [41, 59] sein, aufgrund des synergistischen Effekts monometallischer Nanostrukturen [60].

In dieser Arbeit wurden Gold- und Silbernanopartikel mit Rumex hymenosepalus-Extrakt als Reduktionsmittel synthetisiert, einer Pflanze, die Stilbene und Catechine enthält, die als potente Antioxidantien bei der Reduktion von Metallionen wirken. Goldnanopartikel wurden als Keime verwendet, um bimetallische Kern-Schale-Nanopartikel vom Typ Au@Ag durch eine sequenzielle Synthesemethode zu erhalten. Die Charakterisierung von Nanomaterialien umfasst die Techniken HAADF-STEM, TEM mit EDS und HRTEM.

Mit den verschiedenen Arten synthetisierter Nanopartikel wurde eine vergleichende Studie zur Wachstumsdynamik der Bakterien E. coli und S. aureus und der Hefe Candida albicans durchgeführt.

Experimenteller Abschnitt

Materialien

Die Wurzeln von Rumex hymenosepalus wurden in einem kommerziellen Betrieb der Lokalität erworben. Beide Vorläufer HAuCl₄ und AgNO₃ für die Nanopartikelsynthese wurden von Sigma-Aldrich mit 99% Reinheit gekauft. Brain Heart Infusion (BHI) Brühe und Potato Dextrose Brühe (PDB) für Mikroorganismen-Assays wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Ethanol (99% rein) für den Reinigungsprozess der Nanopartikel wurde von Fermont bezogen, und ultrareines Wasser (Milli-Q) wurde in Experimenten verwendet.

Rumex hymenosepalus Extrakt

Für die Extraktzubereitung wurden 150 g Wurzel in Scheiben geschnitten und zuvor dehydriert in 1000 mL einer 70/30 V/V Ethanol/Wasser-Mischung mazeriert. Die Mazeration wurde bei Raumtemperatur in einem Glasbehälter mit hermético Verschluss und vor Licht geschützt durchgeführt. Die Absorption der erhaltenen Lösung wurde 21 Tage überwacht, bis keine Änderungen im Wert mehr auftraten. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Mazerationsprozess als abgeschlossen betrachtet. Der erhaltene Extrakt wurde nacheinander mit Whatman-Papierfiltern mit Porengrößen von 8 µm und 2 µm und schließlich mit einem Acrodisc-Filter von 0,22 µm filtriert. Ethanol wurde durch Rotavaporation entfernt, und der wässrige Extraktkonzentrat wurde bei -80 °C eingefroren für Lyophilisierung (Labconco, FreeZone 1L). Die erhaltenen Pulver wurden in sterilen Behältern vor Licht geschützt bei Raumtemperatur bis zum Gebrauch aufbewahrt.

Synthese von AuNPs

Zunächst wurde eine wässrige Rumex hymenosepalus-Lösung mit 10 mg/mL aus dem lyophilisierten Extrakt hergestellt. Später wurden 16 mL Rumex-Lösung mit 32 mL ultrareinem Wasser gemischt, unter Rühren bei 1000 rpm gehalten und langsam 16 mL HAuCl₄ (0,01 M) hinzugefügt. Die Reaktion wurde eine Stunde unter Laborbeleuchtungsbedingungen und bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Intensität der Oberflächenplasmonenresonanz (λ_SPR = 540 nm) wurde über die Zeit durch UV-Vis-Spektroskopie bewertet; wenn keine Änderung beobachtet wurde, wurde die Synthese als abgeschlossen betrachtet. Das erhaltene Produkt wurde bei 12.000 rpm zentrifugiert, der Überstand wurde durch ultrareines Wasser ersetzt, und ein Sonikationsprozess wurde für 1 h angewendet, um Nanopartikel neu zu dispergieren. Der Vorgang wurde dreimal wiederholt. Wasser wurde als Lösungsmittel bei den ersten beiden Gelegenheiten und Ethanol beim letzten verwendet. Schließlich wurde die ethanoldispersion zentrifugiert und die Niederschläge in einem Konvektionsofen bei 40 °C getrocknet, um eine AuNPs wässrige Dispersion bei 2300 µg/mL herzustellen.

Synthese von Au@AgNPs

Für die Au@AgNPs-Synthese wurden 2 mL der AuNPs wässrigen Dispersion (2300 µg/mL), 0,8 mL AgNO₃ (0,1 M) und 0,8 mL Rumex hymenosepalus-Lösung (10 mg/mL) in ein steriles Glas-Kulturröhrchen gegeben. Das Gemisch wurde 3 h in einem Ultraschallreinigungsbad (Branson, Modell 2510) soniziert. Später wurde der Inhalt bei 12.000 rpm für eine Stunde zentrifugiert, die erhaltenen Feststoffe wurden in ultrareinem Wasser durch Sonikation neu dispersiert, um eine Konzentration von 1000 µg/mL zu erhalten.

Synthese von AgNPs

Zur Herstellung von AgNPs wurden 16 mL Extraktlösung (10 mg/mL) mit 64 mL ultrareinem Wasser und 8 mL AgNO₃ 0,1 M gemischt. Die Reaktion wurde eine Stunde unter Laborbeleuchtungsbedingungen bei 25 °C durchgeführt, und die Oberflächenplasmonenresonanz (λ_SPR^Ag = 440 nm) wurde über die Zeit durch UV-Vis-Spektroskopie überwacht, um die Bildung zu beurteilen. Das Produkt wurde bei 12.000 rpm zentrifugiert, der Überstand wurde durch ultrareines Wasser ersetzt, und Sonikation wurde für 1 h angewendet. Der Vorgang wurde dreimal wiederholt. Wasser wurde als Lösungsmittel bei den ersten beiden Gelegenheiten und Ethanol beim letzten verwendet. Die ethanoldispersion wurde zentrifugiert und die Niederschläge in einem Konvektionsofen bei 40 °C getrocknet. Schließlich wurde der erhaltene AgNPs-Staub in ultrareinem Wasser durch Sonikation neu dispersiert, um eine kolloidale Dispersion bei 2000 µg/mL Konzentration zu erzeugen.

Charakterisierungen

UV-Vis-Absorptionsspektren wurden mit einem Dual-Strahl PerkinElmer Lambda 45 Spektrometer erhalten. Ein Spalt von 0,5 nm wurde verwendet, und Spektren wurden mit einer Geschwindigkeit von 480 nm/min in einem Bereich zwischen 200 und 900 nm aufgezeichnet. Für die Nanopartikel wurden 50 µL Probe und nur 5 µL für den Extrakt verwendet. Das Endvolumen wurde in Quarzzellen mit ultrareinem Wasser als Lösungsmittel auf 3 mL aufgefüllt.

Zeta-Potenzial (ζ) von AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs wurde mit einem Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK) gemessen. Jede Probe wurde bei Raumtemperatur (25 °C) in Triplicate und als Funktion der Konzentration bei 1, 10, 50 und 100 µg/mL für jede Probe gemessen.

DLS für AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs wurde mit einem Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK) mit einem 633 nm He-Ne-Laser gemessen. Jede Probe wurde bei Raumtemperatur (25 °C) in Triplicate und als Funktion der Konzentration bei 1, 10, 50 und 100 µg/mL für jede Probe gemessen. Der Polydispersitätsindex (PDI) wurde aus DLS-Experimenten mit Malvern-Software durch die Definition PDI = (σ / D̄)² bestimmt, wobei D der durchschnittliche Durchmesser und σ die Standardabweichung von D ist. PDI-Werte von 0,10 oder weniger gelten als hochgradig monodispers [62].

Der optische Bandabstand E_g wurde für AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs mit der Tauc-Gleichung berechnet, um einen Bandabstand in Materialien durch die folgende Beziehung zu bestimmen:

α = (c / hν) (hν - E_g)^1/n

wobei α der Absorptionskoeffizient des Materials ist (α = 2,303 A/d, wobei A Absorption und d die Zellbreite ist) und E_g die optische Bandlückenenergie und hν die Photonenenergie ist, die durch Zeichnen einer Linie zwischen (αhν)ⁿ und Photonenenergie hν erhalten wird. Der Index n wird als 2 für erlaubte direkte Band-zu-Band-Übergänge in Proben genommen [63] und kann leicht mit einem linearen Fit-Plot bewertet werden [64]. Abhängig vom Übergangstyp können Werte 1/2, 2, 3/2 und 3 für erlaubte direkte, erlaubte indirekte, verbotene direkte und verbotene indirekte Übergänge entsprechen [65].

Proben AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs und Rh wurden mit einem FTIR (PerkinElmer, Inc., Waltham, Spectrum Two) durch Infrarotabsorption analysiert. Die Akquisitionsparameter waren: 4 cm⁻¹ Auflösung, 16 Scans, und zwischen 4000 und 900 cm⁻¹ Wellenlängenbereich.

Röntgen-Photoelektronenspektroskopie-Assays wurden auf einem PerkinElmer Modell PHI 5100 durchgeführt, das eine Dual-Quelle von Mg/Al, 300 W, 15 kV enthält. Die Mg Kα-Emissionslinie mit der Energie von 1253,6 eV wurde für AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs und Rh verwendet. Alle Experimente wurden unter Vakuumbedingungen von 2 × 10⁻⁹ Torr durchgeführt [66]. Daten wurden mit Multipak-Software analysiert. Für XPS-Charakterisierung wurden die verschiedenen Nanopartikeldispersionen und die Rumex hymenosepalus-Extraktlösung auf sauberen Deckgläsern wie folgt deponiert. 30 µL der Probe wurde zum Deckglas hinzugefügt, sodass es vollständig trocknen konnte für die nächste Deposition. Der Prozess wurde mindestens 5-mal wiederholt, bis ein dünner Film gebildet war und dann durch XPS charakterisiert.

High-Angle Annular Dark Field-Scanning Transmission Electron Microscopy (HAADF-STEM) kann als leistungsstarker Betriebsmodus in der Elektronenmikroskopie betrachtet werden, der eine große Menge an komplementären Informationen liefert, die die Struktur eines Nanomaterials aufklären. Aberrationskorrigiertes HAADF-STEM kann mit atomarer Auflösung die Positionen von Atomen verschiedener chemischer Natur bestimmen. Dies ist auf das aberrationskorrigierte HAADF-STEM zurückzuführen, das für seine chemische Empfindlichkeit und hohe räumliche Auflösung bekannt ist [67]. In diesem Betriebsmodus ist das inkohärente Bild dominant mit vernachlässigbarem Beitrag von Beugungskontrast [68]. Daher ermöglicht der atomare Zahlkontrast (Z-Kontrast) im aberrationskorrigierten HAADF-STEM die Bestimmung der strukturellen Details von Nanostrukturen mit großer Präzision.

Für STEM-Analyse wurden Proben in einem JEOL-JEMARM200 Elektronenmikroskop bei 200 kV analysiert, mit einem CEOS-Korrektor für die Kondensorlinse. Z-Contrast STEM-Bilder wurden simultan in BF- und HAADF-Modus aufgezeichnet. Bilder wurden mit einer 40-Mikron-Kondensorlinsenblende (32–36 mrad Konvergenzwinkel) und einer Spotgröße von 9 pA aufgezeichnet.

Für Elektronenmikroskopie-Analyse wurde ein Tropfen (10 µL) der Au@AgNPs-Suspension auf ein 300-Mesh dickes Kohlenstoffgitter deponiert, bei Raumtemperatur getrocknet und 24 h in eine Vakuumkammer gelegt.

Nanopartikel wurden mit TEM in Jeol 2010F Apparat (1,9 Å Auflösung) bei 200 kV analysiert. EDS-Analyse wurde mit einem QUANTAX 200-TEM Röntgenspektrometer (Bruker) mit XFlash 4010 Detektor durchgeführt. Für HRTEM-Analyse wurden TEM-Mikrographen bei Vergrößerungen größer als 100.000X aufgezeichnet. Interplanare Abstände von Kristallebenen wurden durch digitale Mikrographen-Analyse (3.0 Gatan Version) bestimmt. Die Probenvorbereitung war ähnlich wie oben für STEM-Analyse beschrieben.

Daten wurden mit einem Bruker D8 QUEST Diffraktometersystem gesammelt, ausgestattet mit einem Mehrschichtspiegel-Monochromator und einer Cu Kα Mikrofokus-versiegelten Röhre (λ = 1,54178 Å). Frames wurden bei T = 300 K über ω/φ-Scans gesammelt und dann verarbeitet, um Diffraktogramme von Intensität vs. 2Theta zu erhalten. High Score Plus Software wurde für Rohdatenbehandlung und die ICSD-Pulverbeugungsdatenbank, die mit der Software assoziiert ist, für Such-Abgleich-Phasenidentifikationsanalysen implementiert.

Antibakterieller Aktivitäts-Assay

Getestete Mikroorganismen waren Bakterien Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 5538P) und Hefe Candida albicans, isoliert aus infiziertem Urin, gesammelt von einem erwachsenen männlichen Patienten mit Harnwegsinfektion (unsere Studie folgt den Prinzipien der Helsinki-Deklaration). Brain Heart Infusion (BHI) und Potato Dextrose Brühe (PDB) wurden verwendet, um Inokulum von Bakterien und Hefe vorzubereiten. Kulturen wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Konzentration in koloniebildenden Einheiten (CFU/mL) pro Milliliter Suspension wurde durch Messen der optischen Dichte durch UV-Vis bei 540 nm für Bakterien, 600 nm für Hefe bestimmt. Suspensionen mit 4 × 10⁸, 7,8 × 10⁸ und 2,5 × 10⁶ CFU/mL wurden für E. coli, S. aureus und C. albicans verwendet. Antimikrobielle Aktivität wurde in 96-Well-Platten getestet, mit flüssigem Kulturmedium, ergänzt mit Nanopartikeln und Mikroorganismen bei 37 °C. Alle Tests wurden in Triplicate durchgeführt. Absorption wurde in einem Multimode-Plattenleser Synergy HTX Biotek mit Gen 5 Software gemessen. Alle mikrobiellen Wachstumskurven wurden mit Origin Lab 8.0 Software durchgeführt. Als erster Schritt wurden 70 µL frisches Brühenmedium (BHI oder PDB, entsprechend den untersuchten Mikroorganismen) gemischt mit Nanopartikeln in der erforderlichen Konzentration zu den Wells hinzugefügt. Später wurden 30 µL Mikroorganismensuspension zu den Wells hinzugefügt und mit dem Medium homogenisiert. Das Endvolumen in jedem Well betrug 100 µL. Nach Ausbringen des Inokulums wurden die 96-Well-Platten in dem oben beschriebenen Spektrophotometer gelesen. Platten wurden bei 37 °C für 24 h gehalten, mit kreisförmigem Schüttelmodus vor jeder Messung mit einer Periode von 15 min. Die Wachstumsrate der Mikroorganismen wurde durch optische Dichtemessung (OD) bei der genannten Wellenlänge bestimmt.

Wachstumskurven analysiert mit dem Gompertz-Modell

Es ist in der Literatur bekannt, dass das Gompertz-Wachstumsmodell das Wachstum von Mikroorganismenpopulationen gut beschreibt. Dieses Modell ermöglicht es uns, zwei kritische Parameter in der Beschreibung des Wachstums der Mikroorganismenpopulation zu verstehen: die adaptive Phase (Lag-Phase) und die Populationswachstumsrate. Insbesondere ist das Studium des Verhaltens der Lag-Phase in inhibitorischen Behandlungen von Mikroorganismen relevant, da es Informationen über die adaptiven Reaktionen des Mikroorganismus auf die Behandlung liefert und sogar Hinweise auf die Entwicklung von Resistenz des Mikroorganismus gegen die bewertete Behandlung geben kann [69].

Das modifizierte Gompertz-Modell wurde von Zwietering et al. [70] beschrieben und von Li et al. [69] und anderen Autoren [71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78] als Modell angepasst, das die Wachstumskurven anpasst:

y = A exp { - exp [ (μe/A)(λ - t) + 1 ] }

wobei A die Zellzahl als OD₅₄₀ (S. aureus und E. coli) und OD₆₀₀ (C. albicans) ausdrückt, μ die Wachstumsrate in der exponentiellen Phase ist und e die Exponentialzahl e¹ ist, λ die Lag-Phase ist. Wir haben unser Wachstumskinetik mit Software Origin 9.1 angepasst, um die Effekte über S. aureus, E. coli und C. albicans der drei Agenten AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs zu analysieren.

Effekt von Nanopartikeln auf E. coli, S. aureus und C. albicans Wachstum

Escherichia coli und Staphylococcus aureus wurden in BHI-Medium inkuliert, und C. albicans wurde in PD-Brühe inkuliert. Alle Kulturen wurden über Nacht bei 36 °C inkubiert. Nach Inkubation wurden die drei Kulturen auf Absorption von 1, 0,7 und 1 eingestellt (λ = 540 nm). AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs wurden auf eine Konzentration von 50 µg/mL eingestellt. In einer 96-Mikrowell-Platte wurden angepasste Kulturen Nanopartikeln in einem Verhältnis 7:3 ausgesetzt, wodurch ein Endvolumen von 200 µL pro Mikrowell erreicht wurde. Ebenfalls wurden angepasste Kulturen sterilisiertem Wasser als Kontrollbedingung in denselben zuvor beschriebenen Bedingungen ausgesetzt. Andere für dieses Experiment verwendete Kontrollen waren frische Medien und jede Nanopartikellösung ohne Mikroorganismen. Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Candida albicans wurden jeweils AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs ausgesetzt. Die Mikrowell-Platte wurde bei 36 °C inkubiert, und eine Probe jedes Mikroorganismus in Behandlungs- und Kontrollbedingungen wurde nach 1, 7, 13 und 19 h entnommen. Entnommene Proben wurden in serieller 1:10 Salzlösung verdünnt und auf Müller-Hinton-Plattenoberfläche ausgestrichen. Inokulierte Platten wurden 24 h bei 36 °C inkubiert. Nach Inkubation wurden CFU/mL durch direkte Zählung berechnet.

Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBC)

Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Candida albicans wurden jeweils in Müller-Hinton-Brühe inkuliert, über Nacht bei 36 °C inkubiert und auf 0,5 McFarland-Nephelometer eingestellt. Sobald Inokulums für die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) angepasst waren, wurde ein Mikrodilutionstest durchgeführt. Kurz: Eine 96-Well-Platte wurde für diesen Zweck verwendet. 160 µL einer angepassten Kultur jedes Mikroorganismus wurde in 5 Wells gegossen. Lösungen von AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs von 1000 µg/mL wurden hergestellt. Vorherige Lösungen wurden für die Herstellung von 750, 500 und 250 µg/mL Lösungen verwendet. Reines sterilisiertes Wasser wurde als 0 µg/mL Nanopartikel verwendet, und 40 µL jeder vorherigen Lösung wurde zu 160 µL angepasster Kulturen hinzugefügt. Auf diese Weise wurde jede Kultur einer Endkonzentration von 200, 150, 100, 50 und 0 µg/mL jedes getesteten Nanopartikels ausgesetzt. Die Mikroplatte wurde 24 h bei 36 °C inkubiert. Danach wurde eine Probe jedes Wells auf einer Müller-Hinton-Oberfläche inokuliert und unter denselben zuvor beschriebenen Bedingungen inkubiert. Nach Inkubation wurden Müller-Hinton-Platten auf jedes Wachstumssignal beobachtet. Die Konzentration, bei der keine Wachstumssignale beobachtet wurden, wurde als MBC-Wert aufgezeichnet.

Ergebnisse und Diskussionen

Charakterisierung

Abbildung 1a zeigt die UV-Vis-Absorptionsspektren der synthetisierten Nanomaterialien. Die Absorptionen wurden für das maximale lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) normalisiert, das jedem Nanopartikelsystem entspricht.

Das Au@AgNPs-Absorptionsspektrum in Abb. 1a hat ein einzelnes Band, zentriert bei 474 nm, das zwischen dem AgNPs LSPR (445 nm) und dem AuNPs LSPR (544 nm) liegt. Das Fehlen eines goldähnlichen Absorptionspeaks bei Au@AgNPs deutet darauf hin, dass die durch sequenzielle Synthese erhaltenen Nanomaterialien Kern-Schale-Strukturen sind. Es ist nicht möglich, ein Absorptionsband zu detektieren, das mit Au des Kerns assoziiert ist. Einige Autoren nehmen an, dass für Kern-Schale-Systeme die Absorptionsspektren aus zwei Bändern bestehen, die jedem der Metalle für Schalendicken zwischen 3 und 4 nm assoziiert sind. Die dem Metallkern assoziierte Absorption verschwindet für höhere Dicken, wobei ein einzelnes Absorptionsband erhalten wird, dessen Maximum von dem Dicken/Kerngrößen-Verhältnis des bimetallischen Partikels abhängt [79, 80].

Samal et al. [81] synthetisierten Kern-Schale-Nanopartikel (Au@Ag) durch Kontrolle der Kernengrößen und Hinzufügen verschiedener Schalenstärken. Insbesondere stimmt unser UV-Vis-Ergebnis für Au@AgNPs mit dem von Samal et al. für 32 nm Goldkerne und eine Silberschalendicke größer als 15 nm überein, wo Spektren durch ein einzelnes Absorptionsband (~ 450 nm) charakterisiert sind und die Unterdrückung von Au-Oberflächenplasmonen beobachtet wird.

Zusätzlich kann in Abb. 1a eine Absorption zentriert bei 280 nm (blau hervorgehobener Bereich) beobachtet werden, die Molekülen des Rumex hymenosepalus-Extrakts entspricht, der als Reduktionsmittel in unserer Nanopartikelsynthese verwendet wurde. Zusatzdatei 1: Abbildung S1 entspricht dem Rumex hymenosepalus wässrigen Lösungsabsorptionsspektrum. Ein charakteristisches Band zentriert bei 278 nm wird beobachtet, assoziiert mit elektronischen Übergängen der aromatischen Ringe, konjugiert mit Carbonylgruppen von polyphenolischen Verbindungen [82]. Dieses Absorptionsband in den Nanopartikel-UV-Vis-Spektren zeigt an, dass Endprodukte Extraktmoleküle enthalten, die in ihnen verbleiben. Rivero-Cruz et al. berichteten vier Stilbenoide, zwei Flavan-3-ole und drei Anthrachinone, isoliert aus R. hymenosepalus [83] und Rodríguez-León et al. führten eine Kernspinresonanz-Studie durch, um zu bestimmen, dass Rumex hymenosepalus wichtige Moleküle wie Stilben-Glykosid, Epicatechingallat und Epigallocatechingallat enthält [61]. Diese Moleküle partizipieren als Reduktionsmittel in der Nanopartikelsynthese. Der Prozess beinhaltet die Deprotonierung einiger -OH-Gruppen phenolischer Ringe zu =CO-Gruppen. Polyphenolische Moleküle werden oxidiert, und die freigesetzten Elektronen werden zu Ag⁺ und Au³⁺ Ionen transferiert, um Au⁰ und Ag⁰ zu bilden.

Abbildung 1b zeigt die Zeta-Potenzial-Werte für AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs bei Konzentrationen von 1, 10, 50 und 100 µg/mL. Nanopartikel sind in ultrareinem Wasser dispersiert, und die Messung wurde bei 25 °C in Triplicate durchgeführt. Im Allgemeinen weisen Nanopartikel über den gesamten Konzentrationsbereich Zeta-Potenzial-Werte negativer als -30 mV auf, erreichen Werte von -40 mV bei einer Konzentration von 100 µg/mL für AuNPs und Au@AgNPs und -38 mV für AgNPs. Diese stark negativen Zeta-Potenzial-Werte deuten darauf hin, dass Nanopartikel abstoßende Wechselwirkungen zwischen ihnen erfahren, die ihre Aggregation verhindern und die langfristige Stabilität von Metallkolloiden ermöglichen [84, 85, 86]. Durch Korrelation der UV-Vis-Spektroskopie-Ergebnisse mit den erhaltenen Zeta-Potenzial-Werten können wir feststellen, dass die stark negativen Werte auf die Komplexierung von Polyphenol-Molekülen des Extrakts auf der Nanopartikeloberfläche zurückzuführen sein können [87].

Für biologische Anwendungen ist es wertvoll, Nanopartikelpopulationen mit monodispersen Größen zu erhalten [88], daher zeigen Abb. 1c und d die DLS-Werte für mittleren Durchmesser und Polydispersitätsindex (PDI) für AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs bei Konzentrationen von 1, 10, 50 und 100 µg/mL. Der mittlere Durchmesser von Au@AgNPs beträgt ca. 250 nm und bleibt als Funktion der Konzentration konstant, ähnlich für monometallische Nanopartikel mit mittlerem Durchmesser von ca. 122 und 135 nm für AuNPs und AgNPs. Im gleichen Fall beobachtet man, dass PDI-Werte bei ca. 0,3 für monometallische Nanopartikel und 0,2 für Au@AgNPs liegen. Diese Ergebnisse, wo die Größen nicht mit der Konzentration variieren, zeigen, dass die verschiedenen Nanopartikelsysteme gute Stabilität aufweisen mit moderater Polydispersität der Größen (0,3 ≥ PDI ≥ 0,2).

Der optische Bandabstand des Tauc-Plots wurde berechnet (Zusatzdatei 1: Abbildung S2). Leitungsband bei Halbleitermaterialien haben Werte E_g < 3 eV, als Referenz hat Germanium E_g < 0,7 eV und Silicium E_g = 1,1 eV [89]. In unserem Fall beträgt der Bandabstand für Au@AgNPs, AuNPs und AgNPs 1,93 eV, 2,03 eV und 2,33 eV. Das bedeutet, dass diese Materialien als Halbleiter betrachtet werden, und dieses Merkmal wurde für Quantenkonfinement-Effekte erzielt, die eine erhöhte Energie-Lücke erzeugen, so können Nanomaterialien als Sensoren, Batterien und optoelektronische Geräte verwendet werden [64].

Um zu prüfen, ob organische Verbindungen in Nanopartikeln vorhanden sind, wurden diese Nanomaterialien durch XPS und FTIR charakterisiert. Abbildung 2a zeigt die Survey-Spektren des Pflanzenextrakts und der Nanopartikel. Wie man sehen kann, präsentieren alle Nanopartikelsysteme die charakteristischen Signale, assoziiert mit den Elementen Kohlenstoff (C 1s, 284,6 eV) und Sauerstoff (O 1s, 532,2 eV) aus dem Rumex hymenosepalus-Extrakt. Dieses Ergebnis bestätigt, dass organische Moleküle aus dem Extrakt in den erhaltenen Nanomaterialien vorhanden sind. Zusätzlich wurden hochauflösende XPS-Spektren erhalten, um die Oxidationszustände von Silber und Gold in den Nanopartikeln zu analysieren (Zusatzdatei 1: Abbildung S3). Für AgNPs (Zusatzdatei 1: Abbildung S3A) können die Signale bei Bindungsenergien von 373,76 eV und 367,76 eV (ΔBE = 6,0 eV), entsprechend den 3d3/2 und 3d5/2 Spektrallinien, mit Ag⁰ (metallisches Silber) assoziiert werden. Für AuNPs (Zusatzdatei 1: Abbildung S3B) ist der Peak, assoziiert mit 4f5/2 Spin-Orbit-Kopplung, bei Bindungsenergie 87,65 eV lokalisiert. Für 4f7/2 Spin-Orbit-Kopplung ist der Peak bei 83,98 eV lokalisiert. Das Verhältnis der Intensitäten (I4f7/2 > I4f5/2), Lage und Trennung zwischen Peaks (ΔBE = 3,67 eV) bestätigen, dass Goldionen (Au³⁺) vollständig zu metallischem Gold Au⁰ reduziert werden [90]. Für Au@AgNPs werden hochauflösende XPS-Spektren für Silber und Gold in Zusatzdatei 1: Abbildung S3C und Abbildung S3-D gezeigt. Diese Spektren zeigen das gleiche Verhalten wie ihre monometallischen Gegenstücke. Dies zeigt an, dass sowohl Silber als auch Gold im Kern-Schale-Präsentationsmodus nullwertig sind.

FTIR in Abb. 2e zeigt bei 3296 cm⁻¹ Hydroxylgruppen, 2974 cm⁻¹ (C–H) Bindung des aromatischen Rings, 1689 cm⁻¹ assoziiert mit Carbonylgruppen-Streckung (C=O), und 1689–1400 cm⁻¹ aufgrund von Carboxylat-Bindung (C–O) und Streckung der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung und 1212 cm⁻¹ assoziiert mit Phenol C–O-Streckung konjugiert mit AuNPs, 1049 cm⁻¹ C–O-Streckmodus der Catechin-Ester-Gruppen-Moleküle [88, 89, 90] und 799 cm⁻¹ die Auslenkung aus der Ebene im Phenol, C–H-Auslenkung berichtet bei 964,4 und 829,39 cm⁻¹ Merkmal von Resveratrol [91] verschoben im Rh-Extrakt zu 1031 und 867 cm⁻¹, jeweils, und AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs sind ebenfalls verschoben, was auf Komplexierung von Polyphenol-Molekülen des Rh-Extrakts mit Nanopartikeln hinweist.

Abbildung 3a entspricht einem repräsentativen Hellfeld-STEM-Mikrographen des Au@AgNPs-Systems bei niedriger Vergrößerung (100 nm Maßstab). Ein Satz von Nanopartikeln ohne Agglomeration und mit meist quasi-sphärischer Geometrie ist zu sehen. Dieselbe Region wird in Dunkel Feld (HAADF) in Abb. 3b gezeigt, und die Kern-Schale-Struktur kann beobachtet werden, wo man Au-Kern intensiver als Ag-Schale unterscheiden kann, aufgrund des Unterschieds in der Ordnungszahl. Abbildung 3c und d entsprechen STEM-Mikrographen bei höherer Vergrößerung (Maßstab 20 nm) einer Nanopartikelgruppe des Kern-Schale-Systems in Hell- und Dunkel Feld. Man kann mit Klarheit den brillanten Au-Kern und die leicht kontrastierte Ag-Schale schätzen. Diese Bilder zeigen, dass die Dicke der Ag-Schale zwischen 3 und 5 nm variiert. Zusatzdatei 1: Abbildung S4 entspricht einer individuellen Bildergalerie, wo die Uniformität der Ag-Schale beobachtet werden kann.

Abbildung 4a, c und e entsprechen TEM-Mikrographen repräsentativer Nanopartikelsysteme AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs. In allen Fällen haben Nanopartikel sphärische Morphologie und sind gut voneinander getrennt gezeigt. Dies kann durch Extraktmoleküle auf Nanopartikeloberflächen erklärt werden, die als Spacer zwischen ihnen wirken. Abbildung 4b, d und f zeigen Histogramme, die der Größenverteilung entsprechen, ermittelt durch TEM und durchgeführt mit 500 Nanopartikeln, gesammelt aus 15 bis 20 Mikrographen für jedes Nanomaterial. Das Histogramm präsentiert Gauß-Verteilung mit mittlerer Größe von 24 ± 4 nm (AuNPs), 13 ± 3 nm (AgNPs) und 36 ± 11 nm (Au@AgNPs). Die Diskrepanz in Werten zwischen DLS- und TEM-Messungen mit Größenverteilungsgraph ist auf mikro-umgebungsbedingungen um die Nanopartikel zurückzuführen, während DLS einen Durchmesser für ein System zeigt, das Metall, hydratisierte Beschichtung und Lösungsmittel einschließt, im Vergleich dazu ist TEM-Messung ein trockenes System, wo Messung nur über Metall erfolgt, insbesondere induzieren in DLS die für Komplexierung der Nanopartikel verwendeten Moleküle (Reduktionsmittel und Stabilisatoren) Dispersanten, die Fehler in der Größenmessung induzieren und die Ergebnisse zu höheren Werten verschieben [91].

Abbildung 5 entspricht den Au@AgNPs HAADF-STEM-Mikrographien. Ein einzelnes Nanopartikel wird in Abb. 5a mit Goldkern und Silberhülle perfekt delimitiert gezeigt, die Ordnungszahl (Z) ändert sich durch die Grenzfläche Au@Ag, Intensitätsvariationen können durch HAADF-STEM quantifiziert werden [67].

Der rote Quadratbereich wird verstärkt, um ein HRTEM-Mikrographie des Schalenbereichs zu erhalten (Abb. 5b), und dann zur Verifizierung der kristallinen Schalenstruktur wurde der Nanopartikel-Peripheriebereich (unterbrochener Quadrat) mit der Digital Micrograph 3.0 Software (Gatan) analysiert. Fast Fourier Transform (FFT) Bild des ausgewählten Bereichs wurde erhalten (Abb. 5c). Mit der Inversen Fast Fourier Transform war es möglich, interplanare Abstände von 2,3 Å, 2,0 Å und 1,4 Å in Abb. 5d zu schätzen. Diese Abstände können jeweils den kristallinen Ebenen (111), (200) und (220) des flächenzentrierten kubischen (fcc) Silbers gemäß der Inorganic Crystal Structure Database (ICSD) am FIZ Karlsruhe–Leibniz Institut für Informationsinfrastruktur, Deutschland oder der Elektronenkristallographie-Software Jems (V 4-5430, JEMS-SAAS, Schweiz) [92] zugeordnet werden. Eine ähnliche Kristallstrukturanalyse durch HRTEM wurde für monometallische Nanopartikel durchgeführt, wie in Zusatzdatei 1: Abbildungen S5 (für AuNPs) und S6 (AgNPs) illustriert. In beiden Fällen entspricht die Kristallstruktur flächenzentriert kubisch (fcc).

EDS-Chemieanalyse zeigt die Anwesenheit beider Metalle für eine Gruppe bimetallischer Au@AgNPs, beobachtet durch TEM (Abb. 6a) in Anteilen des atomaren Gewichtsprozents 77% Ag (Schale) und 23% Au (Kerne) (Abb. 6b). Im Vergleich hat ein einzelnes bimetallisches (Abb. 6c) Au@AgNPs Anteile von ca. 80% Ag (Schale) und 20% Au (Kern) (Abb. 6d). Um den Gold- und Silber-Atomprozentsatz auf Kern-Schale-Nanopartikeln (Au@Ag) zu schätzen, wurde eine quasi-sphärische Geometrieapproximation der Nanopartikelmorphologie berücksichtigt. Der durchschnittliche AuNPs-Durchmesser aus TEM-Größenverteilung (D̄_Au = 24 nm) wurde für Kernvolumen-Schätzung (V_Au) verwendet, und der durchschnittliche Au@AgNPs-Durchmesser (D̄_Au@Ag = 36 nm) für Kern-Schale-Volumen-Schätzung (V_Au@Ag). So wird Schalenvolumen bestimmt als V_Ag = V_Au@Ag - V_Au. Der gesamte atomare Gehalt von Au und Ag wurde unter Berücksichtigung einer fcc-Kristallstruktur (4 Atome pro Einheitszelle) für beide Metalle berechnet, wo die Au- und Ag-Gitterparameter 4,0783 Å und 4,0862 Å betragen [93]. Atomare Gehaltsschätzung durch dieses Verfahren ergibt 70% für Ag (Schale) und 30% Au (Kern), was sich um 10% von der durch EDS erhaltenen Messung unterscheidet. Abbildung 7 zeigt eine theoretische Schätzung von Silber- und Goldgehalt und wie er variiert, wenn die Schalenstärke zunimmt und die Kerngröße konstant gehalten wird (D̄_Au = 24 nm). Es wird beobachtet, dass für Au@AgNPs mit einem Durchmesser größer als 30,2 nm der atomare Gehalt von Silber den Gehalt von Gold übersteigt. Im Supplementary Material wird eine detaillierte Beschreibung der Berechnung durchgeführt, um atomare Gehaltsprozente zu erhalten. Ähnliche Schätzungen atomarer Prozente wurden durchgeführt, unter Berücksichtigung anderer Au-Kerndurchmesser und Variation des Au@AgNPs-Durchmessers (Zusatzdatei 1: Abbildung S7A-B).

Abbildung 8 entspricht XRD-Mustern für AuNPs und AgNPs sowie bimetallische Au@AgNPs. Alle synthetisierten Produkte haben fcc-Kristallstruktur wie zuvor in der Charakterisierung durch Elektronenmikroskopie berichtet. Peaks für Au@AgNPs befinden sich bei 2θ-Beugungswinkeln von 38,25°, 44,4°, 64,9°, 77,85° und 81,25°. Wie in der Abbildung zu sehen, befinden sich die AgNPs- und AuNPs-Beugungspeaks an denselben Positionen mit einem Unterschied von ± 0,5°. Dies liegt daran, dass Au und Ag sehr ähnliche Gitterkonstanten haben, so dass ihre Beugungsmuster für fcc-Kristallstruktur fast identisch sind [94, 95, 96]. Auf diese Weise werden die Beugungspeaks in Abb. 8 jeweils den kristallinen Ebenen (111), (200), (220), (311) und (222) der Gold- und Silber-fcc-Struktur nach JCPDS: 4-0783 und 4-0784 [97] zugeordnet.

Antimikrobielle Aktivität

Monometallische (AgNPs, AuNPs) und bimetallische (Au@AgNPs) Materialien wurden bei vier verschiedenen Konzentrationen getestet: 1, 10, 50 und 100 µg/mL. Ausgewählte Mikroorganismen zur Bewertung der antimikrobiellen Aktivität waren Hefe Candida albicans, Gram-positive Bakterien S. aureus und Gram-negative Bakterien E. coli. Wachstumskinetik-Kurven in einem Zeitverlauf von 24 h sind in Abb. 9 gezeigt.

Candida albicans

AuNPs zeigen keinen Effekt auf Wachstumskinetik bis 10 h (Abb. 9a), variieren dosisabhängig die bei 24 h erreichte Absorption. Interessanterweise zeigt die Wachstumskinetik bei 50 µg/mL oder mehr einen steilen negativen Anstieg von 10 h bis zu einer 45%igen Reduktion bei 24 h, was einen antifungalen Effekt dieser Materialien suggeriert. Dies kann der Fähigkeit von Goldnanopartikeln zugeschrieben werden, mit relevanten Proteinen in Pilzen wie H⁺-ATPase zu interagieren, was die Protonenpumpenaktivität beeinflusst. Dies atrophiert die Fähigkeit der Hefe, Nährstoffe aufzunehmen, was zu ihrem Tod führt [61]. In Abb. 9b und c wurde beobachtet, dass AgNPs und Au@AgNPs das Wachstum der Hefe Candida albicans ab 10 µg/mL inhibieren. Die Bestimmung der MHK₅₀-Konzentration für beide Materialien wurde aus der Dosis-Wirkungs-Kurve geschätzt, die in Zusatzdatei 1: Abbildung S8 gezeigt wird. MHK₅₀ ist definiert als die Konzentration von Nanopartikeln, die eine 50%ige Abnahme der Absorption im Vergleich zur Kontrolle (Hefe ohne Behandlung) bewirkt. Für AgNPs und Au@AgNPs betrugen MHK₅₀ 2,21 µg/mL und 2,37 µg/mL.

Jedoch entsprechend den EDS-Ergebnissen (Abb. 9b) beträgt der Silbergehalt in Au@AgNPs 64,85% Masse. Somit beträgt die Silberkonzentration in Au@AgNPs für MHK₅₀ 1,53 µg/mL, 30% niedriger als im Fall von AgNPs. Padmos et al. haben demonstriert, dass Silbernanopartikel wichtige antibakterielle Eigenschaften besitzen, aber durch Säugetierzellen zytotoxisch sind; dieser Effekt wurde durch bimetallische Nanopartikel reduziert, insbesondere durch Verwendung von Gold im Kern bimetallischer Nanopartikel [35].

Escherichia coli

In Abb. 9d zeigen AuNPs keine signifikante Inhibition (< 15%) oder beeinflussen die Wachstumskinetik von E. coli. Für AgNPs (Abb. 9e) bei niedrigen Konzentrationen bleibt die Lag-Phase unverändert, aber es gibt eine markante Abnahme der Wachstumsrate, angezeigt durch die Steigungsabnahme. Bei 50 µg/mL dauert die Lag-Phase bis zu 16 h und die Lebensfähigkeit erreicht maximal 20% bei 24 h. Für 100 µg/mL wird keine explizite Ablösung der Wachstumsphase des Mikroorganismus beobachtet. Bei Au@AgNPs (Abb. 9f) zeigen die ersten beiden Konzentrationen keine Änderungen in ihrer Wachstumsphase, aber eine Phasenverzögerung von bis zu 2 h wird im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Interessanterweise dauert die Lag-Phase für die 50 µg/mL-Konzentration bis zu 21 h, schließlich gibt es kein explizites Wachstumsverhalten für die 100 µg/mL-Konzentration.

Staphylococcus aureus

Eine vergleichende Analyse der Lag-Phasen-Regeneration, die nach 12 h für Au (Abb. 9g), Ag (Abb. 9h) und Au@AgNPs (Abb. 9i) im Fall von S. aureus bei 50 µg/mL auftrat. Für die höchste Konzentration bei 100 µg/mL gibt es kein Wachstum der Bakterien. Zusätzlich beobachten wir Änderungen der Steigung bezüglich Kontrolle für Au, Ag und Au@AgNPs bei 1 und 10 µg/mL.

Die Interaktion von AuNPs mit diesen Gram-positiven Bakterien könnte auf die geladene Oberfläche zurückzuführen sein, die eine elektrostatische Interaktion verursacht und die Membranstruktur destabilisiert. Ähnliche Ergebnisse, aber mit höheren NP-Konzentrationen, werden für AuNPs berichtet, synthetisiert mit Ananas comosus Fruchtextrakt als Reduktionsmittel [98] und Blaugrünalge Spirulina platensis Protein [99]. Yang et al. zeigen MHK > 500 µg/mL für S. aureus (CMCC(B)26003), unsere AuNPs haben Inhibition mit 10-mal geringerer Konzentration gezeigt; in diesem Fall existiert eine kritische Synergie mit Polyphenol-Molekülen auf Beschichtung und Stabilisierung der Nanopartikeloberfläche [100]. ROS wird von geringer bis höherer Intensität [101] durch AuNPs, Polyphenole (Pflanzenextrakte) und AgNPs generiert, so fördern AuNPs in Synergie mit Resveratrol und Epigallocatechingallat (EGCG) antibakterielle Antwort über S. aureus [102] als den machbarsten Mechanismus in diesem Fall. Penders et al. berichteten 250 und 500 µg/mL AuNPs-ähnliche antibakterielle Wirkstoffe über S. aureus erhöhen bakterielle Wachstums-Lag-Zeit und antibakteriellen Effekt [61, 98, 99].

Wir glauben, dass Inhibition durch AgNPs [103] Akkumulation und Diffusion auf Bakterien verursacht wird, bezogen auf NPs-Oberflächenladungen, die elektrostatische Interaktionen [104] mit der Bakterienmembran fördern, was zu höherer Penetration und Schädigung führt. Wir denken, dies ist ein ähnlicher Mechanismus wie beschrieben für Interaktionen zwischen E. coli Biofilmen und AgNPs [105].

Für Au@AgNPs sind die erhaltenen Ergebnisse vergleichbar mit denen, die von anderen Arbeitsgruppen berichtet wurden [100, 101]; jedoch schlagen verschiedene Autoren vor, dass die Inhibition des Wachstums der Mikroorganismen direkt mit der Dicke der Schale zusammenhängt [100, 101]. Kern-Schale-NPs zeigten niedrige Zytotoxizität, wenn sie in NIH-3T3 Fibroblastenzellen (normale Säugetierzellen) getestet wurden [35]. Ein geringerer Silberanteil in der Schale der Au@AgNPs zeigt ähnliche Ergebnisse wie AgNPs [100], und der Au-Kern potenziert den antibakteriellen Effekt und minimiert die Zytotoxizität.

Wachstumskurven analysiert mit dem modifizierten Gompertz-Modell

Um zu wissen, wie die Wachstumsraten (µ) und Lag-Phasen (λ) quantitativ modifiziert werden, wurden die Wachstumskurven von Mikroorganismen, die verschiedenen Konzentrationen von Nanomaterialien ausgesetzt waren (Abb. 10), mit dem Gompertz-Modell (Gleichung 2) angepasst.

In Abb. 10a ist zu sehen, dass alle Nanomaterialien eine Abnahme der Replikationsrate von S. aureus Populationen bewirken, wenn die Nanopartikelkonzentration zunimmt. Dieser Effekt resultiert in leicht höherer Empfindlichkeit für AuNPs. Bei einer Konzentration von 50 µg/mL beträgt die Wachstumsrate nur 30% bezüglich Kontrolle (Zusatzdatei 1: Tabellen S1-S24); bei einer Konzentration von 100 µg/mL inhibieren alle Materialien das Wachstum der S. aureus Population. Das Verhalten der adaptiven Phase für S. aureus mit den verschiedenen Behandlungen ist in Abb. 10b gezeigt. Es wird beobachtet, dass es keine signifikanten Unterschiede im verwendeten Material gibt, und bei 50 µg/mL hat die Lag-Phase sich fast um das 5-fache im Vergleich zur adaptiven Phase von S. aureus erhöht (Zusatzdatei 1: Tabellen S1-S24). Im Allgemeinen können wir feststellen, dass die verschiedenen bewerteten Nanomaterialien in S. aureus die Replikationsrate verringern und die adaptive Phase dosisabhängig verzögern bis zur Inhibition bei 100 µg/mL.

Abbildung 10c zeigt deutlich, dass AuNPs die Wachstumsrate µ von E. coli Bakterien nicht beeinflussen. Währenddessen erzeugen AgNPs eine Abnahme über µ, erreichen einen Minimalwert entsprechend 19% zur Kontrolle (µ für E. coli ohne Behandlung) für 50 µg/mL (siehe Zusatzdatei 1: Tabelle S52). Im Gegensatz dazu inhibieren Au@AgNPs das E. coli Wachstum vollständig bei 100 µg/mL. Analyse des Verhaltens der E. coli Lag-Phase, exponiert verschiedenen Materialien, ist in Abb. 10d gezeigt. In diesem Fall, im Gegensatz zu Abb. 10b, hat jedes Material eine charakteristische Antwort. Somit erzeugen AuNPs keine Modifikation in der adaptiven Phase von E. coli, während AgNPs und Au@AgNPs einen dosisabhängigen Effekt auf die Lag-Phase haben, wobei das letztere Material hervorsticht. Somit können wir feststellen, dass AuNPs keine nennenswerte Wirkung auf E. coli Bakterien haben, und Au@AgNPs die Replikation inhibieren und daher die Lag-Phase von E. coli unbestimmt verzögern können. Interessanterweise wird dieser Effekt für AgNPs nicht erreicht, obwohl der Nettosilbergehalt höher ist als in Au@AgNPs. Dies deutet darauf hin, dass die Kern-Schale-Präsentation beider Metalle eine Synergie erzeugt, die die antimikrobielle Aktivität begünstigt. Feng et al. haben ein Elektronenkompensationsphänomen von Au zu Ag in Kern-Schale- und Legierungsstrukturen berichtet, das in einer Erhöhung der Zytotoxizität der Nanopartikel resultiert, aber die antibakteriellen Eigenschaften beibehält, was bedeutet, dass eine Synergie zwischen Au und Ag angenommen wird, aufgrund der beobachteten Unterschiede zwischen monometallischen und bimetallischen Materialien [106], aber mehr Forschung ist notwendig.

Abbildung 11 zeigt die Ergebnisse der direkten Kolonie-Zählstudie von Mikroorganismen, die Nanomaterialien ausgesetzt waren. Im Allgemeinen reproduziert das Verhalten der Mikroorganismenpopulationen die Ergebnisse aus der Wachstumskinetik-Studie (Abb. 7a, e, i). Zum Beispiel nimmt in Abb. 11a die Population der Mikroorganismen (logarithmisch dargestellt) signifikant nur bei 19 h ab, wo AuNPs 92% von C. albicans abgetötet haben. Interessanterweise wird für Nanopartikel, die Silber enthalten (Abb. 11b, c) ein stärkerer Bevölkerungsrückgang beobachtet. Au@AgNPs-System bei 50 µg/mL inhibiert S. aureus bei 7 h fast vollständig (99,5% der Bakterien abgetötet), obwohl der Mikroorganismus sein Wachstum für spätere Zeiten reaktiviert. MBC-Bestimmung war für getestete Konzentrationen nicht möglich (Zusatzdatei 1: Abbildung S9-11), gemäß experimenteller Beobachtung sind höhere Konzentrationen erforderlich, um diesen Effekt zu zeigen. Allerdings zeigte AgNPs für C. albicans einen MBC-Wert von 50 µg/mL (Zusatzdatei 1: Tabelle S55).

Schlussfolgerungen

Zum ersten Mal wird die Herstellung von Goldnanopartikeln und Kern-Schale (Au@Ag) mit Rumex hymenosepalus Wurzelextrakt als Reduktionsmittel berichtet. Für die Erhaltung von Au@AgNPs wird eine zweistufige sequenzielle Methode vorgeschlagen, die Partikel mit moderater Polydispersität und homogener Silberschale produziert. Die Bestimmung der Wachstumskurven und ihrer Parameter, erhalten durch das Gompertz-Modell, zeigen unterschiedliche Effekte der Nanomaterialien auf evaluierte Mikroorganismen. Inhibitorische Effekte von AuNPs über S. aureus werden bei einer Konzentration von 5-mal weniger als für andere AuNPs berichtet, synthetisiert durch verschiedene Prozesse. Dies offenbart die Wichtigkeit des gefolgtem Syntheseprozesses und der Umgebung auf der Nanopartikeloberfläche. Andererseits erzeugen AgNPs und Au@AgNPs ein starkes Wachstum der Lag-Phase (> 12 h). Jedoch können Bakterien sich anpassen und ihr Wachstum bei diesen sub-inhibitorischen Konzentrationen initiieren, mit dem konsequenten Risiko, Resistenz gegen diese Nanomaterialien zu generieren. Dies unterstreicht die Wichtigkeit der Durchführung von Wachstumskinetik-Studien, die einen angemessenen Zeitraum abdecken, um verzögertes Wachstum auszuschließen. Interessanterweise zeigt Gompertz-Analyse, dass Au@AgNPs einen höheren Effekt auf die Wachstumskinetik von Mikroorganismen haben als monometallische Nanopartikel, was auf einen synergistischen Effekt beider Metalle in der Kern-Schale-Struktur zurückgeführt werden kann. Bakterizide Effekte werden nur in C. albicans exponiert AgNPs erreicht. Weitere Experimente müssen an höheren Konzentrationsbereichen dieser Nanomaterialien (> 200 µg/mL) durchgeführt werden, um ihre MBC an den untersuchten Mikroorganismen zu bestimmen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel und seiner Supplementary Information Datei enthalten.

Abkürzungen

AuNPs:

Goldnanopartikel

AgNPs:

Silbernanopartikel

Au@AgNPs:

Gold-Silber-bimetallische Nanopartikel mit Kern-Schale-Struktur

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

EDS:

Energie-dispersive Röntgenspektroskopie

EGCG:

Epigallocatechingallat

FTIR:

Fourier-Transform-Infrarotspektrometer

HAADF:

High Angle Annular Dark Field Bilder

MBC:

Minimale bakterizide Konzentration

MHK:

Minimale Hemmkonzentration

Rh:

Rumex hymenosepalus Wurzelextrakt

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

STEM:

Rastertransmissionselektronenmikroskop

UV-Vis:

Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie

XPS:

Röntgen-Photoelektronenspektroskopie

XRD:

Röntgenbeugung