Au@Ag Core@Shell-Nanopartikel, synthetisiert mit Rumex hymenosepalus als antimikrobiellem Wirkstoff

Einführung

In den letzten 25 Jahren wurden mehrere chemische Methoden zur Nanomaterialsynthese untersucht; die meisten dieser Methoden verwenden jedoch umweltschädliche Substanzen und verwenden hohe Temperaturen oder teure Geräte. In dieser Arbeit haben wir die Synthese von Gold-Silber-Nanostrukturen unter Verwendung der grünen Synthesemethode durchgeführt. Diese Methode minimiert die Verschmutzung von Anfang an. Verwendung „sauberer“ Verfahren, Vermeidung des größten Teils des Abfalls und Verwendung gefährlicher Schadstoffe bei der Entwicklung „sauberer“ Nanomaterialien, die keine Gefahr für Gesundheit und Umwelt darstellen.

Die grüne Synthese von Metallnanopartikeln strebt eine positive Beeinflussung der Wechselwirkung mit biologischen Systemen an, was bedeutet, dass Nanopartikel und ihre Selbstfunktionalisierung mit Polyphenolmolekülen biologische Wechselwirkungen erzeugen, die mit Systemen wie Zellen und Makromolekülen kompatibel sind. Im Allgemeinen werden diese biologischen Wechselwirkungen als Nanomedizin für Krankheiten wie Krebs, Diabetes und neurodegenerative Erkrankungen verwendet. Die Synthese von Silber (Schale) und AuNps als Kern-Schale-System hat Anwendungen wie optische Diagnosesensoren, molekulare Sensoren [1, 2], photothermische Therapien, antimikrobielle Mittel und verbessert den katalytischen Prozess [3,4,5,6] im Vergleich mit monometallischen NPs.

Für die Bimetallsynthese werden insbesondere sequentielle oder simultane Verfahren in verschiedenen Reaktoren, chemische und physikalische Verfahren [7] eingesetzt:Ultraschall-Sprühpyrolyse[8], ein sonochemisches Verfahren[5], ein mikrofluidischer Chip [9], sequentielle nanofluidische Nanopräzipitation [ 10, 11] Mikroemulsionen[12], Liposomen [13], verwendete Reduktionsmittel sind chemische oder grüne chemische Typen.

Trockene Materialien werden in der Nanopartikelsynthese als Metalloxide [14], Kohlenstoffnanoröhren [15, 16] verwendet, andere Anwendungen gedruckte weiche elektronische Geräte [17]. Nasse Nanopartikel, die auf biologischen Systemen verwendet werden [18,19,20] Wirkstoffträger [21, 22], antimikrobiell [23, 24], Sensoranwendungen [25] und Computer-Nanotechnologie sind eine moderne Klassifizierung [26], die verwendet wird, um Verwendungen zu definieren.

Khatami et al. haben die grüne Synthese unter Verwendung von Pflanzen von Nanopartikeln vom Core@shell-Typ überprüft, insbesondere wurden Antigonon leptopus verwendet , Diopyros-Kaki , Azadirachta indica , Potamogeton pectinatus , Anacadium oceidentale für die Synthese von Au@Ag-Nanopartikeln mit einer Größe zwischen 5 und 500 nm (a), wurden für verschiedene Anwendungen getestet (nicht antibakteriell) und Asparagus racemosus Wurzelextrakt wurde zur Synthese von Au-Ag-Legierungs-Nanopartikeln verwendet, wobei eine MHK von 480 µg/ml gefunden wurde, die in Escherichia coli . getestet wurde , Bacillus subtilis , Klebsiella-Pneumonie , Pseudomonas aeruginosa , und Staphylococcus aureus [27]. Durch chemische Synthese erhaltene Au@Ag-NPs haben antibakterielle Anwendungen, und die berichtete MHK liegt bei etwa 2,5 µg/ml für den Silbergehalt (Schale) [28], Lu et. al. berichteten über eine chemische Synthese von Au/AgNPs@Van mit NaBH₄ und die Zugabe von Vancomycin und MHK betrug 60 nmol/ml für bimetallische Nanopartikel, die in grampositiven und -negativen Bakterien getestet wurden [29].

Die antibakteriellen Eigenschaften bimetallischer Nanomaterialien [30,31,32,33,34] verbessern sich in Abhängigkeit von der Ag-Konzentration. Im Gegensatz dazu verringert eine Erhöhung der Au-Konzentration die antibakteriellen Eigenschaften, verringert jedoch die zytotoxische Wirkung, d. h. das bimetallische Material wird biokompatibler [35]. Ein Vergleich der Wirkung von monometallischen Au- und Ag-Materialien mit bimetallischen Materialien [36,37,38,39,40] hat gezeigt, dass ein synergistischer Effekt [41] zwischen bimetallischen Materialien auftritt und bifunktionelle Effekte erzeugt [28, 42].

Die Funktionalisierung von Nanomaterialien ist von besonderem Interesse, da die das System umgebende chemische Umgebung [43, 44, 45] (pH, Anwesenheit von Schwefel, biokompatible Moleküle usw.) Auswirkungen auf die Interaktion mit Zellen oder Mikroorganismen hat; daher der Schwerpunkt auf der Erzeugung von Biomaterialien mit grüner Chemie [46,47,48,49,50,51,52,53,54,55].

Die chemische Zusammensetzung der bimetallischen Partikel [56,57,58] wird aufgrund des synergistischen Effekts monometallischer Nanostrukturen [60] ein bestimmender Faktor für ihre optischen Eigenschaften sein [41, 59].

In dieser Arbeit wurden Gold- und Silbernanopartikel unter Verwendung von Rumex hymenosepalus . als Reduktionsmittel synthetisiert Extrakt, eine Pflanze, die Stilbene und Katechine enthält, die als starke Antioxidantien bei der Reduzierung von Metallionen wirken. Goldnanopartikel wurden als Kerne verwendet, um durch eine sequentielle Synthesemethode bimetallische Nanopartikel vom Kern@Schale-Typ von Au@Ag zu erhalten. Die Charakterisierung von Nanomaterialien umfasst die Techniken von HAADF-STEM, TEM mit EDS und HRTEM.

Mit den unterschiedlichen Typen synthetisierter Nanopartikel wurde eine vergleichende Studie zur Wachstumsdynamik der Bakterien E. coli und S. aureus und die Hefe Candida albicans.

Experimenteller Abschnitt

Materialien

Die Wurzeln von Rumex hymenosepalus wurden in einem Gewerbebetrieb des Ortes erworben. Beide Vorstufen HAuCl₄ und AgNO₃ für die Nanopartikelsynthese wurden von Sigma-Aldrich mit einer Reinheit von 99% bezogen. Brain Heart Infusion (BHI) Broth und Potato Dextrose Broth (PDB), die für Mikroorganismen-Assays verwendet wurden, wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Ethanol (99 % rein), das bei der Reinigung von Nanopartikeln verwendet wurde, wurde von Fermont bezogen, und in Experimenten wurde Reinstwasser (Milli-Q) verwendet.

Rumex hymenosepalus-Extrakt

Zur Extraktherstellung wurden 150 g in Scheiben geschnittene und zuvor entwässerte Wurzel in 1000 ml einer 70/30 V/V-Ethanol/Wasser-Mischung mazeriert. Die Mazeration erfolgte bei Raumtemperatur in einem Glasbehälter mit hermetischem Stopfen und lichtgeschützt. Die Absorption der erhaltenen Lösung wurde 21 Tage lang überwacht, bis sich der Wert nicht änderte. Zu diesem Zeitpunkt galt der Mazerationsprozess als abgeschlossen. Der erhaltene Extrakt wurde nacheinander mit Whatman-Papierfiltern mit Porengrößen von 8 µm und 2 µm und schließlich mit einem Acrodisc-Filter von 0,22 µm filtriert. Ethanol wurde durch Rotationsverdampfung entfernt und das wässrige Extraktkonzentrat wurde zur Lyophilisierung bei –80°C eingefroren (Labconco, FreeZone 1L). Die erhaltenen Pulver wurden bis zur Verwendung in sterilen Behältern lichtgeschützt bei Raumtemperatur gelagert.

Synthese von AuNPs

Erstens Rumex hymenosepalus wässrige Lösung wurde mit 10 mg/ml aus dem lyophilisierten Extrakt hergestellt. Später 16 ml Rumex Lösung wurde mit 32 ml Reinstwasser vermischt, wobei bei 1000 U/min gerührt wurde, und es wurden langsam 16 ml HAuCl₄ . zugegeben (0,01 M). Die Reaktion wurde eine Stunde lang unter Laborlichtbedingungen und bei Raumtemperatur gehalten. Die Intensität der Oberflächenplasmonenresonanz (λ _SPR = 540 nm) wurde durch UV-Vis-Spektroskopie im Zeitverlauf ausgewertet; wenn keine Änderung beobachtet wurde, wurde die Synthese als abgeschlossen betrachtet. Das erhaltene Produkt wurde bei 12.000 U/min zentrifugiert, der Überstand wurde durch Reinstwasser ersetzt und ein Beschallungsprozess wurde 1 h lang angewendet, um Nanopartikel zu redispergieren. Der Vorgang wurde noch dreimal wiederholt. Als Lösungsmittel wurde bei den ersten beiden Gelegenheiten Wasser und beim letzten Mal Ethanol verwendet. Schließlich wurde die ethanolische Dispersion zentrifugiert und die Niederschläge in einem Konvektionsofen bei 40 °C getrocknet, um eine wässrige AuNPs-Dispersion mit 2300 µg/ml herzustellen.

Synthese von Au@AgNPs

Für die Au@AgNPs-Synthese 2 ml der wässrigen AuNPs-Dispersion (2300 µg/ml), 0,8 ml AgNO₃ (0,1 M) und 0,8 ml Rumex hymenosepalus Lösung (10 mg/ml) wurden in ein steriles Glaskulturröhrchen gegeben. Die Mischung wurde 3 h in einem Ultraschallbad (Branson, Modell 2510) beschallt. Später wurde der Inhalt eine Stunde bei 12.000 U/min zentrifugiert, die erhaltenen Feststoffe wurden durch Beschallung in Reinstwasser redispergiert, um eine Konzentration von 1000 µg/ml zu erhalten.

Synthese von AgNPs

Zur Herstellung von AgNPs wurden 16 ml Extraktlösung (10 mg/ml) mit 64 ml Reinstwasser und 8 ml AgNO₃ . gemischt 0,1 M. Die Reaktion wurde eine Stunde lang unter Laborlichtbedingungen bei 25 °C und Oberflächenplasmonenresonanz (\(\lambda_{{{\text{SPR}}}}^{{{\text{Ag}} }}\) = 440 nm) wurde durch UV-Vis-Spektroskopie im Zeitverlauf überwacht, um die Bildung zu beurteilen. Das Produkt wurde bei 12.000 U/min zentrifugiert, der Überstand wurde durch Reinstwasser ersetzt und 1 h beschallt. Der Vorgang wurde noch dreimal wiederholt. Als Lösungsmittel wurde bei den ersten beiden Gelegenheiten Wasser und beim letzten Mal Ethanol verwendet. Die ethanolische Dispersion wurde zentrifugiert und die Niederschläge in einem Konvektionsofen bei 40 °C getrocknet. Schließlich wurde der erhaltene AgNP-Staub durch Ultraschall in Reinstwasser redispergiert, um eine kolloidale Dispersion mit einer Konzentration von 2000 µg/ml zu erzeugen.

Charakterisierungen

UV-Vis-Absorptionsspektren wurden auf einem Zweistrahl-PerkinElmer Lambda 45-Spektrometer erhalten. Es wurde ein Spalt von 0,5 nm verwendet und Spektren wurden mit einer Geschwindigkeit von 480 nm/min in einem Bereich zwischen 200 und 900 nm aufgenommen. Für die Nanopartikel wurden 50 µL Probe und nur 5 µL für den Extrakt verwendet. Das Endvolumen wurde in den Quarzküvetten mit Reinstwasser als Lösungsmittel auf 3 ml aufgefüllt.

Zetapotential (ζ ) von AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs wurden mit einem Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK) gemessen. Jede Probe wurde bei Raumtemperatur (25 °C) in dreifacher Ausfertigung und als Funktion der Konzentration bei 1, 10, 50 und 100 µg/ml für jede Probe gemessen.

Die DLS für AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs wurden mit einem Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK) gemessen, der mit einem 633 nm He-Ne-Laser ausgestattet war. Jede Probe wurde bei Raumtemperatur (25 °C) in dreifacher Ausfertigung und als Funktion der Konzentration bei 1, 10, 50 und 100 µg/ml für jede Probe gemessen. Der Polydispersitätsindex (PDI) wurde aus DLS-Experimenten mit Malvern-Software durch die Definition \({\text{PDI}} =\left( {\frac{\sigma }{{\overline{D}}}} \right)^ . bestimmt {2}\), wobei D ist der durchschnittliche Durchmesser und \(\sigma\) ist die Standardabweichung von \(D\). PDI-Werte mit 0,10 oder weniger gelten als stark monodispers [62].

Die optische Bandlücke E _g wurde für AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs berechnet, unter Verwendung der Tauc-Gleichung Bestimmen Sie eine Bandlücke in Materialien durch die folgende Beziehung:

wobei \(\alpha\) der Absorptionskoeffizient des Materials ist (\(\alpha\) = 2.303 A /d wobei A die Extinktion und d die Breite der Zelle ist) und wobei E _g ist die Bandlücke der optischen Energie und hʋ ist die Photonenenergie, die durch Ziehen einer Linie zwischen (αhʋ ) ⁿ und Photonenenergie hʋ . Die Indexzahl n wird als 2 für die zulässigen direkten Band-zu-Band-Übergänge in Stichproben angenommen [63] und kann mit einem linearen Fit-Plot [64] leicht ausgewertet werden. Hängt vom Typ des Übergangs ab, der die Werte 1/2, 2, 3/2 und 3 haben kann, die den erlaubten direkten, erlaubten indirekten, verbotenen direkten bzw. verbotenen indirekten Übergängen entsprechen [65].

Proben von AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs und Rh wurden durch Infrarotabsorption unter Verwendung eines FTIR (PerkinElmer, Inc., Waltham, Spectrum Two) analysiert. Die Erfassungsparameter waren:4 cm ⁻¹ Auflösung, 16 Scans und zwischen 4000 und 900 cm ⁻¹ Wellenlängenbereich.

Röntgen-Photoelektronenspektroskopie-Assays wurden auf einem PerkinElmer Modell PHI 5100 durchgeführt, das eine duale Quelle von Mg/Al, 300 W, 15 kV enthält. Die Mg-Kα-Emissionslinie mit einer Energie von 1253.6 eV wurde für AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs und Rh verwendet. Alle Experimente wurden unter Vakuumbedingungen von 2 × 10 ^–9 . durchgeführt Torr. [66]. Die Daten wurden mit der Multipak-Software analysiert. Zur XPS-Charakterisierung die verschiedenen Nanopartikel-Dispersionen und der Rumex hymenosepalus Extraktlösung wurden wie folgt auf saubere Deckgläser aufgetragen. 30 µL der Probe wurden dem Deckglas zugesetzt, damit es für die nächste Auftragung vollständig trocknen konnte. Der Vorgang wurde mindestens 5 Mal wiederholt, bis ein dünner Film gebildet wurde und dann durch XPS charakterisiert.

Die High-Angle Annular Dark Field-Scanning Transmission Electron Microscopy (HAADF-STEM) kann als eine leistungsstarke Betriebsart in der Elektronenmikroskopie angesehen werden, die eine große Menge an komplementären Informationen liefert, um die Struktur eines Nanomaterials aufzuklären. Aberrationskorrigiertes HAADF-STEM kann mit atomarer Auflösung die Positionen von Atomen unterschiedlicher chemischer Natur bestimmen. Dies ist auf das aberrationskorrigierte HAADF-STEM zurückzuführen, das für seine chemische Empfindlichkeit und hohe räumliche Auflösung bekannt ist [67]. In dieser Betriebsart dominiert das inkohärente Bild mit einem vernachlässigbaren Beitrag des Beugungskontrastes [68]. Somit ermöglicht uns der Ordnungszahlkontrast (Z-Kontrast) in HAADF-STEM aberrationskorrigiert, die strukturellen Details von Nanostrukturen mit hoher Präzision zu bestimmen.

Für die STEM-Analyse wurden Proben in einem JEOL-JEMARM200-Elektronenmikroskop bei 200 kV mit einem CEOS-Korrektor für die Kondensorlinse analysiert. Z-Kontrast-STEM-Bilder wurden gleichzeitig im BF- und im HAADF-Modus aufgenommen. Die Bilder wurden mit einer 40-Mikron-Kondensorlinsenöffnung (32–36 mrad Konvergenzwinkel) und einer Punktgröße von 9 pA aufgenommen.

Für die elektronenmikroskopische Analyse wurde ein Tropfen (10 µL) Au@AgNPs-Suspension auf einem 300 mesh dicken Kohlenstoffgitter abgeschieden, auf Raumtemperatur getrocknet und für 24 h in eine Vakuumkammer gegeben.

Nanopartikel wurden durch TEM in einem Jeol 2010F-Gerät (1,9 Å Auflösung) bei 200 kV analysiert. Die EDS-Analyse wurde mit einem QUANTAX 200-TEM Röntgenspektrometer (Bruker) mit XFlash 4010 Detektor realisiert. Für die HRTEM-Analyse wurden TEM-Mikroaufnahmen bei Vergrößerungen von mehr als 100.000-fach aufgenommen. Die Interplanarabstände der Kristallebenen wurden durch digitale Mikrographieanalyse (3.0 Gatan-Version) bestimmt. Die Probenvorbereitung war ähnlich der oben beschriebenen für die STEM-Analyse.

Die Daten wurden mit einem Bruker D8 QUEST-Diffraktometersystem gesammelt, das mit einem Multilayer-Spiegel-Monochromator und einer abgedichteten Cu-Kα-Mikrofokus-Röhre (λ = 1,54178 Å). Frames wurden um T . gesammelt = 300 K über ω /φ -scannt und dann verarbeitet, um Diffraktogramme von Intensität vs. 2Theta zu erhalten. Die Software High Score Plus wurde für die Rohdatenaufbereitung verwendet und die mit der Software verbundene ICSD-Pulverdiffraktionsdatenbank wurde für die Phasenidentifikationsanalysen mit Such-Übereinstimmung implementiert.

Antibakterieller Aktivitätstest

Die getesteten Mikroorganismen waren Bakterien Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 5538P) und Hefe Candida albicans isoliert aus infiziertem Urin eines erwachsenen männlichen Patienten mit Harnwegsinfektion (unsere Studie folgt den Prinzipien der Deklaration von Helsinki). Gehirn-Herz-Infusion (BHI) und Kartoffel-Dextrose-Bouillon (PDB) wurden verwendet, um Inokulum von Bakterien bzw. Hefe herzustellen. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Konzentration in koloniebildenden Einheiten (KBE/ml) pro Milliliter Suspension wurde durch Messung der optischen Dichte durch UV-Vis bei 540 nm für Bakterien und 600 nm für Hefe bestimmt. Sperren mit 4 × 10 ⁸ , 7,8 × 10 ⁸ , und 2,5 × 10 ⁶ CFU/ml wurden für E verwendet. coli , S. aureus , und C. Albicans , bzw. Die antimikrobielle Aktivität wurde in 96-Well-Platten unter Verwendung von flüssigem Kulturmedium mit zugesetzten Nanopartikeln und Mikroorganismen bei 37 °C getestet. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt. Die Absorption wurde in einem Multimode-Plattenleser Synergy HTX Biotek unter Verwendung der Gen 5-Software gemessen. Alle mikrobiellen Wachstumskurven wurden unter Verwendung der Origin Lab 8.0-Software durchgeführt. In einem ersten Schritt wurden 70 µL frisches Nährmedium (BHI oder PDB, je nach untersuchten Mikroorganismen) gemischt mit Nanopartikeln in der erforderlichen Konzentration in die Wells gegeben. Später wurden 30 µl Mikroorganismensuspension in die Vertiefungen gegeben und mit dem Medium homogenisiert. Das Endvolumen jeder Vertiefung betrug 100 µl. Nach dem Verteilen des Inokulums wurden die 96-Well-Platten in dem oben beschriebenen Spektrophotometer gelesen. Die Platten wurden 24 h lang bei 37 °C gehalten, mit einem kreisförmigen Schüttelmodus vor jedem Ablesen mit einer Dauer von jeweils 15 Minuten. Die Wachstumsrate der Mikroorganismen wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) bei der genannten Wellenlänge bestimmt.

Kurvenwachstum analysiert mit dem Gompertz-Modell

In der Literatur ist bekannt, dass das Gompertz-Wachstumsmodell das Wachstum von Mikroorganismenpopulationen gut beschreibt. Dieses Modell ermöglicht es uns, zwei kritische Parameter bei der Beschreibung des Wachstums der Mikroorganismenpopulation zu verstehen:die adaptive Phase (Lag-Phase) und die Populationswachstumsrate. Insbesondere die Untersuchung des Verhaltens der Lag-Phase bei inhibitorischen Behandlungen von Mikroorganismen ist relevant, da sie Informationen über die adaptiven Reaktionen des Mikroorganismus auf die Behandlung liefert und sogar Hinweise auf die Entwicklung einer Resistenz des Mikroorganismus gegenüber der evaluierten Behandlung geben kann [69 ].

Das modifizierte Gompertz-Modell wurde von Zwietering et al. [70] und adaptiert von Li et al. [69] und andere Autoren [71,72,73,74,75,76,77,78] als Modell zur Anpassung der Wachstumskurven und

wo A ist die Zellzahl, ausgedrückt als OD₅₄₀ (S. aureus und E. coli ) und OD₆₀₀ (C. albicans ), μ ist die Wachstumsrate in der exponentiellen Phase und e ist die Exponentialfunktion e ¹ , \(\lambda\) ist die Lag-Phase. Wir haben unsere Wachstumskinetik mit einem Software-Ursprung 9.1 angepasst, um die Auswirkungen über S zu analysieren. aureus , E. coli, und C. Albicans der drei Agenten AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs.

Wirkung von Nanopartikeln auf E. coli, , S. aureus , und C. Albicans Wachstum

Escherichia coli und Staphylococcus aureus wurden in BHI-Medium geimpft, und C. Albicans wurde in PD-Brühe geimpft. Alle Kulturen wurden über Nacht bei 36°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die drei Kulturen auf Extinktionen von 1, 0,7 bzw. 1 eingestellt (λ = 540 nm). AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs wurden auf eine Konzentration von 50 µg/ml eingestellt. In einer 96-Mikrowell-Platte wurden angepasste Kulturen im Verhältnis 7:3 Nanopartikeln ausgesetzt, wobei ein Endvolumen von 200 µl pro Mikrowell erreicht wurde. Außerdem wurden angepasste Kulturen sterilisiertem Wasser als Kontrollbedingung unter den gleichen zuvor beschriebenen Bedingungen ausgesetzt. Andere verwendete Kontrollen für dieses Experiment waren frische Medien und jede Nanopartikellösung ohne Mikroorganismen. Escherichia coli, Staphylococcus aureus , und Candida albicans wurden AuNPs, AgNPs bzw. Au@AgNPs ausgesetzt. Die Mikrotiterplatte wurde bei 36 °C inkubiert und eine Probe jedes Mikroorganismus unter Behandlungs- und Kontrollbedingungen wurde nach 1, 7, 13 und 19 h erhalten. Die gesammelten Proben wurden in serieller 1:10-Kochsalzlösung verdünnt und über die Oberfläche der Müller-Hinton-Platten verteilt. Beimpfte Platten wurden 24 h bei 36 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden KBE/ml durch direktes Zählen berechnet.

Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBC)

Staphylococcus aureus , Escherichia coli , und Candida albicans wurden jeweils in Müller-Hinton-Brühe beimpft, über Nacht bei 36°C inkubiert und auf 0,5 McFarland-Nephelometer eingestellt. Nachdem die Inokulums auf die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) eingestellt waren, wurde ein Mikroverdünnungstest durchgeführt. Kurz gesagt wurde zu diesem Zweck eine 96-Well-Platte verwendet. 160 &mgr;l einer angepassten Kultur jedes Mikroorganismus wurden in 5 Vertiefungen gegossen. Es wurden Lösungen von AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs von 1000 µg/ml hergestellt. Frühere Lösungen wurden zur Herstellung von 750, 500 und 250 µg/ml-Lösungen verwendet. Als 0 µg/ml Nanopartikel wurde reines sterilisiertes Wasser verwendet, und 40 µl jeder vorherigen Lösung wurden zu 160 µl angepasster Kulturen gegeben. Auf diese Weise wurde jede Kultur einer Endkonzentration von 200, 150, 100, 50 und 0 µg/ml jedes getesteten Nanopartikels ausgesetzt. Die Mikrotiterplatte wurde 24 h bei 36 °C inkubiert. Danach wurde eine Probe jedes Wells auf eine Oberfläche von Müller-Hinton geimpft und unter den gleichen zuvor beschriebenen Bedingungen inkubiert. Nach der Inkubation wurden Müller-Hinton-Platten auf der Suche nach Wachstumssignalen beobachtet. Die Konzentration, bei der keine Wachstumssignale beobachtet wurden, wurde als MBC-Wert aufgezeichnet.

Ergebnisse und Diskussionen

Charakterisierung

Abbildung 1a zeigt die UV-Vis-Absorptionsspektren der synthetisierten Nanomaterialien. Die Extinktionen wurden für die maximale lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) entsprechend jedem Nanopartikelsystem normalisiert.

Nanopartikel UV-Vis-Spektren (a ), Z-Potenzial (b ), DLS (c ) und PDI (d ) von Au, Ag und Au@AgNPs

Das Au@AgNps-Absorptionsspektrum in Abb. 1a weist eine einzelne Bande auf, die bei 474 nm zentriert ist und sich zwischen der LSPR der AgNPs (445 nm) und der LSPR der AuNPs (544 nm) befindet. Das Fehlen eines goldähnlichen Absorptionspeaks auf Au@AgNPs legt nahe, dass die durch sequentielle Synthese erhaltenen Nanomaterialien Kern@Schale-Strukturen sind. Es ist nicht möglich, eine mit Au assoziierte Absorptionsbande nachzuweisen, die zum Kern gehört. Einige Autoren gehen davon aus, dass die Absorptionsspektren von Core@Shell-Systemen aus zwei Banden bestehen, die jedem der Metalle für Schalendicken zwischen 3 und 4 nm zugeordnet sind. Die mit dem Metallkern verbundene Absorption verschwindet für höhere Dicken, wodurch eine einzelne Absorptionsbande erhalten wird, bei der die maximale Position vom Dicke/Kern-Größenverhältnis des bimetallischen Partikels abhängt [79, 80].

Samalet al. [81] synthetisierten Core@Shell-Nanopartikel (Au@Ag) durch Kontrolle der Kerngrößen und Hinzufügen unterschiedlich dicker Schalen. Insbesondere stimmt unser UV-vis-Ergebnis für Au@AgNPs mit dem von Samal et al. für 32 nm Goldkerne und eine Silberdicke von mehr als 15 nm, wobei Spektren durch eine einzelne Absorptionsbande (~ 450 nm) gekennzeichnet sind und die Unterdrückung von Au-Oberflächenplasmonen beobachtet wird.

Darüber hinaus ist in Abb. 1a eine Absorption bei 280 nm (blau hervorgehobener Bereich) zu beobachten, die Molekülen aus Rumex hymenosepalus . entspricht Extrakt, der als Reduktionsmittel in unserer Nanopartikel-Synthese verwendet wird. Zusatzdatei 1:Abbildung S1 entspricht Rumex hymenosepalus Absorptionsspektrum der wässrigen Lösung. Es wird eine charakteristische Bande mit der Mitte bei 278 nm beobachtet, die mit den elektronischen Übergängen der aromatischen Ringe verbunden ist, die mit den Carbonylgruppen von Polyphenolverbindungen konjugiert sind [82]. Diese Absorptionsbande in den UV-Vis-Spektren der Nanopartikel weist darauf hin, dass die Endprodukte Extraktmoleküle enthalten, die in ihnen verbleiben, Rivero-Cruz et. al. haben vier Stilbenoide, zwei Flavan-3-ole und drei Anthrachinone aus R. Hymenosepalus [83] und Rodríguez-León et. al. haben eine Kernspinresonanzstudie durchgeführt, um festzustellen, dass Rumex hymenosepalus enthalten wichtige Moleküle wie Stilbenglycosid und Epicatechingallat und Epigallocatechingallat [61]. Diese Moleküle nehmen als Reduktionsmittel an der Nanopartikelsynthese teil. Das Verfahren beinhaltet die Deprotonierung einiger -OH-Gruppen von Phenolringen, um  = CO-Gruppen zu bilden. Polyphenolische Moleküle werden oxidiert und die freigesetzten Elektronen werden auf Ag ⁺ . übertragen und Ag ³⁺ Ionen zu Au ⁰ und Ag ⁰ .

Abbildung 1b zeigt die Zeta-Potentialwerte für AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs bei Konzentrationen von 1, 10, 50 und 100 µg/ml. Nanopartikel werden in Reinstwasser dispergiert und die Messung wurde dreifach bei 25 durchgeführt. Im Allgemeinen weisen Nanopartikel im gesamten Konzentrationsbereich negative Zetapotentialwerte als -30 mV auf und erreichen Werte von -40 mV bei einer Konzentration von 100 µg/ml für AuNPs und Au@AgNPs und -38 mV für AgNPs. Diese stark negativen Zeta-Potentialwerte weisen darauf hin, dass Nanopartikel abstoßende Wechselwirkungen zwischen ihnen erfahren, die ihre Aggregation verhindern und die Langzeitstabilität von Metallkolloiden ermöglichen [84,85,86]. Durch Korrelation der Ergebnisse der UV-Vis-Spektroskopie mit den erhaltenen Zeta-Potentialwerten können wir feststellen, dass die stark negativen Werte auf die Komplexierung polyphenolischer Moleküle des Extrakts auf der Nanopartikeloberfläche zurückzuführen sein können [87].

Für biologische Anwendungen ist es wertvoll, eine Nanopartikelpopulation mit monodispersen Größen zu erhalten [88], daher zeigen Abb. 1c und d die DLS-Werte entsprechend dem mittleren Durchmesser und dem Polydispersitätsindex (PDI) für AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs bei Konzentrationen von 1, 10, 50 und 100 µg/ml. Der mittlere Durchmesser von Au@AgNPs beträgt etwa 250 nm und wird als Funktion der Konzentration konstant gehalten, in ähnlicher Weise für monometallische Nanopartikel mit einem mittleren Durchmesser von etwa 122 nm bzw. 135 nm für AuNPs und AgNPs. Beachten Sie im gleichen Fall, dass PDI-Werte bei etwa 0,3 für monometallische Nanopartikel und 0,2 für Au@AgNPs liegen. Diese Ergebnisse, bei denen die Größen nicht mit der Konzentration variieren, zeigen, dass die verschiedenen Nanopartikelsysteme eine gute Stabilität aufweisen und eine moderate Polydispersität der Größen aufweisen (0,3 ≥ PDI ≥ 0,2).

Die optische Bandlücke des Tauc-Plots wurde berechnet (Zusatzdatei 1:Abbildung S2). Leitungsband von Halbleitermaterialien hat Werte E _g < 3 eV, als Referenzgermanium haben E _g < 0.7 eV und Silizium ist E _g = 1,1 eV [89]. In unserem Fall beträgt die Bandlücke für Au@AgNPs, AuNPs und AgNPs 1,93 eV, 2,03 eV bzw. 2,33 eV. Dies bedeutet, dass diese Materialien wie Halbleiter betrachtet werden, und diese Eigenschaft wurde für die Quanteneinschlusseffekte erhalten, die eine vergrößerte Energielücke erzeugen, sodass Nanomaterialien als Sensoren, Batterien und optoelektronische Geräte verwendet werden können [64].

Um festzustellen, ob organische Verbindungen in Nanopartikeln vorhanden sind, wurden diese Nanomaterialien durch XPS und FTIR charakterisiert. Abbildung 2a zeigt die Untersuchungsspektren des Pflanzenextrakts und der Nanopartikel. Wie zu sehen ist, zeigen alle Nanopartikelsysteme die charakteristischen Signale der Elemente Kohlenstoff (C 1 s, 284,6 eV) und Sauerstoff (O 1 s, 532,2 eV) von Rumex hymenosepalus Extrakt. Dieses Ergebnis bestätigt, dass in den erhaltenen Nanomaterialien organische Moleküle aus dem Extrakt vorhanden sind. Zusätzlich wurden hochauflösende XPS-Spektren aufgenommen, um die Oxidationsstufen von Silber und Gold in den Nanopartikeln zu analysieren (Zusatzdatei 1:Abbildung S3). Für AgNPs (zusätzliche Datei 1:Abbildung S3A) können die Signale bei Bindungsenergien von 373,76 eV und 367,76 eV (∆BE = 6,0 eV) entsprechend der 3d3/2- und 3d5/2-Spektrallinie mit Ag ^{0 . assoziiert werden} (silbermetallic). Für AuNPs (zusätzliche Datei 1:Abbildung S3B) liegt der mit der 4f5/2-Spin-Orbital-Kopplung verbundene Peak bei einer Bindungsenergie von 87,65 eV. Für 4f7/2 liegt der Peak der Spin-Orbital-Kopplung bei 83,98 eV. Das Intensitätsverhältnis (I4f7/2 > I4f5/2), die Lage und der Abstand zwischen den Peaks (ΔBE = 3.67 eV) bestätigen, dass Goldionen (Au ³⁺ ) werden vollständig zu metallischem Gold Au ⁰ . reduziert [90]. Für Au@AgNPs sind hochauflösende XPS-Spektren, die Silber und Gold entsprechen, in Zusatzdatei 1 dargestellt:Abbildung S3C bzw. Abbildung S3-D. Diese Spektren zeigen das gleiche Verhalten wie ihre monometallischen Gegenstücke. Dies weist darauf hin, dass sowohl Silber als auch Gold in der core@shell-Präsentation nullwertig sind.

XPS-Vermessungsspektren (a ) und FTIR (b ) für Rh, Ag, Au und Au@AgNPs

FTIR in Abb. 2e zeigt bei 3296 cm ⁻¹ Hydroxylgruppen, 2974 cm ⁻¹ (C–H)-Bindung des aromatischen Rings, 1689 cm ⁻¹ verbunden mit Carbonylgruppenstreckung (C=O) und 1689–1400 cm ⁻¹ aufgrund einer Carboxylatbindung (C–O) und einer Streckung der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung und 1212 cm ⁻¹ assoziiert mit Phenol-C-O-Streckung, konjugiert mit AuNPs, 1049 cm ⁻¹ C–O-Streckmodus der Catechinestergruppenmoleküle [88,89,90] und 799 cm ⁻¹ die Biegung aus der Ebene im Phenol, C-H-Biegung berichtet bei 964,4 und 829,39 cm ⁻¹ Merkmal von Resveratrol [91] im Rh-Extrakt auf 1031 und 867 cm ⁻¹ . verschoben , und AuNPs, AgNPs und Au@AgNPs sind ebenfalls verschoben, was auf eine Komplexierung von Molekülen Polyphenolen von Rh-Extrakt mit Nanopartikeln hinweist.

Abbildung 3a entspricht einer repräsentativen Hellfeld-STEM-Aufnahme des Au@AgNPs-Systems bei geringer Vergrößerung (100 nm-Skalenbalken). A set of nanoparticles without agglomeration and with mostly quasi-spherical geometry can be seen. The same region is shown in dark field (HAADF) in Fig. 3b, and the core@shell structure can be observed, where can we distinguish Au-core looks more intense than Ag-shell, due to the difference in atomic number. Figure 3c and d corresponds to STEM higher magnification micrograph (scale bare 20 nm) of a nanoparticles group of system core@shell in a bright and dark field, respectively. Can be appreciated with clarity brilliant Au core and Ag shell lightly contrasted. These images show that the thickness of the Ag-shell varies between 3 and 5 nm. Additional file 1:Figure S4 corresponds to an individual images gallery where can be observed uniformity of Ag-shell.

Scanning Transmission Electron Microscopy at low magnification (scale bar 100 nm) of Au@AgNPs in Bright Field (a ) and HAADF (b ). A Small group of Au@AgNPs at higher magnification (scale bar 20 nm) in Bright Field (c ) and HAADF (d )

Figure 4a, c, and e corresponds to micrograph TEM of representative nanoparticles systems AuNPs, AgNPs, and Au@AgNPs, respectively. In all cases, nanoparticles have sphere-like morphology and are shown well separated from each other. This can be explained by the extract molecules onto nanoparticle surfaces, acting as spacers between them. Figure 4b, d, and f shows histograms corresponding to size distribution obtained by TEM and performed with 500 nanoparticles collected from 15 to 20 micrographs for each nanomaterial. The histogram presents Gaussian distribution with a mean size of 24 ± 4 nm (AuNPs), 13 ± 3 nm (AgNPs), and 36 ± 11 nm (Au@AgNPs). The discrepancy in values between DLS and TEM measurements with size distribution graph is due to conditions micro-environmental around the nanoparticles, while DLS shows a diameter for a system that includes metal, hydrated coating, and solvent by comparison in TEM measurements is a dry system where measurement is over metal only, in particular, in DLS the molecules used for complexation of nanoparticles (reducing agents and stabilizers) are dispersants that induce errors in sizing measurement and shifts it results to higher values [91].

TEM and size distribution of AuNPs in (a ) und (b ), AgNPs in (c ) und (d ), and Au@AgNPs in (e ) und (f )

Figure 5 corresponds to the Au@AgNPs HAADF-STEM micrographics. A single nanoparticle is shown in Fig. 5a with a gold nucleus and silver cover perfectly delimited, the atomic number (Z) changes through the interface Au@Ag, intensity variations can be quantified by HAADF-STEM [67].

Au@AgNPs HRTEM (a ). Magnification from (a ) of interface core–shell (b ). FFT plot with Miller index (c ) and integrated image from FFT (Inverse) with interplanar distance (d )

The red square region is amplified to obtain an HRTEM micrography of the shell portion (Fig. 5b), and then to verify the crystalline shell structure, the nanoparticle periphery region was analyzed (discontinued square) with the Digital Micrograph 3.0 software (Gatan). Fast Fourier Transform (FFT) image of the selected area was obtained (Fig. 5c). Using the Inverse Fast Fourier Transform was possible to estimate interplanar distances of 2.3 Å, 2.0 Å, and 1.4 Å in Fig. 5d. These distances can be assigned, respectively, to the crystalline planes (111), (200), and (220) of face-centered cubic (fcc) silver according to Inorganic Crystal Structure Database (ICSD) at the FIZ Karlsruhe–Leibniz Institute for Information Infrastructure, Germany or the electron crystallography software Jems (V 4-5430, JEMS-SAAS, Switzerland) [92]. A similar analysis of crystal structure by HRTEM was carried out for monometallic nanoparticles as illustrated in Additional file 1:Figures S5 (for AuNPs) and S6 (AgNPs). In both cases, crystal structure corresponds to face-centered cubic (fcc).

EDS chemical analysis shows the presence of both metals for a group of bimetallic Au@AgNPs observed by TEM (Fig. 6a) in proportions of the atomic weight percent 77% of Ag (shell) and 23% of Au (cores) (Fig. 6b). In comparison, a single bimetallic (Fig. 6c) Au@AgNPs has proportions around 80% of Ag (shell) and 20% of Au (core) (Fig. 6d). To estimate the gold and silver atomic percentage on core@shell nanoparticles (Au@Ag), a quasi-spherical geometry approximation of nanoparticles morphology was considered. The AuNPs average diameter obtained from TEM size distribution (\(\overline{D}_{{{\text{Au}}}} =24\;{\text{nm}}\)) was used for core volume estimation (V _Au ), and Au@AgNPs average diameter \(\left( {\overline{D}_{{{\text{Au}}@{\text{Ag}}}} =36\,{\text{nm}}} \right)\) for core@shell volume estimation \((V_{{{\text{Au}}@{\text{Ag}}}} )\). So, shell volume is determined as \(V_{{{\text{Ag}}}} =V_{{{\text{Au}}@{\text{Ag}}}} - V_{{{\text{Au}}}}\). Total atomic content of Au and Ag was calculated considering an fcc crystalline structure (4 atoms per unit cell) for booth metals where the Au and Ag lattice parameters are 4.0783 Å and 4.0862 Å, respectively [93]. Atomic content estimation by this procedure is 70% for Ag (Shell) and 30% Au (Core), which differs by 10% concerning the measurement obtained by EDS. Figure 7 shows a theoretical estimation of silver and gold content and how varies as the thickness of the shell increases and the size of the core is kept constant (\(\overline{D}_{{{\text{Au}}}} =24\;{\text{nm}}\)). It is observed that for Au@AgNPs with a diameter greater than 30.2 nm, the atomic content of silver exceeds the content of gold. In Supplementary Material, a detailed description of calculation is carried out to obtain atomic contents percentage. Similar estimations of atomic percentages were carried out considering other Au-core diameters and varying Au@AgNPs diameter (Additional file 1:Figure S7A-B).

TEM and EDS of an Au@AgNPs group (a , b ) with Au 23 and Ag 77% at. and single Au@AgNPs (c , d ) with Au 20 and Ag 80% at

Variations of atomic content percentage versus increase thickness shell, where diameter AuNPs (24 nm) was kept constant

Figure 8 corresponds to XRD patterns for AuNPs and AgNPs as well as bimetallic Au@AgNPs. All the synthesized products have fcc crystalline structure as previously reported in the characterization by electron microscopy. Peaks for Au@AgNPs are located at 2θ diffraction angles of 38.25°, 44.4°, 64.9°, 77.85°, and 81.25°. As can be appreciated in the figure, the AgNPs and AuNPs diffraction peaks are found in the same positions mentioned with a difference of ± 0.5°. This is because Au and Ag have very similar lattice constants, so their diffraction patterns for fcc crystal structure are almost identical [94,95,96]. In this way, the diffraction peaks in Fig. 8 are assigned, respectively, to the crystalline planes (111), (200), (220), (311), and (222) of the gold and silver fcc structure by JCPDS:4-0783 and 4-0784 [97].

X-ray Diffraction AuNPs (pink), AgNPs (brown), and Au@AgNPs (red)

Antimicrobial Activity

Monometallic (AgNPs, AuNPs) and bimetallic (Au@AgNPs) materials were tested at four different concentrations:1, 10, 50, and 100 μg/mL. Selected microorganisms to evaluate antimicrobial activity were yeast Candida albicans , Gram-positive bacteria S.aureus , and Gram-negative bacteria E. coli . Growth kinetics curves in a time-lapse of 24 h are shown in Fig. 9.

The growth curves using AuNPs, AgNPs, and Au@AgNPs like inhibitory treatments on Candida albicans (a –c ), Escherichia coli (d –f ), and Staphylococcus aureus (g –ich )

Candida albicans

AuNPs show no effect on growth kinetics until 10 h (Fig. 9a), varying in a dose-dependent manner the absorbance reached at 24 h. Interestingly, with 50 µg/mL or more, the growth kinetic shows a steep negative slope from 10 h until reaching a 45% reduction at 24 h, which suggests an antifungal effect of these materials. This can be attributed to the ability of gold nanoparticles to interact with relevant proteins present in fungus such as H ⁺ -ATPase, affecting proton pump activity. This atrophying the ability of yeast to incorporate nutrients causing its death [61]. In Fig. 9b and c was observed that AgNPs and Au@AgNPs inhibit the growth of the yeast Candida albicans from 10 µg/mL. The determination of the MIC₅₀ concentration for both materials was estimated from the dose–response curve shown in Additional file 1:Figure S8. MIC₅₀ is defined as the concentration of nanoparticles that produces a 50% decrease in absorbance concerning the control (yeast without treatment). For AgNPs and Au@AgNPs, MIC₅₀ were 2.21 µg/mL and 2.37 µg/mL, respectively.

However, according to the EDS results (Fig. 9b), the silver content in Au@AgNPs is 64.85% mass. Thus, the concentration of silver in Au@AgNPs for MIC₅₀ is 1.53 µg/mL, 30% lower than in the case of AgNPs. Padmos et. al. have demonstrated that silver nanoparticles possess important antibacterial features, but are cytotoxic by mammalian cells this effect has reduced using bimetallic nanoparticles especially using gold in the core of bimetallic nanoparticles [35].

Escherichia coli

In Fig. 9d, AuNPs do not show significant inhibition (< 15%) or affect the growth kinetics of E. coli . For AgNPs (Fig. 9e) at low concentrations, the Lag phase remains unchanged, but there is a marked decrease in growth ratio indicated by the slope decrement. At 50 µg/mL Lag phase lasts up to 16 h and viability reaches a maximum of 20% at 24 h. For 100 µg/mL, an apparent detachment of the growth phase of the microorganism is not observed. In Au@AgNPs (Fig. 9f), the first two concentrations do not show changes in their growth phase, but a phase delay of up to 2 h is observed compared to the control. It is interesting to note that the lag phase lasts up to 21 h for the 50 µg/mL concentration, finally there is no explicit growth behavior for the 100 µg/mL concentration.

Staphylococcus aureus

A comparative analysis of lag phase regrowth occurred after 12 h for Au (Fig. 9g), Ag (Fig. 9h), and Au@AgNPs (Fig. 9i) in the case of S. aureus at 50 µg/mL. For the highest concentration at 100 µg/mL, there is no growth of the bacteria. Additionally, we observe changes in the slope of respect control for Au, Ag, and Au@AgNPs at 1 and 10 µg/mL.

AuNPs interaction with these Gram-positive bacteria could be due to the charged surface that causes an electrostatic interaction, destabilizing membrane structure. Similar results, but with higher NPs concentrations, are reported for AuNPs synthesized using Ananas comosus fruit extract as reducing agent [98] and blue-green alga Spirulina platensis protein [99]. Yanget al. show MIC > 500 µg/mL for S. aureus (CMCC(B)26003), our AuNPs has shown inhibition with 10 times less concentration; in this case, a critical synergy exists with polyphenols molecules on coating and stabilizing the surface of nanoparticle [100]. ROS is generated of less to higher intensity [101] by AuNPs, polyphenols (plant extracts), and AgNPs, so AuNPs in synergy with resveratrol and epigallocatechin gallate (EGCG) promote antibacterial response over S. aureus [102] had the most feasible mechanism in this case. Penders et al. reported 250 and 500 µg/mL of AuNPs-like antibacterial agents over S. aureus increases in bacterial growth lag time and antibacterial effect [61, 98, 99].

We believe that inhibition is caused by AgNPs [103] accumulation and diffusion on bacteria related to NPs surface charges that promote electrostatic interactions [104] with the bacteria's membrane leading to higher penetration and damage. We think this is a similar mechanism described for interactions between E. coli biofilms and AgNps [105].

For Au@AgNPs, the obtained results are comparable to those reported by other workgroups [100, 101]; however, different authors suggest that the inhibition of the growth of the microorganisms is directly related to the thickness of the shell [100, 101]. Core–shell NPs showed low cytotoxicity when tested in NIH-3T3 fibroblasts cells (normal mammalian cells) [35]. A lower proportion of silver in the shell of the Au@AgNPs shows similar results to AgNPs [100], and Au core potentializes antibacterial effect, and minimizes the cytotoxicity.

Curves Growth Analyzed by the Modified Gompertz Model

To know how the growth ratios (µ ) and Lag phase (λ ) are quantitatively modified, the growth curves of microorganisms exposed to different concentrations of nanomaterials (Fig. 10) were adjusted by the Gompertz model (Eq. 2).

Kinetic parameters were obtained by the Gompertz model. Growth Rate µ and Time Lag Phase \(\lambda\) for S. aureus (a , b ) and E. coli (c , d )

In Fig. 10a, it can be seen that all nanomaterials produce a decrease in the replication rate of S. aureus populations when the concentration of nanoparticles increases. This effect results in slightly higher sensitivity for AuNPs. At a concentration of 50 µg/mL, the growth ratio is only 30% concerning control (Additional file 1:Tables S1-S24); at a concentration of 100 µg/mL, all materials inhibit the growth of the S. aureus Population. The behavior of the adaptive phase for S. aureus with the different treatments is shown in Fig. 10b. It is observed that there are no significant differences in the material used, and at 50 µg/mL, the Lag phase has increased by almost 5 times compared to the adaptive phase of S. aureus (Additional file 1:Tables S1-S24). In general, we can establish that the different nanomaterials evaluated in S. aureus reduce the replication rate and postpone the adaptive phase in a dose-dependent manner until its inhibition at 100 µg/mL.

Figure 10c clearly shows that AuNPs do not affect the growth ratio µ of E. coli bacteria. Meanwhile, AgNPs produce a decrease over µ , reaching a minimum value corresponding to 19% to the control (µ for E.coli without treatment) for 50 µg/mL (see Additional file 1:Table S52). In contrast, Au@AgNPs completely inhibit the E. coli growth at 100 µg/mL. Analysis of the behavior of E. coli Lag phase exposed to different materials is shown in Fig. 10d. In this case, unlike Fig. 10b, each material has a characteristic response. Thus, AuNPs do not generate any modification in the adaptive phase of E. coli , while AgNPs and Au@AgNPs have a dose-dependent effect on the Lag phase, the latter material standing out. Thus, we can establish that AuNPs have no appreciable effect on E. coli bacteria, and Au@AgNPs can inhibit replication and, therefore, indefinitely postpone the Lag phase of E. coli . Interestingly, this effect is not achieved for AgNPs even though the net silver content is higher than in Au@AgNPs. This suggests that the core@shell presentation of both metals produces a synergy that favors antimicrobial activity. Feng et. al. have reported an electron compensation phenomena from Au to Ag in core–shell and alloy structures, which derive in enhance the cytotoxicity of nanoparticles but kept it the antibacterial properties, that means, a synergy between Au and Ag are assumed, due to observed differences between the monometallic and bimetallic materials [106], but more research is necessary.

Figure 11 shows the results of the direct count study of colonies of microorganisms exposed to nanomaterials. In general, the behavior of the microorganism populations reproduces the results obtained from the growth kinetics study (Fig. 7a, e, i). For example, in Fig. 11a, the population of microorganisms (represented logarithmically) decreases significantly only at 19 h where AuNPs have killed 92% of C. albicans . Interestingly, for nanoparticles containing silver (Fig. 11b, c) a more pronounced population decline is observed. Au@AgNPs system at 50 µg/mL, almost entirely inhibits S. aureus at 7 h (99.5% of bacteria killed) although microorganism reactivates its growth for later times. MBC determination was not possible to obtain for tested concentrations (Additional file 1:Figure S9-11), according to experimental observation higher concentrations are required to show this effect. However, for C. albicans , AgNPs showed an MBC value of 50 µg/mL (Additional file 1:Table S55).

Effect of nanoparticles over microorganisms growth C. albicans exposed to AuNPs (a ), E. coli exposed to AgNPs (b ), and S. aureus exposed to Au@AgNPs (c ). All microorganisms were exposed at 50 µg/mL nanoparticles concentration

Conclusions

For the first time, the production of gold nanoparticles and core@shell (Au@Ag) is reported using a Rumex hymenosepalus root extract as a reducing agent. To obtain Au@AgNPs is proposed a two-step sequential method that produces particles with moderate polydispersity and homogeneous silver shell. Determination of the growth curves and their parameters obtained through the Gompertz model indicate different effects of the nanomaterials on evaluated microorganisms. Inhibitory effects of AuNPs over S. aureus are reached at a concentration of 5 times less to report for other AuNPs synthesized by different processes. This reveals the importance of the synthesis process followed and the environment on the surface of the nanoparticles. On the other hand, AgNPs and Au@AgNPs produce a great growth of the lag phase (> 12 h). However, bacteria can adapt and initiate their growth at these sub-inhibitory concentrations with the consequent risk of generating resistance to these nanomaterials. This highlights the importance of conducting growth kinetic studies that cover an appropriate period to discard a delayed growth. Interestingly, Gompertz's analysis indicates that Au@AgNPs present a higher effect on the growth kinetic of microorganisms than shown by monometallic nanoparticles, which can be attributed to a synergistic effect of both metals on the core@shell structure. Bactericidal effects are only achieved in C. albicans exposed to AgNPs. More experiments must be carried out on higher concentration ranges of these nanomaterials (> 200 µg/mL) to determine their MBC on the studied microorganisms.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All data generated or analyzed during this study are included in this article and its supplementary information file.

Abkürzungen

AuNPs:

Goldnanopartikel

AgNPs:

Silver nanoparticles

Au@AgNPs:

Gold–silver bimetallic nanoparticles with core@shell structure

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

EDS:

Energiedispersive Röntgenspektroskopie

EGCG:

Epigallocatechin gallate

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarot-Spektrometer

HAADF:

High angle annular dark field images

MBC:

Minimal bactericidal concentration

MIC:

Minimale Hemmkonzentration

Rh:

Rumex hymenosepalus Root extract

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

MINT:

Scanning transmission electron microscope

UV-Vis:

Spectroscopy ultraviolet–visible spectroscopy

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

XRD:

Röntgenbeugung