Schnelle Vor-Ort-Detektion von Rongalit in Lebensmitteln mittels Aptamer-basiertem Sandwich-Lateral-Flow-Strip-Assay

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen schnellen, benutzerfreundlichen Lateral-Flow-Strip-Assay (LFSA), der zwei hochspezifische Aptamere – A09 und B09 – einsetzt, funktionalisiert mit Goldnanopartikeln (AuNPs), um Rongalit, einen gefährlichen Reagenz, das gelegentlich als Lebensmittelzusatzstoff verwendet wird, zu detektieren. Das biotin-markierte A09-Aptamer wird als Capture-Probe auf einer Streptavidin-beschichteten Nitrocellulose-Membran immobilisiert, während das AuNP-konjugierte B09-Aptamer als Signal-Probe dient. Der Assay liefert eine klare rote Linie in der Testzone für Rongalit-Konzentrationen ab 1 µg mL⁻¹, mit bloßem Auge innerhalb von 15 Minuten beobachtbar, was ihn ideal für Vor-Ort-Screening von Agrar- und Lebensmittelprodukten macht.

Hintergrund

Rongalit (Natriumhydroxymethylsulfinat) wird in der industriellen Färberei und Polymerchemie als Reduktionsmittel breit eingesetzt. Seine unbeabsichtigte oder absichtliche Zugabe zu Lebensmitteln hat jedoch ernsthafte Gesundheitsbedenken ausgelöst, einschließlich Formaldehyd-Freisetzung und nachteiliger Effekte, die in China berichtet wurden [5]. Zuverlässige, schnelle Detektionsmethoden sind daher essenziell, um Lebensmittelsicherheit und öffentliche Gesundheit zu schützen.

Aptamere – einzelnsträngige DNA- oder RNA-Moleküle – bieten deutliche Vorteile gegenüber Antikörpern: Sie werden chemisch mit hoher Batch-Konsistenz synthetisiert, zeigen geringe Immunogenität und können für diverse Sensing-Plattformen leicht modifiziert werden [6]. Während elektrochemische und enzymgekoppelte Aptamer-Assays für Rongalit existieren, erfordern diese oft komplexe Instrumentierung und verlängerte Analysezeiten [10]. Im Gegensatz dazu bieten Lateral-Flow-Strip-Assays (LFSAs) eine einschrittige, portable und kostengünstige Lösung, geeignet für Point-of-Care-Testing.

Bislang zielten nur wenige aptamer-basierte chromatographische Strip-Assays auf Rongalit ab [13]. Angesichts wachsender regulatorischer Überwachung und der Prävalenz illegaler Zusatzstoffe entwickelten wir einen Sandwich-formatigen LFSA, der die Spezifität zweier Aptamere und die optische Klarheit von AuNPs nutzt, um schnelle Vor-Ort-Detektion von Rongalit in diversen Lebensmittelmatrizen zu ermöglichen.

Methoden

Materialien und Reagenzien

Rongalit wurde von Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. bezogen. Gold(III)-chlorid-trihydrat (HAuCl₄) und Trinatriumcitrat wurden von Sigma-Aldrich (USA) gekauft. Unterstützende Reagenzien (NaCl, BSA, Saccharose, PEG₂₀₀₀₀, Tween-20) stammten von Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd. Nitrocellulose (NC) Membranen (Pall 90, Pall 170, Millipore 135) wurden von Pall Corporation und Millipore Corporation über Jiening Biotech Company geliefert. Lebensmittelproben – einschließlich Reiskuchen (Ersi), Nudeln, Tofu und Glucono-δ-Lacton-Tofu – wurden auf lokalen Märkten gesammelt.

Aptamer-Präparation via SELEX

Das Protokoll der systematischen Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) wurde befolgt, um Aptamere mit hoher Affinität für Rongalit zu isolieren. Die initiale 82-mer ssDNA-Bibliothek (5′-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N₄₀-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3′) wurde mit Rongalit inkubiert, ungebundene Sequenzen wurden weggewaschen, und gebundene Aptamere wurden per PCR amplifiziert. Nach 12 Anreicherungszyklen – einschließlich Counter-Selektion gegen strukturell verwandte Verbindungen – ergab klonale Sequenzierung zwei hochaffine Aptamere: A09 und B09. Ihre Sequenzen sind unten aufgeführt und wurden von Tsingke Biological Technology synthetisiert.

• Primäres Aptamer A09 (biotin-markiert): 5′-Biotin-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
• Sekundäres Aptamer B09 (biotin-markiert): 5′-Biotin-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3′

Herstellung von AuNPs

Goldnanopartikel (~40 nm Durchmesser) wurden durch Citrat-Reduktion von HAuCl₄ nach Standardprotokoll [18] synthetisiert. Größe und Monodispersität wurden durch UV/Vis-Spektroskopie (λ_max ≈ 530 nm) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt (Abb. 2). Das sekundäre Aptamer B09 wurde an AuNPs konjugiert, indem 1 mL AuNP-Lösung mit 4 µL 100 µM B09 inkubiert wurde, gefolgt von salzinduzierter Präzipitation, Zentrifugation und Resuspension in 1 mL PBS (pH 7,4) mit 5 % BSA, 5 % Saccharose, 1 % PEG₂₀₀₀₀ und 0,05 % Tween-20.

Lateral-Flow-Strip-Design

Die LFSA-Assemblierung (Abb. 3) umfasste ein Probenpad, Gold-Konjugatpad, NC-Membran (Pall 90) und Absorptionspad auf einer Trägerkarte. Das Probenpad wurde mit PBS + 3 % BSA + 0,05 % Tween-20 vorbehandelt und 2 h bei 37 °C getrocknet. Das Gold-Konjugatpad erhielt die B09-AuNPs. Die Testlinie auf der NC-Membran wurde durch Auftropfen von 1 µL Biotin-A09 (10 µM) gemischt mit 10 µL Streptavidin (1 mg mL⁻¹) für 1 h bei 4 °C erzeugt, während die Kontrolllinie aus Streptavidin allein bestand. Nach Trocknung wurde der Streifen in 40-mm-Abschnitte geschnitten und über Nacht bei 37 °C gelagert.

Spezifitätstest

Teststreifen wurden mit 80 µL von 10 µg mL⁻¹ Rongalit, Formalin oder deionisiertem Wasser gefordert. Das Auftreten einer deutlichen roten Testlinie bestätigte Spezifität, während die Kontrolllinie unter allen Bedingungen sichtbar blieb.

Dosisabhängiger Test

Rongalit-Konzentrationen (0, 0,8, 1, 5, 10 µg mL⁻¹) wurden in PBS hergestellt und 80 µL auf das Probenpad aufgebracht. Eine sichtbare rote Linie innerhalb von 15 min definierte die Detektionsgrenze, die bei 1 µg mL⁻¹ beobachtet wurde.

Lebensmittelproben-Test

Fünf verdächtigte Lebensmittelproben wurden extrahiert (1 g + 10 mL Wasser). Nach Filtration wurden 80 µL jedes Extrakts auf dem LFSA getestet. Ergebnisse wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kreuzvalidiert.

Ergebnisse und Diskussion

Affinität und Spezifität der Aptamere

Nicht-lineare Regression von Sättigungskurven (Abb. 4a) ergab Dissociationskonstanten von 61,1 ± 16,4 nM für A09 und 39,8 ± 12,7 nM für B09, was starke, spezifische Bindung an Rongalit bestätigt (Abb. 4b).

Assay-Performance

Der Sandwich-LFSA erzeugt eine rote Testlinie, wenn AuNP-B09 Rongalit bindet und von immobilisiertem A09 captured wird. Die Kontrolllinie, gebildet durch Streptavidin-Bindung überschüssiger AuNP-B09, bestätigt Assay-Integrität (Abb. 5). Spezifitätstests gegen Formalin und deionisiertes Wasser ergaben keine Falsch-Positiv-Ergebnisse, und die Detektionsgrenze wurde bei 1 µg mL⁻¹ etabliert – weit unter den in kontaminierten Lebensmittelproben berichteten Werten [5].

Lebensmittelproben-Analyse bestätigte das Vorhandensein von Rongalit in mehreren Produkten, corroboriert durch HPLC (Tabelle 1). Die Robustheit des Assays wurde dem optimierten Puffer (PBS pH 7,4 + 5 % BSA + 5 % Saccharose + 1 % PEG₂₀₀₀₀ + 0,05 % Tween-20) und der Auswahl der Pall 90 NC-Membran zugeschrieben, die optimalen Fluss und minimale unspezifische Bindung bot.

Im Vergleich zu chromatographischen Methoden (GC, HPLC) bietet der LFSA vergleichbare Sensitivität, eliminiert jedoch den Bedarf an anspruchsvoller Instrumentierung und verlängerten Verarbeitungszeiten. Seine niedrigen Kosten, einschrittige Bedienung und visueller Readout machen ihn ideal für Vor-Ort-Lebensmittelsicherheitsinspektionen und regulatorische Compliance.

Schlussfolgerungen

Wir haben einen zuverlässigen, kosteneffizienten Sandwich-formatigen LFSA entwickelt, der Rongalit in Lebensmittelmatrizen mit einer Grenze von 1 µg mL⁻¹ detektiert. Der Assay nutzt die Spezifität dualer Aptamere und die optische Klarheit von AuNPs, was sofortiges Vor-Ort-Screening ermöglicht. Diese Plattform kann eine entscheidende Rolle bei der Minderung lebensmittelbedingter Rongalit-Kontamination und dem Schutz der öffentlichen Gesundheit spielen.

Abkürzungen

AuNPs:

Goldnanopartikel

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

LFIA:

Lateral Flow Immunoassay

LFSA:

Lateral Flow Strip Assay

NC-Membran:

Nitrocellulose-Membran

POCT:

Point-of-Care Testing

SELEX:

Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie