Schneller Nachweis von Rongalit mit einem Sandwich-Lateral-Flow-Strip-Assay mit einem Paar Aptamere

Hintergrund

Rongalit (Natriumhydroxymethylsulfinat) ist ein industrielles Reagenz, das typischerweise für die Küpenfärbung [1] oder für die Emulsionspolymerisation [2] als Reduktionsmittel verwendet wird. Rongalit kann auch in Wasseraufbereitern (z. B. Reduzierung von Chlor und Chloramin) [3], in kommerziellen kosmetischen Haarfärbemitteln trotz der Bildung von Formaldehyd (einem bekannten Karzinogen für den Menschen) oder sogar in pharmazeutischen Formulierungen als Antioxidans gefunden werden [4] . Diese Verbindung verursachte auch nachteilige Auswirkungen in China, nachdem sie in mehrere Agrarnahrungsmittelprodukte aufgenommen wurde [5]. Dieser entwickelte Assay bietet eine zuverlässige Rongalit-Nachweisplattform vor Ort und kann zur Lösung von Problemen der Ernährungssicherheit beitragen.

Aptamere, einzelsträngige Oligonukleotide und Oligopeptide gelten aufgrund ihrer hohen Spezifität, einfachen und reproduzierbaren Herstellung, einfachen Modifikation und geringeren Immunogenität als perfekte Alternativen zu Antikörpern [6]. Jüngste Studien haben das starke Potenzial von Aptameren als Biosonden für das Wirkstoff-Targeting, die Biosensorik und die Entwicklung neuer Wirkstoffe aufgezeigt [7]. Elektrochemische [8] und Enzyme-linked Aptamer [9] Assays mit einigen Aptameren wurden als vielversprechendes Werkzeug für den Rongalit-Nachweis entwickelt. Diese Methoden leiden jedoch typischerweise unter langen Analysezeiten und komplexen Verfahren, die ihre Anwendung erschweren [10].

Der Lateral Flow Strip Assay (LFSA, auch Strip Test genannt) wurde erstmals 1956 als logische Erweiterung der Latex-Agglutinations-Testtechnologie entwickelt [11]. Als einstufiger Ansatz hat LFSA aufgrund seines benutzerfreundlichen Formats, der geringen Produktionskosten, der zeitsparenden Verwendung und der Langzeitstabilität unter einem breiten Spektrum von Bedingungen große Aufmerksamkeit für den Vor-Ort-Nachweis mehrerer Analyten auf sich gezogen [ 12].Trotz dieser positiven Eigenschaften wurden die praktischen Anwendungen der Aptamer-basierten Lateral-Flow-Streifenplattform noch nicht kommerzialisiert, und es wurden nur wenige Aptamer-basierte chromatographische Streifenassays zum Nachweis von Rongalit in Lebensmittelproben berichtet [13] . Angesichts des häufigen Auftretens von Angelegenheiten der Lebensmittelsicherheit und der häufigen Verwendung von Rongalit als illegaler Lebensmittelzusatzstoff ist es notwendig, ein Aptamer-basiertes LFSA für den Vor-Ort- und schnellen Nachweis dieser Verbindung in Lebensmittelproben zu entwickeln.

Zwei Arten von Lateral-Flow-Strip-Aptamer-Sensoren können entwickelt werden, nämlich kompetitive und Sandwich-Typ [14]. Die Sandwich-Plattform ist sehr gut geeignet, wenn für ein bestimmtes Zielmolekül mehrere Aptamere verfügbar sind. In der vorliegenden Arbeit wurden spezifische Goldnanopartikel (AuNPs), die als die vielversprechendsten Nanomaterialien für die Entwicklung von Aptamersensoren bekannt sind (z. Inzwischen wurden Aptamer-Konjugationsprozesse an AuNPs über Chemisorption oder physikalische Adsorption demonstriert, was eine einfache, aber empfindliche Plattform für den Aptamer-Sensor darstellt, der später in dieser Studie als Signalsonde verwendet wurde [15]. Aufgrund der Vorteile, die sich aus der Verwendung von AuNPs und Aptameren ergeben, wurde ein sichtbarer, schneller, einstufiger Lateral-Flow-Assay vor Ort für die Analyse von Rongalit in Lebensmittelproben entwickelt. Um diesen Aptamersensor vom Sandwich-Typ zu erreichen, wurden zwei Aptamersonden (A09/B09) verwendet, die als Erfassungs- und Signalsonden dienen. Die positiven Ergebnisse dieses Biosensors wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) weiter bestätigt.

Methoden

Materialien und Reagenzien

Rongalit wurde von Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. bereitgestellt. HAuCl₄ (Trinatriumcitrat-Dehydrat) wurde von Sigma Aldrich (USA) bezogen. NaCl, BSA, Saccharose, Formalin, PEG20000 und Tween20 stammten von Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd.

NC-Membranen (d. h. Pall 90, Pall 170 und Millipore 135) sind getrennt von Pall Corporation und Millipore Corporation und werden von Jiening Biotech Company bezogen

Lebensmittelproben, Ersi (dünn geschnittene quadratische Reiskuchenstränge in China), Nudeln, Tofu und Glucono-δ-lacton-Tofu wurden auf den nahe gelegenen Märkten gekauft.

Aptamer-Herstellung durch systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX)

Der SELEX-Prozess umfasst die folgenden Schritte (Abb. 1):(i) Inkubation des Ziels mit einer zufälligen DNA-Bibliothek, (ii) Isolierung der an das Ziel gebundenen DNA, (iii) DNA-Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) , (iv) Präparation einzelsträngiger DNAs für die Bibliothek der nächsten Runde, (v) Wiederholung der Schritte i–iv für 5–15 Zyklen, einschließlich Intervallzähler-Screening mit Nicht-Zielsubstanzen, um die unspezifischen ssDNAs zu entfernen, und (vi) abschließende Klonierung und Sequenzierung der angereicherten Bibliothek [16].

Typischer Aptamerauswahlprozess (SELEX)

Die Aptamere wurden nach den zuvor beschriebenen Schritten gescreent. Kurz gesagt wurde eine anfängliche ssDNA-Aptamer-Bibliothek, bestehend aus 82-mer-Nukleotiden mit einer zentralen, auf 40 basierenden langen, randomisierten Sequenz jedes Aptamers synthetisiert (Tsingke Biological Technology). Die randomisierte Sequenz des ssDNA-Aptamer-Pools ist 5'-GACATATTCAGTTCTGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3', wobei N ein randomisiertes Nukleotid von entweder A, G, C oder T bedeutet.

In dieser Untersuchung wurden Primer 1 (5′-GACATATTCAGTCTGACAGC-3′) und Primer 2 (5′-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3′) zur Amplifikation der Bibliothek verwendet.

Um Aptamere zu screenen, die spezifisch an Rongalit binden, wurde die synthetisierte zufällige ssDNA-Bibliothek mit Rongalit auf die Platte gegeben. Als nächstes wurde die ungebundene ssDNA durch Waschen entfernt; die gebundene ssDNA wurde gewonnen und durch PCR amplifiziert. Die Bindungsaffinität der Aptamere nahm mit zunehmender Selektionsrunde allmählich zu.

Die Spezifität und K _d der Wert einzelner Aptamere wurde ähnlich den Methoden von Tang bestimmt [17].

Die in dieser Arbeit verwendeten Aptamersequenzen waren wie folgt:

• Primäres Aptamer A09,

  5′-Biotin-GACATATTCAGTTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC

• Sekundäres Aptamer B09,

  5′-Biotin-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3′

Diese Aptamersequenzen (A09 und B09) wurden synthetisiert und von Tsingke Biological Technology bezogen.

Produktion von AuNPs

AuNPs wurden durch die Citratreduktion von HAuCl₄ . synthetisiert Protokoll [18]. Die monodisperse Produktion von AuNPs mit angemessener Größe wurde durch UV/Vis-Spektrophotometrie (Thermo Scientific™ Evolution 60S) bestätigt. Kugelförmige (ca. 40 nm Durchmesser) und tiefrot gefärbte AuNPs wurden synthetisiert. Die Größe dieser unmodifizierten AuNPs wurde unter Verwendung des Beer-Lambert-Gesetzes bei 530 ± 2 nm und Transmissionselektronenmikroskopie (Abb. 2) (JEOL Ltd. JEM-1011) geschätzt.

Das mit AuNPs konjugierte sekundäre Aptamer B09 wurde nach den folgenden Protokollen hergestellt [18]. Kurz gesagt, 1 ml der so hergestellten AuNPs wurde mit 4 μL der sekundären Aptamer-B09-Lösung (100 μM) inkubiert und die Mischung wurde bei Raumtemperatur mindestens 16 h lang in einer Schublade aufbewahrt. Anschließend wurde unter leichtem Händeschütteln ein Mol NaCl tropfenweise in das Fläschchen gegeben, bis eine Endkonzentration von 0,1 M in der Mischung erreicht war. Die Durchstechflaschen wurden vor der Verwendung mindestens 1 Tag in einer Schublade aufbewahrt. Die unkonjugierten thiolierten Aptamere wurden durch Zentrifugation bei 12.000 g . entfernt für 20 min bei 4 °C. Die Röhrchen wurden aus der Zentrifuge entfernt und eine klare überstehende Flüssigkeit wurde erhalten, wobei sich die Nanopartikel am Boden der Röhrchen befanden. Im Falle eines roten Überstands wurde die Mischung für weitere 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und die Nanopartikel wurden schließlich in 1 ml 0,01 M PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) (pH = 7,4) mit 5 % BSA, 5 % Saccharose, 1 % PEG20000 und 0,05 % Tween20 dispergiert.

Lateral Flow Strip Design

Die LFSA wurde wie in Abb. 3 gezeigt entworfen. Kurz gesagt enthielt der Streifen mehrere überlappende Pads auf einer Trägerkartenprobe (GF-08, 20 × 300 mm), Goldkonjugat, Nitrozellulose (NC)-Membran (Pall 90, 60 × 300 .). mm) und Absorptionspads (H-5076, 20 × 300 mm). Die Länge der Überlappung betrug 2 mm. Das Probenkissen wurde in einen 0,01 M PBS-Puffer (pH = 7,4) mit 3% BSA und 0,05% Tween20 getaucht und anschließend 2 h bei 37 °C getrocknet. Das Gold-Konjugat-Pad wurde mit einem 0,01 M PBS-Puffer (pH = 7,4) behandelt, der 5 % BSA, 5 % Saccharose, 1 % PEG20000 und 0,05 % Tween20 enthielt. Die funktionellen AuNPs wurden anschließend mit einem Sprayer (XYZ3010-1429) auf das behandelte Goldkonjugat-Pad gesprüht. Ein Mikroliter Biotin-A09-Aptamer (10 μM) wurde mit 10 μL Streptavidin (1 mg/ml) 1 h bei 4 °C inkubiert. Das Aptamer-konjugierte Streptavidin wurde anschließend mit einem Dispenser (XYZ3010-1429) auf einer NC-Membran ausgekleidet, um die Testlinie zu bilden, während Streptavidin (1 mg/ml) mit dem Instrument ausgekleidet wurde, um die Kontrolllinie zu bilden. Danach wurde die behandelte NC-Membran zur Immobilisierung 2 h bei 37 °C getrocknet. Schließlich wurden die Streifen zusammengebaut und das LFSA in 40 mm breite Streifen geschnitten und bis zur Verwendung über Nacht bei 37 °C gelagert.

TEM-Bilder von AuNPs (40 nm)

Typische Konfiguration von Lateral-Flow-Teststreifen (Sandwich-Format)

Spezifitätstest

Achtzig Mikroliter einer Rongalit-Lösung (10 μg/ml) wurden dem Probenkissen der zusammengesetzten Streifen hinzugefügt. Dieser Schritt wurde für die anderen Gegenziele einschließlich Formalin und deionisiertes Wasser für die Spezifitätstests wiederholt. Als Kontrolle wurde entionisiertes Wasser verwendet. Im erwarteten Linienbereich sollte eine rote Linie erscheinen. Jede Kontrolle wurde zweimal wiederholt.

Dosisabhängiger Test

Ähnlich dem spezifischen Test wurden Rongalitlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,8, 1, 5 und 10 μg/ml) hergestellt. Achtzig Mikroliter der Rongalit-Lösung wurden dem Probenkissen der zusammengesetzten Streifen zugesetzt. Als Kriterium zur Bestimmung der Nachweisgrenze wurde die Beobachtung der Rotfärbung innerhalb von 15 min auf der Testlinie angesehen.

Lebensmittelprobentest

Um die Praktikabilität und Genauigkeit dieses neuartigen LFSA zu bewerten, wurden fünf Lebensmittelproben mit möglicherweise zugesetztem Rongalit von einem Markt rund um das Institut gesammelt. Ein Gramm Probe wurde mit 10 ml Wasser extrahiert. Dann wurden 80 μl jeder Probenextraktlösung zum Nachweis von Rongalit auf den Lateral-Flow-Streifen auf Aptamerbasis aufgetragen. Diese Ergebnisse wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestätigt.

Ergebnisse und Diskussion

Die Spezifitäts- und Dissoziationskonstanten (K _d ) der ausgewählten Aptamere

Unterschiedliche Konzentrationen von A09- und B09-Aptameren wurden mit einer festen Menge Rongalit inkubiert. Sättigungskurven, in denen die gemessene Absorption bei 450 nm gegen die entsprechende Eingangsaptamerkonzentration aufgetragen ist, sind in Abb. 4a gezeigt. Für K . wurde eine nichtlineare Regressionsanalyse verwendet _d Wertberechnung. Die K _d der Wert von A09 beträgt 61,12 ± 16,36 nM und der Wert von B09 beträgt 39,81 ± 12,73 nM. Wie in Abb. 4b gezeigt, ist die Bindungsaffinität zwischen A09/B09 und Rongalit hoch.

a Messung des K _d Wert von A09 und B09. GraphPad Prism wurde verwendet, um eine nichtlineare Aushärtungsanpassungsanalyse für K . durchzuführen _d Berechnung. b Die spezifische Bindungsaffinität zwischen A09/B09 und Rongalit

Spezifität und Empfindlichkeit

Das mit Biotin markierte Aptamer A09 (einfangendes Aptamer) wurde an Streptavidin gebunden, das anfänglich auf der Membran ausgekleidet war. Diese Linie wurde als Testlinie ausgewählt. Inzwischen wurde Streptavidin auf die Kontrollzone ausgerichtet.

Wie in Abb. 5a gezeigt, wird das auf der Testzone ausgekleidete primäre Aptamer, sobald das sekundäre AuNP-Aptamer (als Signalsonde) an Rongalit gebunden ist, an eine andere Stelle dieser Verbindung gebunden. Im Falle einer positiven Analyse sollte auf der Testzone eine von AuNPs erzeugte rote Linie erscheinen. In Bezug auf das Kontrollexperiment fängt das Streptavidin auf der Kontrollzone das verbleibende AuNP-markierte B09-Aptamer ein, das mit Biotin modifiziert wurde, wodurch jederzeit ein Kontrollsignal bereitgestellt wird.

Spezifität (a ) und Sensibilität (b ) von LFSA für Rongalit. a 80 μl einer Rongalit-Lösung (10 μg/ml) wurden dem Probenkissen der zusammengesetzten Streifen hinzugefügt. Dieser Schritt wurde für die anderen Gegenziele einschließlich Formalin für die Spezifitätstests wiederholt. Als Kontrolle wurde entionisiertes Wasser verwendet. b Rongalit-Standardlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (0, 0,8, 1, 5 und 10 μg/ml) wurden hergestellt. 80 μL der Standardlösungen wurden auf das Probenpad pipettiert, und die Beobachtung der roten Farbe innerhalb von 15 min auf der Testlinie wurde als Kriterium für die Bestimmung der Nachweisgrenze angesehen

Wie in Abb. 5b gezeigt, zeigt das Ergebnis, dass Rongalit bei Konzentrationen von nur 1 μg/ml mit bloßem Auge leicht nachgewiesen werden konnte.

Diese Lebensmittelproben wurden über das hier entwickelte LFSA analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Interessanterweise wurde die Kontrolllinie nicht nach jedem LFSA beibehalten. Hohe Rongalit- oder Salzionenkonzentrationen können zu einem schwachen Signal in der Kontrollzone führen. Daher beeinflusst die Zusammensetzung des Resuspendierungspuffers entscheidend die Leistung des Streifentests. Gemäß den erhaltenen Ergebnissen wurde als Resuspendierungspuffer ein 0,01 M PBS-Puffer (pH = 7,4) mit 5 % BSA, 5 % Saccharose, 1 % PEG20000 und 0,05 % Tween20 ausgewählt.

Die Zusammensetzung der verschiedenen Pads hat einen dramatischen Einfluss auf die Leistung des Streifenassays. Unter den verschiedenen Alternativen hat sich die NC-Membran als der am besten geeignete feste Träger für die Adsorption und Hybridisierung von Nukleinsäuren erwiesen. NC wird häufig als Signalpad im Lateral Flow Strip verwendet, da es ausreichende Flussraten bietet [19]. NC-Membranen unterschiedlicher Größe mit entsprechenden Flussraten können für diese Assays geeignet sein. In dieser Arbeit wurden drei häufig verwendete NC-Membranen (d. h. pall 90, pall 170 und Millipore 135), die von Jiening Biotech Company bezogen wurden, getestet. Pall 90 wurde hier als die am besten geeignete NC-Membran für LFSA ausgewählt.

Für den Rongalit-Nachweis wurden zahlreiche Technologien entwickelt. Bei der Vor-Ort-Detektion wurden jedoch nur wenige weit verbreitet eingesetzt, vor allem wegen der damit verbundenen hohen Kosten und komplexen Protokolle, wie GC und HPLC, die für den täglichen Bediener mühsam sind. LFSA, ein einstufiger Ansatz, hat sich aufgrund seines benutzerfreundlichen Formats, der geringen Produktionskosten und des Komforts zu einer perfekten Plattform entwickelt. Trotz der schlechteren Empfindlichkeit als Chromatographiestreifen wäre LFSA eine vielversprechende Methode im Bereich Point-of-Care-Tests.

LFSA hat immer noch eine geringere Empfindlichkeit als Chromatographiestreifen. Darüber hinaus zeigen LFSA-Technologien, die Aptamere verwenden, einige inhärente Vorteile gegenüber Lateral-Flow-Immunoassays (LFIA, antikörperbasierte Methode) und dies ungeachtet der jüngsten Fortschritte auf diesem Gebiet. Obwohl ähnliche Assays auch unter Verwendung von Antikörpern entwickelt werden können, bieten Aptamersensoren Stabilitäts- und Kostenvorteile. Außerdem sind Aptamere flexibler für die Entwicklung verschiedener Formate, da sie aus Nukleinsäuren mit intra- und intermolekularer Hybridisierung, enzymatischer Replikation und einfachen Sequenzbestimmungseigenschaften bestehen. Aufgrund dieser positiven Eigenschaften wurden zahlreiche Aptamersensoren für Multiplex-Assays entwickelt.

Darüber hinaus kann LFSA verschiedene Markierungen verwenden, einschließlich kürzlich entwickelter Quantenpunkte [20] und hochkonvertierender Phosphore [21]. Unter allen bekannten Markern sind AuNPs jedoch die am häufigsten verwendeten für LFSA. Die bemerkenswerteste Eigenschaft der Au-Markierung liegt in ihrer Fähigkeit, die NC-Membran zu färben, was eine direkte Beobachtung mit bloßem Auge ermöglicht. Diese Eigenschaft unterscheidet LFSA von aktuellen teuren Labormethoden und macht diese Technologie zu einem bequemen Analysewerkzeug.

Point-of-Care-Tests (POCT) wurden als ideales Werkzeug vorgeschlagen, um die Kosten dieser Assays zu senken. Für POCT wird derzeit die LFSA-Biosensorplattform, der bekannteste Assay, eingesetzt [22]. Die LFIA-Biosensor-Plattform umfasst hauptsächlich Sandwich- und kompetitive (oder Hemm-) Formate. Im Allgemeinen sind die Assays im Sandwich-Format für den Fall von Zielmolekülen konzipiert, die mindestens zwei Epitope aufweisen. Ein duales Aptamer, das an zwei verschiedenen Bindungsstellen an Rongalit gebunden ist, wurde hier entwickelt, das Einfang- und Signalsonden enthält, die im Sandwich-Format angeordnet sind.

Schlussfolgerungen

Für den Vor-Ort-Schnellnachweis von Rongalit wurde erfolgreich ein einfaches und kostengünstiges LFSA im Sandwich-Format entwickelt. Der Assay umfasste einige Aptamere, die mit AuNPs konjugiert waren. Nach Optimierung einiger Schlüsselparameter lieferte der entwickelte Assay eine hohe Sensitivität mit Nachweisgrenzen von nur 1 μg/ml. Diese Technologie könnte leicht verwendet werden, um die Kontamination von Lebensmittelproben mit Rongalit zu untersuchen. Dieser Assay bietet eine zuverlässige Rongalit-Nachweisplattform vor Ort und kann zur Lösung von Problemen der Ernährungssicherheit beitragen.

Abkürzungen

AuNPs:

Goldnanopartikel

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

LFIA:

Lateral Flow Immunoassay

LFSA:

Lateral Flow Strip-Assay

NC-Membran:

Nitrozellulosemembran

POCT:

Point-of-Care-Tests

SELEX:

Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie