Schneller, kostengünstiger mikrofluidischer elektrochemischer Sensor direkt auf Screen-Printed-Elektroden für ultrasensitiven PSA-Nachweis

Zusammenfassung

Wir präsentieren die erste Demonstration einer mikrofluidischen Plattform, die direkt auf einem kommerziell erhältlichen Screen-Printed-Elektroden (SPE) mittels eines einfachen, schnellen und kostengünstigen Verfahrens gefertigt wird. Das Gerät – bezeichnet als CASPE-MFD (Commercially Available SPE-Based Microfluidic Device) – kombiniert Polydimethylsiloxan (PDMS)-Mikrokanäle mit einem glasbeschichteten SPE-Substrat. In humanem Serum erreicht der CASPE-MFD eine Nachweisgrenze (LOD) von 0,84 pg/mL (25,8 fM) für prostataspezifisches Antigen (PSA) und zeigt ausgezeichnete Linearität über einen 0,001–10 ng/mL Bereich. Diese Plattform bietet eine skalierbare, kostengünstige Lösung für Point-of-Care-Diagnostik, Umweltüberwachung und Lebensmittelsicherheitsanalysen.

Hintergrund

Mikrofluidische Systeme manipulieren Volumen von Nanoliter bis Pikoliter innerhalb mikroskaliger Kanäle und ermöglichen hochdurchsatz, reagentieneffiziente Analysen. Ihre Integration mit elektrochemischen Sensoren verleiht bemerkenswerte Sensitivität, schnelle Antwort und minimale Instrumentierungsanforderungen, was sie ideal für On-site-Biomedizindiagnostik macht.

Elektrochemische Auslesungen sind inhärent kompatibel mit Mikrofluidik, eliminieren voluminöse Optik und vereinfachen die Fertigung. Die Synergie von Mikrofluidik und SPEs – bereits weit verbreitet in klinischen Point-of-Care-Geräten – verspricht eine vollintegrierte, disposable Sensorplattform.

In dieser Arbeit fertigen wir CASPE-MFDs durch Verkleben von PDMS-Mikrokanälen auf ein glasbeschichtetes SPE via Sauerstoffplasmasaktivierung. Das Gerät wird für PSA-Quantifizierung in Phosphatpuffer und humanem Serum mittels Chronoamperometrie (CA) und Quadratwellenvoltammetrie (SWV) getestet.

a Fertigung von PDMS-Mikrokanälen via SU-8-Photolithographie. b Montage des CASPE-MFD: PDMS-Kanäle verklebt mit einem glasbeschichteten SPE, das zwei Gold-Arbeits-/Gegenelektroden und eine Silber-Pseudoreferenzelektrode enthält. c Fotografie des fertigen CASPE-MFD.

Materialien und Methoden

Reagenzien und Materialien

PSA, HRP-konjugiertes Anti-PSA, biotinyliertes Anti-PSA, Streptavidin-Magnetperlen, BSA, Hydrochinon, Tween-20, H₂O₂ und Ferrocencarbonsäure wurden von kommerziellen Lieferanten (Petsec Energy Ltd., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich) bezogen. PDMS-Prepräpolymer und Härter wurden von Dow Corning bezogen. Alle Puffer wurden mit ultrareinem Wasser (Millipore Milli-Q) hergestellt.

Instrumentierung

Fluoreszenzbildgebung: Olympus U-CMAD3. Plasmareinigung: Harrick PDC-32G. Elektrochemische Messungen: CHI 760B Potentiostat (Drei-Elektroden-Aufbau: Gold Arbeits-/Gegenelektrode, Silber-Pseudoreferenz).

Mikrofluidischer Chip-Fertigung

PDMS-Kanäle wurden auf einem Siliziumwafer mit SU-8 2075 beschichtet, UV-belichtet und ausgehärtet. Das SPE-Substrat wurde mit einer dünnen Glasschicht via Sol-Gel-Gemisch (TEOS:MTES:Ethanol:Wasser = 1:1:1:1) beschichtet und über Nacht bei 65 °C ausgehärtet. Beide PDMS- und SPE-Oberflächen wurden durch 30 s O₂-Plasma aktiviert vor Ausrichtung und Verkleben, wodurch ein hermetischer Dichtschluss entstand.

Chronoamperometrische Experimente

Messungen wurden in 1× pH 7,4 PBS mit 4,5 mM Hydrochinon und 0,1 mM H₂O₂ durchgeführt. Der CASPE-MFD wurde zunächst durch Zyklieren zwischen 0,5–1,5 V in 0,5 M H₂SO₄ aktiviert. Dann wurden 50 µL magnetperlen-konjugiertes Anti-PSA-Antikörper bei 50 µL min⁻¹ eingeführt, gefolgt von Blockierung, PSA-Inkubation, HRP-Anti-PSA-Zugabe und schließlich der elektroaktiven Lösung. Chronoamperometrie wurde bei –2,0 mV versus der Silber-Pseudoreferenz durchgeführt, Aufzeichnung des stationären Stroms nach 30 s.

Ergebnisse und Diskussion

Gerätecharakterisierung

Fluoreszente Mikroperlen, in den CASPE-MFD injiziert, füllten die Kanäle gleichmäßig ohne Blasen, was robuste fluidische Leistung bei Flussraten bis 100 µL min⁻¹ bestätigt (Abbildung 2).

a Fluoreszente Mikroperlen-Infiltration auf dem SPE. b Hellfeldbild des gefüllten CASPE-MFD. c Vergrößerte Ansicht der Fluoreszenzverteilung.

Zyklovoltammetrie mit 0,5 mM Ferrocencarbonsäure bestätigte reversiblen Elektronentransfer (E_pa–E_pc = 62 mV) und diffusionskontrollierte Kinetik (i_pa ∝ √v). Die Ströme im CASPE-MFD entsprachen denen in Volumenlösung, was anzeigt, dass die mikrofluidische Architektur die Sensitivität nicht beeinträchtigt (Abbildung 3).

a CVs bei Scanraten 10–350 mV s⁻¹. b Kalibrierplots von i_pa und i_pc versus √Scanrate.

PSA-Nachweisleistung

Chronoamperometrische Kurven (Abbildung 5a) zeigen einen monotonen Stromanstieg mit PSA-Konzentration (0–10 ng mL⁻¹). Der lineare Bereich (0,001–10 ng mL⁻¹) ergibt eine Regression von I (µA) = 14,87 + 3,927 × log C_PSA (R² = 0,9985). Die LOD von 0,84 pg mL⁻¹ übertrifft kommerzielle Assays (0,1 ng mL⁻¹) um >100-fach und übertrifft vergleichbare mikrofluidische Sensoren.

Quadratwellenvoltammetrie (SWV) lieferte parallele Ergebnisse, was die Robustheit der elektrochemischen Auslesung bestätigt (Abbildung 5c).

a Chronoamperometrie für 0–10 ng mL⁻¹. b Lineare Plots in Puffer (blau) und humanem Serum (rot). c SWV-Kurven. d Linearer Fit für SWV (R² = 0,9884).

Selektivität und Echtprobenanalyse

In humanem Serum behielt der CASPE-MFD die gleiche Linearität und LOD bei, was Kompatibilität mit komplexen biologischen Matrizen demonstriert. Keine signifikante Interferenz wurde von potenziellen Matrixkomponenten beobachtet, was die Selektivität des Assays unterstreicht.

Schlussfolgerungen

Der CASPE-MFD kombiniert kostengünstige Fertigung, mikrofluidische Kontrolle und SPE-Elektrochemie, um ultrasensitiven PSA-Nachweis (<0,85 pg mL⁻¹) in tragbarem Format zu liefern. Seine einfache Montage, Reproduzierbarkeit und Potenzial für Multiplexing machen ihn zu einer vielversprechenden Plattform für Point-of-Care-Diagnostik von Krebsbiomarkern, Elektrolyten und Nukleinsäuren.

Abkürzungen

MFDs

Mikrofluidische Geräte (Microfluidic devices)

CASPE-MFDs

Screen-Printed-Elektroden-basierte mikrofluidische Geräte (Screen-printed electrode-based microfluidic devices)

PDMS

Polydimethylsiloxan (Polydimethylsiloxane)

PSA

Prostataspezifisches Antigen (Prostate-specific antigen)

CA

Chronoamperometrie (Chronoamperometry)

SWV

Quadratwellenvoltammetrie (Square wave voltammetry)

LOD

Nachweisgrenze (Limit of detection)

HRP

Horseradish Peroxidase

TEOS

Tetraethoxy silane

MTES

Methyltriethoxysilane

BNP

B-Typ natriuretisches Peptid (B-type natriuretic peptide)