Ultraempfindlicher elektrochemischer DNA-Biosensor zum Nachweis von Vibrio cholerae mit Polystyrol-Acrylsäure-Nanopartikeln und Gold-Nanopartikeln

Zusammenfassung

Wir berichten über einen hochsensitiven elektrochemischen DNA-Biosensor zum Nachweis von Vibrio cholerae DNA. Der Sensor nutzt Polystyrol-co-Acrylsäure (PSA) Latex-Nanosphären, beladen mit Goldnanopartikeln (AuNPs) als DNA-Trägermatrix. Differentialpulsvoltammetrie (DPV) mit einem Anthrachinon-basierten Oligonukleotid-Label misst das Hybridisierungssignal. Die AuNPs verstärken den faradayschen Strom signifikant, was eine reproduzierbare, lineare Antwort von 1,0×10⁻²¹ bis 1,0×10⁻⁸ M (RSD = 4,5 %, n = 5) und eine Detektionsgrenze (LOD) von 1,0×10⁻²¹ M (R² = 0,99) liefert. Rückgewinnung in gespikten Proben lag zwischen 91 % und 109 % (n = 3). Der Sensor behält 95 % seiner ursprünglichen Antwort nach 58 Tagen und kann sechsmal wiederverwendet werden mit einem RSD von 5 % (n = 5).

Hintergrund

Vibrio cholerae bleibt eine globale Gesundheitsbedrohung, besonders in ressourcenarmen Settings. Traditionelle kultur-basierte Methoden sind langsam und arbeitsintensiv, während PCR kostspielige Ausrüstung und geschultes Personal erfordert. Schnelle, inexpensive und hochsensitive Diagnostik ist essenziell für zeitnahe Ausbruchsbekämpfung. Elektrochemische DNA-Biosensoren bieten hohe Sensitivität, Spezifität und Potential für Miniaturisierung, was sie ideal für Point-of-Care-Testing macht.

Methoden

Chemische Reagenzien

Polystyrol, Acrylsäure, HAuCl₄·3H₂O, Trinatriumcitrat und andere Reagenzien stammten von Fluka, Sigma-Aldrich und Riedel-De Haën. Ziel-, Mismatch- und Reporter-Oligonukleotide wurden von Bio Service Unit (NSTDA) und Bioneer synthetisiert.

Apparatur

DPV-Messungen erfolgten an einer screen-printed Kohlenstoffelektrode (SPE) mit Ag/AgCl-Referenz und Platin-Gegenelektrode, mittels Autolab PGSTAT12 Potentiostaten. Elektrochemische Parameter: 0,02 V Schritt, 0,5 V s⁻¹ Scan, 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7.

Synthese von AuNPs und PSA Latex-Partikeln

AuNPs wurden durch Citratreduktion (Turkevich-Methode) hergestellt. PSA-Latexkugeln wurden durch seifenfreie Emulsionscopolymerisation von Styrol und Acrylsäure synthetisiert, was sub-mikron Partikel (~186 nm) mit reichlich Carboxylgruppen für DNA-Anbindung ergab.

Elektrodenmodifikation und DNA-Immobilisierung

PSA-Partikel wurden auf die SPE tropfaufgebracht, gefolgt von AuNP-Abscheidung. EDC/NHS-Kupplung in pH 5 Puffer aktivierte Carboxylgruppen, dann wurde eine 5 µM Capture-Sonde immobilisiert. Hybridisierung mit 1 µM Ziel-DNA und 5 mM Anthrachinon-Label (AQMS) erfolgte in zwei Stufen: Capture-Target und Reporter-Bindung, jeweils 1 h.

Optimierung

Sondenbeladung (1–6 µM) und AQMS-Konzentration (0,1–5 mM) wurden optimiert; 4 µM Sonde und 1 mM AQMS gaben maximalen Response. pH 7, 0,05 M Phosphatpuffer und 2,0 M NaCl lieferten optimale ionische Bedingungen. Hybridisierungszeit 60 min und Sondenimmobilisierungszeit 8 h wurden gewählt.

Leistungsbewertung

Der Sensor demonstrierte einen linearen Bereich von 1,0×10⁻²¹ bis 1,0×10⁻⁸ M mit LOD 1,0×10⁻²¹ M. Rückgewinnungstests in gespikten Proben (1,0×10⁻⁴ bis 1,0×10⁻⁶ µg µl⁻¹) ergaben 91,4 %–108,9 % (n = 3). Haltbarkeitsstudien zeigten 95 % Aktivität nach 58 Tagen; der Sensor konnte mit 0,1 M NaOH regeneriert und sechsmal wiederverwendet werden mit 5 % RSD.

Ergebnisse und Diskussion

SEM bestätigte uniforme PSA-Kugeln (~186 nm). DPV-Analyse zeigte, dass AuNP-Beladung die Peakpotenzialtrennung (ΔEₚ) reduzierte, was verbesserten Elektronentransfer anzeigt. Hybridisierungsexperimente offenbarten einen markanten DPV-Spitzenstromanstieg nur bei Vorhandensein sowohl von Target- als auch Reporter-Sonde, was Sandwich-Typ-Spezifität bestätigt. Optimale Sondenbeladung und AQMS-Konzentration wurden identifiziert; höhere Sondendichten führten zu Plateauerung der Antwort, während übermäßiges AQMS Hintergrundrauschen verursachte. pH 7, Na⁺-Ionen und hohe Ionenstärke (2,0 M NaCl) maximierten Hybridisierungseffizienz.

Die Kalibrierkurve zeigte exzellente Linearität (R² = 0,99). Die sub-zeptomolare LOD des Sensors übertrifft zuvor berichtete PSA-basierte oder Avidin-Biotin-Systeme, während schnelle Assayzeit (~60 min) gewahrt bleibt. Stabilitätstests demonstrierten minimalen Signalverlust über 58 Tage, und Regenerationsprotokolle stellten volle Aktivität für bis zu sechs Zyklen wieder her.

Schlussfolgerungen

Wir haben einen robusten, amplifikationsfreien elektrochemischen DNA-Biosensor entwickelt, der V. cholerae DNA bei sub-zeptomolaren Konzentrationen mit hoher Spezifität und Reproduzierbarkeit detektiert. Seine einfache Fertigung, schnelle Assayzeit und lange Haltbarkeit machen ihn geeignet für Feldeinsatz in Ausbruchssettings.