Umweltverträgliche biokonjugierte Goldnanopartikel als effiziente Kontrastmittel für die entzündungsinduzierte Krebsbildgebung

Einführung

In der medizinischen und biologischen Forschung steigt das Interesse an Goldnanopartikeln (AuNPs) für optische Mikroskopiestudien und diagnostische Verfahren, insbesondere für die konfokale Lasermikroskopie. Die Verwendung von Antikörper/AuNP-Konjugaten ermöglicht den Echtzeit-Nachweis der Goldaufnahme in lebende Zellen (z. B. Krebszellen) auf der Ebene einzelner Partikel, was die Schätzung der intrazellulären Menge an NPs ermöglicht [1,2,3].

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von AuNPs ermöglichen ihre Verwendung in vielen medizinischen Studien wie Genomik, Biosensitivität, Immunoassay, klinische Chemie, Nachweis und Photothermolyse von Mikroorganismen und Krebszellen [1]. Faulk und Taylor [4] beschrieben die erste Methode der Antikörperkonjugation mit kolloidalem Gold zur direkten elektronenmikroskopischen Visualisierung der Oberflächenantigene von Salmonellen. Seitdem wurden viele Studien entwickelt, die auf die Anwendung von mit Biomakromolekülen konjugierten Nanopartikeln wie Antikörpern, Lektinen und Enzymen in verschiedenen Bereichen abzielen, z. B. Biochemie, Mikrobiologie, Immunologie und Morphologie [1, 4]. In Krebsstudien werden hochspezifische und empfindliche AuNP-basierte Kontrastmittel sowohl für Röntgen- als auch für optische Bildgebungsmodalitäten verwendet, da AuNPs in der Lage sind, die Fluoreszenzintensität von konjugierten Molekülen zu erhöhen [5, 6].

2014 haben wir gezeigt, dass AuNPs für die indirekte Immunfluoreszenz (IF)-Färbemethode in Zellkulturen verwendet werden können [6]. In der vorliegenden Studie beschreiben wir drei neue Methoden zur Immunfluoreszenz (IF)-Färbung mit AuNPs. Hier verwenden wir Gewebeschnitte und vergleichen die Fluoreszenzintensität jeder dieser Methoden mit dem Standard-Färbeprotokoll mit Alexa Fluor® 488 (ALEXA) Antikörper (A1) mit dem Ziel, eine Fluoreszenztechnik für die klinische Anwendung zu optimieren [7,8,9 ].

Die Fluoreszenzbildgebung (FI) für das Targeting von Krebszellen verwendet eine Vielzahl von optischen Bildgebungstechnologien, um die Erkennung früher Neoplasien basierend auf molekularen Signaturen, die für Krebs spezifisch sind, zu verbessern [10]. Seit 2013 hat die Zahl der klinischen Studien mit FI rapide zugenommen. Ein Screening wird im Allgemeinen für Hochrisikopatienten in Betracht gezogen, die auf einer Kombination von Lebensstilfaktoren, Genetik oder einer persönlichen Krankheitsgeschichte basieren, während die Überwachung Patienten mit der Diagnose Dysplasie/chronischer Entzündung oder Patienten mit Verdacht auf Malignität vorbehalten ist. FI kann bei der Identifizierung bösartiger Läsionen mit verbesserter Spezifität und Sensitivität im Vergleich zu derzeit verfügbaren Techniken helfen. Darüber hinaus kann das FI-basierte Screening eine weniger invasive und kostengünstigere Möglichkeit bieten, kanzeröse oder präkanzeröse Läsionen zu erkennen. Insbesondere die Fähigkeit von FI, Läsionen früher als herkömmliche Screening-Methoden zu erkennen, führt nicht nur zu verbesserten Behandlungsergebnissen, sondern auch zu geringeren Behandlungskosten, da die Notwendigkeit einer multimodalen Versorgung vermieden wird, die bei Patienten mit späterer Diagnose erforderlich ist [11] . In dieser Studie zeigen wir, dass Antikörper/AuNPs-Konjugate erfolgreich zur Darstellung chronischer Entzündungen mittels Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden können.

Methoden/Experimental

Ziel der Studie

Das Ziel dieser Studie ist es zu zeigen, wie die Fluoreszenzeigenschaften von Goldnanopartikeln in IF- und Durchflusszytometrietechniken genutzt werden können. Darüber hinaus haben wir die mit AuNPs getesteten Protokolle mit dem Standardprotokoll mit ALEXA verglichen und bewiesen, dass es möglich ist, die AuNPs in einem Protokoll zu verwenden, das schneller, aber genauso zuverlässig ist wie das Standardprotokoll.

Chemikalien und Reagenzien

Goldtrichlorid (30 Gew.-% in HCl), Polyvinylpyrrolidon (PVP, MW&sub2; =~10.000), Natriumhydroxid, Dialyseschlauch-Zellulosemembran und Glycerin waren Produkte von Sigma-Aldrich Chemical Co (Saint Louis, USA). Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid wurden von Vetec (Rio de Janeiro, Brasilien) bezogen. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Rinderserumalbumin (BSA, 5%) wurden von Life Technologies Corporation© (Kalifornien, USA) bezogen. Anti-COX-2 (Cyclooxygenase-2) und Anti-MIF (Makrophagen-Migrations-Hemmfaktor)-Primärantikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology (São Paulo, Brasilien) erworben, während Ziegen-Anti-Ratte-IgG-H&L Alexa Fluor® 488-Sekundärantikörper von ABCAM® (Cambridge, UK) bezogen wurden. Zur Gegenfärbung der DNA wurde Fluoroshield Eindeckmedium mit DAPI (20 ml) von ABCAM® (Cambridge, UK) verwendet.

Herstellung und Charakterisierung von AuNPs und Fluoreszenzspektroskopie

Kugelförmige AuNPs (7,1 nm) wurden gemäß einer Studie von Gasparotto et al. hergestellt und charakterisiert. [12]. Kurz gesagt, alle Glaswaren wurden in KMnO₄ . aufbewahrt + NaOH-Lösung über Nacht, mit entionisiertem Wasser gespült, in H₂ . aufbewahrt O₂ + H₂ SO₄ Lösung (1:1 v /v ) 10&supmin;, erneut mit entionisiertem Wasser gespült und vor Gebrauch getrocknet. PVP (0,20 g) und Goldchlorid (6,80 mg) wurden in 10 ml Wasser gelöst. In einem separaten Becherglas wurden Glycerin (0,18 µg) und NaOH (0,080 µg) in 10 ml Wasser gelöst. Die Glycerin-NaOH-Lösung wurde dann dem AuCl₃ . zugesetzt -PVP-Lösung, um die folgenden Endkonzentrationen zu erhalten:1.0 mmol/L ⁻¹ Au ³⁺ , 0,10 M NaOH, 0,10 M Glycerin und 10 g/l ⁻¹ PvP. Die endgültige Mischung hatte aufgrund der Bildung von AuNPs eine tiefrote Farbe. Die kolloidalen Ultraviolett-Vis-Absorptionsspektren der AuNPs wurden mit einem Evolution 60S UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo Scientific, MA, USA) aufgenommen. Die Fluoreszenzspektroskopie wurde mit einem RF-5301 PC-Spektrofluorophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) durchgeführt.

Experimentelles Design

Alle drei Protokolle wurden an Kontrollgruppen von zwei chronisch-entzündlichen Modellen, Essigsäure-induzierter Colitis ulcerosa (UC) [7] und alkoholinduzierter Steatohepatitis [8, 9] bei Ratten getestet.

Essigsäure-induzierte UC wurde an weiblichen Wistar-Ratten (220 ± 20 µg Körpergewicht) durchgeführt, die vom Biotechnology Center/Universidade Federal da Paraiba bezogen wurden. Die Tiere wurden in zwei Gruppen eingeteilt (n = 5 pro Gruppe):Essigsäurekontrolle und nicht-kolitische Ratten. Die Tiere wurden über Nacht gefastet und mit Ketamin (70 mg/kg, 10 %) und Xylazin (10 mg/kg, 2 %) anästhesiert. UC wurde nach Methoden induziert, die ursprünglich von MacPherson und Pfeiffer [13] beschrieben und von Millar et al. [14]. Ein Katheter wurde vorsichtig in den Dickdarm eingeführt. Dann wurde 10 % Essigsäure (0,5 ml) in 0,9 % Kochsalzlösung in das Lumen des Dickdarms eingeträufelt. Die Gruppe ohne Kolitis erhielt intrakolonisch 0,5 ml einer 0,9%-igen Kochsalzlösung. Die Ratten wurden 30 Sekunden lang in einer Rückenlage in Trendelenburg gehalten, um ein Auslaufen der intrakolischen Instillation zu verhindern.

Die Tiere wurden über Nacht gefastet und 48 h nach der Induktion mit einer Überdosis Thiopental eingeschläfert. Als nächstes wurde der Dickdarm aseptisch entfernt, mit PBS gespült und auf eine eiskalte Platte gelegt. Der Dickdarm wurde von Fett und Mesenterium gereinigt. Dann wurde jede Probe gewogen und ihre Länge unter einer konstanten Belastung (2 &mgr;g) gemessen. Anschließend wurde das Kolon längs eröffnet und auf einer Skala von 0 bis 10 auf makroskopisch sichtbare Schäden nach den von Bell et al. [15].

Alkohol-Steatohepatitis wurde bei männlichen Wistar-Ratten (290 ± 10 µg Körpergewicht) induziert, die vom Department of Biophysical and Pharmacology – Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN) bezogen wurden. Die Tiere wurden in zwei Gruppen eingeteilt (n = 5 pro Gruppe):alkoholische und nichtalkoholische Ratten. Ethanollösung (7 g/kg Körpergewicht von 30 % v /v ) wurde als chronische Dosis für die Alkoholikergruppe verwendet. Tiere in der alkoholfreien Gruppe erhielten oral ein äquivalentes Volumen Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) per Schlundsonde. In beiden Gruppen wurde 28  Tage lang einmal täglich eine Sondensonde durchgeführt.

Am 29. Tag wurde Euthanasie durch intraperitoneale Injektion von 7,5 ml/kg Ketamin (50 mg/ml) und 2,5 ml/kg Xylazin (20 mg/ml) durchgeführt. Vor der Euthanasie wurden alle Tiergruppen 12 Stunden lang gefastet. Sobald die Tiere bewusstlos waren, wurden die Tiere einer Herzpunktion unterzogen, gefolgt von einer Entfernung der Leber. Leberfragmente wurden zur histopathologischen Analyse in 10 % gepuffertes Formaldehyd eingetaucht.

Tiere mit sowohl Essigsäure-induzierter CU als auch Alkohol-induzierter Steatohepatitis wurden unter Standardbedingungen (12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus, 22 ± 0,1 °C und 50–55 % Luftfeuchtigkeit) mit ad libitum . gehalten Zugang zu Nahrung und Wasser. Tiere wurden nach den ethischen Grundsätzen für Tierversuche behandelt.

Histologie

Fünf Paraffinblöcke aus den Positivkontrollen (Essigsäurekontrolle und Alkoholkontrolle) jedes Entzündungsmodells wurden für die indirekte IF-Färbung verwendet. Die primären Antikörper Anti-COX-2 und Anti-MIF erwiesen sich als gute Entzündungsmarker bei Essigsäure-induzierter CU bzw. Alkohol-induzierter Steatohepatitis, indem sie eine zuverlässige Färbung in Bezug auf die Fluoreszenzintensität lieferten, die zum Vergleich verschiedener verwendet werden kann Protokolle.

Die Gewebe wurden in 10 % gepuffertem Formaldehyd fixiert, mit Ethylalkohol (70 %, 80 %, 90 %, 95 % und P.A.) entwässert, in Xylol geklärt und gemäß dem Standardprotokoll in Paraffin imprägniert [8]. Vor der Vorbereitung der Schnitte für die indirekte IF-Färbung wurden die Objektträger 24 Stunden bei 60 °C in einem Ofen aufbewahrt.

Immunfluoreszenz- und Protokolldesigns

Drei Gewebeschnitte (4 µm) von jedem Tier wurden in Xylol entparaffiniert und in einer Reihe abnehmender Ethanolkonzentrationen von 99% Ethanol bis 50% Ethanol gewaschen. Schließlich wurden Gewebeschnitte zweimal in dH₂ . gewaschen O und eine Wäsche mit PBS. Die Antigengewinnung erfolgte durch Einlegen der Schnitte in 10&supmin;&sup6; mM Natriumcitrat mit 0,05% Tween 20 bei 95°C für 30 Minuten und anschließend bei Raumtemperatur (RT) für 20 Minuten. Hintergrundrauschen/-signal wurde durch Inkubieren der Schnitte in 0,1% Sudanschwarz in 70% Alkohol bei RT für 20 min, gefolgt von drei Waschungen in 0,02% PBS-Tween 20, reduziert. Die Proben wurden in 0,2% Triton-X-100 in . permeabilisiert PBS (drei Waschgänge, jeweils 5 min), in PBS gewaschen und dann mit PBS, 5% BSA, dH₂ . blockiert O und Triton-X-100. Die Objektträger wurden mit Blocklösung in einer Feuchtigkeitskammer 2 h lang inkubiert. Wie in Tabelle 1 und Abb. 1 gezeigt, wurde die Inkubation der Anti-COX-2- und Anti-MIF-Primärantikörper nach drei verschiedenen Protokollen (NP1, NP2 und NP3) durchgeführt. Diese Protokolle wurden mit zwei ALEXA-basierten Protokollen verglichen, die sich in der Inkubationszeit des Primärantikörpers unterscheiden – dem ALEXA-Standardprotokoll (Inkubation über Nacht), das von unserer Forschungsgruppe als Standardprotokoll für die meisten Verfahren übernommen wurde (A1) und dem ALEXA-modifizierten Protokoll (A2 .).; 30 Minuten Inkubation). NP1 ist eine Nanopartikel-abhängige Immunfluoreszenz-Färbemethode mit 30 min für die Primärinkubation. Primäre Antikörper wurden in 1% BSA in einem Verhältnis von 1:500 (Anti-COX-2) und 1:400 (Anti-MIF) verdünnt, und jede Probe wurde in einer Feuchtigkeitskammer bei RT (20 °C) 30 Minuten lang inkubiert . Als nächstes wurden 100–150 µl AuNPs zu den Proben gegeben, die weitere 30 Minuten bei RT (20 °C) inkubiert wurden. Im zweiten Nanopartikel-abhängigen Protokoll (NP2) wurden Primärantikörper in 1% BSA verdünnt und direkt auf die Objektträger aufgetragen, die über Nacht im Kühlschrank belassen wurden. Daher sind A2 und NP1 beide 30-minütige Inkubationsprotokolle, aber A2 wird mit einem sekundären fluoreszierenden Antikörper (ALEXA) durchgeführt, während NP1 AuNPs als Fluorophore hat. Dies gilt auch für die Übernacht-Inkubationsprotokolle A1 und NP2. Nach den jeweiligen Inkubationszeiten wurden die Objektträger jedes Protokolls dreimal mit PBS gewaschen, um den überschüssigen primären Antikörper zu entfernen. Dann wurden 100–150 µl Nanopartikel zu jedem Objektträger in NP2 hinzugefügt, während ALEXA (1:400) in A1 hinzugefügt wurde. Nach 1 Stunde Inkubation mit AuNPs (NP2) und ALEXA (A1) wurden alle Objektträger dreimal mit PBS gewaschen.

Bilder der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von Kontrollgruppen mit Essigsäure-induzierter CU und Alkohol-induzierter Steatohepatitis. a Negativkontrolle des UC-Modells (× 100; Skalenbalken = 100 μm). b Essigsäure-induzierte UC. Der rote Pfeil zeigt eine Leukozyteninfiltration des Schleimhautbereichs an (× 100; Skalenbalken  = 100 μm). c Negativkontrolle der Steatohepatitis (× 200; Skalenbalken = 50 μm). d Alkoholinduzierte Steatohepatitis. Der schwarze Pfeil zeigt die Leukozyteninfiltration an (× 200; Skalenbalken = 50 μm)

Das dritte Protokoll (NP3) wurde entwickelt, um die verstärkenden Eigenschaften von AuNPs in fluoreszierenden Systemen zu untersuchen. In NP3 wurden AuNPs während der Verdünnung von ALEXA in 1% BSA aufgetragen. Drei Verdünnungen von sekundärem Antikörper (1:200, 1:400 und 1:800) in BSA mit AuNPs wurden getestet, um die Fluoreszenzintensitäten jeder Verdünnung mit A1 zu vergleichen. Die Verdünnungen wurden so hergestellt, dass das Volumen der AuNPs proportional zum Volumen des BSA war, z. B. für eine 1:200-Verdünnung wurden 2 µl ALEXA in 199 µl AuNPs + 199 µl BSA verdünnt. Die Inkubationszeit für die primären Antikörper in A1 und NP3 betrug ungefähr 18 Stunden (über Nacht), während die Inkubationszeit für ALEXA + AuNPs-Suspension 1 Stunde betrug.

Schließlich wurden die Proben mit Fluoroshield Mounting Medium mit DAPI befestigt. Die Objektträger wurden in einer lichtgeschützten Box aufbewahrt und bis zur mikroskopischen Analyse bei 4 °C aufbewahrt. Fluoreszenzbilder wurden mit einem aufrechten Mikroskop Zeiss Observer z.1 für Fluoreszenz- und Hellfeldaufnahmen (× 20 und × 10 Objektive, Carl Zeiss, Jena, Deutschland) mit AxioCam MRc aufgenommen. Der arithmetische Mittelwert der Software Zeiss ZEN lite blue Edition (Carl Zeiss) wurde verwendet, um die Intensität der Fluoreszenz Pixel für Pixel für jedes Bild des ALEXA-Kanals quantitativ zu bewerten. Mindestens drei Proben jedes Tieres (fünf Tiere pro Gruppe) wurden analysiert und fünf Bilder wurden von jedem Fragment mit dem × 10-Objektiv aufgenommen.

Induktion von M2-polarisierten TAMs in vitro

Zur Untersuchung primärer Antikörper-konjugierter Goldnanopartikel (AuNPs) in M2-Makrophagen, RAW 264.7-Zellen (5 × 10 ⁵ Zellen/Well in einer 12-Well-Platte) wurden in Vollmedium mit 10 % fötalem Rinderserum, ergänzt mit 20 ng/ml IL-4, 24 h lang kultiviert. Nach der Behandlung mit IL-4 wurden die Zellen dreimal mit serumfreiem DMEM gewaschen, gefolgt von einer Kultur in demselben Medium für 48 h. Die Zellen wurden mit einem Telaval 31-Lichtmikroskop (ZEISS, Oberkochen, Deutschland) analysiert.

Durchflusszytometrie

Nach 48-stündiger Inkubation mit IL-4, RAW 264.7-Zellen und M2-Makrophagen (1,5 × 10 ⁴ Zellen/Well in einer 12-Well-Platte) wurden mit einem Schaber gesammelt und mit 0,5 µg BSA in 100 µml PBS (PBA) 45 Minuten lang blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit PerCP-konjugiertem Anti-Maus-CD163 (1:1000) und FITC -konjugiertes Anti-Maus-CD86 (1:1000) bei 4 °C für 60 min. Außerdem wurden M2-Makrophagen mit COX-2 und MIF-Primärantikörpern markiert und so an AuNPs konjugiert. M2-polarisierte TAMs wurden gesammelt und mit 2% Paraformaldehyd in PBS für 10 min fixiert, gefolgt von einer Inkubation mit anti-COX-2 und anti-MIF primär (1:100) für 60 min bei 4 °C und; danach wurden die Zellen mit Ziege-anti-Kaninchen Alexa® Fluor 488-konjugiertem Sekundärantikörper (Thermo Fisher Scientific) in Inkubationslösung (1:100) bei Raumtemperatur für 60 min markiert, wie im Alexa-Standardprotokoll beschrieben [16]. Gemäß dem Protokoll (N1), bei dem AuNPs den anti-Kaninchen-Alexa® Fluor 488-konjugierten sekundären Antikörper aus der Ziege ersetzen, wurden M2-Makrophagen geerntet, mit PBS gewaschen und mit dem primären Anti-COX-2- und Anti-MIF-Antikörper (1:100 .) inkubiert ) in Inkubationslösung bei Raumtemperatur für 30 min. Anschließend wurden die Zellen mit AuNPs (1:5) bei 4 °C für 30 min inkubiert (AuNPs-Anregung bei 520 nm). Nach dem letzten Waschschritt wurden markierte Zellen in einem BD FACSCanto II (BD Biosciences, Niederlande) und FlowJo Software (Version 10.1; Tree Star Inc., UK) analysiert. Alle durchflusszytometrischen Analysen wurden mit Proben in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und dreimal wiederholt. Tabelle 2 zeigt einen Vergleich zwischen den Standardprotokollen von ALEXA und AuNPs.

Statistische Analyse

Varianzanalyse (ANOVA) und Bonferronis post hoc Test zur Immunfluoreszenzanalyse durchgeführt. Für die Durchflusszytometrie-Analyse wurden die signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen wie angegeben mit ANOVA und Dunn-Test berechnet. Ein p < 0,05 wurde für alle durchgeführten Analysen als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Mikroskopieanalyse

Der Schnitt in Abb. 1a zeigt einen mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Gewebeschnitt (Negativkontrolle). Der durch Essigsäure induzierte chronische Entzündungsprozess ist in Abb. 1b dargestellt, der einen Verlust der Gewebearchitektur mit nachfolgender Zerstörung des Epithels, eine Verringerung der Becherzellen, das Vorhandensein von Blutungen und Leukozyten in der Nähe der verletzten Stellen zeigt. In der Abbildung wurden die Ansammlung von Fetttröpfchen und entzündliche Infiltrate (Neutrophile und Lymphozyten) in den Lebern von Ratten beobachtet, die chronischer Alkoholexposition ausgesetzt waren.

In Bezug auf die Fluoreszenzintensität ähnelten AuNPs ALEXA, einem herkömmlichen Fluorophor für die IF-Färbung. Sowohl in Leber- als auch Dickdarmproben waren die Unterschiede in der Fluoreszenzintensität von NP1 und NP2 im Vergleich zu A1 minimal oder nicht vorhanden. In Abb. 2 sind mehrere Vergleiche zwischen den IF-Protokollen gezeigt, die unter Verwendung von Anti-COX-2- und Anti-MIF-Primärantikörpern getestet wurden. Die Abbildungen 2a und d zeigen, dass sich die Fluoreszenzintensitäten von A2, NP1 und NP2 im Vergleich zum A1-Protokoll nicht signifikant unterscheiden ( ^# p> 0,05), was darauf hindeutet, dass 30-minütige Inkubationsprotokolle (entweder mit ALEXA oder AuNPs) in einem diagnostischen Kontext anwendbar sein könnten.

Vergleich der Fluoreszenzintensität zwischen den Gruppen. a Fluoreszenzintensität von AuNPs in A2, NP1 und NP2 im Vergleich zu A1-nur Essigsäure-induzierter UC (Anti-COX-2-Antikörper). b Alle Verdünnungen von NP3 (1:200, 1:400 und 1:800) im Vergleich zur Fluoreszenzintensität von A1 (1:400) – nur Essigsäure-induzierte UC (Anti-COX-2-Antikörper). c Vergleich der Fluoreszenzintensität zwischen Essigsäure-induzierten Tieren und Negativkontrollen nach Kurzzeit- (A2 und NP1) und Übernachtinkubation (A1 und NP2). d Fluoreszenzintensität von AuNPs in A2, NP1 und NP2 im Vergleich zu A1-alkoholinduzierter Steatohepatitis (Anti-MIF-Antikörper). e Alle Verdünnungen von NP3 (1:200, 1:400 und 1:800) im Vergleich zur Fluoreszenzintensität von A1 (1:400) – nur alkoholinduzierte Steatohepatitis (Anti-MIF-Antikörper). f Vergleich der Fluoreszenzintensität zwischen alkoholinduzierten Steatohepatitis-Tieren und negativen Kontrollen nach 30-minütiger Inkubation (A2 und NP1) und Übernacht-Inkubation (A1 und NP2). Statistik:ANOVA und Bonferronis Post-hoc-Test, ^# p ≥ 0,05, **p < 0.01,***p <0,001 und ****p < 0,0001

Darüber hinaus zeigte das NP3-Protokoll (Abb. 2b, e), dass es möglich ist, die AuNPs mit ALEXA zu kombinieren, sodass die detektierte Fluoreszenzintensität erhöht wurde (***p < 0,001), was sogar die doppelte Verdünnung von ALEXA ermöglicht, ohne dass die Fluoreszenz im Vergleich zur ursprünglich auf A1 getesteten 1:400-Verdünnung abnimmt ( ^# p> 0,05).

Schließlich verglichen wir die erkrankten Gruppen mit den gesunden Gruppen (Abb. 2f), um zu zeigen, dass alle getesteten Protokolle, entweder mit ALEXA oder mit AuNPs, das Einsetzen entzündlicher Prozesse, die durch die Antigene COX-2 und MIF gekennzeichnet sind, wirksam nachweisen. Die Abbildungen 3 und 4 unterstützen die in Abbildung 2 grafisch dargestellten Daten. Sowohl ALEXA als auch AuNPs sind in grüner Färbung dargestellt, deren Verteilung Stellen mit erhöhter Leukozyteninfiltration und Gewebeschädigung entspricht.

Anti-COX-2-IF-Bilder von Dickdarmproben aus der Kochsalzlösung (Negativkontrolle) und den Essigsäure-induzierten UC-Gruppen, gefärbt mit grün fluoreszierenden Verbindungen (ALEXA, AuNPs oder beides) und DAPI (blau) für Zellkerne. a Negativkontrolle gefärbt mit ALEXA Standardprotokoll (A1) mit Anti-COX-2 und ALEXA (grün). b Negativkontrolle gefärbt mit modifiziertem ALEXA-Protokoll (A2) mit Anti-COX-2 und ALEXA. c Negativkontrolle gefärbt mit Nanopartikelprotokoll 1 (NP1) mit Anti-COX-2 und AuNPs (grün) anstelle von ALEXA. d Negativkontrolle gefärbt mit Nanopartikelprotokoll 2 (NP2) mit Anti-COX-2 und AuNPs anstelle von ALEXA. e Positivkontrolle gefärbt mit A1. f Positivkontrolle gefärbt mit A2. g Positivkontrolle gefärbt mit NP1. h Positivkontrolle gefärbt mit NP2. ich Positivkontrolle gefärbt mit Nanopartikelprotokoll (NP3) mit anti-COX-2 + AuNPs mit 1:200 ALEXA. j Positivkontrolle gefärbt mit NP3 (mit 1:400 Verdünnung von ALEXA). k UC-Positivkontrolle, gefärbt mit NP3 (mit 1:800 Verdünnung von ALEXA). Vergrößerungen, × 200. Maßstabsleiste = 50 μm

Anti-MIF-IF-Bilder von Leberproben aus den Gruppen mit Kochsalzlösung (Negativkontrolle) und alkoholinduzierter Steatohepatitis, gefärbt mit grün fluoreszierenden Verbindungen (ALEXA, AuNPs oder beides) und DAPI (blau) für Kerne. a Negativkontrolle gefärbt mit ALEXA Standardprotokoll (A1) mit Anti-MIF und ALEXA (grün). b Negativkontrolle gefärbt mit ALEXA modifiziertem Protokoll (A2) mit Anti-MIF und ALEXA. c Negativkontrolle gefärbt mit Nanopartikelprotokoll 1 (NP1) mit Anti-MIF und AuNPs (grün) anstelle von ALEXA. d Negativkontrolle gefärbt mit Nanopartikelprotokoll 2 (NP2) mit Anti-MIF und AuNPs anstelle von ALEXA. e Positivkontrolle gefärbt mit A1. f Positivkontrolle gefärbt mit A2. g Positivkontrolle gefärbt mit NP1. h Positivkontrolle gefärbt mit NP2. ich Positivkontrolle gefärbt mit Nanopartikelprotokoll 3 (NP3) mit Anti-MIF + AuNPs mit 1:200 ALEXA. j Positivkontrolle gefärbt mit NP3 mit einer 1:400 Verdünnung von ALEXA. k Positivkontrolle, gefärbt mit NP3 mit einer 1:800-Verdünnung von ALEXA. Vergrößerungen, × 200. Maßstabsleiste = 50 μm

In Bezug auf die klinische Anwendung erwies sich das NP1-Protokoll als das vielversprechendste, da es im Vergleich zum Standard-A1-Protokoll eine Einsparung von 18 h ermöglicht.

Durchflusszytometrie:Primärantikörper-konjugierte Goldnanopartikel (AuNP)-markierte M2-Makrophagen

Um M2-Makrophagen weiter zu charakterisieren, wurde die Expression von M1 (CD86)- und M2 (CD163)-verwandten Herstellern in IL-4-stimulierten RAW 264.7-Zellen in Durchflusszytometrie analysiert. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass die M2-bezogenen Marker wie der CD163-Rezeptor signifikant höher waren als die der nativen Zelle (Abb. 5a, c, p < 0,001), während die CD86-Rezeptorexpression keinen Unterschied zwischen M2-Makrophagen und naiven Zellen zeigte (Abb. 5b, c, p> 0,05). Die Ergebnisse legten nahe, dass IL-4 (20 ng/ml) erfolgreich die Veränderung von klassischen Makrophagen zu M2-Makrophagen induzierte. Nach diesem Schritt wurden M2-Makrophagen mit COX-2- und MIF-Primärantikörpern inkubiert und dann mit AuNPs markiert, um die Effizienz von primärantikörperkonjugierten Goldnanopartikeln (AuNPs) mit dem Standardprotokoll (ALEXA) zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass entweder COX-2- und MIF-Antikörper-konjugierte Goldnanopartikel (Abb. 5d, f, p < 0,001) oder ALEXA (Abb. 5e, f, p < 0,001) zeigte eine höhere Fluoreszenzintensität in M2-Makrophagen im Vergleich zu ungefärbten Proben.

COX-2- und MIF-Antikörper-konjugierte Gold-Nanopartikel (AuNPs) haben eine hohe Affinität auf der Oberfläche von M2-Makrophagen. a –c RAW 264.7-Zellen wurden mit IL-4 (20 ng/ml) für 24 Stunden stimuliert, gefolgt von einer Durchflusszytometrie-Analyse, um die Menge an CD163, einem M2-Makrophagen-Marker, und CD86, einem M1-Marker, zu quantifizieren. d , f Entweder COX-2 und MIF-Antikörper-konjugierte Gold-Nanopartikel oder e , f ALEXA 488 zeigte eine höhere Fluoreszenzintensität in M2-Makrophagen im Vergleich zu ungefärbten Proben. Die Daten werden als Mittelwert ± SD, ^# . ausgedrückt p> 0,05, ***p < 0,001, p < 0,0001. Die gezeigten repräsentativen Strömungsdaten stammen aus Experimenten, die mindestens dreimal unabhängig voneinander durchgeführt wurden

Fluoreszenzspektroskopie

Um die Fluoreszenzemissionsspektren für gereinigte AuNPs in Abwesenheit und Anwesenheit von Anti-COX-2 (Abb. 6a), Anti-MIF (Abb. 6b) und ALEXA (Abb. 6c) zu messen, wurde die Anregungswellenlänge festgelegt bei 320 nm und die Emission wurde im Bereich von 650 bis 900  nm aufgezeichnet. Eine Erhöhung der Anregungswellenlänge veränderte den Emissionsbereich der Partikel nicht, wodurch ein Streuprozess ausgeschlossen wurde. Die Fluoreszenzemissionen wurden leicht erhöht mit Anti-COX-2-Aufnahme (erhöhte 11,93 Extinktionseinheiten (au) für die höchste Antikörperkonzentration), Anti-MIF (erhöht um 12,15 au für die höchste Antikörperkonzentration) und ALEXA (erhöht um 3,18  au für die höchste Antikörperkonzentration) in Kombination mit AuNPs.

Fluoreszenzemissionsspektren von AuNPs angeregt bei 320 nm in Gegenwart von Anti-COX-2 (a ), Anti-MIF (b ) und ALEXA (c ). Das TEM-Bild der kugelförmigen Nanopartikel, die in dieser Studie verwendet wurden, zeigt ihre Größe und Verteilung (d ). Anregungs- und Emissionsspalte betrugen 10 nm. Die Konzentration der AuNPs wurde konstant bei 29,6 ng/ml ⁻¹ . gehalten . Die Antikörperkonzentrationen betragen 100 ng/ml ⁻¹ (blaue Kurve), 150 ng/ml ⁻¹ (rote Kurve) und 200 ng/ml ⁻¹ (grüne Kurve)

Diskussion

Es wurde gezeigt, dass AuNPs aufgrund ihrer chemischen Struktur und Größe Fluoreszenzeigenschaften aufweisen und als verstärkende Moleküle von Fluoreszenzsignalen wirken können. Genauer gesagt stammt die AuNP-Fluoreszenz selbst von aurophilen Wechselwirkungen auf der Oberfläche von Goldatomen [17, 18]. Die Daten aus Abb. 6 ähneln den Ergebnissen von Studien an Silbernanopartikeln, die die erhöhte Fluoreszenzemission auf die Konkurrenz zwischen Adsorbensspezies und dem in Lösung gelösten molekularen Sauerstoff zurückführen. Daher könnte die erhöhte Fluoreszenzemission von Goldnanopartikeln darauf zurückgeführt werden, dass BSA an ihrer Oberfläche adsorbiert ist [19].

Das Fluoreszenzsignal ist eine Funktion des Oberflächenplasmonenresonanzphänomens (SPR). Daher führt die Zunahme der Menge an freien Elektronen zu einem intensiveren SPR-Signal, da SPR die kollektive Schwingung freier Elektronen ist. Das adsorbierte BSA verhindert, dass die freien Elektronen der Oberfläche an die Sauerstoffmoleküle binden, was zu einer Erhöhung des Fluoreszenzsignals führt [20, 21]. Anti-COX-2, Anti-MIF und ALEXA könnten an den AuNPs adsorbiert worden sein, wodurch O₂ . verhindert wird die Oberfläche der Nanopartikel zu erreichen. Dies wird durch Abb. 6 unterstützt, in der die Zunahme des Fluoreszenzsignals bei sehr geringen Konzentrationen der verschiedenen Antikörper auftrat. Es ist jedoch erwähnenswert, dass ALEXA eine höhere Konzentration benötigt, um O₂ . zu verursachen Isolierung der AuNPs-Oberfläche.

Der chronische Entzündungsprozess ist gekennzeichnet durch die Infiltration von Immunzellen, hauptsächlich Makrophagen, an den Verletzungsstellen durch Essigsäure oder Ethanol im jeweiligen Modell. Eine Entzündung ist auch durch die leukozytenabhängige Freisetzung mehrerer Zytokine und Mediatoren als Reaktion auf einen Krankheitserreger oder einen Stresszustand gekennzeichnet. Von diesen Zytokinen sind COX-2 und MIF als Marker für mehrere Entzündungsprozesse bekannt, da sie pro-inflammatorische Zytokine sind. The green staining observed in Fig. 3 and Fig. 4 is due to the release of COX-2 and MIF cytokines, respectively.

In chronic UC and liver steatohepatitis, macrophages are the main cells found which can be classified into two major types:M1 macrophages and M2 macrophages. The classically activated macrophages (M1 macrophages) are proinflammatory and play a pivotal role in host defense against infection which is associated with iNOS and IL-23 production and their cell surface-expressed CD86 or HLA-DR that attract killer cells like neutrophils and/or direct Th1 (cytotoxic) responses and stimulate further M1-type responses [22]. Meanwhile, the alternatively activated macrophages (M2 macrophages) are associated with the responses to anti-inflammatory reactions as well as tissue remodeling [23]. In the tumor context, it has been documented that M2-polarized macrophages promote pro-tumor functions by production of a large array of growth factors such as COX-2 and MIF for tumor cells, which are essential for tumor proliferation [24].

It is well established that UC is an important risk factor for colonic epithelial dysplasia and adenocarcinoma [25, 26]. According to Agoff et al. [25], increased malondialdehyde (MDA) levels and upregulation of Bcl-2 during UC are potential mechanisms to explain the relationship between COX-2 overexpression and neoplastic progression. In UC, the inflammation boosts COX-2 activity, leading to genetic damage through increased production of MDA. MDA is a by-product of COX-mediated prostaglandin synthesis and lipid peroxidation, and it is also constitutively produced by COX-1. Since COX-2 upregulates Bcl-2 expression, it leads to resistance to apoptosis in UC-associated neoplasia [27].

MIF is a multipotent cytokine in the innate immune responses that contributes to hepatic injury driven by alcohol-induced steatohepatitis [28]. When steatohepatitis has developed, the liver morphology rarely goes back to normal, even after cessation. In addition, there is a higher risk of the development of cirrhosis, which is the last stage of alcoholic liver disease (ALD) before hepatocellular carcinoma (HCC) [29].

Studies show MIF presence in the sera after hepatic resection or expression in the course of liver cancer progression [30]. MIF is involved in COX-2 and PGE2 upregulation and directly promotes tumorigenesis by inhibition of p53 accumulation, which is a classic tumor suppressor gene that can promote cell cycle arrest and apoptosis in response to DNA damage [31].

In a previous study [6], we have demonstrated that AuNPs can be easily conjugated with the antibodies anti-β-catenin and anti-E-cadherin to specifically target colorectal carcinoma cells, whose clinical value can be found in an early diagnosis of cancer through non-invasive methods in body fluids such as saliva and urine. In addition, we developed a new protocol to decrease the 27 h that are usually needed for the standard protocol to about 1 h needed for our improved protocol, which makes this method eligible for a clinical colorectal cancer diagnostic.

In this study, we took advantage of the properties of AuNPs conjugated with primary antibodies and applied them for the indirect IF staining method of tissue sections. At this point, we cannot affirm whether the interaction of the antibody with the nanoparticle is purely physical or if there is a chemical bond, since the amount of antibodies used in this method are far too small to produce discernible signals in Fourier-transform infrared spectroscopy. Thus, we rely only on fluorescence data that suggest that conjugation was achieved by direct adsorption of antibodies on the AuNPs surface. Such enhancement has been rationalized in terms of competition between adsorbing species and molecular oxygen dissolved in solution, as explained before by Lima et al. [6]. We found that the replacement of ALEXA by the AuNPs in NP1 saves about 18 h (similar to A2), when compared to standard protocol and NP2 that require about 24 h, each, from the antigenic retrieval to the assembling of the slides for microscopic analysis (Fig. 7 and Table 1). The time for incubation with the primary antibody was 30 min for A2 and NP1, but overnight (18 h) for A1, NP2, and NP3 (Fig. 7a and Table 1).

Comparative schemes illustrating the immunofluorescence (a ) and flow cytometry protocols used in this study (b ). In immunofluorescence, AuNPs may be applied in 30-min incubation protocols as fluorescence-enhancing agents, providing faster results with comparable fluorescence levels to the traditional ALEXA protocol, which makes NP1 a suitable protocol for cancer diagnose. Time was counted from the antigen retrieval to the end of the second incubation. In flow cytometry, although the ALEXA marking was higher than that of the AuNPs, the N1 protocol with AuNPs allowed a greater saving of reagents as well as reduced the time required for the technique from 4 to 1 h

Moreover, we demonstrated MIF and COX-2 primary antibody-conjugated gold nanoparticles can be arranged on the surface of M2 macrophage as a fast alternative to analyze the immune profile of inflammation-induced cancer tissues by flow cytometry. Although the standard protocol is laborious, the intensity of marking to both the primary antibodies was higher than primary antibody-conjugated gold nanoparticles. However, the primary antibody-conjugated gold nanoparticles needed less reagents and the time saving was higher as seen in the standard protocol (4 h) and in primary antibody-conjugated gold nanoparticles N1 protocol (1 h) (Fig. 7b). These results suggest that M2 macrophages can be targeted with primary antibody-conjugated gold nanoparticles either to diagnosis or therapy.

The time saving, the specificity, and the low cost provided by NP1 are especially important in cancer diagnosis, when fast and accurate results are highly required. It is important to highlight that, although the models adopted for this work were based on inflammation diseases, the inflammation markers used in this study are highly cancer-correlated and AuNPs provide multiple possibilities for application in clinical research and diagnosis.

Conclusions

All nanoparticle protocols tested showed similar fluorescent intensities to those observed in standard IF, extending the application of AuNPs, not only in research, but also in clinical diagnostics. When diluted with ALEXA, AuNPs allow greater dilutions with acceptable fluorescence intensity. More importantly, AuNPs can be used in faster protocols (e.g., 30-min incubation protocols), completely substituting ALEXA and providing a way to develop further technologies that will improve cancer diagnose and other diseases. We believe that these findings will contribute to advance research and diagnostic procedures that utilize IF methods as well as widen the applications of AuNPs in biotechnology.

Abkürzungen

A1:

ALEXA standard protocol

A2:

ALEXA modified protocol

ALD:

Alcoholic liver disease

ALEXA:

Alexa Fluor® 488®

AuNP:

Goldnanopartikel

BSA:

Rinderserumalbumin

COX-2:

Cyclooxygenase-2

FC:

Durchflusszytometrie

FI:

Fluorescence imaging

IF:

Immunofluorescence

MDA:

Malondialdehyde

MIF:

Macrophage migration inhibitory factor

NP1:

Nanoparticles protocol 1

NP2

Nanoparticles protocol 2

NP3:

Nanoparticles protocol 3

SPR:

Oberflächenplasmonenresonanz

UC:

Ulcerative colitis