Optimierung der NIR-getriggerten Hyperthermie mit Cs_0,33WO₃-Nanopartikeln zur HepG2-Leberkrebsbehandlung

Zusammenfassung

Hyperthermie ist eine der patientenfreundlichsten Methoden zur Heilung von Krebserkrankungen aufgrund ihrer Nichtinvasivität, minimaler Nebenwirkungen und Toxizität sowie einfacher Implementierung, was die Entwicklung neuartiger therapeutischer Methoden wie photothermisch ausgelöster Dosiersysteme vorantreibt. Diese Forschung untersucht die Variablen der photothermischen Effekte von Cs_0,33WO₃-Nanopartikeln (NPs), nämlich Bestrahlungsdauer, optische Leistungsdichte und NP-Konzentration, an der HepG2-Leberkrebszelllinie in vitro, was zur Formulierung einer nahinfrarot (NIR)-bestrahlten thermischen Dosis führt. Die NPs mit Partikelgrößen von 120 nm wurden durch eine Reihe von Oxidations-Reduktionsreaktionen (REDOX), thermischem Glühen und Nassmahlprozessen synthetisiert, und die anschließende Charakterisierung der physikalischen, kompositionellen, optischen und photothermischen Eigenschaften wurde mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS), energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDS), Raster- und Tunnellelektronenmikroskopie (SEM und TEM), Röntgendiffraktion (XRD) und sichtbar-nahinfraroter (VIS–NIR) Photospektroskopie untersucht. Die Zytotoxizität der NPs und ihrer Bestrahlungsparameter wurde für HepG2-Zellen ermittelt. Durch Inkubation der Zellen mit den NPs wurde der Endozytosezustand verifiziert, und die Abhängigkeit der zellulären Überlebensrate von den variablen Parametern der photothermischen Dosis wurde bestimmt, während die Mediumtemperatur der zellhaltigen Petrischale bei menschlicher Körpertemperatur von ca. 36,5 °C gehalten wurde.

Einleitung

Weltweit forderten im Jahr 2018 allein furchtbare Krebserkrankungen etwa 10 Millionen Leben und fügten schätzungsweise 18 Millionen neue Fälle hinzu [1]. Bisher führen Chemotherapie, Bestrahlung, chirurgische Entfernung oder maßgeschneiderte Kombinationen dieser drei zu einer Verbesserung der 5-Jahres-Überlebensrate auf knapp über 40 % der behandelten Krebspatienten [2, 3], doch die toxische und schädliche Natur von Chemikalionen und ionischer Bombardierung verursacht unvermeidlich zahlreiche Nebenwirkungen wie Haarausfall, Kardiotoxizität, Unfruchtbarkeit, chromosomale Aberrationen und viele mehr [4, 5]. Solche lebensbeeinträchtigenden Folgen haben die Entwicklung patientenfreundlicher therapeutischer Medizin einschließlich NP-basierter Verbindungen stark vorangetrieben.

Nanotechnologie auf Basis besonderer Materialsysteme, Strukturen, Formen und atomarer Stöchiometrie im Größenbereich unter 100 nm erzeugt beispiellose chemische, physikalische und biochemische Eigenschaften, die durch Quanteneffekte verstärkt werden, und hat bereits präklinische und in-vitro-Anwendungen in vielen Bereichen der biomedizinischen Wissenschaften gefunden [6, 7]. Trotz der Nachteile der Chemotherapie verbessern NPs als Träger die Selektivität der Medikamentenfreisetzung im kranken Tumor, erleichtern die Medikamentenaufnahme durch Tumorzellen und reduzieren die kumulative Toxizität im gesunden Gewebe weitgehend [8, 9]. Auch die Bildqualität, die durch eine Reihe von NP-basierten Bildgebungsmodalitäten erzeugt wird, wird mit höherer Sensitivität, feinerer räumlicher Auflösung und besserer Tiefenpenetration erheblich verbessert, um Biodistribution aufzudecken, Medikamentenaufnahme zu überwachen, Tumore zu lokalisieren und die Wirksamkeit der Behandlung zu bewerten [10]. Neben der diagnostischen Funktion können NPs, wenn sie mit inhärenten physikalischen Eigenschaften wie Radiofrequenz (RF)-Ablation oder photothermisch erzeugter Hyperthermie genutzt werden, Schäden an der gewünschten Stelle mit verbesserter Effizienz induzieren [11,12,13], wobei die letztere aufgrund ihrer standortspezifischen Dosierung, geringeren Schmerzen, geringeren Nebenwirkungen und stark reduziertem Risiko von Gewebeverbrennungen häufig bevorzugt wird.

Bislang umfassen NP-Materialsysteme, die bei Photo-Bestrahlung Hyperthermie induzieren können, Gold (Au), Cäsiumtungstat (CsWO₃), Eisenoxid, Kupfersulfid, Graphen und Kohlenstoffnanoröhren, die die Anwendbarkeit demonstrierten, letale Schäden an Krebszellen durch Erhöhung der extrazellulären oder intrazellulären Temperatur in situ zu verursachen [14,15,16,17,18]. Wie bei der NP-verstärkten RF-Ablation ist das Niveau der einfallenden Leistungsdichte photonischer Quellen ein kritisches Thema für klinische Sicherheit und Patientenkomfort [11], und es zeigt sich, dass der maximale Expositionsgrenzwert für menschliche Haut im Wellenlängenbereich von VIS und NIR zwischen 400 und 980 nm laut der Internationalen Kommission zum Schutz vor nicht-ionisierender Strahlung (ICNIRP) von 2013 zwischen 0,2 und 0,726 W/cm² liegt [19]. Dennoch lagen die meisten in früheren in-vitro-Krebszellstudien berichteten optischen Leistungsdichten weit jenseits des Sicherheitsgrenzwerts für Hautgewebe, was ein ernstes Problem darstellen kann, wenn es um die Behandlung innerer biologischer Gewebe mit einem niedrigen Schwellenwert für Photo-Bestrahlung geht. Beispielsweise lagen die NIR-optischen Leistungsdichten von Gold (Au) NPs, die eine wirksame Zerstörung von Krebszellen demonstrierten, zwischen 2 und 80 W/cm² bei Bestrahlungsdauern von nicht mehr als 10 min [13, 14, 20,21,22]. Ebenso erforderten diverse andere Materialsysteme wie Graphenoxide [18], Eisen-Platin (FePt) [23] und NaYF₄:Yb,Er-Nanokristalle [24] nicht weniger als 150 mW/cm² für einen instrumentellen Einsatz.

Als relativ weniger erforschtes Material für In-vitro-Experimente berichteten einige Studien über die Vernichtung von Zervixkrebszellen (Hela) durch NIR-bestrahlte CsWO₃-NPs mit mindestens 0,72 W/cm² [15, 25, 26], was in der Nähe des Hautgewebe-Expositionsgrenzwerts für NIR-Wellenlängen liegt, den ICNIRP festgelegt hat, und bei längerer Expositionsdauer schädliche Auswirkungen auf gesunde Gewebe haben kann [19]. Zudem war die Temperatur der Kulturmedien, die durch die Kombination aus Behandlungsdosis der NP-Konzentration, Dauer der Photoexposition und optischer Intensität in früheren Studien erzeugt wurde, weit über 40 °C, was für gesunde menschliche Zellen intolerabel ist, und die Mortalitätsraten der Krebszellen wurden nicht detailliert dargelegt.

CsWO₃-NPs sind im NIR-Wellenlängenbereich von 800 nm bis 2400 nm außergewöhnlich absorbierend [27] und funktional für biomedizinische Anwendungen geeignet. Trotz ihrer demonstrierten herausragenden Wirksamkeit bei der Elimination von Krebszellen ist die Zytotoxizität weitgehend unbekannt, und die Bereitstellung einer Dosierungsformel für NP-Konzentrationen mit niedriger Zytotoxizität, kurzer Bestrahlungsdauer und optischer Leistungsdichte innerhalb des Sicherheitsgrenzwerts für Photoexposition von Hautgewebe fehlt noch.

Die vorliegende Forschungsstudie versucht, die Machbarkeit der Vernichtung von HepG2-Leberkrebszellen, die in einer Petrischale mit 5,2 cm Durchmesser kultiviert wurden, mittels nicht-zytotoxischer NP-Konzentration und optischer Leistungsdichte weit innerhalb des Photoexpositionsgrenzwerts für Hautgewebe zu bewerten, während die Temperatur des Zellkulturmediums bei normaler menschlicher Körpertemperatur von 36,5 °C gehalten wird. Im Detail wurden Cs_0,33WO₃-NPs mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von ca. 120 nm mittels einer Sequenz aus Redox, thermischem Glühen und Nassmahlprozessen synthetisiert und hinsichtlich ihrer Oberflächenmorphologie, Kristallinität, optischen und zeitlich abhängigen photothermischen Eigenschaften charakterisiert. Zusätzlich wurden die photothermischen Effekte variabler Dosisparameter – Bestrahlungsdauer, NP-Konzentration und optische Leistungsdichte der NIR-Bestrahlung bei der Zentralwellenlänge von 980 nm – auf die Überlebensrate der HepG2-Krebszellen untersucht und beurteilt, um eine Kombination sicherer Behandlungsdosen zu entwickeln.

Methoden

In dieser Forschung wurde die 102. Generation der HepG2-Leberkrebszelllinie, die von einem menschlichen Primärtumor abstammt, als experimentelles Modell kultiviert, um die Zytotoxizität zu bewerten, die durch NIR-bestrahlte, selbst hergestellte Cs_0,33WO₃-NPs auferlegt wird, und die therapeutische Wirksamkeit verschiedener thermischer Dosen weit innerhalb des Sicherheitsgrenzwerts für Hautgewebeexposition und bei einer nicht-toxischen NP-Konzentration zu beurteilen.

Synthese von Cs_0,33WO₃ NPs

Das linke Panel von Abb. 1 veranschaulicht das schematische Flussdiagramm des Syntheseverfahrens für Cäsium-Wolframoxid (Cs_0,33WO₃) NP-Material. Kurz gesagt: Die Vorläuferchemikalien ((NH₄)₂WO₄) (Alfa Aesar, 99,9 % Reinheit) und CsCl (Alfa Aesar, 99,9 % Reinheit) wurden getrennt in 100 ml DI-Wasser gelöst und dann bei 25 °C unter ständigem Rühren bei 250 Umdrehungen pro Minute (rpm) mit einem magnetisch angetriebenen Rührer für eine Stunde (h) vermischt. Nach Beendigung des Rührens wurde die Temperatur des die Mischungslösung enthaltenden Bechers auf 180 °C eingestellt und gebacken, bis der Wassergehalt der Lösung vollständig verdampft war. Das resultierende getrocknete weiße Pulver war der endgültige Vorläufer des Cs_0,33WO₃-Materials. Mit eingeschaltetem Kühler wurde das Vorläuferpulver enthaltende Quarzboot in die Mitte eines Hochtemperatur-Ofenrohrs geladen, und der Druck im Ofenrohr wurde auf 0,08 torr gebracht. Anschließend wurde der Vorläufer bei 500 °C zusammen mit der Einleitung eines Gasgemischs aus H₂ und N₂ im Verhältnis 90 zu 10 Standardkubikzentimeter pro Minute (SCCM) erhitzt, um die Redox-Reaktion zu ermöglichen. Nach 1 h wurde der H₂-Gaszufluss abgeschaltet, der N₂-Gasfluss auf 100 SCCM eingestellt, und die Ofentemperatur auf 800 °C für thermisches Glühen für eine Stunde erhöht. Nach Abschluss der Prozesse wurden Kühler und temperaturgesteuerter Ofen ausgeschaltet, und das Quarzboot wurde abgekühlt, bis es Umgebungstemperatur erreicht hatte, und aus dem Ofenrohr entfernt. Das aus dem Quarzboot erhaltene dunkelblaue Pulver ist das mikrometergroße (µ) Cs_0,33WO₃-Pulver. Um die Partikelgröße der Pulvergranulate weiter zu verkleinern, wurden 150 g einer Mischlösung bestehend aus 15 g des µ-Pulvers, 3,8 g eines copolymerbasierten Dispergiermittels zur Verhinderung von Partikelaggregation, 10 μl Antischaummittel und DI-Wasser hergestellt, in eine Probenwanne gegossen, die 600 g Zirkoniakugeln enthielt, und in die Kammer einer Nanomahlvorrichtung (Justnanotech Co., Taiwan) eingesetzt. Bei einer Drehzahl und Temperatur von 2400 Umdrehungen pro Minute (RPM) und 15 °C wurden die NPs durch Mahlen des µ-Pulvers mit 0,1 mm ZrO₂-Perlen für 4 h und mit 0,05 mm ZrO₂-Perlen für weitere 4 h hergestellt. Die Gesamtdauer jedes Mahlprozesses überschritt nicht 4 h, um übermäßige Flüssigkeitsviskosität sowie unregelmäßige Änderungen der physikalischen Größen des Materials zu vermeiden. Die endgültige Lösung nach dem Mahlprozess wurde durch einen 0,22-μm-Porenfilter gesiebt für alle nachfolgenden Charakterisierungen und Experimente. Die fluoreszierende Version der Cs_0,33WO₃-NPs (fNPs) wurde folgendermaßen hergestellt: Eine Lösung aus 2 ml Fluorescein mit einer Konzentration von 28 mg/ml und 2 ml Cs_0,33WO₃-NP-Lösung mit 1,5 mg/ml wurde in einem Becher zubereitet und für 15 min in die Schale eines Ultraschallschüttlers gegeben. Anschließend wurden die NP-Lösung und das Dispergiermittel im Verhältnis 1:1,25 gemischt und 15 min ultraschallgeschüttelt. Die resultierende Lösung wurde dann mit DI-Wasser gewaschen und bei 10.000 rpm für 15 min zentrifugiert und zweimal wiederholt, bevor sie verwendet wurde.

Materialcharakterisierung

Anschließend wurde die Charakterisierung der Cs_0,33WO₃-NPs einschließlich der statistischen Partikelgrößen, Kristallstruktur, strukturellen Morphologie, Konturform, VIS–NIR-Photoabsorption mittels Zeta-Potenzialanalyse (ZS90, Malvern, UK), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Deutschland), SEM (SU-5000, Hitachi, Japan) in Verbindung mit integrierter energiedispersiver Spektrometrie (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Japan), dynamischer Lichtstreuung (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, USA), UV–VIS–NIR-Spektrometer (V-750, Jasco, Japan) durchgeführt. Die XRD-Spektren wurden durch Bestrahlung der Proben mit Röntgenstrahlen in einem Winkelbereich von 20° bis 80° bei einer Scangeschwindigkeit von 4° pro min erfasst. Das Signal der winkelabhängigen Beugung von der Probe wurde bestimmt und mit dem Standard-XRD-Spektrum von Cs_0,32WO₃ von der Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) Karte Nr. 83-1334 verglichen. Um die zeitliche Abhängigkeit der photothermischen Eigenschaft der NPs zu bestätigen, wurde ein einfacher Versuchsaufbau bestehend aus NIR-Laser mit 980 nm Wellenlänge und einer Temperatursonde aufgebaut, um den Temperaturzustand zu untersuchen, der durch die NIR-bestrahlte Lösung erzeugt wird. Die Untersuchungslösungen umfassten die mit DI-Wasser verdünnte NP-Lösung und das Gemisch aus NP-Lösung in Zellkulturmedium. Der Durchmesser des optischen Strahls für Proben in Petrischalen wurde auf die gesamte Oberfläche der Petrischale erweitert, was eine geschätzte optische Leistungsdichte von 0,05 W/cm² erzeugte, ansonsten blieb er bei 2 W/cm² unverändert. Ein in der rechten Hälfte von Abb. 1 gezeigter optischer Aufbau wurde verwendet, um die NIR-Bestrahlung durchzuführen. Im Zentrum des optischen Systems befindet sich ein NIR-Laserstrahl, der auf eine bikonkave Linse gerichtet ist, die den Strahldurchmesser von 4 mm auf 5,2 cm erweitert, was dem Oberflächendurchmesser einer Petrischale entspricht, die auf einer Heizplatte platziert ist, die auf 36,8 °C eingestellt ist, was eine physiologische Temperatur für Zellwachstum darstellt; zudem ist die Petrischale von einer zylindrischen Kunststoffummantelung umgeben, um die Temperatur der Umgebungsluft und des Mediums auszugleichen. Zusatzdatei 1: Abb. S1 veranschaulicht die Abbildung der optischen Intensität des NIR-Laserstrahls, gemessen am Ausgang der Strahlblende, die durch einen roten Pfeil neben dem Laserstrahl in Abb. 1 angezeigt wird. Das Strahlprofil zeigt die 3D-Verteilung der optischen Intensität und verifiziert die Gleichmäßigkeit des Lichtfeldes über die gesamte Öffnung der Petrischale.

Zytotoxizitäts- und Photothermie-Assays

Um die Zellkultivierungszyklen zu beginnen, wurden 500 ml Mediumlösung bestehend aus 440 ml Ham's Nährstoffmischung F-12 und Dulbecco's modifiziertem Eagle's essentiellen Medium (HDMEM), 50 ml fötalem Rindserum (FBS), 5 ml L-Glutamin und 5 ml P/S (Penicillin-Streptomycin), die durch ein Maschennetz mit Porengröße 0,22 μm sterilisiert wurde, zubereitet. Die zellenhaltigen Petrischalen, 10 cm oder 5,2 cm im Durchmesser, entsprechend gefüllt mit 8 ml bzw. 2 ml Medium, wurden für Primär- und Subkultivierung verwendet und in einem Inkubator bei 5 % CO₂ und 37 °C inkubiert. Die Beobachtung des Zellwachstums und eine Erneuerung des Kulturmediums wurden alle zwei Tage durchgeführt.

Um die Überlebensraten für die Fälle der Zellassays zu erhalten, die (1) Kontrolle ohne externe Eingabe, (2) alleinige NIR-Bestrahlung, (3) Inkubation mit NPs und (4) Inkubation mit NPs mit anschließender NIR-Bestrahlung umfassen, wurde das Kulturmedium in der Kulturschale abgesaugt, und 0,4 ml Trypsin wurde der Kulturschale zugesetzt und für ca. 10 min in den Inkubator gegeben. Nach Bestätigung der Ablösung der Zellen von den Schalenwänden wurden 10 μl der zellenhaltigen Mediumlösung aus der Kulturschale entnommen und zu 10 μl Trypanblau-Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, und eine Entfernung der verbleibenden schwimmenden NPs wurde durch mehrfaches Waschen mit Phosphatpufferlösung (PBS) durchgeführt. Anschließend wurde die Zellzählung durchgeführt, indem eine Zählplatte mit 10 μl der gefärbten Zelllösung durch ein Injektionsloch gefüllt wurde, und die Zellen konnten in der Brennebene eines Stereomikroskops beobachtet und mit einem manuellen Zähler gezählt werden; jeder Datenpunkt in allen Abbildungen zur Zellüberlebensrate war ein Durchschnitt von drei Experimentversuchen (N = 3) plus der Standardabweichung.

Zur Vorbereitung der Bewertung der Zytotoxizität der NPs und ihrer photothermischen Effekte auf die zelluläre Überlebensrate wurde das Medium in der 5,2-cm-Schale entfernt, mit der entsprechenden Menge an NP-Lösung im neuen Medium aufgefüllt, um eine Reihe von Testkonzentrationen (2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml und 0,5 mg/ml) zu erzeugen, und dann für einen Tag vor dem Experiment inkubiert.

Vor dem Photothermie-Assay wurde die Zytotoxizitätsbewertung durchgeführt, um die Reaktion der Zellen auf eine Reihe von NP-Konzentrationen zu untersuchen, und zwar wie folgt: Das die Zellen und NPs enthaltende Medium wurde aus dem Inkubator entnommen und aspiriert. Ein Milliliter vorgewärmtes PBS wurde verwendet, um die Krebszellen zu waschen und übrige schwimmende CsWO₃-NPs, die keine Endozytose durchlaufen hatten, abzusaugen; der Vorgang wurde mehrmals wiederholt, um sicherzustellen, dass keine potenzielle Zellmortalität durch NP-induzierten Temperaturanstieg im neuen Medium verursacht wird. Nach der photothermischen Behandlung wurde das Zählverfahren für den Zytotoxizitäts- und Photothermie-Assay an den Zellen implementiert.

Ergebnisse

Die optische Absorption und die photothermischen Eigenschaften von Cs_0,33WO₃-Nanomaterialien hängen stark von der Kristallstruktur, der Nachglühtemperatur, der atomaren Stöchiometrie und der Partikelgröße ab [28, 29].

Zur Charakterisierung der Oberflächenmorphologie des Cs_0,33WO₃-µ-Pulvers wurden REM-Bilder mit 10.000-facher Vergrößerung zur visuellen Bestätigung der ikonischen säulenförmigen Hexagonstruktur aufgenommen, die durch einen roten Pfeil in Abb. 2a angezeigt wird. Zusätzlich zeigen die TEM-Bilder die Konturform und Partikelgrößen der µ-Pulvergranulate in Abb. 2b, wo die Partikelgröße bei ca. 1 μm oder darunter liegt. Die stabförmige Geometrie der NPs und das DLS-Verteilungs-Histogramm der nanoskaligen Partikelgröße, zentriert um 120 nm, wurden ebenfalls verifiziert und sind in Abb. 2c und dem entsprechenden Inset-TEM-Bild dargestellt. Auch die kristalline Charakterisierung des µ-Pulvers und der NPs mit XRD ist in Abb. 2d dargestellt. Wie aus dem XRD-Spektrum des µ-Pulvers im oberen Panel zu sehen ist, stimmen die ikonischen Kristallisationsebenen entlang (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220), (222), (204), (400) und (224) gut mit dem Standardspektrum von Cs_0,32WO₃ von der JCPDS-Karte Nr. 83-1334 überein. Wenn die Partikelgröße des µ-Pulvers auf 120 nm reduziert wird, nehmen die Intensitäten aller Beugungspeaks monoton ab, und einige charakteristische Peaks, die starke NIR-Absorption anzeigen, wie die Ebenen (102) und (220), werden im Spektrum unsichtbar klein. Ebenso bestätigt die Identifizierung der atomaren Bestandteile Cäsium (Cs), Wolfram (W) und Sauerstoff (O) in Abb. 2e nicht nur ihre atomare Präsenz, sondern authentifiziert auch das Verhältnis der atomaren Prozente von Cs zu W von 0,315, was der ursprünglich entworfenen Stöchiometrie sehr nahe kommt.

Zusätzlich zur Materialcharakterisierung wurden die optischen Absorptionsspektren der NPs und die zeitliche photothermische Modulation der Temperatur gemessen und in Abb. 3 dargestellt. In (a, b) sind die Abhängigkeit der NIR-Absorption und die Profile des temperaturanstiegs durch NIR-bestrahlte NP-Lösung als Funktion der NP-Konzentration dargestellt, wobei der zeitliche Temperaturverlauf von 1 mg/ml beispielsweise 40 °C erreicht und mindestens 1 h stabil bleibt, was die photothermische Stabilität und Haltbarkeit des Materials bestätigt. Ebenso veranschaulicht der zeitliche Temperaturverlauf in Abb. 3c 5 wiederholte Zyklen innerhalb von 190 min, was die photothermische Reaktionsfähigkeit des NP-Materials verifiziert. In Abb. 3d stabilisieren sich die zeitlichen Temperaturprofile des Kulturmediums und des NP-inkorporierten Kulturmediums, entnommen aus dem Inkubator, auf der Heizplatte platziert und NIR-bestrahlt, bei ca. 37 °C über 10 min, und die Temperatur der NIR-bestrahlten reinen NP-Lösung steigt von 24,6 °C auf 33,6 °C nach 10 min. Daher wurde in Anbetracht der photothermischen Funktionalität der NPs die NIR-Bestrahlung für die folgenden Experimente für 10 min, 30 min und 60 min durchgeführt, wobei die Robustheit der NPs während der experimentellen Sitzung gewahrt blieb und potenziell auf präklinische Studien anwendbar ist.

Anschließend wurde die nicht-toxische Dosis der experimentellen Parameter einschließlich der Dauer der NIR-Bestrahlung und NP-Konzentration bestimmt, indem die Zellen für 1 h und 2 h bei 50 mW/cm² bestrahlt und durch direkte Interaktion mit NPs von 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml und 2 mg/ml Konzentration behandelt wurden, was in Abb. 4a, b dargestellt ist. Die Zellüberlebensrate bleibt über 2 h NIR-Bestrahlung hinweg weit über 95 %, was die Nicht-Toxizität der Zellen für eine langfristige Exposition gegenüber dem 980-nm-Photon bestätigt, und auch die nicht-toxische NP-Konzentration unter 1,5 mg/ml wurde bestimmt.

Der Zweck der Dosierung der Krebszellen bei 1,5 mg/ml oder darunter, die kaum schädigende Auswirkungen auf HepG2-Zellen haben, ist es, die Auswirkungen der photothermischen Dosis auf die Krebszellen ohne die Implikation der inhärenten Toxizität der NPs zu untersuchen. Um zu untersuchen, ob NIR-bestrahlte NPs eine lebensfähige Lösung zur Elimination von Krebszellen sein können, wurden die Zellen einen Tag lang mit NPs bei 1,5 mg/ml inkubiert und anschließend 1 h lang NIR-Strahlung ausgesetzt. Wie aus den Hellfeld-(BF)-Optikbildern in Abb. 5d–f zu sehen ist, ist die Zellzahl deutlich reduziert, wenn die Expositionszeit 1 h (e) oder 2 h (f) beträgt. Quantitativ nimmt die Überlebensrate monoton von 84,2 % auf 58,4 % ab, wenn die Bestrahlungsdauer von 10 min auf 1 h zunimmt, und eine lineare Trendlinie passt gut zu den gestreuten Datenpunkten, was eine Überlebensrate von 20 % vorhersagt, wenn die Bestrahlung 2 h dauert. Zusätzlich zeigt Abb. 5h, dass bei 1 h Bestrahlung die Überlebensrate von 73 auf 58 % abnimmt, wenn die optische Leistungsdichte von 12,5 auf 50 mW/cm² zunimmt, was die Funktionalität der NIR-bestrahlten NPs als photothermischer Auslöser bei der Zerstörung von Krebszellen bestätigt.

Des Weiteren wurde die Unsicherheit darüber, ob eine solche photothermische Wirkung intra- oder extrazellulär auftritt, durch die Herstellung der fNPs, Durchführung des gleichen Wasch- und Inkubationsverfahrens und Beobachtung einer intrazellulären Präsenz der fNPs adressiert. Abbildung 6 zeigt konfokale BF (b, e) und Fluoreszenz (a, d) Bilder und ihre überlagerten Komposite (c, f) der Zellen, die mit und ohne fNPs inkubiert wurden. Offensichtlich zeigen die Zellen ohne Inkubation von fNPs als Kontrolle vernachlässigbare grüne Fluoreszenz, die hauptsächlich der zellulären Autofluoreszenz zugeschrieben wird, im scharfen Kontrast zum Experiment, wo die Verteilung grüner Fluoreszenz in allen im Bild gefundenen Zytoplasmen allgegenwärtig ist. Die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten in den Bildern von Kontroll- und Experimentsamples wurden ebenfalls quantifiziert und sind im Histogramm von Abb. 6g dargestellt, wo die Fluoreszenz der fNPs, die Endozytose durchlaufen haben, mindestens neunmal so stark ist wie die der Kontrolle.

Diskussion

Das Konzept der therapeutischen Hyperthermie mittels elektromagnetischer Wellen zur Heilung von Krebserkrankungen reicht bis in die frühen 1900er Jahre zurück und hatte Erfolg bei der Rückbildung einiger Malignome, geriet jedoch aufgrund der Nützlichkeit fieberinduzierender antibakterieller Mittel und des Fehlens präziser Zugänglichkeit zu lokalen Tumoren in situ in Vergessenheit [30]. Erst in den 1980er Jahren wurde das Interesse durch mehrere In-vitro-Studien wiederbelebt, die viele Aspekte metabolischer Veränderungen, Veränderungen der Tumormikrozirkulation und Azidolyse nach Hyperthermiebehandlung entdeckten, die letale Auswirkungen auf Krebszellen hatten [31]. Mechanistisch gesehen unterliegen Krebszellen neben der direkten Zytotoxizität, bei der sie bei angewendeten Temperaturen > 42 °C Nekrose mit abnehmender Apoptose durchlaufen, die reduzierte Blutflussrate in Verbindung mit geringerer Kühlfähigkeit und niedrigem pH (< 6,8) machen die Krebszellen anfälliger für Erwärmung und infolgedessen eine höhere Zelltötungsrate [32, 33]. Klinisch jedoch fand die Hyperthermie aufgrund des jahrhundertealten Nachteils der ungenauen, nicht-spezifischen Lokalisierung nur dann eine verbesserte therapeutische Wirksamkeit, wenn sie gleichzeitig mit Chemo- oder Strahlentherapien angewendet wurde [34, 35].

NP-basierte Materialien, die präzises Targeting und Monitoring ermöglichen und ein breites Spektrum physikalischer Eigenschaften wie Oberflächenladung, Fluoreszenz, photothermische Konversion aufweisen, passen gut in die Nische solcher Ungenauigkeiten in der Hyperthermieanwendung. Trotz der bewiesenen Nützlichkeit vieler NIR-bestrahlter NP-Materialien in Krebszellstudien wird der Sicherheitsgrenzwert der Photoexposition oft nicht gut untersucht, wie im Fall von CsWO₃-NPs. CsWO₃-NPs haben zwar, wie in Abb. 4b gezeigt, eine relativ geringe Zytotoxizität bei 1,5 mg/ml im Vergleich zu einer Handvoll beliebter NP-Materialien wie Ag, Au, Graphen, deren Schwellenwerte im Bereich von 1 μg/ml liegen [18, 36, 37], erfordern dennoch 0,7 W/cm² für eine wirksame Zerstörung von Hela-Zellen, trotz ihrer starken NIR-Absorption im Wellenlängenbereich von 800 nm bis 2400 nm [15, 25, 26].

Diese Forschungsstudie beabsichtigt, eine wirksame, NIR-Bestrahlung-getriggerte, Cs_0,33WO₃-NP-basierte thermische Dosierungsformel für In-vitro-HepG2-Krebszellen als Funktion von NP-Konzentration, Bestrahlungsdauer und optischer Leistungsdichte weit innerhalb des NIR-Expositionsgrenzwerts für Hautgewebe zu entwickeln.

Das Experiment beginnt mit der Synthese der NPs, wobei ein schrittweises Syntheseverfahren einschließlich Redox-Reaktion, Glühprozess und Nassmahlmethode in Abb. 1 skizziert ist. Die Redox-Reaktion incorporiert große ternäre Elemente, in diesem Fall Cs, in Ringe oktaedrischer WO₆-Struktur in einer geeigneten physikalischen Umgebung, was die Bildung einer eigentümlichen Kristallstruktur und die Einbindung freier Elektronen in die metallische Molekülverbindung ermöglicht, was der intrinsische Grund für die starke photothermische Konversion bei NIR-Absorption ist [26, 27]. Auch die nachfolgenden Glüh- und Nassmahlprozesse halfen, die Kristallbildung zu verfeinern und die Partikelgröße zu reduzieren, was die NIR-photothermische Konversion weiter verbessert. Anschließend wurde die synthetisierte NP-Lösung einer Reihe von physikalischen und materialwissenschaftlichen Charakterisierungen unterzogen, die eine durchschnittliche Partikelgröße von 120 nm, eine kritische Optimierung der NIR-Absorption, verifizieren und die atomare Zusammensetzung authentifizieren (Abb. 2). Zusätzlich ergab die entsprechende Messung des Zeta-Potenzials für 0,5 mg/ml, 1 mg/ml und 1,5 mg/ml Werte von −53,2 mV, −54,3 mV, −60,1 mV. Generell ist der Prozess der Endozytose der Haupteinstiegsweg für die meisten NP-Typen, und die Aufnahmerate sowohl kationischer als auch ionischer NPs für nicht-phagozytäre Zellen ist höher als bei neutralen Entitäten, wobei die ersteren besser abschneiden als die letzteren [38]. Auch viele frühere Berichte fanden negativ geladene NPs weniger toxisch für nicht-phagozytäre Zellen [39, 40], was ein vorteilhafter Vorzug ist, wenn eine übermäßige intrazelluläre NP-Akkumulation für photothermische Dosis bei niedriger Toxizität in Betracht gezogen wird.

Um den Ton für den Photothermie-Assay an den HepG2-Zellen anzugeben, wurde die Bewertung der Robustheit der NPs als photothermischer Heizer, ihrer langfristigen Stabilität bei Sättigungstemperatur im Gleichgewicht mit der Umgebungsstemperatur über eine Stunde und der Wiederholbarkeit für 5 aufeinanderfolgende Zyklen innerhalb von 3 h demonstriert (Abb. 3b, c). Auch zur Quantifizierung der Wirksamkeit der NP-Hyperthermie an sich bei der Dosierung der Krebszellen durch Ausschluss des Einflusses der Umgebungstemperatur (nominal 25 °C) wurde eine Kalibrierung des Versuchsaufbaus durchgeführt, indem eine Heizplatte auf 37 °C eingestellt wurde, auf der alle Zellassays durchgeführt wurden, und die zeitlich photothermischen Eigenschaften des reinen Kulturmediums und des NP-inkorporierten Kulturmediums bei 37,1 °C blieben (Abb. 3d). Anschließend wurde die Abhängigkeit der Zytotoxizität von der Bestrahlungsdauer und NP-Konzentration separat untersucht und in Abb. 4 dargestellt, was weniger als 5 % Zelltötung für über 2 h NIR-Bestrahlung und 1,5 mg/ml als Wendepunkt zur letalen Konzentration anzeigte. Durch Festlegung der NP-Konzentration auf 1,5 mg/ml, die im restlichen Photothermie-Assay verwendet wurde, wurde die thermische Dosis für medizinische Hyperthermie als Funktionen der variablen Dosierdauer und optischen Leistungsdichte definiert. Abbildung 5 veranschaulicht die Zelltötungswirkung bei niedriger (a–c) und hoher (d–f) Vergrößerung, wenn NIR-Bestrahlung für 0 h, 1 h und 2 h implementiert wurde, die scheinbar reduzierte Zellzahl spiegelt die quantitative Analyse der Zellüberlebensrate in (g) wider, und die lineare Trendlinie sagt 80 % Zelltod für 2 h Bestrahlung voraus. Ebenso wird die Abnahme der Zellüberlebensrate bei inkrementeller optischer Leistungsdichte in (h) demonstriert. Schließlich, wie deutlich durch die BF-, Fluoreszenz- und überlagerten Kompositbilder in Abb. 6 dargestellt, in der ein Histogramm der Fluoreszenzanalyse präsentiert wurde, wurde die Endozytose der fNPs verifiziert.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend präsentiert diese Studie Materialsynthese und Charakterisierung von Cs_0,33WO₃-NPs, untersucht In-vitro-Zytotoxizitätsassays der direkten NP-Interaktion und getrennt davon mit NIR-Bestrahlung, und beweist die Endozytose der NPs sowie die Wirksamkeit der NIR-bestrahlten NPs bei der Zerstörung der HepG2-Krebszellen. Darüber hinaus schlägt diese Studie eine kombinierte Dosis der NIR-bestrahlten Cs_0,33WO₃-NP-Lösung für HepG2-Krebszellen vor: 1,5 mg/ml NP-Konzentration, Bestrahlungsdauer zwischen 30 min und 1 h, und optische Leistungsdichten der NIR-Bestrahlung unter 50 mW/cm², was weit unter dem Sicherheits-NIR-Expositionsgrenzwert für Hautgewebe liegt, während eine Krebszellmortalitätsrate von nahe 40 % ermöglicht wird und potenziell auf die Entwicklung patientenfreundlicher und personalisierter Medizin anwendbar sein könnte. Solche Studien in einem klinischen Setting werden zusätzliche Maßnahmen wie Oberflächenmodifikation mit Molekülen erfordern, die Oberflächenrezeptoren spezifischer Krebszelltypen erkennen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind vollständig ohne jegliche Einschränkung verfügbar.

Abkürzungen

NPs:

Nanopartikel

fNPs:

Fluoreszente Version von Cs_0,33WO₃-Nanopartikeln

NIR:

Nahinfrarot

UV–VIS–NIR:

Ultraviolett–sichtbar–nahinfrarot

REDOX:

Oxidation-Reduktion

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

XRD:

Röntgendiffraktion

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

EDS:

Energiedispersive Röntgenspektroskopie

RF:

Radiofrequenz

ICNRP:

Internationale Kommission zum Schutz vor nicht-ionisierender Strahlung

MIN:

Minuten

SCCM:

Standardkubikzentimeter pro Minute

μ:

Mikrometer

RPM:

Umdrehungen pro Minute

JCPDS:

Joint Committee on Powder Diffraction Standards

DI:

Deionisiert

BF:

Hellfeld