Nanotechniken inaktivieren Krebsstammzellen

Hintergrund

Das Problem des malignen Wachstums bleibt eines der dringendsten in der Medizin. In den letzten Jahrzehnten wurden einige Fortschritte bei der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden für Krebs erzielt. Dies ist auf die Überarbeitung des klassischen Krebskonzepts und die Entdeckung von Krebsstammzellen (CSCs) zurückzuführen, die zur unbegrenzten Selbsterneuerung fähig sind und durch eine Reihe von phänotypischen Markern identifiziert werden können. Die meisten dieser Zellen sind resistent gegen Strahlen- und Chemotherapien, was zu einem Rückfall des malignen Wachstums und zur Metastasierung führt. Es werden neue Methoden der Krebstherapie beherrscht, nämlich die selektive Inaktivierung von Tumorzellen mit minimaler Schädigung des normalen Gewebes [1].

Die CSCs wurden erstmals 1997 vom M. Dick-Team identifiziert und beschrieben [2]. Die Autoren untersuchten eine akute myeloische Leukämie, bei der eine Subpopulation von 0,01–1% der Gesamtpopulation von Zellen Leukämie verursachen könnte, wenn sie auf immundefiziente NOD/SCID-Mäuse (Nonobese diabetic-severe Combined Immunodefficiency) transplantiert wird. Diese tumorinduzierenden Zellen wurden phänotypisch als CD34 ⁺ . charakterisiert CD38 ^– . Im Jahr 2003 haben M. Al-Hajj und M.S. Wicha gelang es, die CSCs in einer soliden Form des menschlichen Brustkrebses (BC) zu identifizieren [3]. Es wurde festgestellt, dass die nicht getrennte Population von primärem Brustkrebs in 100 % der Fälle (10/10) ein tumorerzeugendes Potenzial aufwies, wenn sie NOD/SCID-Mäusen in einer Konzentration von 5 × 10 ⁴ . verabreicht wurde Zellen/Maus. Reduzierung der verabreichten Zellkonzentration auf 1 × 10 ⁴ Zellen/Maus verringerten ihre tumorerzeugende Aktivität um das Vierfache (3/12) [3]. CD24 ⁺ CD44 ⁺ Fraktion bei Verabreichung in verschiedenen Dosierungen (2 × 10 ⁴ bis zu 100 Zellen/Maus) ließ das Tumorwachstum nicht zu. Hiermit CD44 ⁺ CD24 ^– /geringe Subpopulation wies eine signifikant höhere tumorigene Aktivität auf, was die Bildung von Tumoren in 100 % der Fälle bei Verabreichung von 10 ³ . zeigt Zellen / Maus. Die ausgeprägteste Fähigkeit zur Tumorbildung war der Subpopulation von CD44 ⁺ . inhärent CD24 ^– / ^lo ESA ⁺ Phänotyp. Die Verabreichung von nur 200 dieser Zellen an Mäuse führte zu 100 % (4/4) 5 Monaten nach der Injektion zur Bildung solider Tumoren [3]. Diese Studien wurden von Ponti D. et al. fortgesetzt, die die Fähigkeit bestimmter Populationen von Brustkrebsbiopsieproben zeigten, in vitro die Mammosphären in serumfreier Kultur zu bilden [4]. Die meisten Zellen der erhaltenen Mammosphären waren von CD44 ⁺ /CD24 ^–/low Phänotyp sowie ein erhöhtes tumorerzeugendes Potenzial in vivo bei Verabreichung an SCID (Schwere kombinierte Immunschwäche)-Mäuse. Die Fähigkeit zur Tumorbildung in dieser Subpopulation war 1000-mal höher als bei der traditionell transplantierten MCF7-Linie des Mammakarzinoms [4]. Die Autoren haben jedoch gezeigt, dass nur 20 % der CD44 ⁺ CD24 ^–/niedrig Zellen hatten die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Dies kann auf die Heterogenität dieser Subpopulation zurückzuführen sein, nämlich das Vorhandensein zusätzlicher Marker (ESA, ALDH), die die Funktion von Zellen bestimmen, und kann auch mit der CD44-Expressionsrate in Verbindung gebracht werden. Die in den letzten Jahren veröffentlichten Arbeiten zeigen, dass die CSCs mit einer hohen Expression des Markers (CD44 ^high ) haben die höchste tumorigene Aktivität [5, 6]. Bei orthotoper Implantation von 5 × 10 ⁵ CD44 ^hoch -RAS-transformiert und CD44 ^niedrig Zellen zu NOD/SCID-Mäusen wurde festgestellt, dass eine Subpopulation CD44 ^niedrig besaß eine geringe Tumorigenität (in 30 % der Fälle wurde ein Tumor gebildet), während der CD44 ^hohe Zellen waren in 100 % der Fälle in der Lage, Tumore zu bilden [6].

Die veröffentlichten Daten zusammenfassend kann die Differenzierungsreihe von Subpopulationen von Brustkrebszellen wie folgt dargestellt werden:

Eine Reihe von Zellen mit anderen Markern, insbesondere Sca-1 ⁺ beansprucht die CSCs-Stufe. Die Daten zu einer Reduktion des Tumorwachstums bei den Sca-1-Knock-out-Mäusen sprechen für die Hypothese einer tumorinitiierenden Rolle von Sca-1 ⁺ Zellen in einem frühen Stadium der Tumorentstehung [7]. In letzter Zeit haben nicht nur CSCs, sondern auch die Zellen, die ihre akzessorisch-regulatorische Mikroumgebung bilden, viel mehr Aufmerksamkeit der Forscher auf sich gezogen. Der CD117 ⁺ Besondere Aufmerksamkeit verdienen dabei Zellen, die traditionell in einem Pool von Blutstammzellen nachgewiesen werden [8]. Die Gesamtpopulation menschlicher Brustkrebszellen umfasst die sogenannten Karzinom-assoziierten Fibroblasten des Stromas mit CD117 ⁺ Phänotyp. Sie unterstützen das Tumorwachstum und fördern dessen Angiogenese [9, 10]. Eine Annahme des Vorhandenseins von Stammzellen in der Ehrlich-Karzinom (EC)-Population, Untersuchung des tumorigenen Potenzials von CD44 ⁺ Anteil und Rolle von CD117 ⁺ Zellen bei der Aufrechterhaltung der Tumorentwicklung erfordert einen zusätzlichen Nachweis.

Die meisten Experimente zur Passage von CSCs in vivo wurden in SCID- oder NOD/SCID-Mäusen durchgeführt. Diese Mäuse reagieren nicht mit einer Immunreaktion auf die Xenotransplantation menschlicher Zellen. Die Suche nach geeigneten und relevanten experimentellen Modellen zur Untersuchung und Bewertung der Antitumoraktivität verschiedener Therapeutika ist im Gange. Eine davon ist die in vivo transplantierte Tumorzelllinie von EC, die aus einem spontanen Brustkrebs von Mäusen gewonnen wurde [11]. Es gibt jedoch praktisch keine Veröffentlichungen über die Zusammensetzung der Subpopulation von EC-Zellen und ihre phänotypischen Eigenschaften, das Vorhandensein von CSCs und ihre Bedeutung für die Aufrechterhaltung des Wachstums dieses Tumortyps. Unter Berücksichtigung der histogenetischen Ähnlichkeit von EC und BC kann angenommen werden, dass an der Initiierung und Entwicklung des simulierten Tumors die gleichen Gene beteiligt sein können, die die Proliferation von Krebszellen steuern, sowie ähnliche biochemische Wege, die zur Expression von Tumormarkerproteinen führen. Die Annahme des Vorkommens von CSCs in der EG-Population und die Untersuchung ihres tumorigenen Potenzials erfordert jedoch zusätzliche Beweise, was eines der Ziele der vorliegenden Studie war.

Ein nicht minder dringendes Problem der aktuellen Onkologie besteht darin, die Medikamente zu finden, die die CSCs nicht nur spezifisch erkennen, sondern auch inaktivieren. Der eigentliche Begriff des Problemverständnisses wurde in Richtung des Moments „Theranostik“ (Therapie + Diagnose) zu Grunde gelegt [12]. Im Rahmen der Theranostik werden technologische Ansätze zur Anwendung der Medikamente und Werkzeuge der gleichzeitigen Diagnose und Therapie von Krebs entwickelt. Eine der Richtungen der Theranostik ist das Targeting von Goldnanopartikeln auf die Tumorstelle und nach einer photothermischen Therapie [13]. Ein anderer Ansatz zur Identifizierung von Tumorzellen ist die Verwendung von Quantenpunkten, starken optischen Kontrastmitteln, die die Überwachung des Tumors in vivo ermöglichen [14]. Die Fähigkeit der Quantenpunkte, menschliche embryonale Stammzellen nicht-invasiv in vivo zu visualisieren, spricht für ihre mögliche biomedizinische Anwendung [15].

In letzter Zeit wird Nanoluminophoren auf der Basis dielektrischer Materialien und Breitzonenhalbleitern, die mit Seltenerdelementen aktiviert werden, nämlich Nanopartikeln (NPs) von Seltenerdmetallen (insbesondere Vanadium und seinen Verbindungen), größere Aufmerksamkeit geschenkt [16]. Diese Materialien besitzen eine hohe Photostabilität, eine große Stokes-Verschiebung der Lumineszenz, das Fehlen des Szintillationseffekts und die Stabilität der charakteristischen schmalen Lumineszenzbanden. Dabei sind Antitumorwirkungen von Vanadiumverbindungen bekannt. Es wurde also gezeigt, dass ein Vanadiumdichlorid die Zellproliferation infolge einer Akkumulation in nukleärem Heterochromatin mit anschließender Induktion einer mitotischen Aberration signifikant hemmen kann. vorübergehende Unterdrückung von Mitosen, was zu einer Akkumulation von Zellen im späten S . führt und G ₂ Phasen [17]. Vielversprechend für die Behandlung bösartiger Tumoren kann der Einsatz hybrider Nanokomplexe sein, die auf Seltenerd-basierten NPs von Orthovanadaten GdYVO₄ basieren :Eu ³⁺ und Cholesterin, entwickelt am Institut für Szintillationsmaterialien der Nationalen Akademie der Wissenschaften der Ukraine [18].

Der Zweck ihrer Schaffung bestand darin, die therapeutische Wirkung von Antikrebsmitteln aufgrund des Vorhandenseins von Nanokomplexen mit einer Affinität für die Zielzellmembranen in der Zusammensetzung zu verstärken. Eine davon ist Cholesterin, das durch die Vermehrung von Krebszellen aktiv aus dem Blutkreislauf „entzogen“ wird, um die Biomembranen aufzubauen. Dies wird durch die Anwesenheit einer großen Anzahl von Tumorzellen auf der Oberfläche der Rezeptoren SR-B1 (Scavenger-Rezeptor, Klasse B Typ I) und Caveolin-1 (Cav-1) ermöglicht, die an das freie Cholesterin des Blutkreislaufs binden können [19] .

Ziel dieser Arbeit war es daher, die Zusammensetzung der Subpopulation von EC-Zellen, einschließlich solcher mit den Anzeichen von CSCs, sowie ihre tumorigene Aktivität nach Vorbehandlung mit hybriden Nanokomplexen zu identifizieren.

Methoden

Die Experimente wurden an 8 Monate alten weiblichen Balb/C-Mäusen durchgeführt. Die Mäuse wurden unter Standardbedingungen des Vivariums gehalten (Raumtemperatur 20 ± 2 °C, relative Luftfeuchtigkeit 50–70 %, Hell-Dunkel-Zyklus 12:12 h). Alle Versuchsprotokolle wurden von der Tierethikkommission des Instituts für Probleme der Kryobiologie und Kryomedizin der Nationalen Akademie der Wissenschaften der Ukraine, Charkiw, Ukraine, genehmigt (Rec. Nr. 1 vom 23.01.2017) und entsprechen der Europäischen Konvention über die Verwendung von Versuchstieren (Straßburg, 1986), genehmigt vom Ersten Nationalkongress der Ukraine für Bioethik (Kiew 2004).

Kultur von EC-Zellen in vivo

Ehrlich-Karzinom (EC)-Zellen wurden in die Peritonealhöhle (PC) von Balb/C-Mäusen passagiert. Als Primärkultur wurden die in Aszitesflüssigkeit kryokonservierten EC-Zellen verwendet [20]. Nach dem Auftauen wurden die EC-Zellen dreimal in vivo retransplantiert, um einen Einfluss der Faktoren des Gefrieren-Auftauens zu mildern und dadurch morphologische und funktionelle Merkmale nativer Zellen zu gewinnen [21]. Dadurch „stabilisierte“ EC-Zellen wurden intraperitoneal in einer Dosis von 3 × 10 ⁶ . injiziert Zellen/Maus in 0,3 ml Kochsalzlösung und 7 Tage in vivo kultiviert. Nach 7 Tagen wurden die Versuchstiere unter leichter Ethernarkose aus dem Experiment genommen. Aszitesflüssigkeit aus PC wurde mit einer Spritze durch eine Nadel mit 2,69 mm Innendurchmesser entnommen und in ein 10-ml-Messröhrchen gegeben. Die absolute Zellzahl wurde durch Vergrößern des Volumens der in der Peritonealhöhle angesammelten Aszitesflüssigkeit (ml) mit der Zahl der in der Goryaev-Kammer gezählten EC-Zellen bestimmt. Eine Erhöhung der Gesamtzahl auf bis zu 35.00 × 10 ⁷ EC-Zellen im PC von Mäusen bis zum 7. Tag war ein Kriterium für die Karzinomentwicklung [21]. Zukünftig dienten die Zellen selbst als Untersuchungsgegenstand.

Phänotypische Bewertung von EG-Subpopulationen

Sie wurde mit einem Durchflusszytometer „FACS Calibur“ („Becton Dickinson“, USA) unter Verwendung monoklonaler Antikörper (US „BD Biosciences“) gegen CD44 (FITC) (Nr. 553133, Klon IM7), CD117 (FITC) (Nr. 553354, Klon 2B8) und Sca-1 (FITC)-Nr. 553333, Klon E13-161.7) und CD24 (PE) Nr. 553262, Klon M1/69) nach Herstellerangaben. Als Kontrolle wurden die Proben mit Zusatz von nichtimmunen FITC- und PE-markierten monoklonalen Antikörpern der gleichen Isotypen („BD Biosciences“), Nr. 553988, Klon A95-1 und Nr. 553989, Klon A95-1), als Antikörper gegen den getesteten Marker verwendet. Eine immunphänotypische Doppelfärbung wurde mit monoklonalen Antikörpern CD44 (FITC) und CD24 (PE) durchgeführt. Die Zellen mit einer durchschnittlichen Fluoreszenz des CD44-Markers höher als 10 ³ (nach einer logarithmischen Skala) wurden als CD44 ^hoch bezeichnet Teilpopulationen. Die Aufzeichnung und Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit der Software „WinMDi 2.9“ (Joseph Trotter, La Jolla, USA).

Trennung von CD44 ⁺ Fraktion von EC-Zellen mit immunomagnetischer Sortierung

Denken Sie daran, dass die CSCs mit einem hohen Expressionsniveau des CD44-Markers (CD44 ^high ), bestehend aus einer heterogenen Population von CD44 ⁺ Zellen die höchste tumorerzeugende Aktivität aufweisen, wurden sie mit einem magnetischen Sortierer (BDTM Imagnet) aus einer gesamten EC-Population isoliert. So isolieren Sie CD44 ⁺ Fraktion wurden primäre unmarkierte monoklonale Antikörper für den Marker CD44 (BD, 558739) und sekundäre Maus-IgG1-Magnetpartikel-DM (BD, 557983) gemäß Herstellerprotokoll verwendet. Trennreinheit für CD44 ⁺ Zellen aus der gesamten EC-Population betrug 90 %.

Bestimmung der tumorogenen Aktivität von Zellen der Gesamtpopulation und denen von isoliertem  CD44 ⁺ und CD44 ^– - EC-Fraktionen

Tumorerzeugende Fähigkeit der Gesamtpopulation und isoliertes CD44 ⁺ und CD44 ^– EC-Fraktionen wurden durch das oben beschriebene Verfahren zur Kultivierung in vivo vergleichend analysiert. Der Versuchsaufbau ist in Abb. 1 dargestellt.

Experimentelles Design bei vergleichender Analyse der tumorerzeugenden Fähigkeit der Gesamtpopulation und isoliertem CD44 ⁺ und CD44 ^– EC-Fraktionen

In der ersten Reihe von Experimenten haben wir die tumorerzeugende Fähigkeit der Gesamtbevölkerung und isoliertes CD44 ⁺ . untersucht und CD44 ^– EC-Fraktionen bei Verabreichung an Tiere in einer Standarddosis, die für die EC-Initiierung verwendet wird (3 × 10 ⁶ Zellen in 0,3 ml Kochsalzlösung).

Die Tiere wurden in die folgenden Gruppen eingeteilt (n = 10):

• Gruppe 1.1 – Verabreichung der Gesamtpopulation von EC-Zellen (3 × 10 ⁶ Zellen/Tier)

• Gruppe 2.1 – Verabreichung von CD44 ⁺ Anteil der EC-Zellen (3 × 10 ⁶ Zellen/Tier)

• Gruppe 3.1 – Verabreichung von CD44 ^– Fraktion von EC-Zellen (3 × 10 ⁶ Zellen/Tier)

7 Tage nach der Impfung in jeder der Versuchsgruppen wurde die Gesamtzahl der Zellen im PC von Tieren gezählt, die phänotypischen Eigenschaften der Zellen wurden bewertet (wie oben beschrieben) und CD44 ^hoch /CD117 ⁺ Verhältnis von EC-Zellen, bestimmt als Verhältnis von CD44 ^high Prozentsatz zu CD117 ⁺ Zellen [22]. Proliferatives Potenzial von Zellen der gesamten EC-Population und isoliertem CD44 ⁺ und CD44 ^– Fraktionen wurde basierend auf den Daten wie folgt geschätzt:Multiplizitätsfaktor (MF) des Zellpopulationsüberschusses während der Kulturzeit, M = N/N₀; und Zeitverdopplung (TD), TD = (log₂ 2)* t /[log₂ (N /N ₀ )], wobei t ist die Zeit der Zellkultivierung (h), N ist die Anzahl der Zellen bei t Zeit; N ₀ ist die anfängliche Zellennummer [23].

In der zweiten Reihe von Experimenten gab es eine geschätzte Mindestdosis der verabreichten Zellen der Gesamtpopulation und isoliertem CD44 ⁺ und CD44 ^– EC-Fraktionen, die das Tumorwachstum induzieren. Gesamtzellsuspension und isoliertes CD44 ⁺ und CD44 ^– EC-Fraktionen wurden Mäusen in Dosen von 3 × 10 ⁶ . intraperitoneal verabreicht , 3 × 10 ⁵ , 3 × 10 ⁴ , und 3 × 10 ³ Zellen pro Maus in 0,3 ml Kochsalzlösung und 7 Tage lang im PC kultiviert.

Die in dieser Versuchsreihe verwendeten Tiere wurden in die folgenden Gruppen eingeteilt (n = 10):

• Gruppe 1.1 – Verabreichung der Gesamtpopulation von EC-Zellen (3 × 10 ⁶ Zellentier)

• Gruppe 1.2 – Verabreichung der Gesamtpopulation von EC-Zellen (3 × 10 ⁵ Zellen/Tier)

• Gruppe 1.3 – Verabreichung der Gesamtpopulation von EC-Zellen (3 × 10 ⁴ Zellen/Tier)

• Gruppe 1.4 – Verabreichung der Gesamtpopulation von EC-Zellen (3 × 10 ³ Zellen/Tier)

• Gruppe 2.1 – Verabreichung von CD44 ⁺ Anteil der EC-Zellen (3 × 10 ⁶ Zellen/Tier)

• Gruppe 2.2 – Verabreichung von CD44 ⁺ Anteil der EC-Zellen (3 × 10 ⁵ Zellen/Tier)

• Gruppe 2.3 – Verabreichung von CD44 ⁺ Anteil der EC-Zellen (3 × 10 ⁴ Zellen/Tier)

• Gruppe 2.4 – Verabreichung von CD44 ⁺ Anteil der EC-Zellen (3 × 10 ³ Zellen/Tier)

• Gruppe 3.1 – Verabreichung von CD44 ^– Fraktion von EC-Zellen (3 × 10 ⁶ Zellen/Tier)

• Gruppe 3.2 – Verabreichung von CD44 ^– Fraktion von EC-Zellen (3 × 10 ⁵ Zellen/Tier)

• Gruppe 3.3 – Verabreichung von CD44 ^– Fraktion von EC-Zellen (3 × 10 ⁴ Zellen/Tier)

• Gruppe 3.4 – Verabreichung von CD44 ^– Fraktion von EC-Zellen (3 × 10 ³ Zellen/Tier)

In jeder Versuchsgruppe wurde die Gesamtzahl der Zellen bei PC und bei Tieren mit Aszitesentwicklung 7 Tage später nach der EC-Inokulation bestimmt.

Synthese von Nanokomplexen

Am Institut für Szintillationsmaterialien wurden hybride Nanokomplexe synthetisiert, die sphärische Nanopartikel (NPs) (von 2–3 nm Durchmesser) in einer Konzentration von 1,30 g/l und Schafscholesterin in einer Konzentration von 0,55 g/l („Acros organics“, Belgien) enthalten der Nationalen Akademie der Wissenschaften der Ukraine (Charkiw), wie berichtet [18]. NPs basierend auf Orthovanadaten von Seltenerdelementen GdYVO₄ :Eu ³⁺ Kugelform in 1,30 g/l Konzentration wurden wie beschrieben hergestellt [24]. Wässrige kolloidale Lösungen auf Basis von Orthovanadaten wurden durch Dialyse mit den Membranen „Cellu Sep H1“ 3,5 KDa von Verunreinigungen gereinigt.

In hybriden Nanokomplexen sind die negativ geladenen NPs aufgrund von Van-der-Waals- und hydrophoben Wechselwirkungen entlang der Peripherie von Cholesterinpartikeln lokalisiert. Die NPs stabilisieren die Nanokomplexe über elektrostatische Wechselwirkungen. Die Größen der synthetisierten Nanokomplexe überschreiten nicht 100 nm. Darüber hinaus weisen die NPs antioxidative Eigenschaften auf und unterliegen keiner Oxidation. Diese Tatsache trägt zur Erhöhung der Beständigkeit der wässrigen Dispersion von Cholesterin in Bezug auf die reaktiven Sauerstoffspezies bei. Die schematische Struktur des Hybrid-Nanokomplexes ist in Abb. 2 gezeigt.

Hybrider Nanokomplex:a schematische Darstellung und b Transmissionselektronenmikroskopie Photomikrographie von hybriden Nanokomplexen, gewonnen aus wässriger Cholesterinlösung, die auf einem Kohlenstoffnetzwerk platziert ist

Um eine Akkumulation von Hybrid-Nanokomplexen in Zellen während der In-vitro-Studien zu erfassen, konnte zusätzlich der hydrophobe Fluoreszenzfarbstoff 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) in eine wässrige Cholesterin-Dispersion eingebracht werden, Dies ermöglicht in der lokalen Lumineszenzspektroskopie die Bewertung der Integrationsdynamik des Komplexes in eine Zellmembran durch das Verhältnis der Monomer-–„J-Aggregat“-Lumineszenzbanden [25]. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass hybride Nanokomplexe in nicht mehr als 10 % der Zellen der gesamten EC-Population und praktisch in alle Zellen von isoliertem CD44 ⁺ . integriert werden können Fraktion mit dem höchsten krebserzeugenden Potenzial. Dies ermöglicht die Verwendung von Hybrid-Nanokomplexen in dieser Modifikation (NPs + Cholesterin + DiI) als Methode zur Identifizierung der lokalen Anhäufung von Nanokomplexen in Krebszellen [26, 27].

Vorbehandlung von EG-Zellen mit Nanomaterialien

Die Gesamtsuspension von EC-Zellen mit hybriden Nanokomplexen oder NPs wurde in einer Lösung von 5 % Glukose („Infusion“ CJSC, Kiew) bei Raumtemperatur 3 h lang inkubiert. Eine solche Inkubationszeit wurde zuvor als optimal für die Bindung von Nanokomplexen an Zellen gefunden [26].

Folgende Varianten der Vorbehandlung von EC-Zellen mit Nanomaterialien wurden getestet:

• Option 1–900 μl EC-Zellen (1 × 10 ⁷ ) 100 μl sphärischer NPs (1,3 g/l) wurden hinzugefügt.

• Option 2–900 μl EC-Zellen (1 × 10 ⁷ ) 100 μl Hybridkomplex (kugelförmige NPs (1,3 g/l) + Cholesterin (0,55 g/l)) wurden hinzugefügt.

Die Kontrolle waren die Zellen der EC-Gesamtpopulation, die in 5% Glucoselösung ohne Behandlung mit Nanokompositen inkubiert wurden. Die Anzahl der Tiere in jeder Versuchsgruppe betrug nicht weniger als 20.

Nach der Inkubation wurden die EC-Zellen aller getesteten Gruppen dreimal mit Kochsalzlösung (1:1) durch Zentrifugation (10 min bei 300 g) gewaschen.

Die Intensität der EC-Entwicklung nach Vorbehandlung mit Nanomaterialien wurde durch intraperitoneale Injektion in einer Dosis von 3 × 10 ⁶ . bewertet Zellen in 0,3 ml Kochsalzlösung. 7 Tage nach der Inokulation mit EC-Zellen wurden in allen untersuchten Gruppen festgestellt:

• Eine Gesamtzahl (TN) von EC-Zellen in der Bauchhöhle.

• Hemmungsrate (Ri) des EC-Wachstums nach der Formel Ri = (TN (c) – TN(e)):TN (c) × 100%, wobei TN (c)––Gesamtzahl der EAC-Zellen im PC des Kontrollgruppe, TN (e) – Gesamtzahl der EAC-Zellen im PC der experimentellen Gruppe.

• Die Wachstumsrate (Rg) von EC wurde unter Verwendung der Formel Rg (e) = Rg (c) – Ri berechnet, wobei Rg (e) – Wachstumsrate von Tumoren der Versuchstiergruppe; Rg (c) – Wachstumsrate des Tumors der Kontrollgruppe, Ri – Hemmungsrate des EC-Wachstums in der Versuchsgruppe von Tieren; Die Hemmungsrate des EC-Wachstums in der Kontrolle wurde als 100 % angenommen, dabei gab es keine Hemmung des EC-Wachstums.

• CD44 ^hoch /CD117 ⁺ Verhältnis (Verhältnis von CD44 ^hoch Prozentsatz zu CD117 ⁺ Zellen).

• Das Überleben der Tiere wurde bis zum Tag 20 nach intraperitonealer Injektion von unbehandelten und mit allen Arten von Nanokomposit-EC-Zellen behandelt.

Die statistische Verarbeitung wurde mit nicht-parametrischem Mann-Whitney U . durchgeführt Test in der Statistica 6.0-Software. Unterschiede wurden bei P . als statistisch signifikant angesehen < 0.05.

Ergebnisse

Die erhaltenen Ergebnisse weisen auf das Vorhandensein einer heterogenen Population von EC-Zellen hin, die auf ihrer Oberfläche die CD44-, CD24-, Sca-1-Marker tragen und solche, die auf akzessorisch-regulatorische Elemente der Mikroumgebung (CD117) zurückgeführt werden könnten. Die Konzentrationen von Zellen mit diesen Merkmalen im gesamten EC-Pool (Gruppe 1.1) sind in Tabelle 1 gezeigt und stimmen vollständig mit den vorherigen Ergebnissen zur Zusammensetzung der EC-Subpopulation überein [28]. Die Identifizierung der Sca-1-Struktur praktisch in allen EC-Zellen ermöglicht es, sie als vielseitigen Marker für diesen Tumortyp zu betrachten.

Am informativsten in Bezug auf die phänotypische Identifizierung von CSCs ist die CD44-Molekülexpression, die entweder selbst oder in Kombination mit anderen Oberflächenmarkern verwendet wird, um diese Zellpopulation aus verschiedenen Tumoren, einschließlich EC, zu isolieren. Nach klassischer Auffassung geht die Differenzierung von Tumorzellen während der Brustkrebsentwicklung mit einer verminderten Expression des CD-44-Rezeptors mit seinem allmählichen Verschwinden und Erscheinen der Zellen einher, die den CD24-Marker exprimieren [3].

Die Kandidaten für die Rolle von CSCs während der EC könnten die Zellen mit CD44 ^hohem . sein Phänotyp als Teil von CD44 ⁺ CD24 ^– - Population. Diese Vermutung über die Abhängigkeit von EC von der funktionellen Aktivität einer Subpopulation von CD44 ⁺ Zellen wurde bei der Bewertung der Intensität des durch CD44 ⁺ . induzierten Tumorwachstums getestet und CD44 ^– Fraktionen und EG-Gesamtbevölkerung. Tabelle 1 zeigt, dass die höchste tumorinduzierende Aktivität den Zellen von CD44 ⁺ . innewohnt Fraktion. Tatsächlich, nach der Verabreichung von 3x10 ⁶ CD44 ⁺ Zellen (Gruppe 2.1) war die absolute Zahl der Zellen in PC 23-mal höher als die der Gesamtpopulation der EC-Zellen (Gruppe 1.1) und 105-mal höher als bei CD44 ^– Fraktion wurde verabreicht (Gruppe 3.1).

Dabei wurden nicht nur Veränderungen der quantitativen, sondern auch der qualitativen Zusammensetzung eines sich entwickelnden Tumors festgestellt. Der Anteil von CD44 ⁺ bildete den Aszites mit einem überwiegenden Gehalt an CD44 ⁺ Zellen, d. h. CD44 ^high , CD44 ⁺ CD24 ^– , und CD44 ⁺ CD24 ⁺ Zellen. Außerdem ist die Konzentration von CD44 ^hoch Zellen war 2-mal höher im Vergleich zu Gruppe 1.1 und 16-mal höher in Gruppe 3.1. Der Anteil von CD44 ^– , bildete im Gegensatz dazu einen Tumor, der reifere Zellen enthielt, nämlich solche mit CD44 ^– CD24 ⁺ Phänotyp. Gerade die Umverteilung der Subpopulationszusammensetzung der Zellen in Gruppe 3.1 hat offenbar den minimalen absoluten Zellgehalt im PC bestimmt.

Wichtig ist die nachgewiesene Tatsache, dass unter den EC-Zellen eine Subpopulation mit einem CD117 ⁺ . vorhanden ist Marker. Das Molekül von CD117 ist ein Transmembran-Tyrosinkinase-Rezeptor. Unter normalen Bedingungen wird es durch den entsprechenden Liganden, d. h. den Stammzell-Wachstumsfaktor (SCGF) aktiviert [29]. In der onkologischen Pathologie tritt die ligandonabhängige Aktivierung des c-KIT-Rezeptors auf, die am häufigsten (bis zu 92 % der Fälle) eine Folge der c-kit-Onkogen-Mutation ist oder durch einen gestörten Regulationsmechanismus dieser Rezeptorfunktion verursacht wird. [30].

In Anbetracht von CD117 ⁺ Zellen als Zellen der Tumormikroumgebung die nachgewiesene Tatsache der Abhängigkeit der Tumorwachstumsintensität von der Anwesenheit oder Abwesenheit von CD117 ⁺ Zellen und ihre Konzentrationsbeziehungen zu CD44 ^high Zellen ist logisch. Wie Tabelle 1 zeigt, wurden beim Einleiten der EC durch Einführen der Gesamtzellpopulation (Gruppe 1.1.) in das PC 34,80 ± 1,27 × 10 ⁷ . gebildet Zellen auf CD44 ^high /CD117 ⁺ Verhältnis, das 0,02 relativen Einheiten entsprach.

Tumorerzeugendes Potenzial von CD44 ^– Fraktion war viermal niedriger (Gruppe 3.1), was sich in einem reduzierten CD44 ^hoch . manifestierte /CD117 ⁺ Verhältnis im gleichen Ausmaß (4-fach) im Vergleich zu Gruppe 1.1. Diese Veränderung des CD44 ^hoch /CD117 ⁺ Index war hauptsächlich auf einen Rückgang von CD44 ^hoch . zurückzuführen Konzentration (in 8,5-facher) vor dem Hintergrund des reduzierten Gehalts an CD117 ⁺ Zellen (in 2 mal) ebenfalls.

Bei der Bewertung der Intensität des Aszites-Wachstums, erzeugt durch CD44 ⁺ Fraktion wurde ein signifikanter Anstieg der Gesamtzahl der Zellen in PC (fast das 24-fache im Vergleich zu Gruppe 1.1) festgestellt. Wichtig ist auch der zweimalige Überschuss an CD44 ^high Konzentration und Mangel an CD117 ⁺ Zellen. Im Ausgangsmaterial von CD44 ⁺ Fraktion (vor der Kultivierung) gemäß durchflusszytometrischer Analyse der Daten, der Gehalt an CD44 ^hoch Zellen war 15-mal höher als in der Gesamtpopulation der EC-Zellen (Daten nicht dargestellt).

Um das oben Erwähnte zusammenzufassen, können wir argumentieren, dass CSCs mit einer hohen Expressionsrate des CD44-Markers (CD44 ^high ), während eine der wichtigsten Funktionen von CD117 ⁺ Subpopulation ist eine Regulierung („Einschränkung“) der tumorigenen Aktivität von CD44 ^hoch Zellen. Das Fehlen von CD117 ⁺ Zellen (Gruppe 2.1) scheint das Proliferations- und Differenzierungspotential des gesamten CD44-Pools zu vervielfachen ⁺ Zellen, was zu einem signifikanten Anstieg der Gesamtzahl der Zellen im PC führt.

Die Analyse des proliferativen Potenzials eines Gesamtpools von EC-Zellen und CD44 ⁺ Fraktion befürwortet diese Interpretation. Es wird gezeigt, dass der Multiplikationsfaktor (MF) in der Gesamtpopulation im PC in Gruppe 2.1 kultiviert wurde. während 7 Tagen fast um das 24-fache im Vergleich zu Gruppe 1.1 erhöht. Dies ging einher mit einer Verringerung der Zellzeit, die sich von 24,47 ± 2,75 h in Gruppe 1,1 auf 14,70 ± 1,35 h in Gruppe 2.1 verdoppelte, was eine Population von Asziteszellen charakterisieren könnte, die aus CD44 ⁺ . gezüchtet wurden Fraktion, als aktiver proliferieren (Tabelle 1).

Um die besondere Rolle von CD44 zu beweisen ⁺ Zellen in der Initiierung und Aufrechterhaltung von Tumoren bei Verabreichung von EC selbst in minimalen Dosen, war es von Interesse, die tumorigene Kapazität von isoliertem CD44 ⁺ . vergleichend zu bewerten und CD44 ^– Fraktionen, wenn sie in verschiedenen Konzentrationen verabreicht werden. Es wurde festgestellt, dass nach der Einführung von 3 × 10 ⁶ Zellen der gesamten EC-Population wurde bei 100 % der Tiere (10/10) ein Tumorwachstum beobachtet (Tabelle 2). Reducing 10 times the dose of cells administered (3 × 10 ⁵ ) resulted in a proportional decrease in absolute number of cells in the PC, tumor developed only in 50% of animals (Table 2). Reducing the administered dose of total EC population of cells down to 3 × 10 ⁴ did not lead to tumor formation in the PC.

Initiations of EC by introducing of CD44 ⁺ cells at concentrations of 3 × 10 ⁶ and 3 × 10 ⁵ cells per animal resulted in almost 100% tumor development for both cases. Herewith, tumorigenic potential of CD44 ⁺ fraction exceeded that of total population of EC cells administered in the same doses (in 23 and 21 times, respectively). Moreover, introduction of 3 × 10 ⁴ cells of CD44 ⁺ fraction caused a tumor formation in 33% of animals, while total population of EC cells used in the same dose, did not cause the formation of ascites. With the introduction of 3 × 10 ³ cells of CD44 ⁺ fraction, no animals with the developed EC have been identified.

Fraction of CD44 ^– cells just in a dose of 3 × 10 ⁶ was capable of forming tumors in 50% of animals, the number of cells in the PC in this case was 4.5 times less than when introducing the total population and in 105.9 times less than when inducing by CD44 ⁺ fraction. Thus, the results of this part of research suggest that CSCs are mainly present in the pool of cells with CD44 ⁺ phenotype. This emphasizes the importance of this subpopulation of cells in initiation and development of EC.

As noted above, identification and inactivation of CSCs is a major theoretical and practical issue of oncology. On this basis, the next task of our study was to investigate the impact of hybrid nanocomplexes designed at the Institute for Scintillation Materials of National Academy of Sciences of Ukraine on the tumorigenic activity of EC cells.

As Table 3 demonstrates an incubation of EC cells with only NPs as a component of hybrid nanocomplexes (option 1) decreased the concentration of CD44 ^high virtually twice if compared to the control and 5 times the content CD44 ⁺ CD24 ^– cells in ascites formed in vivo. The number in it of more differentiated CD44 ⁺ CD24 ⁺ , CD44 ^– CD24 ⁺ cells remained practically unchanged if compared to the control. In this group, there was established reduction of CD117 ⁺ cells (35%) at a slightly changed content of Sca-1 ⁺ subpopulation. Based on the data, the inhibition rate of EC growth (59.41 ± 3.45%) in variant 1 was accompanied by a twofold decrease in the concentrations of CD44 ^high cells in comparison with the control that was also reflected in the reduction of CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio (Table. 3).

Pretreatment of EC cells with hybrid nanocomplexes (option 2) reduced almost 10 times the concentration of CD44 ^high and CD44 ⁺ CD24 ^– cells in the developed ascites if compared to the control (Table 3). It should be noted that the concentration of more differentiated CD44 ⁺ CD24 ⁺ and CD44 ^– CD24 ⁺ cells after this treatment increased slightly if compared to the control. The redistribution pattern of EC subpopulation composition in this option was accompanied with a pronounced enhancement of tumor growth inhibition compared to option 1 (74.70 ± 4.38 and 59.41 ± 3.45%, respectively, P  < 0.05) that underlined the importance of cholesterol as a targeted compound of antitumor therapy. Pretreatment with hybrid nanocomplexes (option 2) led to maximal reduction there was found a maximum reduction of CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio (10 times) as compared with option 1, that again confirmed a specific role of ratio of these cell subpopulations in the EC growth.

For all the types of EC pretreatment, the reduction of CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio was accompanied by a decrease in tumor growth rate and increased survival of animals to day 20 of EC development (Fig. 3).

Tumor growth rate of EC, survival of animals and CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio after incubation with nanocomplexes. Note:differences are statistically significant as compared with administration of the control (*), option 1 (**) (P  < 0.05)

Discussion

One of the tasks of current oncology is elucidation of the mechanisms of initiation and development of malignant neoplasms. Mandatory participants in these events are the CSCs and so-called accessory-regulatory cells of tumor microenvironment. The variety of functional and structural characteristics of the CSCs in the development of different types of tumors determines the need for their further study. This is facilitated by the expansion of experimental model systems. One of them is the transplantable line of tumor cells of EC.

The elucidation of the peculiarities of this experimental model development, the subpopulation composition of tumor and tumorigenic potential of individual cell populations within the general pool of the EC cells will facilitate the development of new approaches to cancer therapy.

Using the method of phenotypic evaluation of progenitor cells of various levels of differentiation in the tumor focus makes it possible the identifying the stages, dynamics of development and invasiveness of the process. The established fact of heterogeneity of the EC subpopulation composition is important and there has been emphasized the value of CD44 ⁺ subpopulation in maintaining the growth of this type of tumor.

The most important role in implementing a tumorigenesis is played by an expression rate of the molecule. Indeed, in contrast to leukocytes for adhesion of those normally a low expression rate of CD44 receptor is required, triggering and self-maintenance in CSCs are implemented its much greater density on a cell surface [31].

It is known that CD44-glycoprotein is a hyaluronic acid (HA) receptor, a main component of extracellular matrix. The emerging set of HA-CD44 activates many receptor tyrosine kinases, resulting in activation of PI3K/Akt/ mTOR way [32, 33], which plays the role of a single universal signal transmission mechanism to the translation apparatus and is responsible for the integration of proliferative stimuli.

Among two known CD44-isoforms in normal hematopoietic cells its standard isoform (CD44s) is predominantly expressed [34]. In most malignant tissues there were detected both CD44s and variable isoforms of CD44- molecule (CD44v), resulting from alternative splicing of exons 6-15. Namely alternative splicing leads to a lengthening of CD44-extracellular domain, promoting its greater interaction with HA and tumor metastasis [35]. Due to that the role of CD44 ^high cells in triggering and maintaining the tumorogenesis is clear. It was previously found that a minor subpopulation of CD44 ^high cells had a high proliferative potential and played a critical role in EC developing [20].

In this paper, a special role of CD44 ⁺ -cells of the EC in initiation and maintenance of the tumor process in the EC under administration even in minimal doses has been shown. CD44 ⁺ cells were able to form a tumor even at a cell concentration of 100 times lower (10 ⁴ cells/ mouse) if compared with the introduction of a total EC population (10 ⁶ cells / mouse). The belonging of tumor cells to the CD44 ⁺ fraction was also confirmed by the fact that the EC initiation by the fraction of CD44-cells even at a dose of 10 ⁶ cells / mouse caused the formation of a tumor only in 50% of cases, with an absolute number of cells in the PC 5 times less than in under introduction of a similar amount of the total population of EC and more than 100 times less than after the introduced CD44 ⁺ -fraction.

This is in accordance with the data of Shipitsin M et al. has shown that CD44 ⁺ and CD24 ⁺ cells in breast cancer development there are cell populations with different genetic profiles [36]. The research performed by Shipitsin M CD24 ⁺ cells have been noted to be more differentiated, while more progenitor-like functions are inherent to CD44 ⁺ Zellen. The research performed by Shipitsin M CD24 ⁺ cells have been noted to be more differentiated, while more progenitor-like functions are inherent to CD44 ⁺ Zellen. The authors suggest that CD24 ⁺ cells can be derived from CD44 ⁺ cells [36]. Fillmore C. and Kuperwasser C. supposed that CD24 ⁺ population was mainly characterized by less differentiated basal type of breast cancer, and CD44 ⁺ cells caused the development of luminal form of breast cancer, being more differentiated type of tumor [37].

Analyzing the patterns of tumor development, the classic hypothesis of «seed and soil» looks very actual [38], which postulated that an appropriate microenvironment (soil) is required for optimal growth of tumor cells (CSCs).

Most often the carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) act as a tumor stroma in breast cancer and pancreatic cancer [39]. It has been shown that the CAFs, derived from invasive forms of human breast carcinomas, activated much stronger the growth of human breast cancer cell line MCF-7-Ras when administered to immunodeficient mice if compared with normal fibroblasts [9]. This function is implemented by the microenvironment cells due to the secretion by them of cytokines, chemokines and growth factors [10, 40].

Although so far the phenotypic identification of the microenvironment cells for various types of tumor has remained a subject of debate, most often used for this purpose the surface markers of primitive hematopoietic and endothelial cells, including c-kit (CD 117), CD133, VE-cadherin, VEGFR-2 and endoglin are used [41]. In this experimental model the most probable candidate to the role of tumor microenvironment cells is CD 117 ⁺ .

It is known that the c-KIT receptor (CD117 ⁺ ) is highly expressed in normal epithelium of the breast and progressively decreases with the development of breast carcinoma in situ and is almost completely lost in invasive breast cancer [42, 43]. Some authors proposed this kind of change in the expression rate of this marker as a possible test to assess the effectiveness of antitumor therapy [44].

Previously, after analysis of the significance of the content ratios for different subpopulations of EC cells when maintaining tumor growth, we proposed to use the CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio as a prognostic criterion of tumor development [22].

Adequacy of using this index is confirmed in this study using the applied nanocomposites as therapeutic agents when treating the EC. The inhibition rate of EC growth (59.41 ± 3.45%) when treated with spherical NPs (option 1) was accompanied by a 2-fold decrease if compared to the control in the CD44 ^high -cell concentration, which was reflected in the reduced CD44 ^high / CD117 ⁺ index. The maximum decrease in the CD44 ^high /CD117 ⁺ index (10 times if compared to option 1) was established using the hybrid nanocomplexes for a pre-treatment of EC cells. Thus, many cells of a total pool of EC, but primarily those with the phenotype CD44 ^high and CD117 ⁺ , can be the target of the effect of the studied nanocomplexes (both direct and indirect). A significant decrease in their concentrations in the growing pool of EC after pretreatment with hybrid nanocomplexes clearly coincides with a reduced intensity of tumor growth.

Judging by the decrease in the amount of CD44 ^high as the most potent CSCs forming the entire subsequent series of advanced tumor cells, the main component in manifestation of antitumor effect of the synthesized hybrid nanocomplexes is spherical NPs. Introduction of cholesterol having affinity to tumor cell membranes into composition of hybrid nanocomplexes enhanced an inhibitory activity of NPs. Similar data were obtained by Betker J.L. et al. after analysis of the structure and functioning principles of the membranes of tumor cells. The authors concluded that the incorporation of cholesterol into membranes of tumor cells could be a prerequisite for a targeted delivery of liposomes with therapeutic agents directly into a cell.

Thus, the importance of cooperative interactions of cells with different phenotypic signs in maintaining the EC growth has been proven. The cells with the CD44 ^high phenotype being the part of the population of CD44 ⁺ CD24 ^– can be considered as CSCs in this model system. The use of new forms of nanocomposites that are capable to bind to CSCs and induce tumor destruction as the EC is a promising direction the treatment of oncopathology.

Conclusions

1. 1.

   On the base of the findings of phenotypic assessment and functional potential studies, the Ehrlich carcinoma is a heterogeneous population of tumor cells of varying differentiation extent referred to high and less potent tumor-inducing precursors, as well as the cells composing their microenvironment.

2. 2.

   A high (tenfold) tumorigenic activity of the EC CD44 ⁺ cells if compared to CD44 ^– cells was proven. In this pair of comparison, the CD44 ⁺ cells had a higher potential of generating in PC of CD44 ^high , CD44 ⁺ CD24 ^– , CD44 ⁺ CD24 ⁺ cell subpopulations, highlighting the presence of CSCs in a pool of CD44 ⁺ cells.

3. 3.

   There was found an ability of the synthesized nanocomplexes based on rare earth orthovanadates and cholesterol to inhibit the growth of CD44 ⁺ cell pool (CD44 ^high , CD44 ⁺ CD24 ^– , CD44 ⁺ CD24 ⁺ ) that was accompanied by a reduced intensity of EC growth (by 75%) and increased survival of the animal with tumors (in 3.5 times) in comparison with the control.

4. 4.

   It has been shown that the reduction in tumor growth rate after pretreatment with hybrid nanocomplexes was accompanied with a change in the composition of EC subpopulation that was reflected in a decrease in the CD44 ^high /CD117 ⁺ Verhältnis. This ratio can be offered as one of diagnostic and prognostic tests of the severity and extent of oncology inactivation.

Abkürzungen

BC:

Breast cancer

CAFs:

Carcinoma-associated fibroblasts

CSCs:

Cancer stem cells

DiI:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

EC:

Ehrlich carcinoma

HA:

Hyaluronic acid

MF:

Multiplicity factor

NOD/SCID mice:

Nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency mice

NPs:

Nanoparticles

PC:

Peritoneal cavity

Rg:

Growth rate of EC

Ri:

Inhibition rate of EC growth

SCID mice:

Severe combined immunodeficiency mice

TD:

Time doubling