Die sukzessive Freisetzung von Gewebeinhibitoren der Metalloproteinase-1 durch ein Graphenoxid-basiertes Abgabesystem kann die Hautregeneration fördern

Hintergrund

Hautläsionen können durch viele Faktoren wie Unfälle, diabetische Komplikationen, Verbrennungen oder oberflächliche Operationen verursacht werden [1]. Die autogene Hauttransplantation oder Biopolymere zur Herstellung der künstlichen Haut stellen den gebräuchlichsten Ansatz zum Wundverschluss dar [2]. Diese Ersatzstoffe können eine Einschränkung des verfügbaren Weichgewebes des Spenders umfassen, insbesondere bei Patienten mit schweren Verbrennungen [3], Infektionen [4], Schmerzen und Hautlappennekrose [5], eine Verlangsamung der Heilung und die Biokompatibilität des Materials.

Der Gewebeinhibitor der Metalloproteinase-1 (TIMP-1) verhindert den Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) durch Bildung eines inhibitorischen Komplexes mit den Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) [6, 7]. TIMP-Proteine ​​kontrollieren auch den MMP-getriebenen Umsatz und die Verarbeitung von Wachstumsfaktoren sowie Zytokinen, die mit der Wundheilung und -regeneration verbunden sind [8]. TIMPs und MMPs werden während der normalen Wundheilung reguliert, und ihr Ungleichgewicht wurde mit Hautreparaturdefekten, Keloiden und Fibrose in Verbindung gebracht [9]. Von Epithel abgeleitetes TIMP-1 kann die Epithelisierung in verschiedenen Stadien entweder direkt oder indirekt regulieren. Eine wichtige Phase der Wundheilung durch Exzision und Hautregeneration ist die Reepithelisierung, das heißt das erneute Wachstum von Epithel über einer traumatischen Oberfläche [10]. Eine Reepithelisierung tritt auf, wenn Zellen am Wundrand ihre Zell-Zell- und Zell-ECM-Kontakte lösen und beginnen, über die Wunde zu wandern. Diese Prozesse wurden mit der Biologie von TIMP-1 in Verbindung gebracht [11].

Ein optimales regionales TIMP-1-Verabreichungssystem zur Wiederherstellung der Haut ist abhängig vom verwendeten Trägermedium. Es wurden einige Transportvehikel zur Freisetzung von Zytokinen entwickelt [12]. Träger umfassen PLGA (Poly(milchsäure-co-glycolic Acid)) [13], Chitosan [14], PLGA-Nanokugeln [15] und Hydrogele. Die Verwendung eines Abgabevehikels würde dazu beitragen, die TIMP-1-Dosierung zur Hautregeneration zu reduzieren und eine regionale Abgabe des Mittels zu ermöglichen. Graphen besteht aus Kohlenstoffatomen mit einer flachen Monoschicht und einer wabenartigen zweidimensionalen Struktur [16]. Graphenoxid (GO) wurde in der Literatur als Vehikel für die Wirkstoffabgabe mit kleinen Molekülen verwendet, da es eine effiziente Beladung (Absorption) aufweist, biokompatibel ist und eine geringe Toxizität aufweist [17,18,19]. Zu den wesentlichen Merkmalen von GO gehören hydrophobe π Domänen im Kern der Struktur mit ionisierten Regionen entlang der Kanten. Das unverwechselbare π –π Stapelwechselwirkung macht GO effizient mit Wasserlöslichkeit, mit einer großen spezifischen Oberfläche für eine hohe Ladekapazität [20, 21].

In der vorliegenden Studie haben wir untersucht, ob rekombinantes humanes TIMP-1-Protein mit GO als Transportvehikel gepaart werden kann, um die Hautregeneration zu verbessern. Um die Wirkung auf die Hautregeneration zu untersuchen, wurde TIMP-1 auf GO-Flocken aufgetragen und seine Freisetzung und Toxizität in vitro an Rattenfibroblasten gemessen. Die Ergebnisse werden schließlich an Ratten getestet, bei denen ein Hautwundemodell verwendet wird.

Materialien und Methoden

Zellkultur

Rattenfibroblasten wurden vom Institute of Biochemistry and Cell Biology, CAS (Shanghai, China) bezogen und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) mit 10 % (v .) kultiviert /v ) fötales Rinderserum (FBS, Gibco). Das Medium wurde alle 2 Tage gewechselt. Alle Zellen wurden bei 37 °C aufbewahrt.

GO-Charakterisierung

GO-Flocken wurden von Chengdu Organic Chemicals Co., Ltd., Chinesische Akademie der Wissenschaften (Chengdu, China) bezogen und nach der Platinbeschichtung unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM, JSM-6701F, JEOL, Tokio, Japan) charakterisiert. Die Proben wurden unter einem Rasterelektronenmikroskop (Hitachi S3000N) bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV gescannt. Die Größenverteilung der GO-Flocken wurde mit einem auf Zeta-Elektropotential basierenden Spektrophotometer (Zetasizer 3000 HSA, Malvern, UK) bestimmt. Die Morphologie der GO-Flakes wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM, MultiMode, VEECO, USA) gekoppelt mit einem inversen Mikroskop (IX71 inverses Mikroskop, Olympus, Tokio, Japan) bestimmt. Die thermogravimetrische Analyse und die Differentialscanningkalorimetrie wurden mit einem thermogravimetrischen TGA/DSC-Analysator (Pyris 1 TGA, Perkin-Elmer, USA) durchgeführt, indem die Proben in Aluminiumoxidpfannen gegeben und eine Heizrampe von 25 auf 1100 °C bei 10 °C angewendet wurden. min.

TIMP-1-Adsorption bei GO

GO-Flocken wurden mit 1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetram-ethylindocarbocyaninperchlorat (DiI, rot, Sigma) vor der Adsorption von humanem rekombinantem TIMP-1 (Huaan Co., Hangzhou, China) markiert. Für die TIMP-1-Adsorption wurden Fluoresceinisothiocyanat (FITC, grün, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)-konjugiertes TIMP-1 (Huaan Co., Hangzhou, China) und DiI-markiertes GO zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS ) und 4 h bei 4 °C inkubiert. Das Gewichtsverhältnis von GO zu rekombinantem TIMP-1 betrug 1:1. Um die TIMP-1-Beladung auf GO zu bestimmen, wurde TIMP-1 (1 μg) zu 20 μl PBS mit GO gegeben und 4 h bei 4 °C inkubiert. An GO adsorbiertes TIMP-1 wurde unter Verwendung eines konfokalen Laserscanning-Mikroskops (invertiertes Mikroskop IX81-FV1000, Olympus) sichtbar gemacht. Um die TIMP-1-Adsorption an GO zu bestätigen, wurde Fourier-transformierte Infrarotspektroskopie (FTIR) unter Verwendung einer Nicolet 5700-Spektroskopie (ThermoFisher Co., SGE, Australien) an Pellets (10 mm Durchmesser) durchgeführt, die durch Mischen von 2 mg GO mit 100 mg . hergestellt wurden KBr und Pressen, um das zu analysierende Pellet herzustellen. Spektren wurden nach Basislinienkorrektur durch die Software EZ OMNIC (Nicolet) analysiert.

Freisetzungskinetik des TIMP-1-Proteins

Die Freisetzungsprofile von TIMP-1 aus verschiedenen GO-Konzentrationen (10, 20 und 30 μg/ml) wurden unter Verwendung eines kommerziellen humanen TIMP-1-spezifischen Enzymimmunoassays (ELISAs, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Nach 4 h Inkubation bei 4 °C zeigte ein ELISA des Überstands, dass praktisch das gesamte TIMP-1 auf dem GO adsorbiert war. Das mit TIMP-1 beladene GO wurde in 60-mm-Kulturschalen suspendiert, die 1,5 ml PBS enthielten. Die Schalen wurden dann bei 37 °C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde der Überstand nach kontinuierlichem Rühren gesammelt und frischer Puffer wurde zu den Kulturschalen gegeben. Die Konzentration von humanem TIMP-1 im Überstand wurde durch ELISA bestimmt.

GO Biokompatibilitätsassay

Zwanzig Mikrogramm pro Milliliter GO-Flocken, die mit einer Konzentration von 20 μg/ml TIMP-1 beladen waren, wurden zu Ratten-Fibroblastenkulturen gegeben und die Zellen wurden 6, 24, 48 und 72 Stunden lang kultiviert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des Zellzählung-8-Tests (CCK8), wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben, bewertet. Die Extinktion der Probe wurde als Extinktionswert bei 450 nm (n = 5 für jede Gruppe).

Durchflusszytometrische Charakterisierung

Fibroblasten wurden durch Trypsinierung geerntet und mit Hoechst 33258 und Annexin-V-FITC/PI markiert. Die Zellzyklusaktivität und die Zellapoptose wurden anschließend mit einem Durchflusszytometrie-Analysekit (Lianke, Hangzhou, China) bestimmt. Die Markierung wurde 30 min bei 4 °C in Gegenwart eines Blockierungsreagenzes (Lianke, Hangzhou, China) durchgeführt, gefolgt von zwei Waschschritten mit PBS. Nach dem Waschen und Fixieren mindestens 10 ⁴ Zellen wurden akquiriert und analysiert. Die durchflusszytometrische Analyse wurde mit einem Becton Dickinson FACSCanto II durchgeführt.

In-vivo-Experiment

Alle experimentellen Verfahren wurden nach den Richtlinien des NIH in den USA durchgeführt. Die Tiere für experimentelle Verfahren wurden von der Ethikkommission der Universität Zhejiang genehmigt. Vier Wochen alten männlichen Sprague-Dawley-Ratten wurde eine Hautdefektoperation (SDS) wie zuvor beschrieben durchgeführt (Abb. 4a) [22]. Die Größe der Hautdefekte betrug 10 mm × 10 mm. Nach der Operation wurden die Tiere in ihre Einzelkäfige zurückgebracht. Vierzehn Tage nach dem SDS wurden die Tiere zufällig in vier Gruppen eingeteilt und die Therapie wurde eingeleitet. Lokale Injektionen von Kontrollmittel (4 ml nur PBS), GO-Mittel (4 ml GO mit PBS, 1:20), TIMP-1-Mittel (4 ml TIMP-1 mit PBS 1:20) oder TIMP-1-GO-Mittel (4 ml GO mit TIMP-1, 1:1 v /w ) wurden subkutan verabreicht. Die Injektionen wurden jede Woche um den Hautdefekt herum durchgeführt (insgesamt 4 Punkte, jeweils 1 ml) für insgesamt zwei Behandlungen über einen Zeitraum von 2 Wochen. Die Ratten wurden 4 Wochen nach der Operation getötet (Fig. 4a). Die regenerierte Haut wurde seziert, in Paraffin eingebettet und durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Masson-Färbung untersucht.

Histologische und immunhistochemische Analyse

Die regenerierten Häute wurden 72 h lang in 4 % Formalin fixiert. Anschließend wurden die Proben in 9 % Ameisensäure 2 Wochen lang bei Raumtemperatur entkalkt. Die Hautproben wurden durch abgestuftes Ethanol entwässert. Die aufeinanderfolgenden Schnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin (HE) und Masson gefärbt. Die Expression von CD34 am Hautdefekt wurde durch immunhistochemische Färbung analysiert. Die Schnitte wurden in Xylol entwachst und durch abgestufte Alkohole hydratisiert. Nach dem Blockieren mit 1% Ziegenserum (1:100 Verdünnung, Sigma) wurden die Schnitte mit primären Antikörpern gegen CD34 (Abcam, Cambridge, UK) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit sekundärem Antikörper 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Färbung wurde mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Lösung (Dako, Hamburg, Deutschland) entwickelt. Die regenerierte Haut wurde von drei geschulten Beobachtern beobachtet. Die immunhistochemischen Schnitte wurden anhand des DBA-Prozentsatzes inszeniert.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Die Einweg-ANOVA und der Student-Newman-Keuls-Post-hoc-Test bestimmten das Signifikanzniveau. p Werte unter 0,05 bzw. 0,01 wurden als signifikant bzw. hochsignifikant angesehen. Die statistische Analyse wurde mit SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) durchgeführt.

Ergebnisse

GO-Charakterisierung

Die 2D-Darstellung von GO-Bildern wird im AFM gezeigt (Abb. 1a). Ein SEM zeigte, dass die GO-Flocken unregelmäßig geformte Platten waren (Abb. 1b). Die Größenverteilung der GO-Flocken wurde mit einem auf elektrischem Potential basierenden Spektrophotometer gemessen. Die größte Intensität der Größenverteilung betrug 1140 nm und das größte Intensitätsvolumen des GO betrug 10.674,1 nm (Abb. 2a).

GO Absorption. a 2D-Darstellung von GO-Bildern, die bei AFM gezeigt wurden. b SEM zeigt, dass GO-Flocken unregelmäßig geformte Platten sind. Die GO-Flocken waren unregelmäßig geformte Blätter. c Die Größenverteilung der GO-Flocken. Die größte Intensität lag bei 1140 nm und das größte Intensitätsvolumen bei 10.674,1 nm

GO- und TIMP-1-GO-Charakterisierung. a TIMP-1 wurde an GO absorbiert. Die Analyse ergab, dass 75 ± 1,2 % von GO von TIMP-1 absorbiert wurden. b Die kumulativen Freisetzungsprofile von TIMP-1 wurden aufgezeichnet. In GO eingebettetes TIMP-1 stellt ein geeignetes System für eine verlängerte TIMP-1-Freisetzung von etwa 40 Tagen dar. c Die chemische Zusammensetzung zwischen GO und TIMP-1-GO wurde mittels FTIR-Spektroskopie untersucht. Die Wellenform und der Wellenpeak von GO unterschieden sich signifikant von denen von TIMP-1-GO. d Die Kurve der thermogravimetrischen Analyse zeigt keine großen Unterschiede zwischen GO und TIMP-1-GO von 50 bis 800 °C. Die Kurve der thermogravimetrischen Analyse zeigte keine nennenswerten Unterschiede zwischen Kontroll-GO und TIMP-1-GO

TIMP-1-Adsorption bei GO

Es folgt die Inkubation von FITC-konjugiertem TIMP-1 (grün) und DiI-markiertem GO (rot) in PBS für 4 h; TIMP-1 wurde an GO adsorbiert. Die Analyse ergab, dass 75 ± 1,2 % von GO nach 4 h an TIMP-1 absorbiert wurden, was darauf hindeutet, dass GO effizient an TIMP-1-Protein bindet (Abb. 1c). Wir untersuchten die chemische Zusammensetzung von TIMP-1-GO mittels FTIR-Spektroskopie (Abb. 2b). Die Wellenform und der Wellenpeak von GO unterschieden sich signifikant von denen von TIMP-1-GO. Wir untersuchten weiter die thermogravimetrische Analyse zwischen Kontroll-GO und TIMP-1-GO (Abb. 2d). Die Kurve der thermogravimetrischen Analyse zeigte keine nennenswerten Unterschiede zwischen Kontroll-GO und TIMP-1-GO.

TIMP-1-Version

Auf GO wurden verschiedene Konzentrationen von TIMP-1 (Gruppe 1 3 μg/ml, Gruppe 2 2 μg/ml und Gruppe 3 10 μg/ml) geladen. Die kumulativen Freisetzungsprofile von TIMP-1 sind in 2c gezeigt. Die TIMP-1-GO-Freisetzung von 2 μg/ml erreichte eine kumulative Freisetzung von 50 % schneller als die TIMP-1-Dosis von 10 und 30 μg/ml. TIMP-1 wurde ungefähr 40 Tage lang kontinuierlich freigegeben. Dies legt nahe, dass die Anwendung von TIMP-1 eingebettet in GO ein geeignetes System für eine verlängerte TIMP-1-Freisetzung darstellen könnte (Abb. 2c).

Zellproliferation und -lebensfähigkeit auf TIMP-1-GO

Die Proliferation und Lebensfähigkeit der in der Kontrolle kultivierten Rattenfibroblasten, GO und TIMP-1, unterschieden sich nicht merklich von denen der Zellen, die in den verschiedenen Proben von TIMP-1-GO gezüchtet wurden (p> 0,05). Der Zellzyklus und die Apoptose von Fibroblasten, die in Kontrollkulturen, GO und TIMP-1, kultiviert wurden, unterschieden sich nicht merklich von denen der Zellen, die in den Proben von TIMP-1-GO (p> 0,05) (Abb. 3a–c).

Die Wirkung von TIMP-1-GO auf die Proliferation und Lebensfähigkeit von Rattenfibroblastenzellen. a Die Lebensfähigkeit von Fibroblasten, die in verschiedenen Gruppen kultiviert wurden, zeigt keine signifikanten Unterschiede zu verschiedenen Zeitpunkten (p> 0,05). b Der Zellzyklus von Fibroblasten unterschied sich nicht signifikant von dem von Zellen, die in verschiedenen Gruppen gezüchtet wurden (p> 0,05). c Die Zellapoptose von Fibroblasten unterschied sich nicht signifikant von der von Zellen, die in verschiedenen Gruppen gezüchtet wurden (p> 0,05)

Wirksamkeit von TIMP-1-GO im Exzisionshautwundemodell

TIMP-1-GO wurde Ratten subkutan verabreicht, um zu bestimmen, ob es die Heilung der experimentellen Wunde fördern könnte. Vier Wochen nach der Operation zeigten mit TIMP-1-GO behandelte Hautdefekte im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikante Unterschiede im Endpunkt (p < 0,05), während mit TIMP-1 behandelte Hautdefekte signifikante Unterschiede mit der Kontrollgruppe und der GO-Gruppe im Endpunkt aufwiesen (p < 0,05). Darüber hinaus zeigte die TIMP-1-GO-Gruppe eine verbesserte therapeutische Wirkung bei der Regeneration der Haarfollikel (p < 0,05). Mit TIMP-1 behandelte Hautdefekte zeigten signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der GO-Gruppe im Endpunkt (p < 0,05) (Abb. 4b).

In-vivo-Experiment. a Schema und das SDB und das Modell. b Histologische und immunhistochemische Analyse in vivo (1 cm). Kontinuierliche Kollagenfasern sind in der TIMP-1-GO-Gruppe sichtbar. c Die quantitative Bewertung ergab signifikante Unterschiede zwischen Kontrolle und GO im Vergleich zu TIMP-1 und TIMP-1-GO (p < 0,05). Die Haarfollikel verschiedener Gruppen waren signifikant unterschiedlich (p < 0,05). Mit TIMP-1 behandelte Hautdefekte zeigten halbquantitativ signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der GO-Gruppe (p < 0,05)

Histologische und immunhistochemische Analyse

Histologische Merkmale der Hautregeneration nach Behandlung mit PBS sind in Abb. 4b dargestellt. Die Merkmale in den Kontrollgruppen nach einem Hautdefekt zeigen in den Proben 4 Wochen nach der Behandlung gebrochene Kollagenfasern. Im Gegensatz dazu ist in den TIMP-1-GO-Gruppen zum gleichen Zeitpunkt durchgehende Kollagenfaser sichtbar und zeigt einen statistischen Unterschied zur Kontrollgruppe. Die immunhistochemischen Merkmale der Vaskularisierung nach der Behandlung von TIMP-1-GO sind in Fig. 3c dargestellt. CD34+ subkutane Zellen sind in den Proben nach 4 Wochen in den mit TIMP-1-GO behandelten Gruppen sichtbar. Die quantitative Bewertung ergab signifikante Unterschiede zwischen den Kontrollgruppen und der TIMP-1-GO-Behandlungsgruppe (p < 0,05) (Abb. 4c).

Diskussion

In der vorliegenden Studie haben wir einen möglichen neuen Ansatz zur Verbesserung der Wundheilung durch die Kombination von rekombinantem TIMP-1-Protein mit kontrollierter Freisetzung aus GO analysiert. GO hat in vitro eine gute Biokompatibilität gezeigt. Und es wird gezeigt, dass TIMP-1 bis zu 40 Tage lang kontinuierlich aus dem GO-Fahrzeug freigesetzt wird. Die Kombination von TIMP-1 mit GO fördert nachweislich die Vaskularisierung und Kollagenregeneration in einem experimentellen Hautdefektmodell.

Eine Vielzahl biomedizinischer Materialien wurde als Therapievehikel für die Abgabe von Mitteln bei der Geweberegeneration bewertet. Vehikel wie Kollagen, Seide, Titan, Calciumphosphatzement und Polymilchsäure-Polyglykolsäure neigen dazu, eine schnelle Freisetzung von biologischen Wirkstoffen zu bewirken, die in manchen Therapiesituationen unerwünscht sein kann [23]. Daher kann die Fähigkeit eines biomedizinischen Vektors, eine langsame kontinuierliche Freisetzung biologischer Moleküle bereitzustellen, als ein wichtiges Merkmal angesehen werden. Voraussetzung für diese Qualität ist eine flexible Beladung des Medikaments mit Hilfe einer elektrischen Ladung [24]. Graphenoxid (GO) bietet einen „Off-Start“-Effekt, der sich sowohl in vitro als auch in vivo für die langsame Freisetzung verschiedener biologischer Wirkstoffe als nützlich erwiesen hat [25,26,27]. Hier haben wir gezeigt, dass GO verwendet werden kann, um eine anhaltende Freisetzung von rekombinantem humanem TIMP-1-Protein auszuüben. Die Wechselwirkung zwischen hydrophoben π Domänen von GO und elektrostatische Wechselwirkung können die negativ geladenen Domänen von GO aktivieren und eine effiziente TIMP-1-Proteinabsorption an GO über die inneren hydrophoben Regionen ermöglichen. Die lange Freisetzung von TIMP-1 aus GO ist ideal geeignet für die notwendige Revaskularisierung bei der dermalen Wundheilung.

Es wird vermutet, dass sich Kohlenstoffpartikel mit einer Konzentration von mehr als 50 mg/ml in Geweben ablagern könnten [28]. Wanget al. schlugen vor, dass dies aufgrund seines extrem kleinen Durchmessers, aber einer großen funktionellen Oberfläche von GO entzündliche Reaktionen verursachen kann [29]. Im Gegensatz zu früheren Studien wurde in unserer Studie keine GO-Ablagerung nachgewiesen. Angesichts des Fehlens einer offensichtlichen Nebenwirkung, die hier beobachtet wird, kann das potenzielle Negative von GO-Nanopartikeln nicht unterstützt werden. Weitere Studien haben zu Graphen vorgeschlagen, einschließlich biologischer Reaktions- und Sicherheitstests [30].

Die Erforschung der Wirkung der Wechselwirkung des Graphenoxids auf Zellen ist ein wichtiges Thema. Graphen ist ein neu entwickeltes biomedizinisches Material, dessen Eigenschaften seine Verwendung in vielen biologischen Anwendungen nahelegen. Die potenzielle Biologie der zweidimensionalen Kohlenstoffstruktur/Graphen-Toxikologie und die allgemeinen biologischen Wechselwirkungen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden, was umfangreiche zusätzliche Studien erfordert.

Schlussfolgerung

Graphenoxid (GO) zeigt eine anhaltende Biokompatibilität, wenn es als Vehikel für die langsame Abgabe von rekombinantem TIMP-1 verwendet wird. TIMP-1 wird nachweislich bis zu 40 Tage lang kontinuierlich von GO freigesetzt, und die Kombination von TIMP-1 mit GO fördert nachweislich die Revaskularisierung und Kollagenregeneration in einem Modell der Hautregeneration.