Taurin-funktionalisiertes Graphenoxid für 5-Fluorouracil-Abgabe: Herstellung, Charakterisierung & Antikrebs-Wirksamkeit

Zusammenfassung

Nanoträgersysteme für Krebsmedikamente, insbesondere Graphenoxid-basierte Systeme, sind ein Segen für Krebspatienten. In dieser Studie wurde Taurin (Tau) zur Funktionalisierung der GO-Oberfläche gewählt, um die Biokompatibilität zu verbessern. Zunächst wurde nanoskaliges GO durch modifizierte Hummers-Methode und Ultraschall-Exfoliation synthetisiert. Der Taurin-modifizierte Graphenoxid-Träger (Tau-GO) wurde chemisch hergestellt und zeigt gute Dispergierbarkeit und Stabilität in Wasser (Zeta-Potenzial −38,8 mV, Partikelgröße 242 nm). Basierend auf Einkapselungseffizienz wurde die optimale Formulierung zur Kombination von Tau-GO und 5-FU durch nicht-kovalente Bindung bestimmt. 5-FU-Tau-GO war in neutraler Umgebung stabiler als in saurer, mit pH-abhängiger Freisetzung und Sustain-Release-Effekt. In vivo wurden orale und intravenöse Verabreichung von 5-FU und 5-FU-Tau-GO per Pharmakokinetik-Tests verglichen: 5-FU-Tau-GO verlängert die Wirkzeit von 5-FU im Körper und verbessert die Bioverfügbarkeit. MTT-Assay an HepG2-Zellen: IC₅₀ von 5-FU = 196 ± 8,73 µg/ml, IC₅₀ von 5-FU-Tau-GO = 65,2 ± 0,7 µg/ml – 5-FU-Tau-GO ist potenter und hemmt Krebszellen stärker. AO/EB-Färbung zeigte, dass 5-FU-Tau-GO nicht nur Zellen zerstört, sondern signifikant Apoptose induziert im Vergleich zu 5-FU. Computergestütztes Design bestätigte, dass Tau-GO besser an 5-FU bindet als unverändertes GO, und das gebildete 5-FU-Tau-GO-System stabiler ist, was Transfer und Freisetzung in vivo begünstigt.

Einleitung

Chemotherapie ist weiterhin gängige Behandlungsmethode für verschiedene Krebsarten. Ein bedeutendes Hindernis der meisten Chemotherapeutika ist ihre Unfähigkeit, Tumorgewebe in effektiven Konzentrationen zu durchdringen, oder unerwünschte Nebenwirkungen auf gesundes Gewebe. Daher konzentrieren sich Wissenschaftler auf die Entwicklung wirksamer Drug-Delivery-Systeme, die kontrollierte Freisetzung in Tumorgewebe ermöglichen für effektive Medikamentenabgabe und Therapie.

Viele nanoskalige Materialien (Liposome, Polymere, Nanopartikel, Dendrimere, Mizellen, Graphenoxid) wurden für Drug Delivery entwickelt. Graphenoxid (GO) ist ein neuartiges Kohlenstoff-Nanomaterial, chemisch exfoliiert aus oxidiertem Graphit, mit faszinierenden Eigenschaften: reichlich Funktionsgruppen, große spezifische Oberfläche, hohe Arzneimittelbeladung, exzellente Dispergierbarkeit in Wasser. Niedrige GO-Konzentrationen können als Substrat für Zellwachstum dienen und Immunzellen aktivieren. GO wird breit in Krankheitsdiagnose, Krebszell-Imaging/Tracking, Photothermischer Therapie, Tissue Engineering, gezieltem Drug Delivery und besonders als Antitumor-Wirkstoffträger eingesetzt. Allerdings berichten mehrere Gruppen, dass hohe GO-Konzentrationen offensichtliche zytotoxische Effekte in präklinischen/klinischen Studien zeigen. Der Toxizitätsmechanismus: oxidativer Stress, Überproduktion intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Induktion von Apoptose, schwere Entzündung, Lungenödem, Granulombildung. Daher ist es kritisch, die GO-Toxizität zu lösen.

Berichten zufolge kann kovalente oder nicht-kovalente Funktionalisierung die starke hydrophobe Wechselwirkung zwischen GO und Zellen reduzieren. Studien zeigten, dass GO-Funktionalisierung Biokompatibilität verbessert und Toxizität in vivo und in vitro nahezu eliminiert. Yang et al. untersuchten erstmals langfristige Biodistribution von kovalent konjugiertem PEG-GO in Mäusen per Radiomarkierung: PEG-GO wird allmählich ausgeschieden (Urin/Kot). Zhang et al. verglichen DEX-funktionalisiertes GO mit GO: GO-DEX reduziert Zelltoxizität deutlich und wird innerhalb einer Woche mostly aus Mäusen eliminiert. GO nicht-kovalent an Pluronic F127 gebunden ergibt gute Löslichkeit/Stabilität in physiologischen Bedingungen, geringe Toxizität. Obwohl verschiedene Polymere/Moleküle zur GO-Funktionalisierung genutzt wurden, sind signifikante Ergebnisse erzielt worden. Dennoch sind Anstrengungen nötig, einfache Methoden für biokompatible GO-basierte Drug-Carrier zu entwickeln.

Taurin (Tau) ist eine semi-essentielle Aminosäure mit guter Stabilität und Wasserlöslichkeit. Tau verhindert Herz-Kreislauf-/Zerebrovaskuläre Erkrankungen, erhält Sehfunktion, schützt Zellen, reguliert Immunität. Zahlreiche Studien deuten auf antitumorale Eigenschaften durch Regulation von Expressionsfaktoren in Lungen-, Magen-, Darm-, Brustkrebs hin. Daher könnte Tau-funktionalisiertes GO eine überlegene Rolle als Antitumor-Wirkstoffträger spielen. In diesem Artikel wurde erstmals kovalent Tau-funktionalisiertes GO als Nanoträger verwendet und seine Zytotoxizität in vitro evaluiert. 5-Fluorouracil (5-FU) wurde als Antikrebsmedikament nicht-kovalent auf Tau-GO geladen. 5-FU-Tau-GO kann Nebenwirkungen auf Normgewebe reduzieren und Bioverfügbarkeit verbessern. Tau-GO wurde erfolgreich als neuartiges GO-basiertes Nanomaterial mit signifikanter biomedizinischer Anwendungsperspektive entwickelt.

Experimente und Methoden

Materialien

Graphitpulver, PBS, DMSO von Tianjin Laibo Chemical Co.; EDC, NHS, HCl, H₂O₂ (30%) von Shandong Yuwang Industrial Co.; Taurin, 5-FU, HepG2-Zellen, Penicillin-Streptomycin, FBS von Dalian Meilun Biotechnology Co.; H₂SO₄ (98%), KMnO₄ von Nanjing Chemical Reagent Co.; NaNO₃, SDS-Na von Shanghai Jinjinle Industrial Co.; MTT von Sigma-Aldrich; DMEM von HyClone; Ratten von Benxi Changsheng Experimental Animal Center. Alle anderen Reagenzien analytisch rein, kommerziell erhältlich.

GO-Synthese

GO wurde aus Graphitpulver per modifizierter Hummers-Methode hergestellt. 168 ml 98% H₂SO₄ in Dreihalskolben (Eisbad, 5 °C), 5 g Graphit, 4 g NaNO₃ zugegeben. 22,5 g KMnO₄ portionsweise über 1 h zugegeben (Temp. < 5 °C). Umschalten auf Ölbad: 35 °C 30 min, dann 65 °C 30 min, dann 85 °C 1 h → purpurbraune Paste. 1 Woche bei Raumtemperatur stehen lassen, in Becher mit 700 ml heißem Wasser überführen, 30% H₂O₂ tropfenweise bis gelbbraun. Zentrifugation 10.000 rpm, Heißwasserwäsche, Wiederholung bis pH 7,0. Vakuum-Gefriertrocknung → nano GO.

Tau-GO-Synthese

50 mg GO in 50 ml dest. Wasser, 150 mg EDC, 100 mg NHS zugegeben, Ultraschall 20 min im Eisbad zur GO-Aktivierung. 10 ml Tau-Lösung (0,1 g/ml) tropfenweise zugegeben, pH auf 6–7 mit HCl eingestellt, 24 h bei Raumtemperatur im Dunkeln gerührt. Zentrifugation 5000 rpm, 10 min, 3× mit dest. Wasser gewaschen. Tau-GO nach Gefriertrocknung gewonnen.

5-FU-Beladung

20 ml Tau-GO-Lösung 2 h ultraschallbehandelt. Gewogene 5-FU-Menge in dest. Wasser gelöst, tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zu Tau-GO-Lösung gegeben, 1,5 h bei 30 °C im Dunkeln ultraschallbehandelt. Zentrifugation 5000 rpm, 10 min, 4 °C. Unterer Sediment 3× mit 20 ml dest. Wasser gewaschen, zentrifugiert. Untere Schicht gefriertrocknet, Überstand Volumen bestimmt, 5-FU-Konzentration per HPLC (Agilent 1200): C18-Säule (4,6 × 250 nm, 5 µm), 25 °C, mobile Phase 0,1% KH₂PO₄ pH 5,5, Fluss 1,0 ml/min, Injektion 20 µl, λ = 265 nm. Einkapselungsratio (EE) und Beladungseffizienz (LE):

EE (%) = (M₁ - C₁×L₁) / M₁ × 100%

LE (%) = (M₁ - C₁×L₁) / (20C₀ + M₁ - C₁×L₁) × 100%

M₁ = Gesamtdosis 5-FU, C₁/L₁ = freie 5-FU-Konzentration/Volumen, C₀ = Trägerkonzentration.

Charakterisierung

FT-IR (4000–400 cm⁻¹, IRAffinity-1, Shimadzu) zur Bestätigung von Wechselwirkungen. UV-Vis (UV-3600, Shimadzu). Partikelgröße, Zeta-Potenzial, PDI per Nano-ZS 90 (Malvern, UK). Morphologie per TEM (JEM-2100, JEOL, Japan). TGA (NETZSCH, Deutschland) 10 °C/min, 0–800 °C, N₂-Atmosphäre. XRD (Bruker, Deutschland) CuKα (λ = 1,5406 Å), Weitwinkel. XPS (Omicron ESCA Probe, monochromatisierte Al Kα, Thermo, USA).

In-vitro-Freisetzung

Bei pH 1,2 (Magen), 6,5 (Leberkrebszellumgebung), 7,4 (physiologisch) bei 37 °C. 15 mg 5-FU-Tau-GO in Dialysemembran, 50 ml Puffer (0,1% SDS-Na) bei jeweiligem pH. Kontinuierlicher Schüttelwasserbad (100 rpm, 37 °C). Zu vorgegebenen Zeitpunkten (0 min–72 h) 1 ml entnommen, durch 1 ml frischen Puffer ersetzt. Freigesetztes Medium zentrifugiert, per HPLC analysiert.

In-vitro-Zytotoxizitätsstudien

MTT-Assay

Zytotoxizität von 5-FU, Tau-GO, 5-FU-Tau-GO an HepG2-Zellen per MTT. Zellen in DMEM + 10% FBS + 1% Antibiotika, 37 °C, 5% CO₂. 96-Well-Platte, 5 × 10³ Zellen/Well, 100 µl Medium, 24 h Inkubation. Medium entfernt, 100 µl frisches Medium mit verschiedenen Konzentrationen (5–100 µg/ml) von 5-FU, Tau-GO, 5-FU-Tau-GO. 24 h Inkubation, 20 µl MTT-Lösung, 4 h weiter. Medium aspiriert, Formazankristalle in 150 µl DMSO gelöst. Platten 15 min bei 37 °C geschüttelt. OD bei 570 nm (Microplate Reader). Triplicate. Zellinhibitionsrate = (OD_control - OD_treated) / OD_control × 100%.

AO/EB-Färbung

AO/EB-Doppelfärbung zur Beurteilung morphologischer Veränderungen. HepG2-Zellen (logarithmische Wachstumsphase), 6-Well-Platte, 10.000 Zellen/Well, 37 °C, 5% CO₂. 24 h, dann Behandlung mit fixer Konzentration 5-FU, Tau-GO, 5-FU-Tau-GO, 24 h weiter. Medium entfernt, 2× PBS gewaschen. 1 ml PBS + 40 µl Fluoreszenzfarbstoffe (1 mg/ml AO + 1 mg/ml EB, 1:1), 10 min im Dunkeln inkubiert. Fluoreszenzmikroskopie, zufällige Bilder.

Pharmakokinetische Studie

Tierexperimente gemäß Tierschutz-/Ethikkomitee. 24 männliche SD-Ratten (230–270 g), 12 h Nüchtern, randomisiert in 4 Gruppen. Gruppen A/B: i.v. Injektion 5-FU / 5-FU-Tau-GO. Gruppen C/D: oral 5-FU / 5-FU-Tau-GO. Dosis 20 mg/kg. Blutentnahme (0,5 ml) zu Zeitpunkten (15 min–48 h) in Antikoagulanzien-Röhrchen. Plasma per Zentrifugation (7500 rpm, 4 °C, 10 min). 200 µl Plasma + 50 mg (NH₄)₂SO₄ + 10 µl 40 µg/ml 5-BrU (Internstandard), Stickstoff-Trocknung 40 °C Wasserbad, 5 min Vortex, 10800 rpm 3 min Zentrifugation. 900 µl Ethylacetat/Isopropanol (85:15), 3 min Vortex, 10800 rpm 15 min. Überstand entfernt, Stickstofftrocknung, 100 µl mobile Phase, 1 min Vortex. HPLC-Analyse (1200).

Molekulardynamik-Simulation

Analyse Wechselwirkungs-Kräfte zwischen Wirkstoff und Träger, Diffusionsverhalten. Chemische Struktur 5-FU per ChemDraw (ChemOffice 2014). Tau-GO und GO Strukturen per Polymer/Molecule Builders in Materials Studio 7.0 (Accelrys, USA). Geometrieoptimierung unter COMPASS II Kraftfeld, niedrigste Energie = stabile Konformation. 10 ps NVT-Equilibration. 100 ps MD bei 298 K, 101,325 kPa, Zeitschritt 1 fs. Mittlere quadratische Verschiebung (MSD) und kohäsive Energiedichte (CED) ermittelt. Diffusionskoeffizient D = 1/(2d) lim_{τ→∞} d/dτ [|r→(t) - r→(0)|²], d = Systemdimension, r→(t)/r→(0) = Positionsvektor zum Zeitpunkt t/0, [...]² = MSD.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung

Tau-GO-Konjugat durch Amidbindung von GO und Tau hergestellt. Erfolgreiche Synthese per FT-IR validiert (Abb. 1). GO-Sauerstofffunktionalitäten bestätigt: –OH (~3405 cm⁻¹), C=O (1723 cm⁻¹), C=C (1628 cm⁻¹), C–OH (1391 cm⁻¹) (Abb. 1a). Zusätzlich zu GO-Peaks: neue Peaks bei 1638 cm⁻¹, 3427 cm⁻¹ (Amidgruppe), 1164 cm⁻¹, 1085 cm⁻¹ (–SO) – Tau erfolgreich auf GO funktionalisiert (Abb. 1b). In Abb. 2b: –SO₃-Peak bei 1164 cm⁻¹ durch Wasserstoffbrücken überlagert, nicht sichtbar. 5-FU erfolgreich auf Tau-GO geladen.

GO UV-Vis (Abb. 3): Absorptionspeak 234 nm (π–π* Übergang C=C), Schulter 300 nm (n–π* Übergang C=O Carboxyl/Carbonyl). Zwei charakteristische Peaks belegen erfolgreiche GO-Herstellung.

Partikelgrößen (Abb. 4) und Zeta-Potenziale (Abb. 5) von GO, Tau-GO, 5-FU-Tau-GO. GO: ~221 nm, PDI ~0,188 (gleichmäßige Verteilung, gute Stabilität). Zeta ~−33,3 mV (negative Ladung durch Sauerstoffgruppen). Tau-Modifikation via Amidbindung: Aminogruppen ersetzen Carboxylgruppen, –SO₃ stärkere Ionisierung → Zeta −38,8 mV. Tau-GO: ~242 nm, PDI ~0,190. 5-FU-Beladung nicht-kovalent: Zeta ~−26,7 mV (|Zeta| > 20 mV), Größe ~264 nm, PDI ~0,182. Große elektrostatische Abstoßung verhindert Aggregation. Tau und GO wasserlöslich → 5-FU-Tau-GO stabil in wässriger Lösung. Tau-GO-Träger verbessert 5-FU-Wasserlöslichkeit signifikant.

Morphologie per TEM (Abb. 6): GO flach mit Falten (planare 2D-Struktur, Abb. 6a). Tau-GO: Größe leicht erhöht, lamellare Struktur (Abb. 6b). 5-FU-Tau-GO: keine Aggregation, lamellare GO-Struktur intakt (Abb. 6c). Tau-GO und 5-FU-Tau-GO gute Stabilität.

TGA zur Quantifizierung (Abb. 7): GO und Tau-GO Restmasse 39,73% bzw. 34,22% bei 800 °C (N₂). Gewichtsänderung → Tau-Gehalt in Tau-GO ~13%.

XRD (Abb. 8): GO-Peak bei 10,7° (2θ) → vollständige Oxidation/Exfoliation. Nach Tau-Funktionalisierung: Peak leicht abgenommen bei 2θ = 8,2° → erfolgreiche Tau-Funktionalisierung.

C1s-XPS (Abb. 9): GO zeigt beträchtliche Oxidation, vier Kohlenstoff-Atome verschiedener Funktionsgruppen. Tau-GO zeigt gleiche Kohlenstoff-Atome plus C–N-Bindungskomponenten (Amin-, Amidgruppen) → GO erfolgreich durch Tau funktionalisiert.

Wirkstoffbeladung und Freisetzungsverhalten

5-FU auf Tau-GO per nicht-kovalenter Wechselwirkung adsorbiert. 5-FU-Kalibrierkurve: y = 62,135x + 21,873 (r = 0,9999), Bereich 6,5–250 µg/ml. EE und LE über ungebundene Wirkstoffkonzentration. EE steigt mit Wirkstoffkonzentration, max. EE = 83,2%. LE = 33,7% → 508,52 µg 5-FU pro 1 mg Tau-GO. Tau-GO vielversprechender Träger für hohe Arzneimittelbeladung. Mechanismen: 1) Tau funktionalisiert GO, führt –SO₃ ein (starke Ionisierung, reduziert GO-Agglomeration, erleichtert 5-FU-Beladung). 2) Zeta-Differenz 12,1 mV zwischen 5-FU-Tau-GO und Tau-GO → 5-FU auf Oberfläche, elektrostatische Wechselwirkung wichtig. 3) Zahlreiche Wasserstoffbrücken zwischen 5-FU und Tau-GO (–COOH/–NH–, –COOH/C=O, –OH/–NH–, –OH/C=O, –COOH/–F) → Stabilität in Lösung.

In-vitro-kumulative Freisetzung (Abb. 10): pH-abhängig. pH 7,4: langsame, kontinuierliche Freisetzung, ~70,84% nach 72 h. pH 1,2 und 6,5: signifikant höhere Freisetzung (~90,29% bzw. ~85,75%). Attribuiert π-π-Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken. Niedrigerer pH → höherer Protonierungsgrad der Wasserstoffbrücken → Freisetzung von 5-FU. pH-sensitives System wichtig für Antitumor-Wirkstoffe, ermöglicht Freisetzung in Tumorzellen.

In-vitro-Zytotoxizitätsstudien

MTT-Assay an HepG2 (Abb. 11): Tau-GO keine signifikante Zytotoxizität. 5-FU-Tau-GO zeigt deutliche Inhibition, dosisabhängig → Nanoträger liefert Antitumor-Wirkstoffe. IC₅₀ 5-FU-Tau-GO = 65,2 ± 0,7 µg/ml vs. freies 5-FU = 196 ± 8,73 µg/ml. Toxischer aufgrund Tauringes induzierter Apoptose in Tumorzellen, indirekte Verstärkung 5-FU-Inhibition. In-vitro-Freisetzung: 5-FU auf Tau-GO wird in Zellen graduell freigesetzt → längere Wirksamkeit als freies 5-FU → bessere Inhibition.

AO/EB-Färbung (Abb. 12): AO grüne Fluoreszenz in intakten Zellkernen, EB rot/orange in geschädigten Zellen. Früh/spät apoptotische Zellen: gelbgrüne/orange Kerne. Kontrollzellen: spindelförmig, grüne Kerne. Tau-GO allein: kleine Kernteil-Einziehungen, dunkelgrün/orangerot. 5-FU allein: signifikante orange/rote apoptotische Zellen mit Chromatinfragmenten/apoptotischen Körpern. 5-FU-Tau-GO: stärkere Schädigung HepG2-Morphologie – Zellen gebrochen, große Apoptose-Menge. Fast alle Zellen morphologisch verändert, viel Zelltrümmer/apoptotische Körper → 5-FU-Tau-GO Nano-Drug-Delivery-System gute Tötungswirkung auf HepG2.

Pharmakokinetische Studien

Pharmakokinetik 5-FU vs. 5-FU-Tau-GO an SD-Ratten. Plasma-Konzentrations-Zeit-Profile oral (Abb. 13a): Kurven ähnlich, aber 5-FU-Tau-GO höhere Plasma-Konzentration an jedem Messzeitpunkt. i.v. (Abb. 13b): 5-FU-Tau-GO sustained Release über 24 h, Konzentration in ersten Stunden allmählich abnehmend → langsame Freisetzung.

Zweikompartiment-Modell für Pharmakokinetik-Parameter (Tabelle 1). 5-FU-Tau-GO vs. 5-FU: T₁/₂β oral 2,3-fach, i.v. 3,0-fach höher. AUC₀₋ₜ oral ~2,1-fach, i.v. ~2,8-fach höher. Schluss: 5-FU-Tau-GO verlängert 5-FU-Retention signifikant, verbessert Bioverfügbarkeit. T₁/₂β oral (1,67 ± 1,15 h) > i.v. (1,33 ± 0,64 h); AUC₀₋ₜ oral (36,02 ± 1,83 mg/L·h) < i.v. (96,50 ± 8,70 mg/L·h). Gründe: i.v. direkte Blutkreislauf-Zugang ohne GI-Barriere; 5-FU schädigt GI-Trakt, beeinträchtigt effektive Arzneimittelnutzung.

MD-Simulationen

Molekulardocking und -dynamik von unverändertem GO, Tau-GO und 5-FU. Docking (Abb. 14): Bindungslängen 5-FU–GO = 3,66 Å, 5-FU–Tau-GO = 2,602 Å. Bindungsenergien: 5-FU–GO = 47,69 kcal/mol, 5-FU–Tau-GO = 25,04 kcal/mol. Stärkere Bindung Tau-GO–5-FU durch polare Tau-Atome (S, N) → stärkere nicht-kovalente Bindung.

MD-Simulation (Abb. 15): CED 5-FU-GO = 2,67×10⁸, 5-FU-Tau-GO = 2,83×10⁸ → stärkere Wechselwirkung Drug–Tau-GO. MSD vs. Zeit (Abb. 16): Diffusionskoeffizienten (Steigung/6): 0,094 m²/s (GO) vs. 0,058 m²/s (Tau-GO). Stärkere Kraft Tau-GO–5-FU, konsistent mit Docking. Funktionalisiertes GO reicher an Atomen/Gruppen → stärkere nicht-kovalente Bindung zu 5-FU, stabileres Gesamtsystem.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend wurde Tau-GO-Nanokomposit per einfacher chemischer Methode hergestellt. GO-Funktionalisierung mit Tau verbessert Stabilität und Biokompatibilität. Einzigartige Struktur und hervorragende Eigenschaften von Tau-GO-Nanoträgern bieten große Chancen für 5-FU-Beladung und -Abgabe. 5-FU-Tau-GO zeigt potentielles Antitumor-Vermögen und exzellente Zirkulationszeit. Daher ist die GO-Modifikation durch Träger Tau für 5-FU-Beladung ein effektives, anwendbares Werkzeug zum Aufbau eines 5-FU-Tau-GO-Nano-Drug-Delivery-Systems für Antikrebs-Wirkstoffabgabe und Antitumor-Therapie.