Mikrowellen-reduziertes, Chitosan-beschichtetes Graphenoxid für gezielte Adriamycin-Abgabe und verbesserte Brustkrebstherapie

Zusammenfassung

Um eine bessere antitumorale Wirksamkeit zu erreichen, ist es dringend erforderlich, die Abgabeeffizienz von Antikrebsmedikamenten bei der Zielgerichtetheit auf Krebszellen zu verbessern. In dieser Arbeit wurden Chitosan-funktionalisierte Graphenoxid-Nanosheets (ChrGO) mittels mikrowellenunterstützter Reduktion hergestellt, die als intrazelluläres Abgabenanosystem für Antikrebsmedikamente in Brustkrebszellen eingesetzt wurden. Untersuchungen zur Medikamentenbeladung und -freisetzung zeigten, dass Adriamycin effizient auf den ChrGO-Nanosheets beladen und von diesen freigesetzt werden kann. Weniger Medikamentenfreisetzung während der Abgabe und bessere Biokompatibilität von ChrGO/Adriamycin verbessern seine Sicherheit und therapeutische Wirksamkeit in HER2-überexprimierenden BT-474-Zellen signifikant. Darüber hinaus zeigten ChrGO/Adriamycin in Kombination mit Trastuzumab synergistische antitumorale Aktivität in BT-474-Zellen, die eine überlegene therapeutische Wirksamkeit im Vergleich zu jedem Medikament allein demonstrierten. Zellen, die mit Trastuzumab (5 μg/mL) oder äquivalentem ChrGO/Adriamycin (5 μg/mL) behandelt wurden, zeigten jeweils 54,5 % und 59,5 % Zelltod, während die Kombinationsbehandlung mit Trastuzumab und ChrGO/Adriamycin zu einem dramatischen 88,5 % Zelltod führte. Die dual-zielgerichtete Therapie zeigte höhere Apoptose, was auf überlegene therapeutische Wirksamkeit aufgrund unterschiedlicher Wirkmechanismen hinweist. Die Kombinationsbehandlung von ChrGO/Adriamycin und Trastuzumab in BT-474-Zellen induzierte Zellzyklusarrest und Apoptose, was letztendlich zum Tod verstärkter Krebszellen führte. Diese Arbeit hat eine einfache mikrowellenunterstützte Herstellung von ChrGO als kontrolliertes und gezieltes intrazelluläres Medikamentenabgabenanosystem bereitgestellt, das voraussichtlich eine neuartige vielversprechende Therapie für die Behandlung von HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen sein wird.

Einleitung

Der HER2-Rezeptor ist ein Mitglied der EGFR-Rezeptorfamilie, das Krebszellwachstum und -differenzierung vermittelt und in 20–30 % der menschlichen Brustkrebse stark überexprimiert ist, was zu einem metastatischen Tumorphenotyp und schlechter Prognose führt [1]. HER2 ist auch in etwa 20 % der menschlichen Magenkrebse überexprimiert [2]. Trastuzumab, ein humanisierter monoklonaler therapeutischer Antikörper, zeigt vielversprechende therapeutische Vorteile als Erstlinientherapie bei HER2-überexprimierenden Brustkrebspatienten [3]. Die Gesamtansprechrate auf Trastuzumab bleibt jedoch bescheiden: 15–30 % bei Einzeltherapie und 50–75 % bei kombinierter Behandlung mit Chemotherapeutika [4]. Bei Patienten, die auf Trastuzumab ansprechen, schreitet die Mehrheit schließlich nach anfänglichem Ansprechen fort und erwirbt im Laufe der Zeit Resistenz nach kontinuierlicher Behandlung [5]. Daher ist es essenziell und notwendig, zusätzliche neuartige Therapien für HER2-überexprimierende Patienten zu entwickeln, um die Gesamtüberlebensraten zu verbessern.

Anthrazykline dienen weiterhin als Rückgrat der Krebstherapie. Für Anthrazyklin-Wirkstoffe wurde der Topoisomerase-II-Inhibitor Adriamycin breit zur Behandlung vieler Krebsarten eingesetzt, wie Brust-, Lungen- und Lymphdrüsenkrebs [6]. Adriamycin zeigt wirksame Wirksamkeit bei der Behandlung von HER2-überexprimierenden Brustkrebspatienten aufgrund der Nähe zwischen dem HER2-Gen und dem Topoisomerase-II-Gen [7]. Trotz des klinischen Nutzens, der mit Anthrazyklin-basierten Therapien bei Brustkrebs beobachtet wurde, hat kardiale Dysfunktion umfangreichere therapeutische Anwendungen eingeschränkt. In der klinischen Studie zeigte Trastuzumab in Kombination mit Adriamycin signifikante Wirksamkeit, während hochgradig dosisabhängige Kardiotoxizität ein Problem war, das gelöst werden musste [8]. Die freigesetzte Freisetzung von Chemotherapeutika am Zielgewebe des Krebses wird als gute Lösung anerkannt, um die für therapeutische Wirksamkeit erforderlichen Dosen zu senken und die Sicherheitsprofile zu verbessern [9]. Um eine bessere antitumorale Wirksamkeit, aber weniger Nebenwirkungen zu erreichen, besteht dringender Bedarf, die Abgabeeffizienz von Antikrebsmedikamenten bei der Zielgerichtetheit auf Krebszellen zu verbessern.

Graphenoxid (GO)-basierte Nanomaterialien haben großes Potenzial in der kontrollierten Abgabe von Chemotherapeutika gezeigt [10]. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Toxizität von GO mit seiner Oberflächenfunktionalisierung assoziiert ist [11]. Kürzlich wurden umweltfreundliche Wirkstoffe wie Chitosan und PEG berichtet, um GO mit weniger giftigen Oberflächenfunktionalgruppen zu funktionalisieren [12, 13]. Die kolloidale Stabilität von Nanopartikeln in biologischen Medien ist entscheidend für die Entwicklung effektiver und sicherer Medikamentenabgabesysteme für den klinischen Einsatz [14]. Funktionalisierte GO-Nanosheets haben aufgrund ihrer Eigenschaften wie Biokompatibilität und Stabilität große Aufmerksamkeit in biomedizinischen Anwendungen gewonnen. Als hervorragender Kandidat für graphenbasierte Biomaterialien ist die kolloidale Stabilität von GO oder rGO wichtig für die Kontrolle der Leistung von Medikamententrägern. Das Poly(ethylenglykol)-funktionalisierte GO zeigte verbesserte kolloidale Eigenschaften in Zellkulturmedien [15]. P. Khanra berichtete eine neuartige Methode zur simultanen Reduktion und Biofunktionalisierung von GO durch Verwendung von Hefezellen als reduktiven Biokatalysator [16, 17]. Avinav G präsentierte eine One-Pot-Biosynthese von GO durch Nutzung von Hefeextrakt während eines Autoklavprozesses [18]. Sonikationsbehandlung von mikrometergroßen GO-Blättern über Stunden resultierte in GO-Nanosheets, die höhere kolloidale Stabilität im Vergleich zu regulären mikrometergroßen GO aufwiesen [19]. Obwohl frühere Studien das hohe Potenzial von GO für Biomaterialien demonstrierten, wurden biofunktionalisierte GO-Nanosheets mit Chitosan durch mikrowellenunterstützte Reduktion unter Verwendung von zellfreiem Hefeextrakt bisher nicht untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine neuartige Chitosan-funktionalisierte Graphenoxid-Struktur (ChrGO) durch ein einfaches Mikrowellensynthesesystem konstruiert, das Hefeextrakt als Reduktionsmittel nutzt. Darüber hinaus bietet die effektive Funktionalisierung von GO mit biokompatiblem Chitosan eine potenzielle Plattform für effiziente Medikamentenbeladung und -abgabe. Untersuchungen zur Medikamentenbeladung und -freisetzung zeigten, dass Adriamycin effizient auf den ChrGO-Nanosheets beladen und von diesen freigesetzt wurde. Die ChrGO/Adriamycin-Komposite zeigten signifikante antitumorale Aktivität in konzentrationsabhängiger Weise. Besonders die Kombinationsbehandlung mit ChrGO/Adriamycin und Trastuzumab führte zu einem verstärkten Wachstumsinhibitionseffekt in BT-474-Zellen im Vergleich zur Monotherapie. Die synergistische antitumoralen Wirksamkeit dieser Wirkstoffe wurde durch Zellzyklusarrest und Apoptose vermittelt, was letztendlich zum Krebzelltod führte. Diese Arbeit berichtete einen vielversprechenden Weg für die schnelle und kosteneffektive Herstellung von ChrGO-Kompositen, die Chemotherapeutika in einer räumlich-zeitlich kontrollierten Weise für effiziente Krebsbehandlung abgeben (Schema 1).

Materialien und Methoden

Materialien

Graphitpulver wurde von Qingdao Huatai Tech (Qingdao, China) bezogen. Chitosan und Adriamycin wurden von Aladdin Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Trastuzumab wurde von Hoffmann-La Roche Ltd (Basel, Schweiz) gekauft. Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und fötales Kälberserum (FBS) wurden von Invitrogen Corporation (Camarillo, USA) gekauft. Amicon® Ultra Zentrifugalfilter wurden von Merck Millipore gekauft. CellTiter 96® wässrige Ein-Lösungs-Zellproliferationsassay-Kit und Caspase-Glo® 3/7 Assay-System-Kit wurden von Promega Corporation (Madison, USA) bezogen. Trockenes Bäckerhefe wurde von AB/Mauri Co., Ltd. bezogen. BT-474 und Cos-7 Zelllinien wurden von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) bezogen. Luria-Bertani-Medium wurde von Sangon Biotech Co., Ltd. gekauft. Alle Chemikalien waren analytischer Grad und kommerziell erhältlich ohne weitere Reinigung.

Mikrowellenunterstützte Reduktion von Chitosan-funktionalisiertem GO

Graphenoxid (GO) wurde aus nativem Graphitflocken mittels modifizierter Hummers-Methode [14] hergestellt. Um eine einzelne Schicht nanoskaligen GO zu erhalten, wurde der GO mit einer Ultraschallsonde (Scientz, China) mit 800 W für 8 h exfoliiert. Schließlich wurde der exfoliierte GO in deionisiertem Wasser für weitere Verwendung dispersiert. Die teilweise reduzierten Chitosan-GO (ChrGO) Nanosheets wurden durch mikrowellenunterstützte Reduktion von GO mit Chitosan-wässriger Lösung unter Verwendung eines Mikrowellensynthesesystems synthetisiert. Der zellfreie Hefeextrakt wurde für die Biosynthese von ChrGO mittels mikrowellenunterstützter Reduktion verwendet. Zuerst wurden die gelagerten Hefezellen durch Inokulation in Luria-Bertani-Medium und Schütteln bei 135 U/min für 18 h bei 25 °C aktiviert. Die aktivierten Hefezellen wurden in 2% Saccharoselösung übertragen und weitere 6 h bei 25 °C bei 135 U/min geschüttelt. Anschließend wurden 6 mL zellfreier Hefeextrakt durch Zentrifugation bei 2000 U/min für 5 min erhalten. Dann wurden 50 mg Chitosan in 25 mL 2% (v/v) Essigsäurelösung gelöst und mit Hefeextrakt [20] gemischt. Eine 5 mg GO-Lösung wurde unter kräftigem magnetischem Rühren hinzugefügt. Schließlich wurde die vorbereitete Lösung in NOVA-2S Mikrowellensynthesegerät (PreeKem Scientific Instruments, China) für die Mikrowellenreaktion übertragen. Das Heizschema für das Mikrowellensystem beinhaltete Erhitzen auf 80 °C für 5 min und Halten der Temperatur für weitere 5 min. Der erhaltene ChrGO wurde mit einem 100-kDa MWCO-Filter (Millipore, USA) gereinigt und gefriergetrocknet für weitere Verwendung.

Charakterisierungen

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder von nanoskaligem GO wurden an einem JEM-2100 Transmissionselektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV (JEOL, Japan) aufgenommen. Ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektren wurden mit einem UV/Vis/NIR Spektrophotometer Lambda 950 (Perkin-Elmer, USA) erhalten. Fourier-Transform-Infrarot (FTIR) Spektren wurden mit einem Vertex 70 FTIR-Spektrometer im Scanbereich 4000 bis 400 cm⁻¹ mit als KBr-Pellets vorbereiteten Proben gesammelt (Bruker, Deutschland). Ramanspektren wurden mit einem Senterra R200-L Ramanmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm (Bruker Optics, Deutschland) aufgezeichnet. Röntgenbeugung (XRD) Muster wurden mit einem Bruker D8 Advance Diffraktometer (Bruker, Deutschland) untersucht. Die Oberflächenelemente wurden mit Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD mit monochromatischer Al Ka Strahlung (1486,6 eV) (Shimadzu, Japan) aufgezeichnet. Thermogravimetrische Analyse (TGA) wurde an einem PerkinElmer Pyris 1 TGA mit einer Heizrate von 5 °C/min von 30 bis 800 °C in Stickstoffatmosphäre durchgeführt (PerkinElmer, USA). Die Oberflächenladung der Komposite wurde mit einem Malvern Zeta Nano ZS-90 Instrument (Malvern, UK) gemessen.

Medikamentenbeladung und -freisetzung

Vier Milligramm ChrGO-Nanopartikel wurden in 20 mL Adriamycin-wässriger Lösung (0,4 mg/mL) suspendiert. Nach 0,5 h Sonikation wurde 24 h im Dunkeln gerührt, um Licht zu vermeiden. Das unbehandelte Adriamycin wurde durch Zentrifugationsfiltration durch 50-kDa MWCO Amicon-Filter (Millipore, USA) entfernt und mit Phosphat-gepuffertem Salin (PBS, pH 8,0) gewaschen, bis der Überstand farblos wurde. Die Adriamycin-Konzentration wurde mittels einer Standard-Adriamycin-Konzentrationskurve durch UV-Vis-Spektrometrie bei 490 nm mit einem SpectraMax® M5 Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA) bestimmt. Die Menge der Adriamycin-Beladung auf ChrGO wurde mit UV-Vis-Absorption durch Messung der Konzentration des Adriamycin-Verlusts im Überstand des Amicon® Ultra-15 mL Zentrifugalfilters bestimmt.

Die Adriamycin-Freisetzungscharakteristika von ChrGO wurden untersucht. Das Adriamycin-beladene ChrGO wurde in 10 mL PBS-Pufferlösung getaucht. In festgelegten Intervallen wurden 2 mL freigesetzte Adriamycin-Lösung, die sich von ChrGO gelöst hatte, durch Zentrifugationsfiltration durch 50-kDa MWCO Amicon-Filter (Millipore, USA) gesammelt. Das Volumen der ChrGO/Adriamycin-Lösung wurde konstant gehalten, indem nach jeder Probenahme 2 mL frische PBS-Pufferlösung hinzugefügt wurden. Die Menge des von ChrGO freigesetzten Adriamycins wurde durch UV-Vis-Absorption bei 490 nm mit einem SpectraMax® M5 Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA) gemessen. Die Freisetzungsstudien wurden in verschiedenen pH-Lösungen (pH-Werte 5 und 7,4) untersucht.

Biokompatibilitätsanalyse und therapeutische Wirksamkeitsassay

BT-474 und Cos-7 Zellen wurden in RPMI-1640 mit 10% FBS bzw. DMEM mit 10% FBS gehalten und in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO₂ bei 37 °C kultiviert. Der Biokompatibilitätsassay von GO und ChrGO wurde an BT-474 oder Cos-7 Zellen über Zellzytotoxizitätsassay durchgeführt. Zellen wurden in 96-Well-Flat-Platten mit einer Dichte von 3 × 10⁴ Zellen pro Well eingebracht und 18 h vor der Behandlung mit GO und ChrGO vorinkubiert. Dann wurden die Verdünnungen der getesteten Wirkstoffe den Zellen hinzugefügt und weitere 24 h inkubiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch CellTiter 96® wässrige Ein-Lösung bestimmt. Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem SpectraMax® M5 Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA) gemessen.

Die Wirksamkeit von ChrGO/Adriamycin-Komplexen allein oder in Kombinationsbehandlung mit Trastuzumab auf Proliferation in BT-474-Zellen wurde durch Proliferationsinhibitionsassay [16] untersucht. BT-474-Zellen wurden in 96-Well-Flat-Platten mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen pro Well eingebracht und 24 h inkubiert. Dann wurden ChrGO/Adriamycin-Komplexe allein oder in kombinierter Behandlung mit Trastuzumab den BT-474-Zellen im Kulturmedium zugegeben. Nach 96-h Inkubation wurden die lebensfähigen Zellen durch CellTiter 96® wässrige Ein-Lösung bestimmt. Die Absorption wurde mit einem SpectraMax® M5 Mikroplattenleser bei 490 nm gemessen (Molecular Devices, USA). Die Daten wurden mit einseitiger ANOVA analysiert. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.

Zellzyklusanalyse und Apoptoseassay

Für die Zellzyklusanalyse wurden BT-474-Zellen in Sechs-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Well eingebracht und 16 h haften gelassen. Die Zellen wurden 24 h mit ChrGO/Adriamycin-Komplexen allein oder in Kombination mit Trastuzumab behandelt. BT-474-Zellen wurden geerntet und mit 70% (v/v) Ethanol bei 4 °C für 24 h fixiert. Die fixierten BT-474-Zellen wurden mit Propidiumiodid-Lösung (15 μg/mL) mit Ribonuklease A (10 μg/mL) bei 25 °C für eine Stunde gefärbt. Dann wurden die Zellen mit einem Durchflusszytometer (BD Biosciences, USA) analysiert. Für den Apoptoseassay wurden BT-474-Zellen in weißwandige 96-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen pro Well eingebracht und 18 h haften gelassen. Die Zellen wurden 24 h mit ChrGO/Adriamycin-Komplexen, Trastuzumab allein oder in Kombinationsbehandlung behandelt. Dann wurde das Kulturmedium verworfen, und 100 µL Caspase-Glo® 3/7 Reagenz wurde jedem Well hinzugefügt und bei RT für 2 h inkubiert. Lumineszenz wurde mit einem SpectraMax® M5 Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA) gemessen. Die Ergebnisse wurden mit einseitiger ANOVA analysiert. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet. Alle Studien wurden in Übereinstimmung mit relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung

Die Morphologie der synthetisierten GO-Blätter wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) charakterisiert. Abb. 1a zeigt die gleichmäßige Größenverteilung der GO-Nanosheets unter 100 nm, mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 45 nm. Die hohe Elektronendichte von GO zeigte besseren Kontrast im Vergleich zu Chitosan, das aufgrund seiner niedrigen Elektronendichte und hydratisierten Natur kaum sichtbar ist [21]. Aufgrund der größeren Oberfläche wurden nanoskalige GO oder reduzierte GO-Blätter breit als Medikamententräger verwendet [22]. Das SAED-Muster (Selected-Area Electron Diffraction) in Abb. 1c zeigt konzentrische Ringe, die das Vorhandensein einer polykristallinen Natur entsprechend Graphenoxid demonstrieren [23].

Um GO-Nanosheets in physiologischer Lösung zu stabilisieren, wurden Chitosan-funktionalisierte GO-Nanosheets durch mikrowellenunterstützte Reduktion mit einem Mikrowellensystem [24] hergestellt. Die resultierenden reduzierten GO-Chitosan (ChrGO) wurden durch UV-Vis-Spektrometrie analysiert. Abb. 2a zeigt die UV-Vis-Spektren von GO und ChrGO. GO zeigte einen scharfen Absorptionspeak bei 230 nm und eine Schulter bei 300 nm, was der π-π* Übergang von aromatischen C=C Bindungen und n-π* Übergang von C=O Bindungen zugeschrieben wird [25, 26]. Nachdem Chitosan auf GO aufgepfropft wurde, verschob sich der Peak bei 230 nm für ChrGO auf 270 nm (Rotverschiebung), und die Schulter bei 300 nm verschwand offensichtlich, was auf die teilweise Wiederherstellung der elektronischen Konjugation unter den aromatischen Kohlenstoffatomen zurückgeführt wird [27]. Eine schwarze Lösung des synthetisierten ChrGO ist in Abb. 2b gezeigt, was die Bildung von teilweise reduziertem Graphenoxid (p-rGO) anzeigt. Sowohl die GO-Nanosheets als auch ChrGO waren gut in deionisiertem H₂O dispersiert. Die kolloidale Stabilität von GO oder GO-Derivaten in wässriger Lösung ist sehr wichtig für ihre biomedizinische Anwendung. Die Ergebnisse legten nahe, dass das Chitosan nach der Reduktion mit GO konjugiert wurde.

FTIR-Spektroskopie wurde durchgeführt, um die Struktur von GO, Chitosan und ChrGO zu charakterisieren (Abb. 3a). Die charakteristischen Peaks von GO lagen bei 3440 cm⁻¹ und 1376 cm⁻¹, entsprechend O-H und C-OH Bindungen. Der Peak bei 1072 cm⁻¹ wurde der Streckungsschwingung von C-N-C zugeordnet. Auffällig waren die Peaks der Chitosan-Moleküle bei 2912 cm⁻¹ und 2848 cm⁻¹, die den Streckungsschwingungen von CH₃- und -CH₂- zugeordnet wurden [28, 29]. Funktionalisiertes p-rGO mit Chitosan führte zu neuen Bindungen, was neue Peaks in den ChrGO-Spektren bewirkte. Es gibt eine signifikante Abnahme der Intensitäten des C=O Bands bei 1636 cm⁻¹ in ChrGO im Vergleich zu GO, was darauf hindeutet, dass der Reduktionsprozess die sauerstoffhaltigen Gruppen von GO entfernte [30]. Das FTIR-Spektrum von ChrGO bestätigte die erfolgreiche Konjugation von Chitosan auf GO. Zusätzlich wurde Ramanspektroskopie verwendet, um die elektronischen Eigenschaften und Struktur von Graphen zu charakterisieren. Die G-Bande wird den E_2g Phononen von sp² Kohlenstoffdomänen zugeschrieben, während die D-Bande der Schwingung von sp³ Kohlenstoffatomdomänen und ungeordneten Kohlenstoffatomen zugeordnet wird. Die Intensität der D-Bande gibt die Charakteristika von Unordnungen und Defekten in Kohlenstoffblättern an [31]. Die Reduktion von GO-Nanosheets wurde auch im Signalverhältnis der D- versus G-Bande analysiert [32]. Das repräsentative Ramanspektrum von GO zeigt zwei charakteristische Peaks der D-Bande (1341 cm⁻¹) und der G-Bande (1591 cm⁻¹) in Abb. 3b. Die Änderung der relativen Intensität des I_D/I_G Wertes illustriert die Änderung des elektronischen Konjugationszustands von GO im Reduktionsprozess [33]. Die Verschiebung der D-Bande zeigt die erfolgreiche Funktionalisierung von reduziertem GO an. Der Wert von I_D/I_G steigt von 0,99 (GO) auf 1,12 (ChrGO), was auf die Einführung von sp3-Defekten nach Funktionalisierung und unvollständige Wiederherstellung der graphencharakteristischen Struktur zurückgeführt wird [34]. Diese Beobachtung stimmt gut mit dem vorherigen Bericht überein und deutet auf die Bildung von Chitosan-funktionalisiertem Graphen hin [16].

Die Oberflächenzusammensetzung von ChrGO wurde durch XPS bestätigt. Der Vollscan des XPS-Spektrums von ChrGO zeigt drei Peaks bei 284, 399 und 533 eV, die C1s, N1s und O1s zugeordnet sind (Abb. 4a). Die relative Elementaranalyse zeigte eine Erhöhung der ChrGO-Sauerstoff- und Stickstoffwerte mit einer assoziierten Abnahme des Kohlenstoffgehalts im Vergleich zu GO. Die hochauflösenden C1s-Spektren von ChrGO in Abb. 4b zeigen vier getrennte Peaks, die C-C oder C=C (sp², 284,7 eV), C-O (Epoxy/Hydroxyl, 286,4 eV), C=O (sp³, 288,2 eV) und O=C-O (Carboxylate, 289,1 eV) Bindungen entsprechen. Das Erscheinen eines Amid-Peaks in ChrGO liefert Beweise für die Funktionalisierung von Chitosan auf GO [35]. Die reichlichen hydrophilen Funktionsgruppen auf der Oberfläche machten ChrGO hochlöslich in wässriger Lösung, was mit den FTIR-Ergebnissen konsistent ist. Biomoleküle wie reduktive Aminosäuren und Alpha-Linolensäure im Hefeextrakt können eine signifikante Rolle in der mikrowellenunterstützten Herstellung von ChrGO spielen [20].

Das Röntgenbeugungsmuster (XRD) von GO und ChrGO ist in Abb. 5a dargestellt. In GO XRD-Spektren zeigen der Hauptpeak bei 11,0° und der schwache Peak bei 20,7° deutlich die Graphitstruktur. Der charakteristische Beugungspeak bei 11,0° entsprechend der (001) Ebene von GO, der die erfolgreiche Synthese von GO zeigt [36]. Der kleine Buckel zwischen 20° und 24° zeigt die graphitischen Moieties, was dem unoxidierten reinen Graphit zugeschrieben wird [37]. Mit der Funktionalisierung von Chitosan verschwindet der (001) Peak von GO, während der breite Beugungspeak bei 21,4° prominent wird. Diese Verschiebung kann auf die Reduktion des GO zurückgeführt werden, wobei die Reduktion das rGO enger packt als GO. Die (002) Reflexion des ChrGO-Proben ist sehr breit, was darauf hindeutet, dass die Probe entlang der Stapelrichtung sehr schlecht geordnet ist, was auf unvollständige Reduktion von GO zurückzuführen sein kann [33]. Die Zersetzungsverhalten von GO, Chitosan und ChrGO wurden durch thermogravimetrische Analyse (TGA) [38] untersucht. Die TGA-Kurven von ChrGO, GO und Chitosan sind in Abb. 5b dargestellt, die in Stickstoffatmosphäre gemessen wurden. GO begann unter 100 °C an Gewicht zu verlieren, was auf die Elimination von adsorbiertem freiem Wasser in der gestapelten Struktur zurückgeführt wurde [39]. GO verlor 42% seines Gewichts im Bereich 191–231 °C, was mit der Zersetzung labiler sauerstoffhaltiger Gruppen zusammenhing. Die Gewichtsverlustrate von ChrGO bei 100–250 °C ist signifikant niedriger als bei GO, und es ist offensichtlich, dass ChrGO ein anderes Zersetzungsmuster als GO zeigte. Die thermische Elimination von ChrGO und reinem Chitosan fand von 250 bis 440 °C statt, was mit der Depolymerisation und Pyrolyse stabilerer Funktionsgruppen wie Glykosid-Einheiten von Chitosan und Carboxylgruppen zusammenhing [40]. Im Vergleich zu GO war ChrGO thermisch stabil und zeigte einen Hauptgewichtsverlust von 36% in der ersten Zersetzungsstufe bei 250–440 °C, während für GO wenig Gewichtsverlust angezeigt wurde. Der signifikante Gewichtsverlust im Hochtemperaturbereich 450–800 °C war auf die thermische Degradation des Kohlenstoffgerüsts zurückzuführen, was auf Chitosan-Rückstände und Biomoleküle aus Hefeextrakt wie Aminosäuren zurückgeführt werden konnte [41].

Die Oberflächenladung von GO und ChrGO wurde mit einem Malvern Zeta Nano ZS-90 Instrument gemessen, was ein wichtiger Parameter der kolloidalen Stabilität ist. Die höhere Oberflächenladungsdichte auf GO-Nanosheets erzeugt eine stabilere kolloidale Dispersion [42]. Wie in Zusatzdatei 1: Abb. S1 gezeigt, nahm das Zeta-Potenzial von GO monoton von -10,7 mV bei pH 3 auf -35,5 mV bei pH 11 ab, was die negative Ladung auf der Oberfläche der GO-Nanosheets bestätigte. Der Zeta-Potenzialwert für ChrGO war vergleichsweise geringer als das Potenzial von GO bei jedem pH von 3 bis 11. ChrGO-Nanosheets zeigten Stabilität über den gesamten pH-Wertebereich, während reduzierte GO-Kolloide in deionisiertem Wasser aufgrund erhöhter π-π-Stapelung in den deoxygenierten Oberflächen als weniger stabil berichtet wurden [43]. Obwohl einige freie Aminogruppen auf der Oberfläche von Chitosan vorhanden waren [44], wurde kein höheres Zeta-Potenzial von ChrGO erreicht. Der niedrigere Zeta-Potenzialwert von ChrGO könnte auf die reichlichen negativ geladenen Aminosäuremoleküle aus dem Hefeextrakt zurückgeführt werden, die die kolloidale Stabilität in physiologischer Lösung erhöhten [20]. Die negativ geladene Oberfläche von ChrGO macht sie potenziell anwendbar für die Beladung und Abgabe des Medikaments.

Biokompatibilität des synthetisierten ChrGO

Die Biokompatibilität des synthetisierten ChrGO ist wichtig für seine Anwendungen in der Medikamentenabgabe. Die Zellzytotoxizität von ChrGO und GO wurde durch Zytotoxizitätsassay untersucht. Cos-7 Zellen und BT-474 Zellen wurden 24 h in Gegenwart von entweder ChrGO oder GO inkubiert. Die Ergebnisse der Zellzytotoxizität sind in Abb. 6 dargestellt. Es konnte geschlossen werden, dass ChrGO keine offensichtliche Zellzytotoxizität für Cos-7 und BT-474 Zellen zeigte. Selbst bei einer Konzentration von 100 μg/mL lag die Zelllebensfähigkeit über 90%. GO zeigte jedoch signifikante Zellzytotoxizität in dosisabhängiger Weise, mit nur 73,0 ± 0,5% und 71,0 ± 0,5% Zellüberleben für Cos-7 und BT-474 Zellen bei einer Konzentration von 100 μg/mL. Die Ergebnisse zeigten, dass Chitosan, das auf der Oberfläche von GO funktionalisiert war, die Zytotoxizität stark verringerte und die Biokompatibilität erheblich verbesserte. Die Oberflächenfunktionalisierung von GO mit Makromolekülen wurde berichtet, um seine zytotoxischen Effekte bemerkenswert abzuschwächen [45]. Hu et al. berichteten, dass fötales Kälberserum in Zellmedium die Zellzytotoxizität von GO in nicht-kleinzelligen Lungenkrebs A549 Zellen deutlich verringerte [46].

Beladung und Freisetzung des Medikaments

Die potenzielle biomedizinische Anwendung von ChrGO als Medikamententräger wird durch das Medikamentenbeladungs- und -freisetzungsverhalten gemessen. Die strukturellen Charakteristika von Graphenderivaten sind aufgrund ihrer sehr großen spezifischen Oberfläche hochwirksam für die aromatische Medikamentenabgabe. Adriamycin ist eines der primären Tumorchemotherapeutika gegen eine Vielzahl von hämatologischen Malignomen und soliden Tumoren und wird häufig als Modellmedikament verwendet, um Graphenderivat-Medikamentenabgabesysteme zu evaluieren [47]. Die Beladungskapazität von Adriamycin auf ChrGO-Nanosheets wurde durch den charakteristischen UV-Vis-Absorptionspeak von Adriamycin bei 490 nm verifiziert. Wie erwartet war die maximale Beladungseffizienz von Adriamycin, das an ChrGO-Nanosheets gebunden war, so hoch wie 169,8%, was teilweise auf die große Oberfläche der ChrGO-Nanosheets zurückzuführen war. Die Adriamycin-beladenen ChrGO/Adriamycin-Nanokomposite ließen sich leicht in einen physiologischen Puzer dispergieren und zeigten eine transparente Lösung mit leicht rötlicher Farbe.

Um das Freisetzungsprofil von Adriamycin aus den ChrGO/Adriamycin-Komplexen zu untersuchen, wurden verschiedene pH-Werte von PBS eingeführt, um Tumormikroumgebungen nachzuahmen. Zusatzdatei 1: Abb. S2 zeigt die kumulativen Freisetzungsprofile von Adriamycin aus ChrGO/Adriamycin bei pH 5 und 7,4. Das aus ChrGO/Adriamycin freigesetzte Adriamycin wurde durch eine initiale schnelle Freisetzung und dann eine Phase langsamerer Freisetzung in pH 5,0 PBS-Lösung charakterisiert. Die kumulative Freisetzung von Adriamycin betrug 6,5% in den ersten 3 h und zeigte dann einen langsamen Anstieg auf 26,7% in 96 h bei pH 5,0. Im Gegensatz dazu stieg der Adriamycin-Prozentsatz von ChrGO/Adriamycin langsamer und war bei pH 7,4 niedriger, mit einer Freisetzungsprozentsatz von 2,5% in den früheren 3 h bis 7,4% in 96 h. Frühere Studien haben die Freisetzungsprofile von Medikamenten aus funktionalisiertem GO sehr langsam in einem Medium bei pH 7,4 gezeigt [48]. Die Protonierung von Carboxylgruppen auf ChrGO verringert π-π-Stapelung, H-Bindung und elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Adriamycin und ChrGO, was die Freisetzung von Adriamycin im sauren Medium erleichtert [49]. Die pH-Empfindlichkeit gibt ChrGO/Adriamycin Potenzial für standortspezifische Medikamentenabgabe, was anschließend die Zytotoxizität in Tumorzellen erhöht.

Therapeutische Wirksamkeit von ChrGO/Adriamycin-Komplexen

Die therapeutische Wirksamkeit der ChrGO/Adriamycin-Komplexe in HER2-überexprimierenden BT-474 Krebszellen wurde durch Proliferationsinhibitionsassay untersucht. Die Überexpression des HER2-Rezeptors spielt eine Schlüsselrolle bei der Transformation von BT-474 Brustkrebszellen. Behandlung mit Trastuzumab allein, einem anti-HER2 monoklonalen Antikörper, führt zu signifikantem Wachstumsinhibition von BT-474 Zellen [50]. Wie in Abb. 7a gezeigt, wurde nach Behandlung mit ChrGO/Adriamycin-Komplexen die Zelllebensfähigkeit von BT-474 Zellen signifikant verringert, was einen dosisabhängigen toxischen Effekt demonstrierte. Darüber hinaus zeigten die ChrGO/Adriamycin-Komplexe im Vergleich zu freiem Adriamycin eine weniger effektive Leistung beim Töten von BT-474 Zellen, was auf die allmähliche Diffusion des beladenen Adriamycins statt direkter Behandlung mit freiem Adriamycin zurückgeführt wurde [51]. Die therapeutische Wirksamkeit der ChrGO/Adriamycin-Komplexe war jedoch der von freiem Adriamycin nahe, da ihre Konzentration zunahm, was durch die freigesetzte Adriamycin-Freisetzung vom ChrGO-Träger erklärt werden kann.

Um zu untersuchen, ob Trastuzumab, ein anti-HER2 monoklonaler Antikörper, die antitumorale Aktivität äquivalenter Mengen Adriamycin, die auf ChrGO beladen sind, verbessern könnte, wurden BT-474 Zellen mit Trastuzumab allein oder in Kombination mit ChrGO/Adriamycin behandelt. Behandlung mit Trastuzumab allein erzeugte signifikante Inhibition der BT-474 Proliferation, was mit einem früheren Bericht konsistent ist [52]. Die Kombinationstherapie mit Trastuzumab und ChrGO/Adriamycin führte zu einem verstärkten Zellwachstumsinhibitionseffekt, wie durch eine Reduktion von 88,5% im Vergleich zu einer Reduktion von 54,5% mit Trastuzumab allein (5 μg/mL) und 59,5% mit äquivalentem ChrGO/Adriamycin allein (5 μg/mL) versus Negativkontrolle gezeigt (Abb. 7b). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das ChrGO-System effektiv zur Entwicklung von Kompositen für Kombinationstherapien verwendet werden kann, und die Kombinationsbehandlung von ChrGO/Adriamycin und Trastuzumab führte zu einer bescheidenen, aber signifikanten Reduktion der Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu jedem Medikament allein.

Zellzyklusanalyse und Apoptose

Um zu bestimmen, ob die ChrGO/Adriamycin-Komplexe Auswirkungen auf den Zellzyklusfortschritt haben, wurde ein Zellzyklusassay der ChrGO/Adriamycin-Komplexe allein oder in Kombinationsbehandlung mit Trastuzumab an BT-474 Zellen durchgeführt. Wie in Abb. 8a gezeigt, ergab die Durchflusszytometrieanalyse, dass Trastuzumab allein die Zellpopulation in der G0/G1-Phase erhöhte. Behandlung mit ChrGO/Adriamycin allein vermittelte eine signifikante Reduktion der G0/G1-Zellanzahl und Anreicherung in S-Phase und G2/M-Phase im Vergleich zu Kontrollzellen. Außerdem vermittelte ChrGO/Adriamycin kombiniert mit Trastuzumab S-Phasenarrest, begleitet von einer signifikanten Abnahme der Zellanzahl in der G0/G1-Phase. Während ChrGO/Adriamycin am aktivsten in der S-Phase des Zellzyklus ist, kann ChrGO/Adriamycin-Behandlung mit Trastuzumab einen Anstieg in der G0/G1-Phase im Vergleich zu ChrGO/Adriamycin allein verursachen. Ein früherer Bericht zeigte, dass Trastuzumab Zellarrest in der G1-Phase verursachen kann [53]. Adriamycin inhibiert Zellproliferation und DNA-Replikation, was letztendlich zu Zellzyklusarrest führt [54].

Um die Auswirkungen von ChrGO/Adriamycin auf apoptotische Moleküle zu bewerten, wurden BT-474 Zellen 48 h mit entweder ChrGO/Adriamycin, Trastuzumab oder einer Kombinationsbehandlung beider Wirkstoffe behandelt. Für die Visualisierung von Apoptose wurde Caspase 3/7 Aktivität umfangreich als apoptosespezifischer Marker verwendet aufgrund ihrer Aktivität im Zusammenhang mit dem Apoptoseprozess [55]. Wie aus Abb. 8b beobachtet, erhöhte die Behandlung mit ChrGO/Adriamycin (5 μg/mL) allein im Vergleich zur Negativkontrolle die Caspase 3/7 Aktivität signifikant. Trastuzumab (5 μg/mL) allein erhöhte jedoch die Caspase 3/7 Expression nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass Trastuzumab keine Apoptose induziert. Im Gegensatz dazu erhöhte die Behandlung mit ChrGO/Adriamycin (5 μg/mL) plus Trastuzumab (5 μg/mL) die Caspase 3/7 Aktivität signifikant im Vergleich zu jedem Medikament allein. Die dual-zielgerichtete Therapie zeigte höhere Apoptose, was auf überlegene therapeutische Wirksamkeit aufgrund der Anwesenheit unterschiedlicher Wirkmechanismen hinweist. Ähnlich wie andere Studien verstärkt Adriamycin die apoptotische Antwort in HER2-überexprimierenden Krebszellen [56]. Zusammenfassend induzieren ChrGO/Adriamycin kombiniert mit Trastuzumab Zellzyklusarrest und Apoptose, was letztendlich zu verstärktem Zelltod führt.

Schlussfolgerungen

In der vorliegenden Arbeit wurden Chitosan-funktionalisierte Graphenoxid-Nanosheets mit mikrowellenunterstützter Reduktion strukturiert, die Biokompatibilität und gute Dispersionsstabilität demonstrierten. Die hergestellten Nanokomposite zeigten hohe Effizienz der Medikamentenkapselung und -abgabe. Die ChrGO/Adriamycin-Nanosheets zeigten signifikante Wachstumsinhibition von BT-474 in dosisabhängiger Weise. Die Kombinationsbehandlung von ChrGO/Adriamycin und Trastuzumab führte zu überlegener therapeutischer Wirksamkeit in BT-474 Zellen im Vergleich zu jedem Wirkstoff allein. Die Ergebnisse sind günstig für die Entwicklung intrazellulärer Nanoträger zur kontrollierten Medikamentenabgabe, was voraussichtlich den therapeutischen Effekt auf HER2-überexprimierende Krebstherapien verbessern wird.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieser aktuellen Studie stützen, sind auf vernünftige Anfrage bei den korrespondierenden Autoren verfügbar.

Abkürzungen

ChrGO:

Chitosan-funktionalisiertes Graphenoxid (Chitosan-functionalized graphene oxide)

EGFR:

Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor (Epidermal growth factor receptor)

HER2:

Humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (Human epidermal growth factor receptor-2)

GO:

Graphenoxid (Graphene oxide)

DMEM:

Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (Dulbecco's modified Eagle medium)

FBS:

Fötales Kälberserum (Fetal bovine serum)

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie (Transmission electron microscopy)

UV-Vis:

Ultraviolett-sichtbar (Ultraviolet-visible)

FTIR:

Fourier-Transform-Infrarot (Fourier transform infrared)

XRD:

Röntgenbeugung (X-ray diffraction)

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie (X-ray photoelectron spectroscopy)

TGA:

Thermogravimetrische Analyse (Thermogravimetric analysis)

PBS:

Phosphat-gepuffertes Salin (Phosphate-buffered saline)

SAED:

Ausgewählte-Bereich-Elektronenbeugung (Selected-area electron diffraction)

TGA:

Gravimetrische Analyse (Gravimetric analysis)