Mikrowellen-unterstütztes Chitosan-funktionalisiertes Graphenoxid als Nanosystem zur kontrollierten intrazellulären Wirkstoffabgabe für synergistische Antitumoraktivität

Einführung

Der HER2-Rezeptor ist ein Mitglied der EGFR-Rezeptorfamilie, die das Wachstum und die Differenzierung von Krebszellen vermittelt und bei 20–30% der menschlichen Brustkrebserkrankungen stark überexprimiert wird, was zu einem metastasierten Tumorphänotyp und einer schlechten Prognose führt [1]. HER2 wird auch bei etwa 20 % der menschlichen Magenkarzinome überexprimiert [2]. Trastuzumab, ein humanisierter monoklonaler therapeutischer Antikörper, zeigt vielversprechende therapeutische Vorteile als Erstlinientherapie bei HER2-überexprimierenden Brustkrebspatientinnen [3]. Die Gesamtansprechrate auf Trastuzumab bleibt jedoch bescheiden:15–30 % bei Behandlung als Einzeltherapie und 50–75 % bei kombinierter Behandlung mit Chemotherapeutika [4]. Unter den Patienten, die auf Trastuzumab ansprechen, entwickelt die Mehrheit von ihnen nach dem anfänglichen Ansprechen schließlich eine Progression und entwickelt nach einer kontinuierlichen Behandlung im Laufe der Zeit eine Resistenz [5]. Daher ist es unerlässlich und notwendig, zusätzliche neuartige Therapien für HER2-überexprimierende Patienten zu entwickeln, um die Gesamtüberlebensrate zu verbessern.

Anthrazykline sind nach wie vor das Rückgrat der Krebstherapie. Bei den Anthrazyklin-Wirkstoffen wird der Topoisomerase-II-Inhibitor Adriamycin häufig zur Behandlung vieler Krebsarten wie Brust-, Lungen- und Lymphkrebs eingesetzt [6]. Adriamycin hat aufgrund der Nähe zwischen dem HER2-Gen und dem Topoisomerase-II-Gen eine wirksame Wirksamkeit bei der Behandlung von HER2-überexprimierenden Brustkrebspatientinnen [7]. Trotz des klinischen Nutzens, der bei anthrazyklinbasierten Therapien bei Brustkrebs beobachtet wurde, hat die kardiale Dysfunktion umfangreichere therapeutische Anwendungen eingeschränkt. In der klinischen Studie zeigte Trastuzumab in Kombination mit Adriamycin eine signifikante Wirksamkeit, während die stark dosisabhängige Kardiotoxizität ein zu lösendes Problem war [8]. Die anhaltende Freisetzung von Chemotherapeutika am Zielgewebe des Krebses wird als eine gute Lösung für niedrigere Dosen angesehen, die für die therapeutische Wirksamkeit erforderlich sind und das Sicherheitsprofil verbessern [9]. Um eine bessere Antitumor-Wirksamkeit, aber weniger Nebenwirkungen zu erzielen, besteht ein dringender Bedarf, die Wirksamkeit der Wirkstoffabgabe gegen Krebs zu verbessern, um Krebszellen gezielt zu bekämpfen.

Graphenoxid (GO)-basierte Nanomaterialien haben sich bei der kontrollierten Verabreichung von Chemotherapeutika als vielversprechend erwiesen [10]. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Toxizität von GO mit seiner Oberflächenfunktionalisierung verbunden ist [11]. Kürzlich wurde berichtet, dass umweltfreundliche Mittel wie Chitosan und PEG GO mit weniger giftigen funktionellen Oberflächengruppen funktionalisieren [12, 13]. Die kolloidale Stabilität von Nanopartikeln in biologischen Medien ist entscheidend für die Entwicklung eines wirksamen und sicheren Wirkstoffabgabesystems für den klinischen Einsatz [14]. Funktionalisierte GO-Nanoblätter haben aufgrund ihrer Eigenschaften wie Biokompatibilität und Stabilität in biomedizinischen Anwendungen große Beachtung gefunden. Als hervorragender Kandidat für Graphen-basiertes Biomaterial ist die kolloidale Stabilität von GO oder rGO wichtig, um die Leistung von Wirkstoffträgern zu kontrollieren. Das poly(ethylenglycol)-funktionalisierte GO zeigte eine verbesserte kolloidale Eigenschaft in Zellkulturmedien [15]. P. Khanra berichtete über eine neue Methode zur gleichzeitigen Reduktion und Biofunktionalisierung von GO unter Verwendung von Hefezellen als reduktiven Biokatalysator [16, 17]. Avinav G präsentierte eine Eintopfbiosynthese von GO unter Verwendung von Hefeextrakt während eines Autoklavenprozesses [18]. Die stundenlange Beschallung von mikrometergroßen GO-Blättern führte zu GO-Nanoblättern, die eine höhere kolloidale Stabilität im Vergleich zu normalem mikrometergroßem GO zeigten [19]. Obwohl die vorherigen Studien das hohe Potenzial von GO für Biomaterialien gezeigt haben, wurden die biofunktionalisierten GO-Nanoblätter mit Chitosan durch Mikrowellen-unterstützte Reduktion mit zellfreiem Hefeextrakt bisher nicht untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine neuartige Chitosan-funktionalisierte Graphenoxid(ChrGO)-Struktur durch ein einfaches Mikrowellensynthesesystem konstruiert, das Hefeextrakt als Reduktionsmittel verwendet. Darüber hinaus bietet die effektive Funktionalisierung von GO mit biokompatiblem Chitosan eine potenzielle Plattform für eine effiziente Wirkstoffbeladung und -abgabe. Studien zur Wirkstoffbeladung und -freisetzung zeigten, dass Adriamycin effizient auf die ChrGO-Nanoblätter geladen und von diesen freigesetzt wurde. Die ChrGO/Adriamycin-Komposite zeigten konzentrationsabhängig eine signifikante Antitumoraktivität. Insbesondere die Kombinationsbehandlung mit ChrGO/Adriamycin und Trastuzumab führte im Vergleich zur Monotherapie zu einer verstärkten wachstumshemmenden Wirkung auf BT-474-Zellen. Es wurde gezeigt, dass die synergetische Antitumorwirksamkeit dieser Wirkstoffe durch einen Zellzyklusarrest und Apoptose vermittelt wird, was letztendlich zum Tod von Krebszellen führte. Diese Arbeit berichtete über einen vielversprechenden Weg zur schnellen und kostengünstigen Herstellung von ChrGO-Verbundwerkstoffen, die raumzeitlich kontrollierte Chemotherapeutika für eine effiziente Krebsbehandlung liefern (Schema 1).

Mikrowellen-unterstützte Biofunktionalisierung und Reduktion von Graphitoxid als Nanosystem zur kontrollierten Wirkstoffabgabe für die duale zielgerichtete Therapie in HER2-überexprimierenden BT-474-Zellen

Materialien und Methoden

Materialien

Graphitpulver wurde von Qingdao Huatai Tech (Qingdao, China) bezogen. Chitosan und Adriamycin wurden von Aladdin Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Trastuzumab wurde von Hoffmann-La Roche Ltd (Basel, Schweiz) bezogen. Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Invitrogen Corporation (Camarillo, USA) bezogen. Amicon ^® Ultrazentrifugalfilter wurden von Merck Millipore bezogen. CellTiter 96 ^® wässriger Zellproliferations-Assay-Kit mit einer Lösung und Caspase-Glo ^® 3/7 Testsystem-Kits wurden von Promega Corporation (Madison, USA) erhalten. Trockenbackhefe wurde von AB/Mauri Co., Ltd. bezogen. BT-474 und Cos-7-Zelllinien wurden von der Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) bezogen. Luria-Bertani-Medium wurde von Sangon Biotech Co., Ltd. bezogen. Alle Chemikalien waren von analytischer Qualität und ohne weitere Reinigung im Handel erhältlich.

Mikrowellen-unterstützte Reduktion von Chitosan-funktionalisiertem GO

Graphitoxid (GO) wurde aus nativen Graphitflocken nach einer modifizierten Hummer-Methode hergestellt [14]. Um eine einzelne Schicht von GO in Nanogröße zu erhalten, wurde das GO mit einer Ultraschallsonde (Scientz, China), die bei 800 W für 8 Stunden betrieben wurde, abgeschält. Schließlich wurde das abgeblätterte GO zur weiteren Verwendung in entionisiertem Wasser dispergiert. Die partiell reduzierten Chitosan-GO (ChrGO) Nanoblätter wurden durch Mikrowellen-unterstützte Reduktion von GO mit wässriger Chitosanlösung unter Verwendung eines Mikrowellensynthesesystems synthetisiert. Der zellfreie Hefeextrakt wurde für die Biosynthese von ChrGO mittels Mikrowellen-unterstützter Reduktion verwendet. Zuerst wurden die gelagerten Hefezellen durch Inokulation in Luria-Bertani-Medium und Schütteln bei 135 U/min für 18 h bei 25 °C aktiviert. Die aktivierten Hefezellen wurden in eine 2%ige Saccharoselösung überführt, die bei 135 U/min für weitere 6 h bei 25 °C geschüttelt wurde. Als nächstes wurden 6 ml zellfreier Hefeextrakt durch Zentrifugaltrennung bei 2000 U/min für 5 Minuten erhalten. Dann wurden 50 mg Chitosan in 25 ml 2% (v/v) Essigsäurelösung gelöst und mit Hefeextrakt vermischt [20]. Eine 5 mg GO-Lösung wurde unter kräftigem Magnetrühren zugegeben. Schließlich wurde die so hergestellte Lösung für die Mikrowellenreaktion in ein Mikrowellensynthesegerät NOVA-2S (PreeKem Scientific Instruments, China) überführt. Das Heizschema für das Mikrowellensystem umfasste das Erhitzen auf 80 °C für 5 Minuten und das Halten der Temperatur für weitere 5 Minuten. Das erhaltene ChrGO wurde mit einem 100-kDa-MWCO-Filter (Millipore, USA) gereinigt und zur weiteren Verwendung gefriergetrocknet.

Charakterisierungen

Transmissionselektronenmikroskopie-(TEM-)Bilder von GO in Nanogröße wurden auf einem JEM-2100-Transmissionselektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV (JEOL, Japan) erhalten. Ultraviolett-sichtbare (UV-Vis)-Spektren wurden mit einem UV/Vis/NIR-Spektrophotometer Lambda 950 (Perkin-Elmer, USA) erhalten. Fourier-Transformations-Infrarot-Spektren (FTIR) wurden mit einem Vertex 70 FTIR-Spektrometer aufgenommen, das von 4000 bis 400 cm ^–1 . scannt mit Proben, die als KBr-Pellets (Bruker, Deutschland) hergestellt wurden. Raman-Spektren wurden mit einem Senterra R200-L Raman-Mikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm (Bruker Optics, Deutschland) aufgenommen. Röntgenbeugungsmuster (XRD) wurden mit einem Bruker D8 Advance-Diffraktometer (Bruker, Deutschland) untersucht. Die Oberflächenelemente wurden mit Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD mit monochromatischer Al Ka-Strahlung (1486,6 eV) (Shimadzu, Japan) aufgenommen. Die thermogravimetrische Analyse (TGA) wurde auf einem PerkinElmer Pyris 1 TGA mit einer Heizrate von 5 °C/min von 30 auf 800 °C in einer Stickstoffatmosphäre (PerkinElmer, USA) durchgeführt. Die Oberflächenladung der Verbundstoffe wurde mit einem Malvern Zeta Nano ZS-90 Instrument (Malvern, UK) gemessen.

Beladung und Freisetzung von Medikamenten

Vier Milligramm ChrGO-Nanopartikel wurden in 20 ml wässriger Adriamycin-Lösung (0,4 mg/ml) suspendiert. Nach 0,5 h Beschallung wurde 24 h im Dunkeln gerührt, wobei Licht vermieden wurde. Das unbeladene Adriamycin wurde durch Zentrifugationsfiltration durch 50-kDa-MWCO-Amicon-Filter (Millipore, USA) entfernt und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 8,0) weggewaschen, bis der Überstand farblos wurde. Die Konzentration von Adriamycin wurde anhand einer Standard-Adriamycin-Konzentrationskurve durch UV-Vis-Spektrometrie bei 490 nm mit einem SpectraMax ^® . bestimmt M5-Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA). Die Menge der Adriamycin-Beladung auf ChrGO wurde mit einer UV-Vis-Absorption durch Messung der Konzentration des Adriamycin-Verlustes im Überstand von Amicon ^® . bestimmt Ultra-15 ml-Zentrifugalfilter.

Die Adriamycin-Freisetzungseigenschaften von ChrGO wurden untersucht. Das mit Adriamycin beladene ChrGO wurde in 10 ml PBS-Pufferlösung eingetaucht. In festgelegten Intervallen wurden 2 ml freigesetzte Adriamycinlösung, abgelöst von ChrGO, durch Zentrifugationsfiltration durch 50-kDa-MWCO-Amicon-Filter (Millipore, USA) gesammelt. Das Volumen der ChrGO/Adriamycin-Lösung wurde durch Zugabe von 2 ml frischer PBS-Pufferlösung nach jeder Probenahme konstant gehalten. Die von ChrGO freigesetzte Adriamycinmenge wurde anhand einer UV-Vis-Absorption bei 490 nm mit einem SpectraMax ^® . gemessen M5-Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA). Die Freisetzungsstudien wurden in verschiedenen pH-Lösungen (pH-Werte 5 und 7,4) untersucht.

Biokompatibilitätsanalyse und therapeutischer Wirksamkeitstest

BT-474- und Cos-7-Zellen wurden in RPMI-1640, ergänzt mit 10 % FBS bzw. DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, gehalten und in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ . kultiviert bei 37 °C. Der Biokompatibilitätsassay von GO und ChrGO wurde an BT-474- oder Cos-7-Zellen mittels Zellzytotoxizitätsassay durchgeführt. Die Zellen wurden in flachen 96-Well-Platten mit einer Dichte von 3 × 10 ⁴ . ausplattiert Zellen pro Vertiefung und vor der Behandlung mit GO und ChrGO für 18 h vorinkubiert. Anschließend wurden die Verdünnungen der getesteten Wirkstoffe zu den Zellen gegeben und weitere 24 h inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit CellTiter 96 ^® . bestimmt wässrige Lösung. Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem SpectraMax ^® . gemessen M5-Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA).

Die Wirksamkeit von ChrGO/Adriamycin-Komplexen allein oder in Kombination mit Trastuzumab auf die Proliferation in BT-474-Zellen wurde durch einen Proliferationsinhibitionsassay untersucht [16]. BT-474-Zellen wurden in flachen 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 10 ⁴ . ausplattiert Zellen pro Vertiefung und inkubiert für 24 h. Anschließend wurden ChrGO/Adriamycin-Komplexe allein oder in Kombination mit Trastuzumab in die BT-474-Zellen im Kulturmedium eingebracht. Nach 96-stündiger Inkubation wurden die lebensfähigen Zellen mit CellTiter 96 ^® . bestimmt wässrige Lösung. Die Extinktion wurde mit einem SpectraMax ^® . gemessen M5-Mikroplattenleser bei 490 nm (Molecular Devices, USA). Die Daten wurden mit Einweg-ANOVA analysiert. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Zellzyklusanalyse und Apoptose-Assay

Für die Zellzyklusanalyse wurden BT-474-Zellen in Sechs-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 ⁵ . ausplattiert Zellen pro Vertiefung und 16 h anhaften gelassen. Die Zellen wurden 24 h lang mit ChrGO/Adriamycin-Komplexen allein oder in Kombination mit Trastuzumab behandelt. BT-474-Zellen wurden geerntet und mit 70 % (v/v) Ethanol bei 4 °C 24 h fixiert. Die fixierten BT-474-Zellen wurden mit Propidiumiodidlösung (15 μg/ml), die Ribonuklease A (10 μg/ml) enthielt, eine Stunde lang bei 25 °C gefärbt. Anschließend wurden die Zellen mit einem Durchflusszytometer (BD Biosciences, USA) analysiert. Für den Apoptose-Assay wurden BT-474-Zellen in einer Dichte von 2 × 10 ⁴ . in weißwandige 96-Well-Platten ausgesät Zellen pro Vertiefung und 18 h adhärieren gelassen. Die Zellen wurden 24 h lang mit ChrGO/Adriamycin-Komplexen, Trastuzumab allein oder in Kombination behandelt. Dann wurde das Kulturmedium verworfen und 100 µL Caspase-Glo ^® 3/7 Reagenz wurde in jede Vertiefung gegeben und 2 h bei RT inkubiert. Die Lumineszenz wurde mit einem SpectraMax ^® . gemessen M5-Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA). Die Ergebnisse wurden durch Einweg-ANOVA analysiert. p <  0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Studien wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung

Die Morphologie der so hergestellten GO-Schichten wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) charakterisiert. Abbildung 1a zeigt die einheitliche Größenverteilung von GO-Nanoblättern unter 100 nm mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 45 nm. Die hohe Elektronendichte von GO zeigte einen besseren Kontrast im Vergleich zu Chitosan, das aufgrund seiner geringen Elektronendichte und hydratisierten Natur kaum sichtbar ist [21]. Aufgrund der größeren Oberfläche wurden nanoskalige GO- oder reduzierte GO-Schichten häufig als Wirkstoffträger verwendet [22]. Das Elektronenbeugungsmuster (SAED) im ausgewählten Bereich in Abb. 1c zeigt die konzentrischen Ringe, was das Vorhandensein einer polykristallinen Natur entsprechend Graphenoxid zeigt [23].

a TEM-Aufnahme mit geringer Vergrößerung von GO-Nanoblättern, b hochauflösendes TEM-Bild von Nanoblättern und c ein typisches SAED-Muster von GO-Nanoblättern

Um GO-Nanoblätter in physiologischer Lösung zu stabilisieren, wurden Chitosan-funktionalisierte GO-Nanoblätter durch Mikrowellen-unterstützte Reduktion mit einem Mikrowellensystem hergestellt [24]. Das resultierende reduzierte GO-Chitosan (ChrGO) wurde durch UV-Vis-Spektrometrie analysiert. Abbildung 2a zeigt die UV-Vis-Spektren von GO und ChrGO. GO zeigte einen scharfen Absorptionspeak bei 230 nm und eine Schulter bei 300 nm, was dem π . zugeschrieben wird –π * Übergang aromatischer C=C-Bindungen und n –π * Übergang von C=O-Bindungen bzw. [25, 26]. Nachdem Chitosan auf GO gepfropft wurde, verschwand der Peak bei 230 nm für ChrGO auf 270 nm rot, und die Schulter bei 300 nm verschwand offensichtlich, was auf die teilweise Wiederherstellung der elektronischen Konjugation zwischen den aromatischen Kohlenstoffatomen zurückgeführt wurde [27]. Eine schwarze Lösung von synthetisiertem ChrGO ist in Abb. 2b gezeigt, was die Bildung von teilweise reduziertem Graphenoxid (p-rGO) anzeigt. Sowohl die GO-Nanoblätter als auch ChrGO waren in deionisiertem H₂ . gut dispergiert O. Die kolloidale Stabilität von GO oder GO-Derivaten in wässriger Lösung ist für ihre biomedizinische Anwendung sehr wichtig. Die Ergebnisse legten nahe, dass das Chitosan nach der Reduktion mit GO konjugiert war.

a UV-Vis-Spektrum der GO-Nanoblätter und ChrGO in wässriger Lösung, b Fotografien von GO-Nanoblättern und synthetisiertem ChrGO

FTIR-Spektroskopie wurde durchgeführt, um die Struktur von GO, Chitosan und ChrGO zu charakterisieren (Abb. 3a). Die charakteristischen Peaks von GO lagen bei 3440 cm ⁻¹ und 1376 cm ⁻¹ , entsprechend OH- bzw. C-OH-Bindungen. Der Peak bei 1072 cm ⁻¹ wurde der Streckschwingung von C–N–C zugeordnet. Auffällig sind die Peaks der Chitosanmoleküle bei 2912 cm ⁻¹ und 2848 cm ⁻¹ wurden den Streckschwingungen des CH₃ . zugeschrieben – und –CH₂ – [28, 29]. Funktionalisiertes p-rGO mit Chitosan führte zu neuen Bindungen, die zu neuen Peaks in den ChrGO-Spektren führten. Die Intensitäten der C=O-Bande bei 1636 cm ⁻¹ . nehmen deutlich ab in ChrGO verglichen mit dem in GO, was darauf hindeutet, dass der Reduktionsprozess die sauerstoffhaltigen Gruppen von GO entfernt hat [30]. Das FTIR-Spektrum von ChrGO bestätigte die erfolgreiche Konjugation von Chitosan an GO. Darüber hinaus wurde die Raman-Spektroskopie verwendet, um die elektronischen Eigenschaften und die Struktur von Graphen zu charakterisieren. Das G-Band wird dem E zugeschrieben _2g Phononen von sp ² Kohlenstoffdomänen, während die D-Bande der Schwingung von sp . zugeordnet wird ³ Kohlenstoffatomdomänen und ungeordnete Kohlenstoffatome. Die Intensität der D-Bande weist auf die Merkmale von Störungen und Defekten in Kohlenstoffblechen hin [31]. Die Reduktion von GO-Nanoblättern wurde auch im Signalverhältnis der D- gegenüber der G-Bande analysiert [32]. Das repräsentative Raman-Spektrum von GO zeigt zwei charakteristische Peaks der D-Bande (1341 cm ⁻¹ ) und das G-Band (1591 cm ⁻¹ ) in Abb. 3b. Änderung der relativen Intensität von I_D /I_G Wert veranschaulicht die Änderung des elektronischen Konjugationszustands des GO im Reduktionsprozess [33]. Die Verschiebung der D-Bande zeigt eine erfolgreiche Funktionalisierung von reduziertem GO. Der Wert von I _D /Ich _G steigt von 0,99 (GO) auf 1,12 (ChrGO), was auf die Einführung von sp3 zurückgeführt wird Defekte nach Funktionalisierung und unvollständiger Wiederherstellung der charakteristischen Graphenstruktur [34]. Diese Beobachtung stimmt gut mit dem vorherigen Bericht überein und legt die Bildung von Chitosan-funktionalisiertem Graphen nahe [16].

a FTIR-Spektren von GO, ChrGO und Chitosan, b Raman-Spektren von GO und ChrGO

Die Oberflächenzusammensetzung von ChrGO wurde durch XPS bestätigt. Der vollständige Scan des XPS-Spektrums von ChrGO zeigt drei Peaks bei 284, 399 und 533 eV, die C1s, N1s bzw. O1s zugeordnet sind (Abb. 4a). Die relative Elementaranalyse zeigte einen Anstieg des Sauerstoff- und Stickstoffgehalts von ChrGO mit einer damit verbundenen Abnahme des Kohlenstoffgehalts im Vergleich zu GO. Die hochauflösenden C1s-Spektren von ChrGO in Abb. 4b zeigen vier getrennte Peaks, entsprechend C–C oder C=C (sp ² , 284,7 eV), C-O (Epoxid/Hydroxyle, 286,4 eV), C=O (sp ³ , 288.2 eV) und O=C–O (Carboxylate, 289,1 eV) Bindungen. Das Auftreten eines Amidpeaks in ChrGO belegt die Funktionalisierung von Chitosan auf GO [35]. Die zahlreichen hydrophilen funktionellen Gruppen auf der Oberfläche machten ChrGO in wässriger Lösung sehr gut löslich, was mit den FTIR-Ergebnissen übereinstimmt. Die Biomoleküle wie reduktive Aminosäuren und Alpha-Linolensäure im Hefeextrakt könnten eine bedeutende Rolle bei der mikrowellenunterstützten Herstellung von ChrGO spielen [20].

a Vermessung der XPS-Spektren von GO und ChrGO, b hochauflösende Spektren von C1s

Das Röntgenbeugungsmuster (XRD) von GO und ChrGO ist in Abb. 5a dargestellt. In GO XRD-Spektren zeigen der Hauptpeak bei 11,0° und der schwache Peak bei 20,7° deutlich die Graphitstruktur. Der Merkmalsbeugungspeak bei 11,0° entspricht der (001)-Ebene von GO, was die erfolgreiche Synthese von GO zeigt [36]. Der kleine Höcker zwischen 20° und 24° zeigt die graphitischen Einheiten, die dem nicht oxidierten reinen Graphit zugeschrieben werden [37]. Mit der Funktionalisierung von Chitosan verschwindet der (001)-Peak von GO, wohingegen der breite Beugungspeak bei 21,4° hervortritt. Diese Verschiebung kann der Reduzierung des GO zugeschrieben werden, wobei die Reduzierung das rGO-Pack enger macht als das GO. Die (002)-Reflexion der ChrGO-Probe ist sehr breit, was darauf hindeutet, dass die Probe entlang der Stapelrichtung sehr schlecht geordnet ist, was auf die unvollständige Reduktion von GO zurückgeführt werden kann [33]. Das Zersetzungsverhalten von GO, Chitosan und ChrGO wurde durch thermische Schwerkraftanalyse (TGA) untersucht [38]. Die TGA-Kurven von ChrGO, GO und Chitosan sind in Abb. 5b gezeigt, die in einer Stickstoffatmosphäre gemessen wurden. GO begann unterhalb von 100 °C an Gewicht zu verlieren, was auf die Eliminierung von adsorbiertem, freiem Wasser in der Stapelstruktur zurückgeführt wurde [39]. Das GO verlor im Bereich von 191–231 °C 42 % seines Gewichts, was mit der Zersetzung labiler sauerstoffhaltiger Gruppen zusammenhing. Die Gewichtsverlustrate von ChrGO bei 100–250 °C ist deutlich geringer als bei GO, und es ist offensichtlich, dass ChrGO ein anderes Zersetzungsmuster als GO aufwies. Die thermische Eliminierung von ChrGO und reinem Chitosan fand von 250 bis 440 °C statt, was mit der Depolymerisation und Pyrolyse stabilerer funktioneller Gruppen wie glycosidischer Einheiten von Chitosan und Carboxylgruppen zusammenhängt [40]. Im Vergleich zu GO war ChrGO thermisch stabil und ergab einen großen Gewichtsverlust von 36 % in der ersten Zersetzungsstufe bei 250–440 °C, während für GO ein geringer Gewichtsverlust zu verzeichnen ist. Der signifikante Gewichtsverlust im Hochtemperaturbereich von 450–800 °C war auf den thermischen Abbau des Kohlenstoffgerüsts zurückzuführen, der auf die Chitosanreste und Biomoleküle aus Hefeextrakt wie Aminosäuren zurückgeführt werden konnte [41].

a XRD-Muster von GO und ChrGO, b TGA-Kurven von GO, Chitosan und ChrGO

Die Oberflächenladung von GO und ChrGO wurde mit einem Malvern Zeta Nano ZS-90 Instrument gemessen, was ein wichtiger Parameter der kolloidalen Stabilität ist. Die höhere Oberflächenladungsdichte auf GO-Nanoblättern erzeugt eine stabilere kolloidale Dispersion [42]. Wie in Zusatzdatei 1:Abb. S1 gezeigt, nahm das Zetapotential von GO monoton von − 10.7 mV bei pH 3 auf  − 35.5 mV bei pH 11 ab, was die negative Ladung auf der Oberfläche der GO-Nanoblätter bestätigte. Der Wert des Zeta-Potentials für ChrGO war bei jedem pH-Wert im Bereich von 3 bis 11 vergleichsweise geringer als das Potenzial von GO. ChrGO-Nanoblätter zeigten Stabilität über den gesamten pH-Wert-Bereich, während reduzierte GO-Kolloide in entionisiertem Wasser aufgrund von . weniger stabil waren π . erhöht –π Stapeln in den desoxygenierten Oberflächen [43]. Obwohl einige freie Amingruppen auf der Oberfläche von Chitosan vorhanden waren [44], wurde ein höheres Zetapotential von ChrGO nicht erreicht. Der niedrigere Zeta-Potential-Wert von ChrGO könnte auf die reichlich vorhandenen negativen Aminosäuremoleküle aus dem Hefeextrakt zurückgeführt werden, die die kolloidale Stabilität in physiologischer Lösung verbesserten [20]. Die negativ geladene Oberfläche von ChrGO macht sie potenziell für die Beladung und Abgabe des Medikaments geeignet.

Biokompatibilität von ChrGO wie synthetisiert

Die Biokompatibilität von wie synthetisiertem ChrGO ist für seine Anwendungen in der Wirkstoffabgabe wichtig. Die Zellzytotoxizität von ChrGO und GO wurde mittels Zytotoxizitätsassay untersucht. Cos-7-Zellen und BT-474-Zellen wurden in Gegenwart von entweder ChrGO oder GO für 24 Stunden inkubiert. Die Ergebnisse der Zellzytotoxizität sind in Abb. 6 dargestellt. Daraus konnte geschlossen werden, dass ChrGO keine offensichtliche Zellzytotoxizität gegenüber Cos-7- und BT-474-Zellen zeigte. Selbst bei einer Konzentration von 100 μg/ml lag die Zellviabilität über 90 %. GO zeigte jedoch dosisabhängig eine signifikante Zellzytotoxizität mit nur 73,0 ± 0,5 % und 71,0 ± 0,5 % Zellüberleben für Cos-7- und BT-474-Zellen bei einer Konzentration von 100 μg/ml. Die Ergebnisse zeigten, dass auf der Oberfläche von GO funktionalisiertes Chitosan eine stark niedrige Zytotoxizität und verbesserte Biokompatibilität zeigte. Es wurde berichtet, dass die Oberflächenfunktionalisierung von GO mit Makromolekülen seine zytotoxischen Wirkungen bemerkenswert abschwächt [45]. Huet al. berichteten, dass fötales Rinderserum in Zellmedium die Zellzytotoxizität von GO in nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-A549-Zellen deutlich verringerte [46].

Biokompatibilität von GO und ChrGO. Unterschiedliche Konzentrationen von Nanopartikeln wurden mit a . kultiviert Cos-7-Zellen und b BT-474-Zellen und ihre Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurde bestimmt

Beladung und Freigabe des Arzneimittels

Die potenzielle biomedizinische Anwendung von ChrGO als Wirkstoffträger wird anhand des Wirkstoffbeladungs- und Freisetzungsverhaltens gemessen. Die strukturellen Eigenschaften von Graphenderivaten sind aufgrund ihrer sehr großen spezifischen Oberfläche für die Abgabe aromatischer Wirkstoffe hochwirksam. Adriamycin ist eines der primären Tumor-Chemotherapeutika gegen eine Vielzahl von hämatologischen Malignomen und soliden Tumoren und wird häufig als Modellarzneimittel zur Bewertung der Wirkstoffabgabesysteme von Graphenderivaten verwendet [47]. Die Beladungskapazität von Adriamycin auf ChrGO-Nanoblättern wurde durch den charakteristischen UV-Vis-Absorptionspeak von Adriamycin bei 490 nm bestätigt. Wie erwartet, betrug die maximale Beladungseffizienz von Adriamycin, das an ChrGO-Nanoblätter gebunden war, bis zu 169,8 %, was teilweise auf die große Oberfläche der ChrGO-Nanoblätter zurückzuführen war. Die mit Adriamycin beladenen ChrGO/Adriamycin-Nanokomposite ließen sich leicht in einem physiologischen Puffer dispergieren und zeigten eine transparente Lösung mit einer leicht rötlichen Farbe.

Um das Freisetzungsprofil von Adriamycin aus den ChrGO/Adriamycin-Komplexen zu untersuchen, wurden die unterschiedlichen pH-Werte von PBS eingeführt, um die Umgebung von Tumorzellen zu imitieren. Zusätzliche Datei 1:Abb. S2 zeigt die kumulativen Freisetzungsprofile von Adriamycin aus ChrGO/Adriamycin bei pH 5 und 7,4. Das aus ChrGO/Adriamycin freigesetzte Adriamycin war durch eine anfängliche schnelle Freisetzung und dann eine Phase langsamerer Freisetzung in einer PBS-Lösung mit einem pH-Wert von 5,0 gekennzeichnet. Die kumulative Freisetzung von Adriamycin betrug in den ersten 3 h 6,5 % und stieg dann langsam auf 26,7 % in 96 h bei pH 5,0 an. Im Gegensatz dazu stieg der Adriamycin-Prozentsatz von ChrGO/Adriamycin langsamer an und war bei pH 7,4 niedriger, was einen Freisetzungsprozentsatz von Adriamycin von 2,5 % in den früheren 3 h auf 7,4 % in 96 h zeigte. Frühere Studien haben die Freisetzungsprofile von Wirkstoffen aus funktionalisiertem GO in einem Medium bei pH 7,4 sehr langsam gezeigt [48]. Die Protonierung von Carboxylgruppen auf ChrGO verringert die π-π-Stapelung, H-Brücken und elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Adriamycin und ChrGO, wodurch die Freisetzung von Adriamycin im essigen Medium erleichtert wird [49]. Die pH-Empfindlichkeit verleiht ChrGO/Adriamycin das Potenzial für eine ortsspezifische Wirkstoffabgabe, die anschließend die Zytotoxizität in Tumorzellen erhöht.

Therapeutische Wirksamkeit von ChrGO/Adriamycin-Komplexen

Die therapeutische Wirksamkeit der ChrGO/Adriamycin-Komplexe in HER2-überexprimierenden BT-474-Krebszellen wurde mit dem Proliferationsinhibitionsassay untersucht. Die Überexpression des HER2-Rezeptors spielt eine Schlüsselrolle bei der Transformation von BT-474-Brustkrebszellen. Die Behandlung mit Trastuzumab allein, einem monoklonalen Anti-HER2-Antikörper, führt zu einer signifikanten Wachstumshemmung der BT-474-Zellen [50]. As shown in Fig. 7a, after treatment with ChrGO/adriamycin complexes, the cell viability of BT-474 cells was decreased significantly, demonstrating a dosage-dependent toxic effect. Besides, when compared to free adriamycin, the ChrGO/adriamycin complexes demonstrated a less effective performance in killing BT-474 cells, which was ascribed to the gradual diffusion of loaded adriamycin rather than direct treatment with free adriamycin [51]. However, the therapeutic efficacy of the ChrGO/adriamycin complexes was close to that of free adriamycin as their concentration of ChrGO/adriamycin complexes increased, which can be explained by the sustained adriamycin release from the ChrGO carrier.

a In vitro cell viability of BT-474 cells incubated with concentrations of free adriamycin and adriamycin loaded in ChrGO/adriamycin complexes, b cytotoxicity of ChrGO/adriamycin complexes (5 μg/mL) in combination with trastuzumab (5 μg/mL) in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p < 0.01, ***p  < 0.001

To study whether trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody, could improve the antitumour activity of equivalent amounts of adriamycin loaded on ChrGO, BT-474 cells were treated with trastuzumab alone or in combination with ChrGO/adriamycin. Treatment with trastuzumab alone produced a significant inhibition of BT-474 proliferation, which is consistent with a previous report [52]. The combined therapy with trastuzumab and ChrGO/adriamycin resulted in an enhanced cell growth inhibition effect, as shown by a reduction of 88.5% compared with a reduction of 54.5% with trastuzumab alone (5 μg/mL) and 59.5% with equivalent ChrGO/adriamycin alone (5 μg/mL) versus the negative control (Fig. 7b). The results suggest that the ChrGO system may be effectively used to develop composites for combination therapies, and the combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in a modest, but significant, reduction of cell viability compared to each drug alone.

Cell Cycle Analysis and Apoptosis

To determine whether the ChrGO/adriamycin complexes have effects on cell cycle progression, a cell cycle assay of ChrGO/adriamycin complexes alone or in combination treatment with trastuzumab was performed on BT474 cells. As shown in Fig. 8a, flow cytometry analysis revealed that trastuzumab alone increased the cell population in the G0/G1 phase. Treatment with ChrGO/adriamycin alone mediated a significant reduction in the number of G0/G1 cells and accumulation in S phase and G2/M phase compared to control cells. Besides, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab mediated S phase arrest, accompanied by a significant decrease in the number of cells in the G0/G1 phase. While ChrGO/adriamycin is most active in the S phase of the cell cycle, ChrGO/adriamycin treatment with trastuzumab can cause an increase in G0/G1 phase compared to ChrGO/adriamycin alone. A previous report showed that trastuzumab can cause cell arrest in the G1 phase [53]. Adriamycin inhibits cell proliferation and DNA replication, ultimately leading to cell cycle arrest [54].

a Cell cycle analysis after treatment with ChrGO/adriamycin alone or in combination with trastuzumab in BT-474 cells, b effect of ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) on induction of apoptosis in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p < 0.01, ***p  < 0.001

To assess the effects of ChrGO/adriamycin on apoptotic molecules, BT-474 cells were treated for 48 h with either ChrGO/adriamycin, trastuzumab, or a combinational treatment of both agents. For the visualization of apoptosis, caspase 3/7 activity has been extensively used as an apoptosis-specific marker due to its activity related to the process of apoptosis [55]. As observed from Fig. 8b, compared to the negative control, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) alone significantly increased the caspase 3/7 activity. However, trastuzumab (5 μg/mL) alone did not significantly increase caspase 3/7 expression, suggesting that trastuzumab does not induce apoptosis. In contrast, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) significantly increased caspase 3/7 activity compared to that with each drug alone. The dual-targeted therapy showed higher apoptosis, indicating superior therapeutic efficacy due to the presence of different mechanisms of action. Similar to other studies, adriamycin amplifies the apoptotic response in HER2-overexpressing cancer cells [56]. In conclusion, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab induces cell cycle arrest and apoptosis, which ultimately results in augmented cell death.

Schlussfolgerungen

In the present work, the chitosan-functionalized graphene oxide nanosheets were structured with microwave-assisted reduction, which demonstrated biocompatibility and good dispersion stability. The as-prepared nanocomposites showed high efficiency of drug encapsulation and delivery. The ChrGO/adriamycin nanosheets displayed significant growth inhibition of BT-474 in a dose-dependent manner. The combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in superior therapeutic efficacy in BT-474 cells compared to that with each agent alone. The results are favourable for the development of intracellular nanocarriers to deliver drugs in a controlled manner, which is expected to improve the therapeutic effect on HER2-overexpressing cancer therapies.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The datasets supporting the conclusions of this current study are available from the corresponding authors upon reasonable request.

Abkürzungen

ChrGO:

Chitosan-functionalized graphene oxide

EGFR:

Epidermal growth factor receptor

HER2:

Human epidermal growth factor receptor-2

GO:

Graphenoxid

DMEM:

Dulbecco's modified Eagle medium

FBS:

Fötales Rinderserum

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

UV–Vis:

Ultraviolet–visible

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarot

XRD:

Röntgenbeugung

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

TGA:

Thermogravimetrische Analyse

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

SAED:

Selected-area electron diffraction

TGA:

Gravimetric analysis