Runde Goldnanopartikel:Einfluss der Partikelgröße und -konzentration auf das Wurzelwachstum von Arabidopsis thaliana

Hintergrund

Die moderne Chemie und Technik produziert heute riesige Mengen an Nanoobjekten, um die Gebrauchseigenschaften von Materie nicht nur in speziellen Anwendungen, sondern zunehmend auch in Produkten des täglichen Bedarfs zu verbessern. Nanostrukturierte Materialien, dh Nanopartikel [1, 2], Nanostäbchen [3], Nanotubes [4], Vlies-Nanotextilien [5], wie sie stehen oder auf unterschiedlichen Trägern befestigt sind, steigern die Ausbeuten in fast allen Bereichen der industriellen Anwendung signifikant von Kosmetik [6] und Gesundheitswesen [7] über Bioengineering [8, 9] bis hin zu Anwendungen zur Energieumwandlung [10] und Katalysatoren [3]. Während die Aufnahme von Nanomaterialien in diese Produkte ihre Leistung verbessern kann, bietet ihr Abbau am Ende ihrer Nutzungsdauer mehrere wichtige Eintrittspunkte für synthetische Nanopartikel in die Umwelt. Speziell konstruierte NPs, die in großem Umfang in Katalysatoren, UV-schützenden Farbstoffstabilisatoren, antimikrobiellen Wirkstoffen in der Textilindustrie oder Gesundheitsprodukten und Kosmetika (insbesondere solchen mit hoher chemischer Inertheit wie Au, Ag, Pt und Pd) verwendet werden, müssen besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden, da sie sich über viele Jahre nahezu unverändert in der Umwelt anreichern und bei ihrer Aufnahme durch die Pflanzen bisher unbekannte Prozesse auslösen können. In Bezug auf Edelmetall-Nanopartikel (NMNPs) wurden einige bahnbrechende Arbeiten zur Wirkung von Silber-Nanopartikeln (AgNPs) auf Setzlinge der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana ), was darauf hinweist, dass sehr niedrige Konzentrationen von AgNPs (< 1 ppm) für die Sämlinge toxisch sein könnten [11]. AgNPs von 20 bis 80 nm hemmten das Wachstum deutlich und ihre Phytotoxizität ist konzentrations- und partikelgrößenabhängig. Es wurde beobachtet, dass sich die Wurzelspitze (Kappe und Columella) hellbraun verfärbte, wenn Primärwurzeln AgNPs ausgesetzt wurden. Die braune Spitze wurde der Adsorption von AgNPs entweder selbst oder in Verbindung mit Zellwandmaterialien oder sekundären Metaboliten, die von Wurzelspitzen produziert werden, zugeschrieben. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch nicht aufgeklärt.

Obwohl es einige Studien zur Rolle von Nanopartikeln in der Umwelt gab [12], sind solche, die auf Goldnanopartikel (AuNPs) abzielen, immer noch selten [13]. Sofern verfügbar, konzentrierten sich die meisten der veröffentlichten Daten zur Nanotoxikologie auf die Zytotoxizität von Säugetieren [14,15,16] oder die Auswirkungen auf Tiere und Bakterien [17,18,19,20], und nur wenige Studien haben die Toxizität von gentechnisch veränderten NPs zu Pflanzen. Darüber hinaus wurde die Interaktion von NMNPs mit Pflanzen und anderen Organismen, die Ähnlichkeiten mit Pflanzenzellen aufweisen, wie Algen, bisher nur unzureichend untersucht, was impliziert, dass die allgemeinen Folgen der NMNP-Exposition für Pflanzenzellen noch unklar sind [11]. Das Fehlen dieser Daten führt zu einem fehlerhaften Verständnis davon, wie NMNPs übertragen und in den verschiedenen Ebenen der Nahrungskette angereichert werden.

In dieser Arbeit berichten wir über die Wirkung von Gold-Nanopartikeln auf das Pflanzenwachstum, insbesondere auf die Entwicklung von Primär- und Seitenwurzeln von A. thaliana in Gegenwart von Partikeln unterschiedlicher Größe. AuNPs wurden durch Nassverfahren unter Verwendung eines biologisch freundlichen Protokolls ohne Stabilisatoren synthetisiert, wodurch kugelförmige Nanopartikel mit präziser Kontrolle über ihre Größe und Größenverteilung hergestellt wurden. Vor der Pflanzenbehandlung wurden AuNPs mit einem breiten Spektrum analytischer Methoden (AAS, ICP-MS, DLS und TEM) gründlich charakterisiert.

Experimentell

Materialien, Geräte und Verfahren

Goldnanopartikel wurden nach einem leicht angepassten Verfahren synthetisiert, das von Batús et al. [20]. Kurz gesagt, 149 ml Wasser wurden in einem 250 ml-Zweihalsrundkolben erhitzt, bis der Rückfluss beginnt. Anschließend wurden 1 ml 0,33 M Natriumcitrat und 0,945 ml 10 mg/ml Kaliumtetrachloroaurat(III) in Wasser zugegeben. Nach 30 min wurde das Erhitzen beendet und die Reaktionsmischung abkühlen gelassen. In allen Zubereitungsexperimenten wurde Milli-Q-Wasser (18,2 MΩ bei 25 °C) verwendet.

Für Wurzelassays von A. thaliana , synthetisierte AuNPs in drei verschiedenen Größen (10, 14 und 18 nm) wurden bei 5000g . zentrifugiert 1 h lang, um die Partikelkonzentration auf den Grenzwert von 2000 mg/L zu erhöhen.

A. thaliana Columbia (Col-0)-Samen (erhalten von Lehle Seeds, USA) wurden mit 30 % (v /v ) Bleichlösung für 10 Minuten und spülen Sie fünfmal mit sterilem Wasser. Sterile Samen wurden auf Agarplatten ausgesät, die ½ Murashige-Skoog (MS)-Medium und 1% Pflanzenagar (pH 5,8) enthielten. Um die Samenkeimung zu synchronisieren, wurden die Agarplatten 2 Tage bei 4 °C aufbewahrt. A. thaliana Pflanzen wurden für 5 Tage in vertikal ausgerichteten Platten in einer Wachstumskammer bei 22 °C mit 100 μmol m ^− 2 . gezüchtet s ^− 1 Lichtintensität bei langen Tagbedingungen (16 h/8 h Hell-Dunkel-Zyklus).

Fünf Tage alte Sämlinge ähnlicher Größe wurden auf Agarplatten (20 Pflanzen pro Platte) mit 1/16 MS-Medium, verschiedenen Konzentrationen von AuNPs (0, 1, 10 und 100 mg/l) und 1% Pflanzenagar ( pH-Wert 5,8). AuNPs wurden dem Medium nach dem Autoklavieren zugesetzt. Als Kontrolle wurde auch die Wirkung von Natriumcitratpuffer untersucht. Die Länge der Wurzel wurde markiert und die Setzlinge wurden für die nächsten 5 Tage gezüchtet. Sowohl die Zunahme der Primärwurzel- als auch der Seitenwurzellänge wurden mit der Software JMicroVision 1.2.7 gemessen.

Analytische Methoden

Die hergestellten AuNP-Lösungen wurden durch Atomabsorptionsspektroskopie (AAS), mit Massenspektroskopie ausgestattetes induktiv gekoppeltes Plasma (ICP-MS), dynamische Lichtstreuung (DLS) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) charakterisiert.

Die Konzentrationen der hergestellten NPs wurden mittels AAS mit einem VarianAA880-Gerät (Varian Inc., USA) unter Verwendung eines Flammenzerstäubers bei einer Wellenlänge von 242,8 nm bestimmt. Die typische Konzentrationsunsicherheit, die mit dieser Methode bestimmt wird, beträgt weniger als 3%.

Induktiv gekoppeltes Plasma mit Massenspektroskopie-Detektor (ICP-MS) wurde verwendet, um die Konzentration von Au-Ionen zu bestimmen, die aus nicht umgesetzter Au-Quellchemikalie stammen, unter Verwendung eines Agilent 8800 Triple-Quadrupol-Spektrometers (Agilent Technologies, Japan), das an einen Autosampler angeschlossen ist. AuNPs-Kolloidlösung wurde in 1,5 ml hydrophobe Mikroröhrchen pipettiert und bei 30000g . zentrifugiert auf Eppendorf 5430 Zentrifuge für 1 h. Nach der Zentrifugation wurden 0,3 ml Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernt und ICP-MS analysiert. Die Probenzerstäubung wurde mit einem MicroMist-Gerät durchgeführt, das mit einer peristaltischen Pumpe ausgestattet war. Als Blindprobe wurde reine Pufferlösung (2,2 mM Natriumcitrat) verwendet. Die Messunsicherheit betrug weniger als 3%.

TEM-Bilder wurden mit JEOL JEM-1010 (JEOL Ltd., Japan) gemessen, das bei 400 kV betrieben wurde. Ein Tropfen kolloidaler Lösung wurde auf ein Kupfergitter gegeben, das mit einem dünnen amorphen Kohlenstofffilm auf einem Filterpapier beschichtet war. Das überschüssige Lösungsmittel wurde entfernt. Die Proben wurden luftgetrocknet und in einem Exsikkator unter Vakuum gehalten, bevor sie auf einen Probenhalter gelegt wurden. Die Partikelgröße wurde anhand der TEM-Mikroaufnahmen gemessen und unter Berücksichtigung von mindestens 500 Partikeln berechnet.

Die Partikelgrößenverteilung wurde mit dem Zetasizer ZS90 (Malvern Instruments Ltd., England) im DLS-Regime für die Partikelgrößenverteilung, ausgestattet mit einer Avalanche-Photodiode zur Signaldetektion, bestimmt. Als Lichtquelle wurde ein diodengepumpter Festkörperlaser (50 mW, 532 nm) verwendet. Die Messungen wurden in Polystyrolküvetten bei Raumtemperatur durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Nanaopartikel-Charakterisierung

Größe und Größenverteilung von AuNPs wurden durch TEM- und DLS-Analysen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst, zusammen mit den AuNP-Konzentrationen, die durch AAS unmittelbar nach der NP-Synthese bestimmt wurden, und den Konzentrationen der restlichen Au-Ionen, die durch ICP-MS bestimmt wurden. Aus diesen Daten ist ersichtlich, dass unser Syntheseprotokoll gut größenkontrollierte Au-Nanopartikel mit einer ziemlich engen Größenverteilung liefert. Hier haben wir eine modifizierte Methode verwendet, die von Batús et al. [20] für die Synthese von größen- und formkontrollierten Citrat-stabilisierten AuNPs. Das entwickelte Protokoll ermöglicht eine gezielte Größenerweiterung basierend auf der Vergrößerung vorsynthetisierter AuNPs durch oberflächenkatalysierte Reduktion von Au ³⁺ zusammen mit einer gleichzeitig wirksamen Hemmung der sekundären Nukleation.

Wanget al. [21] fanden heraus, dass während einer 3-tägigen hydroponischen Exposition von A. thaliana entweder zu Ag ⁺ und AgNPs (5 nm) bei gleicher Konzentration nahm die Ag-Konzentration im Ag ⁺ . schneller ab -behandelte Lösung als in der AgNP-Lösung, was auf eine schnellere Aufnahme von Ag ⁺ . hinweist Ionen. Daher haben wir besonderes Augenmerk darauf gelegt, den möglichen Einfluss von Au-Ionen auf die Ergebnisverzerrung zu minimieren. Die wie synthetisierten AuNPs wurden bis zu einer Grenzkonzentration von 2000 mg/l zentrifugiert und mit MS-Medium auf die erforderlichen Konzentrationen (1, 10 und 100 mg/l) verdünnt. Nach diesem Verfahren wurde die Konzentration der restlichen Au-Ionen in Lösungen mit 100 mg/l AuNPs durch ICP-MS bestimmt (siehe Tabelle 1). Anscheinend hatte die Zentrifugation positive Auswirkungen sowohl auf das Vorhandensein von restlichen Au-Ionen, deren Konzentrationen im Vergleich zu den wie synthetisierten Lösungen (Tabelle 1, AAS) um zwei Größenordnungen reduziert waren, und auf den Gehalt des Citratpuffers selbst.

Um die NP-Polydispersität zu quantifizieren, führten wir eine DLS-Messung durch, die sehr empfindlich auf das Vorhandensein eventuell gebildeter Partikelkonglomerate reagiert (Abb. 1). Bei dieser Messung verursacht selbst eine geringe Menge agglomerierter NPs die Dominanz entsprechender Peaks bei erheblich höheren Durchmessern, insbesondere in der intensitätsgewichteten Größenverteilung (siehe Einschub in Abb. 1). Glücklicherweise wurde keine Partikelagglomeration festgestellt, und daher kann die Glaubwürdigkeit der Größenbewertung nur durch sphärische Näherung beeinflusst werden [22]. Trotz dieses Nachteils liefert die DLS-Messung im Vergleich zur TEM ein statistisch aussagekräftigeres Gesamtbild der Partikelgrößenverteilung, da sie das gesamte Probenvolumen auf einmal auswertet. Aufgrund der überwiegend runden Natur der präparierten NPs (siehe Abb. 2) stimmten die von DLS abgeleiteten Größen gut mit denen überein, die durch TEM erhalten wurden (Tabelle 1). Scheinbare Partikelagglomerate, sichtbar im TEM-Bild (Abb. 2, 10 nm), wurden eher durch die Notwendigkeit der Lösungsmittelentfernung bei TEM-Messungen als durch die Verbindung einzelner Partikel in der Kolloidlösung selbst verursacht.

Dynamische Lichtstreuungsanalyse (zahlengewichtete Größenverteilung) wässriger Lösungen von AuNPs unterschiedlicher Größe. Einschub zeigt „rohe“ intensitätsgewichtete Daten. Zahlen beziehen sich auf den durchschnittlichen Partikeldurchmesser in nm

TEM-Bilder von präparierten AuNPs. Bitte beachten Sie, dass die Bildvergrößerung für bestimmte NPs-Größen unterschiedlich ist

Anpassung von Nanopartikellösungen an pflanzenbiologische Bedingungen

Aufgrund der starken Aggregationsneigung von AuNPs in Pflanzenwachstumsmedien (MS-Medium), die üblicherweise für das Pflanzenwachstum in vitro verwendet werden [23], mussten wir das gegenseitige Verhältnis dieser beiden Komponenten optimieren, um eine NPs-Aggregation zu vermeiden und gleichzeitig akzeptable Bedingungen für das Pflanzenwachstum aufrechtzuerhalten. Es wurden verschiedene Verdünnungen von MS getestet. Die Aggregation von AuNPs war durch die Änderung der Farbe (Übergang von Rot nach Violett) leicht sichtbar. Aufgrund der geringen Anfangskonzentration der wie synthetisierten AuNPs (ca. 30 mg/l, siehe Tabelle 1), die für biologische Experimente nicht ausreicht, war es notwendig, die NP-Konzentration durch Zentrifugation zu erhöhen. Durch dieses Verfahren haben wir die Partikelkonzentration bis zum Grenzwert von 2000 mg/L erhöht. Solche NPs-Lösungen wurden dann auf Endkonzentrationen verdünnt, was auch die Konzentration des Citratpuffers in unseren Experimenten verringerte. Für Wachstumsexperimente von A. thaliana , haben wir AuNPs in 1/16 MS-Medium verdünnt. In diesem Medium war eine minimale NP-Aggregation nachweisbar und die NPs waren im Vergleich zu 1/2 MS, 1/4 MS und 1/8 MS bei nahezu unverändertem Pflanzenwachstum viel stabiler. Die Konzentration der AuNPs in den endgültigen Lösungen wurde durch AAS bestimmt. Da Pflanzenwachstumsexperimente in in vitro (unter sterilen Bedingungen) durchgeführt wurden, wurde auch die Wirkung des Sterilisationsverfahrens auf NPs untersucht. Das häufig verwendete Autoklavieren (121 °C, 20 min) von vorbereiteten Nährmedien führte zu einer vollständigen Aggregation der untersuchten NPs. Daher war dieses Verfahren für unsere Versuche nicht geeignet. Die Zugabe von NPs in autoklaviertes Agarmedium mit etwa 60 °C wurde schließlich als alternatives Verfahren verwendet, bei dem keine NP-Aggregation festgestellt wurde und der Sterilisationsprozess noch wirksam war.

Einfluss von NPs auf das Wurzelwachstum von Arabidopsis thaliana in vitro

Modellpflanzen wie Dicot A. thaliana haben das Potenzial, Stressfaktoren zu verstehen, die die weltweiten Ernteerträge reduzieren, mit dem Ziel, Gene zu identifizieren, die die Lebensfähigkeit unter Stressbedingungen verbessern können [24]. Alle getesteten Formen von AuNPs hatten eine signifikante Wirkung auf Lateral Roots (LRs). Sowohl die Länge (Abb. 3a) als auch die Anzahl (Abb. 3b) der LRs wurden in AuNP-behandelten Pflanzen reduziert. Die höchsten Konzentrationen von AuNPs (100 mg/l) aller untersuchten Partikelgrößen führten zu einer Verringerung der LRs-Länge auf etwa 50 %. Die Anzahl der LRs sinkt bei 18 nm AuNPs und der höchsten Konzentration (100 mg/L) auf etwa 70 %. Bei Verwendung der höchsten Konzentration kleinerer AuNPs (14 und 10 nm) wurde eine geringfügig geringere Verringerung der Anzahl der LRs beobachtet (Abb. 3b). Auch die Länge der Primärwurzeln war nach der AuNP-Behandlung verringert (Abb. 3c). Der negative Effekt von 10-nm-AuNP war insbesondere bei höheren Partikelkonzentrationen beträchtlich. Die Wirkung größerer Partikel (14, 18 nm) war viel geringer und ähnelte der Wirkung von Natriumcitratpuffer, der als Kontrolle verwendet wurde. Die meisten veröffentlichten Studien mit gentechnisch veränderten NPs zeigten einen gewissen Grad an Phytotoxizität, insbesondere bei hohen NP-Konzentrationen. Citrat-beschichtete AgNPs hemmten beispielsweise A. thaliana Wurzelverlängerung bei Sämlingen mit einer linearen Dosisantwort von 67 auf 535 µg/l nach 2 Wochen [25]. Mehrere andere Studien mit Wurzeldehnungs- und Samenkeimungsassays haben gezeigt, dass die Phytotoxizität von der Größe der NPs beeinflusst wird. Viele Studien kamen zu dem Schluss, dass je kleiner die NPs desto phytotoxischer sind. Diese Verallgemeinerung über die größenabhängige Toxizität technisch hergestellter Nanomaterialien gilt jedoch nicht immer für alle Kombinationen von Pflanzen und NP-Typen [21, 25]. Im Gegensatz dazu beeinflussten einwandige Kohlenstoffnanoröhren die Wurzelverlängerung von Tomaten, Kohl, Karotten und Salat innerhalb von 24 bis 48 h positiv [26]. Eine positive Wirkung von 24-nm-AuNPs auf die Samenkeimungsrate und das vegetative Wachstum wurde von Kumar et al. [13].

Wirkung von AuNPs auf a Länge und b Anzahl der Seitenwurzeln und c Verlängerung der Primärwurzel von A. thaliana Sämlinge. Pflanzen wurden unterschiedlichen Konzentrationen (0,1, 10 und 100 mg/l) von 10, 14 und 18 nm AuNPs ausgesetzt. Daten sind Mittelwerte + SD von 19–20 Pflanzen. *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001; t testen

Bei Wurzelwachstumsexperimenten wurde ein erheblich positiver Effekt von 10 nm AuNPs auf das Wurzelhaarwachstum beobachtet (Abb. 4). Dieser Effekt zeigte eine starke Konzentrationsabhängigkeit. Eine steigende NP-Konzentration induzierte ein stärkeres Wachstum der Wurzelhaare (Abb. 4e). Dieses Verhalten wurde häufig bei Wurzeln beobachtet, die in phosphorarmen Böden angebaut wurden [27]. Ein ähnlicher Effekt wurde bei 14 und 18 nm AuNPs nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu haben García-Sánchez et al. [28] beobachtet, während A. thaliana Behandlung mit kommerziell erhältlichen AgNPs, Hemmung einer Reihe von Wurzelhaaren bezogen auf 1 cm Pflanzenwurzel. Eine Abnahme der Haarwurzeln wurde bei allen getesteten Partikeln unabhängig von ihrer spezifischen Größe (10, 20, 40 und 80 nm) bei einer einheitlichen Konzentration der Behandlungslösungen von 200 mg/L beobachtet. Wurzelhaare vergrößern die Wurzeloberfläche im Kontakt mit dem Boden erheblich, und das meiste Wasser und die Nährstoffe, die in die Pflanze gelangen, werden durch sie aufgenommen. Daher wird ihre Entwicklung maßgeblich durch Umweltreize und Stresssignale beeinflusst [29].

Wirkung verschiedener Konzentrationen von 10 nm AuNPs auf das Wurzelhaarwachstum in A. thaliana Sämlinge. a Kontrolle, b –d Sämlinge, die mit 1, 10 bzw. 100 mg/l AuNPs behandelt wurden, und e Detail des induzierten Wurzelhaarwachstums in Pflanzen, die 100 mg/l AuNPs ausgesetzt waren. Die Maßstabsbalken entsprechen 1 cm

Schlussfolgerungen

Wir haben erfolgreich Goldnanopartikel durch sanfte Zweikomponentenreduktion (Natriumcitrat-Kaliumtetrachloroaurat) in einer Wasserumgebung hergestellt, die runde, eng verteilte Partikel mit hervorragender Kontrolle über ihre resultierende Größe liefert. Die Zentrifugation nach der Synthese ermöglichte das Erreichen der gewünschten NP-Konzentrationen und eliminierte den Einfluss von Ionen und Citratpuffer auf die Ergebnisverzerrung in Pflanzenexperimenten. Die Wirkung von AuNPs unterschiedlicher Größe (10, 14 und 18 nm Durchmesser) und Konzentrationen (1, 10 und 100 mg/l) auf das Wurzelwachstum von A. thaliana wurde untersucht. Die Anzahl und Länge der Seitenwurzeln wurden nach der Behandlung mit NPs-Lösungen höherer Partikelkonzentrationen unabhängig von ihrer spezifischen Größe signifikant verringert. Bei 10 nm großen AuNPs wurde ein negativer Effekt auf das Primärwurzelwachstum beobachtet. Überraschenderweise induzierten die kleinsten AuNPs (10 nm) eindeutig das Wurzelhaarwachstum. Insgesamt zeigte diese Studie, dass die direkte Exposition von Pflanzen gegenüber AuNPs signifikant zur Phytotoxizität beitrug und unterstreicht die Notwendigkeit einer umweltgerechten Entsorgung von Abfällen und Schlämmen, die Au-Nanopartikel enthalten.

Abkürzungen

AAS:

Atomabsorptionsspektroskopie

AgNPs:

Silbernanopartikel

AuNPs:

Goldnanopartikel

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

ICP-MS:

Induktiv gekoppeltes Plasma mit Massenspektroskopie

LRs:

Seitenwurzeln

MS:

Murashige und Skoog

NMNPs:

Edelmetall-Nanopartikel

NPs:

Nanopartikel

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie