Goldnanopartikel mit Chitosan, N-acyliertem Chitosan und Chitosan-Oligosaccharid als DNA-Träger

Hintergrund

Gentherapie kann kurz als eine Möglichkeit definiert werden, genetisches Material für verschiedene Zwecke in Zellen einzubringen, darunter die Behandlung genetischer Krankheiten [1]. Unter den beiden Haupttypen von DNA-Vektoren für die Gentherapie, viral und nicht-viral, hat der letzte die Vorteile der Abwesenheit von Immunogenität, guter Compliance, Nicht-Infektiosität [2], Lagerstabilität und einfacher Herstellung. Andererseits weisen virale Vektoren wie Retroviren, Adenoviren, adeno-assoziierte Viren usw. hohe Transfektionsraten und schnelle Transkription auf, aber sie weisen Nachteile wie schnelle Clearance aus dem Kreislauf, Toxizität, Immunogenität und verringerte Kapazität auf große Mengen an Informationen zu transportieren [3,4,5]. Üblicherweise wird bei nicht-viralen Trägern die Fremd-DNA auf ein Plasmid geladen und während der Bildung von Konjugaten oder Komplexen geschützt und stabilisiert. Insbesondere Chitosan (CO) wurde für die Entwicklung nicht-viraler DNA-Vektoren untersucht, da es hohe Transfektionsraten und geringe Toxizität gezeigt hat und die DNA während des interzellulären Transports vor den Nukleinsäuren schützt [4]. Dieses in der Natur weit verbreitete Polymer (es kommt als Hauptbestandteil der Schalen von Krustentieren und als Teil der Zellwände vieler Pilze vor [6]) ist ein Polysaccharid, das nach der Chitintransformation (unter Erhalt von 2-Amino-2-desoxy -β-D-Glucopyranose-Wiederholungseinheiten, aber immer noch eine kleine Menge an 2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranose-Resten [7]) (Abb. 1a). Medizinische Anwendungen von nativem Chitosan erfordern in den meisten Fällen einige Modifikationen des Polymers; Zu den zu überwindenden Hauptnachteilen zählen die Unlöslichkeit bei physiologischem pH-Wert und die hohe Viskosität in verdünnter Säurelösung [8]. Einige Forscher haben darauf hingewiesen, dass die Zelltransfektionsdynamik von der Größe und Form des Vehikels abhängt [1, 8,9,10,11,12], zum Beispiel Huo et. al. berichteten, wie diese Eigenschaften im Fall von Goldnanopartikeln mit der Penetrationseffizienz korrelieren [10].

Die Löslichkeit von Chitosan kann verändert werden, indem die Verteilung der verbleibenden Acetylgruppen in der Kette und der Acetylierungsgrad verändert werden [13]. Eine andere Methode zur Kontrolle der physikalischen Eigenschaften von Chitosan ist die Acylierung (Abb. 1b). Abhängig von der Verfügbarkeit von Aminogruppen und dem Grad der Acetylierung können einige Biointeraktionen von Chitosan kontrolliert werden, indem seine Hydrophobie beispielsweise durch Acylierung mit Fettsäuren erhöht wird [7]. Le Tien et. al. [7] haben über die Chitosan-N-Acylierung für Matrices mit kontrollierter Freisetzung in Pharmazeutika berichtet. Bhattarai et. al. [14] erhielten N-acylierte Chitosan-stabilisierte Goldnanopartikel für Anwendungen unter physiologischen Bedingungen, die die Vorteile von nicht-acyliertem Chitosan aufwiesen. Eine weitere sinnvolle Modifikation von Chitosan ist die Verkürzung der Polymerkettenlänge (Chitosan Oligosaccharide, COS) [15]. Unter den Eigenschaften der vielen Arten von COS, die aus Chitosan gewonnen werden, sind ihre niedrigere Viskosität und ihre höhere Löslichkeit in Wasser für viele Anwendungen sehr nützlich [16]. Es wurde berichtet, dass Chitosan mit niedrigem Molekulargewicht die zelluläre Aufnahme erhöhen kann, hauptsächlich aufgrund seiner kürzeren Kettenlängen (2-10 D-Glucosamin-Einheiten) (Abb. 1c) und der freien Aminogruppen [17,18,19]. Darüber hinaus enthält die Synthese von Goldnanopartikeln mit Chitosan-Oligosaccharid als Reduktionsmittel kein toxisches Reagenz [20].

Chemische Struktur von a Chitosan, b acyliertes Chitosan und c Chitosan-Oligosaccharid

Goldnanopartikel (AuNPs) führten zur Entwicklung einer neuen Art von Nanomaterialien, die sich ihre optischen Eigenschaften und ihre hohe physikalische Stabilität zunutze machten, die sie zu einer sehr praktikablen Option für verschiedene Anwendungen machen [21,22,23,24,25]; dabei stellen sie Verbesserungen für die zelluläre Transfektion gegenüber Lipokomplexen oder Polymeren dar, indem sie eine höhere Dichte aufweisen und so die Aufnahmezeit verkürzen [12]. Da Gold eine große Affinität zu Amino (-NH₂ ), Cyano- (-CN) und Thiol- (-SH)-funktionellen Gruppen eröffnen sich enorme Möglichkeiten für viele Arten der Funktionalisierung [9, 26]. Kationische Monoschichten werden beispielsweise durch Zugabe von kationischen Polymeren zu Gold-Nanopartikeln erhalten, wodurch die Nukleinsäure-Interaktion und die elektrostatische Adsorption verbessert werden [27, 28]. Auf diese Weise nutzen Nanokomplexe, die Chitosan und Gold kombinieren, die Vorteile beider Materialien für biologische Anwendungen [29,30,31,32,33] und stellen ein vielversprechendes Material für die Entwicklung von DNA-Trägern dar [5, 10, 12, 14].

Es gibt eine Vielzahl biologischer Methoden zur Synthese von AuNPs, die unter anderem die Verwendung von Kohlenhydraten, Mikroorganismen, Enzymen, Vitaminen und Biopolymeren umfassen [34]. Zwischen der sogenannten grünen Synthese [35] hat sich der Einsatz der Eintopf-Synthese mit Chitosan als Reduktions- und Stabilisierungsmittel als besser abstimmbar und sicher für biomedizinische Anwendungen erwiesen [36, 37]. Wie bei herkömmlichen Synthesemethoden hängt bei der Eintopfsynthese die erhaltene Partikelgröße von der Konzentration des Reduktionsmittels ab; Auf diese Weise muss im speziellen Fall von Chitosan-Oligosaccharid das Chitosan/Gold-Verhältnis kontrolliert werden, um unterschiedliche Partikelgrößen zu erhalten, da das Molekulargewicht des Chitosan ein wichtiger Faktor für die Größen- und Formverteilung der Nanopartikel ist. Diese Arbeit zielte auf die Bewertung verschiedener Chitosan-AuNP-basierter Nanokomplexe für die DNA-Transfektion ab, einschließlich der Green/One-Pot-Synthese mit 5 kDa Chitosan-Oligosaccharid, das ein niedrigeres Molekulargewicht aufweist als die für ähnliche Anwendungen berichteten [36, 38].

Transfektionstests wurden in der Zelllinie HEK-293 (Homo sapiens (human)-epitheliale Morphologie-embryonale Niere-Fetus) mit pSV-β-Gal und pIRES2-EGFP-Plasmiden. Diese Tests wurden basierend auf der Transfektionseffizienz und Zytotoxizität ausgewählt, die vom Zelltyp abhängig sind, und dass gemäß Corsi et. al. [4] ist die Transfektion für die Zelllinie HEK-293 im Vergleich zu MG63 und mesenchymalen Stammzellen günstiger.

Methoden

Nanokomposit-Synthese

Jedes Experiment wurde mit Gold-Nanopartikeln mit modifiziertem und unmodifiziertem Chitosan durchgeführt; zwei Hauptsynthesemethoden wurden verwendet:eine chemische Synthese für Gold-Nanopartikel mit Chitosan in seiner einfachen Form (CO-AuNPs) und hydrophob modifiziertem Chitosan mit Acylgruppen (Acyl-CO-AuNPs) und die andere eine grüne/ein- Topfsynthese mit kurzkettigem Chitosan (Chitosan-Oligosaccharid, COS@n-AuNPs). Figur 2 zeigt ein schematisches Diagramm für jede Synthese; die entsprechenden experimentellen Verfahren sind unten beschrieben.

Schematische Darstellung für jede Synthese:a –b chemische Synthese für Goldnanopartikel mit Chitosan in seiner einfachen Form (CO-AuNPs) und mit hydrophob modifizierten Acylgruppen (Acyl-CO-AuNPs) und c –f Grüne/Eintopf-Synthese für kurzkettiges Chitosan (Chitosan-Oligosaccharid, COS@n-AuNPs)

Materialien

Gold(III)-chlorid-Trihydrat (HAuCl₄ .) ∙3H₂ O), Natriumborhydrid (NaBH₄ .) ), Chitosan mit niedrigem Molekulargewicht (50-190 kDa, 75% Deacetylierungsgrad) und Chitosan-Oligosaccharid (niedriges Molekulargewicht, 5 kDa) wurden von Sigma Aldrich bezogen. Alle Glaswaren wurden gewaschen und in einem Bad mit frisch zubereitetem Königswasser (HCl:HNO₃ , 3:1 v /v ) für 24 h und spülen Sie es vor Gebrauch gründlich mit Mili-Q-Wasser ab, um alle Metallspuren zu entfernen [39].

Chitosan-Gold-Nanopartikel (CO-AuNPs)

Die Synthese von Chitosan-Gold-Nanopartikeln wurde nach Huang et. al. [9] Methodik. Dazu wurden 20 mg Chitosanlösung mit niedrigem Molekulargewicht (2 mg/ml) zu 10 ml 1%iger Essigsäure gegeben und mit Vortex bis zur vollständigen Auflösung vermischt und über Nacht gelagert. 2 Milliliter der erhaltenen Lösung wurden unter Verwendung eines 0,22 μm Polyethersulfon-Spritzenfilters filtriert, dann wurde sie mit 1 ml 10 mM HAuCl₄ . vermischt ∙3H₂ O-Lösung unter starkem Rühren für 30 min. 0,4 ml frisch zubereitetes 100 mM NaBH₄ als Reduktionsmittel wurde kalte Lösung verwendet; es wurde unter Rühren zugetropft, und es wurde ein schneller Farbumschlag von gelb nach weinrot beobachtet; danach wurde das Rühren für eine Gesamtzeit von 2 h fortgesetzt (Abb. 2a).

Acylierte Chitosan-Gold-Nanopartikel (Acyl-CO-AuNPs)

Caproylchlorid (C₆ .) H₁₁ ClO, Sigma Aldrich) wurde für die Synthese acylierter Chitosan-Gold-Nanopartikel verwendet.

Gelation

Die Acylierung von Chitosan (niedriges Molekulargewicht) wurde nach dem von Remant Bahadur et al. [6] mit leichten Modifikationen. Dazu wurden 0,83 g Chitosan zu 100 ml 1%iger Essigsäurelösung unter magnetischem Rühren gegeben, das 24 h fortgesetzt wurde. 5 Milliliter dieser Lösung wurden mit einem 0,22-&mgr;m-Polyethersulfon-Spritzenfilter filtriert, und dann wurde ihr pH-Wert mit einer 0,1 M Natriumhydroxid (NaOH)-Lösung, die langsam unter kräftigem Rühren zugegeben wurde, auf 7,2 eingestellt. 1 ml Caproylchlorid wurde zu 5 ml dieser letzten Lösung gegeben und die resultierende Mischung wurde 5 h gerührt. Der pH-Wert der Mischung wurde mit einer Hydroxidlösung auf 6,8–7 eingestellt. Das erhaltene Gel wurde mit Aceton präzipitiert und bei 5000 U/min für 20 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Überschüssige Capronsäure wurde durch dreimaliges Waschen mit Methanol (50–60 °C) und Dekantieren entfernt und 3 Tage lang auf dem Herd trocknen gelassen. Dieses Gel wurde für die Nanokomposit-Synthese verwendet.

Nanocomposites

Ein Milliliter eines 10-mM HAuCl₄ ∙3H₂ O-Lösung wurde zu 2 ml Gel, verdünnt auf 0,33 % in einer 0,1 M HCl-Lösung, zugegeben, wobei 1 Stunde gerührt wurde. Fügen Sie schließlich die letzten 0,4 ml eines 0,1-M NaBH₄ . hinzu frisch zubereitete kalte Lösung unter Rühren, die Bildung von Goldnanopartikeln war erkennbar, wobei sich die rosa/rote Farbe änderte, bevor 2 Stunden kontinuierliches Rühren abgeschlossen wurde (Abb. 2b).

Chitosan-Oligosaccharid-Gold-Nanopartikel (COS@n-AuNPs)

COS@n-AuNPs wurden nach einer modifizierten Methode hergestellt, die von Manivasagan et al. [20]. Chitosan-Oligosaccharid (COS) wurde zu 10 ml HAuCl₄ . gegeben ∙3H₂ O-Lösung gewaschen und 60 min bei 80 °C gerührt. Es wurden vier Synthesen durchgeführt, indem die Menge an COS (100 und 200 mg) und die Goldkonzentration in HAuCl₄ . variiert wurden ∙3H₂ O-Lösung (0,003 und 0,017 Gew.-%). Tabelle 1 zeigt die Parameter, die bei der AuNP-Synthese für jedes Experiment verwendet werden. Die Bildung von Gold-Nanopartikeln war mit der weinroten/rosa-roten Farbumwandlung ersichtlich, wobei die Farbänderung in jedem Fall zu unterschiedlichen Zeitpunkten registriert wurde, abhängig von der Menge an Reduktionsmittel und Goldvorstufe. Die erhaltenen Nanokomposite wurden durch Zentrifugieren bei 12.000g . gereinigt für 30 min (Abb. 2c–f).

Nanokomposit-Charakterisierung

Infrarotspektroskopie

Chitosan, das für CO-AuNPs verwendet wird, acyliertes Chitosan für Acyl-CO-AuNPs und Chitosan-Oligosaccharid für eine Reihe von COS@n-AuNPs wurden durch FTIR-Spektrometrie (Spectrum One, Perkin Elmer) charakterisiert, um die Acylierung des Acyl-CO-Polymers durch Vergleich der Intensität charakteristischer Banden von funktionellen Gruppen zwischen Proben. Der Substitutionsgrad (SD) wurde aus IR-Spektreninformationen nach Remant Bahadur et. al. [6].

ξ-Potenzial

Zetasizer (Nano Z, Malvern) wurde verwendet, um das Verbundoberflächenpotential zu bewerten. Für Nanokomposite wird ein positives Potenzial für eine erfolgreiche Adhäsion an DNA zur Bildung von Komplexen erwartet. ξ- Das Potenzial wurde vor und nach der Komplexbildung bewertet, um Veränderungen nach der DNA-Adhäsion zu bestätigen. 1,5 ml entsprechend verdünnter Proben wurden für Oberflächenpotentialmessungen unter Verwendung einer Kapillarzelle (DTS 1060, Malvern) verwendet.

UV-Vis-Spektroskopie

UV-Vis-Spektren (UV-1800 m, Shimadzu) im Bereich von 400 bis 700 nm wurden zur vorläufigen Bestätigung der Goldnanopartikelbildung mittels der Oberflächenplasmonenresonanzbande um 530 nm erhalten. Ergänzend wurden die Spektren frisch hergestellter Nanokomposite verwendet, um die Photostabilität von Proben qualitativ zu bewerten; dies erfolgte durch Vergleich mit Spektren, die 150 Tage nach der Synthese von denselben Proben erhalten wurden, durch Verfolgen von Änderungen um die Oberflächenplasmonenresonanzbande, durch Auswahl einer Probe für jede Methode und Verwendung von COS@2-AuNPs als repräsentativste für COS@n-AuNP Serie. Als Probenbehälter wurde eine Quarzzelle und als Blindwert entionisiertes Wasser verwendet.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Zur Bestimmung der Form und Partikelgrößenverteilung wurde TEM-Mikroskopie (JEM 1010, JEOL) verwendet. Für TEM-Bilder wurden Nanokomposit-Proben hergestellt, indem 10 µl Lösung über 200 mesh Kupfergitterträger aufgebracht, mit Formvar bedeckt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten getrocknet wurden. Drei Bilder für jede Probe wurden ausgewählt und mit Hilfe eines hausgemachten Bildverarbeitungsprogramms analysiert, das mit der Matlab®-Software entwickelt wurde.

Komplexbildung und Adhäsionsgrad

Nanokomposit-pDNA

pSV-β-Gal (6,82 kb) und pIRES2-EGFP (5,3 kb) (pDNA) wurden aus transformiertem DH5α Escherichia coli . isoliert . Die Plasmidreinigung wurde durch alkalische Lyse unter Verwendung des Mo Bio® UltraClean Microbial DNA Isolation Kit durchgeführt. Agarose-Gelelektrophorese wurde verwendet, um die strukturelle Integrität von Plasmiden zu überprüfen, wobei ein Hochleistungs-UV-Transilluminator verwendet wurde und Bilder mit einem Kodak Gel Logic 100 Digital Imaging System aufgenommen wurden. Die Konzentration und Reinheit der Plasmid-DNA wurde mit dem Synergy™ 2 Multi-Detection Microplate Reader unter Verwendung des Gen5-Programms validiert. Komplexe wurden durch Mischen von Plasmid-DNA (pDNA) mit jedem Typ von Gold-Chitosan-Nanopartikel-Nanokompositen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma-Aldrich) ohne Serum bei Plasmidmengen zwischen 200 und 400  ng erhalten. Die pDNA-Adhäsion an Nanokomposit wurde durch Elektrophorese unter Verwendung von Agarosegel bei 0,8% und einer Spannung von 90 V für 60 min bewertet.

Chitosan-Gold-Nanopartikel-pDNA-Komplex-Transfektion in HEK-293-Zellen

Zellkultur

HEK-293 Homo sapiens (human)-epitheliale Morphologie-embryonale Nieren-Fötus-Zellen wurden in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit fötalem Rinderserum (SFB, Sigma-Aldrich) bei 37 °C unter 5 % CO₂ . kultiviert -haltige Atmosphäre. Für die pDNA-Transfektion wurden HEK-293-Zellen mit 12.000 Zellen pro Well in eine 96-Well-Platte ausgesät und für 24 Stunden bei 37 °C in 5% CO₂ . inkubiert -haltige Atmosphäre, die eine Konfluenz von 90% erreicht.

Transfektionseffizienz mit pIRES2-EGFP

Die In-vitro-pDNA-Nanokomposit-Funktionalisierung wurde durchgeführt, indem Kulturmedium aus den Vertiefungen gegossen wurde, bis die Zellen kaum bedeckt waren, und die Komplexlösung in jede Vertiefung gegeben wurde (15 µl Nanoverbundstoffe und 200 µg DNA) und 2 Stunden unter denselben Kulturbedingungen inkubiert wurde. Danach wurden 500 µl komplettes DMEM zur Inkubation für 48 µl zugegeben. Die pIRES2-EGFP-Transfektion wurde direkt durch Fluoreszenzmikroskopie (Axio Vert.A1, Carl Zeiss) bewertet.

Transfektionseffizienz mit pSV-β-Gal

Die X-gal-Histochemie wurde verwendet, um die β-Galactosidase-Aktivität zu bewerten, indem die pSV-β-Gal-Plasmidexpression auf der HEK-293-Zelllinie modifiziert wurde; bei dieser Methodik wurden die transfizierten Zellen blau. Die in vitro pDNA-Nanokomposit-Funktionalisierung wurde wie oben erläutert durchgeführt, wobei 2 h bei den gleichen Kulturbedingungen inkubiert wurde. Danach wurden 500 µl komplettes DMEM zur Inkubation für 24 Stunden, Mediumwechsel und Inkubation für weitere 24 Stunden zugegeben. Die Wells wurden zweimal mit 50 µl steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1 x nach dem Entfernen des Kulturmediums gewaschen, dann wurden die Zellen mit einer Mischung aus 2 % Formaldehyd und 0,2 % Glutaraldehyd für 5 min fixiert; danach wurden sie zweimal mit 50 µl PBS 1x gewaschen. Fixierer wurde vor dem Waschen zweimal mit 50 µl PBS 1× entfernt und dann mit einer Mischung von 0,4 µg/ml X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, Sigma-Aldrich) verdünnt in 5 µM Kaliumferrocyanid (Meyer) und Magnesiumchlorid 2 µM (Meyer) auf PBS 1x. Dann wurden die Zellen 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Expression von β-Galactosidase wurde durch Hellfeldmikroskopie (AE2000, Motic) beobachtet, wobei 5 Felder pro Vertiefung mit einem Ziel von ×   40 aufgenommen wurden, wobei erwartet wurde, dass die transfizierten Zellen blau werden. Die Transfektionseffizienz wurde durch Vergleichen von Zellen mit β-Galactosidase-Expression (blau verfärbt) mit Gesamtzellen pro Feld bewertet. LipofectAMINE ^TM 2000 (30 μl) wurde als Positivkontrolle für jeden Test verwendet.

Zelllebensfähigkeit nach Farbstoffausschlussmethode

Mikrokulturen wurden 24 Stunden nach der Zellpassage verwendet. Das Kulturmedium wurde entfernt und die Zellen wurden 1x mit PBS gewaschen, bevor 40 &mgr;l Komplexlösung zugegeben wurden. Danach wurden die Zellen 2 h bei 37 °C bei 5% CO₂ . inkubiert -haltige Atmosphäre. Zum Farbstoffausschluss wurde die Komplexlösung mit 50 µl PBS 1× aus den Zellen gewaschen und 20 µl Trypanblau (0,2% auf PBS 1×) eingearbeitet. Mit dieser letzten Mischung wurden die Zellen 10 min bei 37 °C und 5% CO₂ . inkubiert -haltige Atmosphäre. Nach dieser letzten Inkubation wurde der Farbstoff aus den Vertiefungen entfernt und durch zweimaliges Waschen mit 50 µl PBS 1x gereinigt. Die Zellen wurden durch Hellfeldmikroskopie beobachtet, wobei blau gefärbte Zellen (tot oder beschädigt) gegen die Gesamtzahl der Zellen pro Feld gezählt wurden. Zelllebensfähigkeitstests wurden für verschiedene komplexe Konzentrationen auf Wasser durchgeführt, von 0,1 µM bis 3 µM, CO-AuNPs und Acyl-CO, bei 3 µM; COS@3-AuNPs und COS@4-AuNPs, bei 0.5 mM; und die niedrigste Konzentration (0,1 mM) für COS@1-AuNPs und COS@2-AuNPs.

Software Image J (Open-Source-Software (OSS ) Lizenz ) zusammen mit dem Plugin Image-based Tool for Counting Nuclei-ICTN wurden verwendet, um Zellen für Transfektions- und Lebensfähigkeitstests zu zählen.

Ergebnisse und Diskussionen

Nanokomposit-Synthese und -Charakterisierung

Unter den drei Arten von Komplexen, die in dieser Arbeit synthetisiert wurden, verdient COS@n-AuNP besondere Aufmerksamkeit, da sie ohne den Einsatz toxischer Reagenzien wie Natriumborhydrid oder Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) synthetisiert wurden. Es wurde berichtet, dass Chitosan als Reduktions- und Stabilisierungsmittel und optimale Konzentration geeignet ist, um AuNP-Komplexe in gewünschten Größen und Formen zu synthetisieren, abhängig von mehreren Faktoren:Reaktionszeit, Temperatur und Grad der Chitosan-Deacetylierung und seinem Molekulargewicht, unter anderem [38 , 40]. Unter dieser Überlegung wurde das Molekulargewicht von Chitosan für die vier COS@n-AuNP-Synthesen konstant bei 5 kDa gehalten, wobei HAuCl₄ . angenommen wurde ∙3H₂ O- und Chitosan-Lösungen in unterschiedlichen Konzentrationen.

Abbildung 3 zeigt UV-Vis-Absorptionsspektren von AuNPs-Chitosan-Nanokompositen, die in dieser Arbeit synthetisiert wurden. Plasmonenbanden zentriert bei 534 nm für Chitosan (CO-AuNPs), 507 nm für acyliertes Chitosan (Acyl-CO-AuNPs) und für die verschiedenen Chitosan-Oligosaccharide bei 533 nm (COS@1-AuNPs), 530 nm (COS@2 .) -AuNPs), 535 nm (COS@3-AuNPs) und 536 nm (COS@4-AuNPs) bestätigen die Anwesenheit von Goldnanopartikeln. Einschübe in dieser Abbildung zeigen Bilder der erhaltenen Nanokomposite, deren Färbung von der Konzentration, Größe, Form und Oberflächenfunktionalisierung der Nanopartikel abhängt.

UV-Vis-Spektren für Nanokomposite. Die Werte in den Einfügungen entsprechen der maximalen Wellenlänge der lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz. Diese Maxima waren wie folgt:für CO-AuNPs bei 534 nm (0,1 M NaBH₄ ) (a ), für Acyl-CO-AuNPs bei 507 nm (b ), und für COS-@n-AuNP-Chitosan-Oligosaccharid bei 533, 530, 535, 536 nm für jede Nanokomposit-Präparation mit 1–4 unterschiedlicher Dicke (c )

Stabilität von Nanokompositen

Abbildung 4 zeigt den Vergleich zwischen UV-Vis-Absorptionsspektren von frisch synthetisierten Nanokompositen und 150 Tagen nach der Synthese; wie zu sehen ist, bleiben die beiden Spektren für jeden Fall im Wesentlichen gleich, keine signifikante Verschiebung des Maximums der Resonanzbanden und kein Hinweis auf zusätzliche Peaks. Diese Ergebnisse weisen qualitativ auf eine hohe Stabilität der erhaltenen Nanokomposite hin.

Stabilität von Gold-Nanopartikel-Nanokompositen durch UV-Vis-Absorptionsspektren 150 Tage nach der Synthese:chemisch synthetisierte CO-AuNPs (a ) und Acyl-CO-AuNPs (b ) und Grün/Eintopf-Synthese für COS@2-AuNPs (c )

Infrarotspektroskopie für die drei verschiedenen Chitosanproben sind in Abb. 5 gezeigt. Diese Technik wurde zur Identifizierung des acylierten Chitosans verwendet, indem seine Absorptionsbanden im Infrarotbereich (IR) (die charakteristisch für die chemische Struktur sind) mit dem IR . verglichen wurden Datenbank. Einige charakteristische IR-Banden sind erwähnenswert:Chitosan-Banden (50–190 kDa, 75% Deacetylierungsgrad) bei 1656 cm ⁻¹ , 1593 cm ⁻¹ , und 1373 cm ⁻¹ entsprechen Amidgruppen (Amide I, II bzw. III); die Bande bei 2895 cm ⁻¹ entspricht C-H-Bindungen und solchen zwischen 3200–3500 cm ⁻¹ zu N-H- und O-H-Bindungen. Für acyliertes Chitosan wurden IR-Banden bei 1651 cm ⁻¹ . erhalten , 1591 cm ⁻¹ , und 1369 cm ⁻¹ entsprechen den Amidgruppen (Amide I, II bzw. III) und denjenigen innerhalb von 3200–3500 cm ⁻¹ entsprechen N-H- und O-H-Bindungen. Die Chitosan-Acylierung wurde durch IR-Spektroskopiedaten bestätigt [7]:die Bande bei 1591 cm ⁻¹ war für acyliertes Chitosan niedriger als für natives Chitosan aufgrund einer größeren Anzahl sekundärer Amide auf acyliertem Chitosan. Bänder innerhalb von 3200–3500 cm ⁻¹ , charakteristisch für N-H- und O-H-Schwingungen in nativem Chitosan, verschwindet für acyliertes Chitosan und Chitosan-Oligosaccharid aufgrund der primären Amidreduktion.

FT-IR-Spektren von Chitosan, Acyl-Chitosan und Chitosan-Oligosaccharid. Band bei 1591 cm ⁻¹ entspricht sekundären Amiden; 3200–3500 cm ⁻¹¹ Regionen entsprechen N-H- und O-H-Schwingungen

Der Substitutionsgrad für acyliertes Chitosan wurde nach Bahadur et. al. [6], durch den folgenden Ausdruck:

wo A ₁₆₅₁ = 1,973965 und A ₃₃₅₀ = 1.977278 entspricht der Absorption (für Amid I bzw. OH-Schwingung) von acyliertem Chitosan bei 1631 cm ⁻¹ und 3350 cm ⁻¹ , und 0,25 entspricht den Gruppen der freien Amine. Es wurde ein N-Acylierungsgrad von 75% erreicht.

ξ Potenzial

Die ξ-Potenzialwerte wurden für jeden Verbundstoff wie folgt ermittelt (Tabelle 2, Spalte „ξ-Potenzial“):43,3 mV (CO-AuNPs), 40,2 mV (Acyl-CO-AuNPs), 52,2 mV (COS@1-AuNPs) , 55,3 mV (COS@2-AuNPs), 51,6 mV (COS@3-AuNPs) und 46,3 mV (COS@4-AuNPs). Das Potenzial für alle Nanokomposite war aufgrund der Amingruppen aus Chitosan positiv, wie es geplant war, um eine DNA-Komplexbildung durch elektrostatische Kräfte zu erreichen. Nach der Komplexbildung bestätigte die Verringerung der ξ-Potentialwerte die erfolgreiche Adhäsion von DNA (Tabelle 2, Spalte „ξ-Potenzial/DNA“).

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Abbildung 6 zeigt die repräsentativen TEM-Aufnahmen für jedes Nanokomposit zusammen mit Histogrammen der Nanopartikelgröße zur Berechnung der Größenverteilung. Die Größenverteilungen für jedes Nanokomposit wurden wie folgt erhalten:Drei TEM-Bilder für jede Probe wurden aufgenommen und mit einer hausgemachten Bildverarbeitungssoftware, die mit Matlab® entwickelt wurde, analysiert und die Nanopartikelzahl betrug 500 für Acyl-CO-AuNPs, 1000 für CO-AuNPs , und 100 für die COS@n-AuNP-Reihe. Die durchschnittliche Größe für jede Probe ist in Tabelle 2, Spalte „Durchschnittlicher TEM-Durchmesser (nm)“ zusammengefasst. Es ist erwähnenswert, dass mit Chitosan-Oligosaccharid synthetisierte AuNPs kugelförmig waren, mit einer besseren Größenverteilung im Vergleich zu ähnlichen, die mit anderen in der Literatur beschriebenen grünen Synthesemethoden erhalten wurden [36, 38, 41, 42, 43].

TEM-Aufnahmen von a 4,7 nm acylierte Chitosan-AuNPs, b 3.5 nm Chitosan-AuNPs (0,1 M NaBH₄ ), c 7,4 nm Oligosaccharid-Chitosan-AuNPs (COS@1), d 15,6 nm Oligosaccharid-Chitosan-AuNPs (COS@2), e 10 nm Oligosaccharid-Chitosan-AuNPs (COS@3) und f 14 nm Oligosaccharid-Chitosan-AuNPs (COS@4)

Komplexbildung und Adhäsionsgrad:Nanokomposit-pDNA

Elektropherogramme aller pDNA-Komplexe und reiner DNA wurden mit verschiedenen Konzentrationen des Plasmids durchgeführt; die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. 7a zeigt die entsprechenden Elektropherogramme für das reine Plasmid und alle Komplexe, die mit 200 und 300  ng des Plasmids getragen werden. Die Verteilung der Nanokomposit-Proben für diese Elektropherogramme sieht wie folgt aus:Acyl-CO-AuNPs (300 und 200 ng) in Bahnen 1 und 2, CO-AuNPs (300 ng) in Bahnen 3, COS@1-AuNPs (300 und 200 ng) bei 4 und 5, COS@2-AuNPs (300 und 200 ng) bei 6 und 7, COS@3-AuNPs (300 und 200 ng) bei 8 und 9, COS@4-AuNPs (300 und 200 ng) bei 10 und 11 und 300 ng reine pDNA in Spur 12. Für alle Tests wurden 10 ul Komplexlösung verwendet. Diese Abbildung zeigt, dass nur die pDNA im Gel wandert (wie in Spur 12 ersichtlich) und die anderen pDNA-Komplexe in ihren entsprechenden Vertiefungen verbleiben, wodurch die pDNA-Adhäsion an allen Komplexen bestätigt wird. Dies liegt an der Wechselwirkung der positiven Ladungen der Aminogruppen des Chitosan, das auf der Goldnanopartikeloberfläche verbleibt, und der negativen Ladungen der Phosphatgruppen der DNA-Helix.

a Elektropherogramme für Nanokomplexe mit 200 und 300  ng pDNA-Konzentrationen. Spur 12 entspricht reiner pDNA. b CO-AuNPs und Acyl-CO-AuNPs mit 300 ng pDNA, reine pDNA in Spur 3. c COS@2-AuNPs-Nanokomplex mit 300 und 350 ng DNA, 400 ng reiner pDNA in Spur 3. d same CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs at 1:10 dilution, with respectively pure DNA control at lane 3

To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.

Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection into HEK-293 Cells

As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE ^TM 2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et. al. [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells

Dye Exclusion Test

Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE ^TM 2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.

Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells

Conclusions

Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.

Abkürzungen

Acyl-CO:

Acylated chitosan

AuNPs:

Goldnanopartikel

CO:

Chitosan

COS:

Chitosan oligosaccharide

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarot

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

pDNA:

Plasmid Deoxyribonucleic acid

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie