Formabhängige Zytotoxizität & zelluläre Aufnahme von Grüntee-reduzierten Goldnanopartikeln in Krebszellen

Zusammenfassung

In diesem Bericht wurden drei verschiedene Formen von Chitosan-kappten Goldnanopartikeln (Nanosphären, Nanosterne und Nanostäbe) synthetisiert, um die Auswirkungen der Form auf Zytotoxizität und zelluläre Aufnahme in Krebszellen zu untersuchen. Grüntreextrakt wurde als Reduktionsmittel verwendet, um Goldsalze zu Goldnanosphären zu reduzieren. Goldnanosterne wurden mittels einer als Saatlösung dienenden Nanosphärenlösung hergestellt. Goldnanostäbe wurden mit einer konventionellen Methode synthetisiert. Alle drei Arten von Goldnanopartikeln zeigten ihre charakteristischen Oberflächenplasmonenresonanzbänder in der UV-Vis-Spektrophotometrie. In hochauflösenden Transmissionelektronenmikroskopie-Bildern waren Gitterstrukturen in allen drei Formen klar beobachtbar, was die kristalline Natur der Nanopartikel bestätigt. Alle drei kolloidalen Lösungen der Goldnanopartikel behielten kolloidale Stabilität in verschiedenen Lösungen. Zur Bewertung der Zytotoxizität wurde der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Test an vier Krebszelllinien durchgeführt. Die Zytotoxizität war bei Nanostäben am höchsten, gefolgt von Nanosternen und schließlich Nanosphären. Die zelluläre Aufnahme von Goldnanopartikeln in menschlichen Hepatozellenkarzinomzellen (HepG2) wurde gemessen, und die Ergebnisse folgten der Reihenfolge Nanosphären > Nanostäbe > Nanosterne. Die Ergebnisse der aktuellen Studie können bei der Formgestaltung von Goldnanopartikeln für therapeutische Anwendungen als Drug-Delivery-Vehikel im Bereich der Nanomedizin helfen.

Einleitung

Pflanzen enthalten natürliche primäre und sekundäre Metaboliten, einschließlich Flavonoide, Saponine, Alkaloide, Steroide, Cumarine, Tannine, Phenole, Terpenoide, Kohlenhydrate, Proteine und Aminosäuren. In jüngster Zeit wurden Pflanzenextrakte für die Synthese von Nanomaterialien, speziell metallischen Nanopartikeln wie Gold, Silber, Titandioxid, Kupfer, Palladium, Zinkoxid und Platin-Nanopartikeln [1], genutzt. Diversifizierte Phytochemikalien nehmen aktiv an der Umwandlung von Metallsalzen in metallische Nanopartikel als Reduktionsmittel teil. Zudem spielen Pflanzenextrakte eine Rolle als Stabilisierungsmittel zur Erhaltung der kolloidalen Stabilität metallischer Nanopartikel in Lösung. Chemische Reduktionsmittel sind generell schädlich und toxisch für lebende Organismen. Im Gegensatz dazu ist die Verwendung von Pflanzenextrakten in der Synthese metallischer Nanopartikel grün, umweltfreundlich und nachhaltig. Verschiedene Pflanzenteile wie Stängel, Früchte, Samen, Blätter und Blüten werden zur Synthese metallischer Nanopartikel genutzt [1, 2]. Umfassende Reviews haben die grüne Synthese von Goldnanopartikeln (AuNPs) mittels Pflanzenextrakten als Reduktionsmittel untersucht [2,3,4]. Mit dieser grünen Strategie wird der Syntheseschritt in einem Schritt und in einem Topf durchgeführt. Darüber hinaus ist der Prozess einfach, unkompliziert, kosteneffizient und umweltfreundlich. Die Größe, Form und Topographie der AuNPs hängen von den Konzentrationen der Goldsalze und Extrakte, Reaktionszeit, Reaktionstemperatur und Lösungs-pH ab. Spektroskopische und mikroskopische Techniken werden zur Charakterisierung von AuNPs eingesetzt, einschließlich UV-Vis-Spektrophotometrie, Röntgenbeugung, Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR), Transmissionelektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM), Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und hydrodynamische Größen- und Zeta-Potenzial-Messungen. Diese grünen AuNPs werden als Katalysatoren, Antioxidantien, antimikrobielle und antikarzinogene Wirkstoffe angewendet [5,6,7,8].

Im Labor der Autoren wurden Pflanzenextrakte (Artemisia capillaris, Leonurus japonicus, Polygala tenuifolia, Caesalpinia sappan, Bupleurum falcatum und Garcinia mangostana) als Reduktionsmittel zur grünen Synthese sowohl von AuNPs als auch Silbernanopartikeln (AgNPs) verwendet [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. Der aeriale Teil von A. capillaris wurde extrahiert und für die Synthese von AgNPs und AuNPs verwendet [9, 15, 16]. Die hergestellten AgNPs zeigten hervorragende antibakterielle Aktivität gegen Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes und Klebsiella oxytoca im Vergleich zum Extrakt allein [15]. Dieses Ergebnis zeigte, dass der synergistische Effekt der Kombination von AgNPs und Extrakt zu verbesserter antibakterieller Aktivität beitrug. Interessanterweise zeigten AgNPs, synthetisiert mit A. capillaris in Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid, antibakterielle Aktivität gegen methicillin-resistente Staphylococcus aureus [16]. Zudem zeigten AuNPs, synthetisiert mit A. capillaris, katalytische Aktivität zur 4-Nitrophenol-Reduktionsreaktion [9]. L. japonicus Extrakt wurde für die Synthese von AgNPs mit bemerkenswerten Verbesserungen der antibakteriellen Aktivität genutzt [10]. Wir beobachteten, dass antibakterielle Aktivität gegen Gram-negative Bakterien größer war als gegen Gram-positive Bakterien. Der Wurzelextrakt von P. tenuifolia wurde ebenfalls für die Synthese von AuNPs und AgNPs genutzt [11, 17]. Verbesserte antikoagulante Aktivität und antibakterielle Aktivität wurden in AuNPs bzw. AgNPs beobachtet, synthetisiert mit P. tenuifolia Extrakt. Am interessantesten zeigten AgNPs, synthetisiert mit C. sappan Extrakt, effektive antibakterielle Aktivität gegen methicillin-resistente S. aureus [18]. Der Extrakt von G. mangostana produzierte asymmetrische Hantel-förmige AgNPs mit apoptotischen Effekten [14].

Frühere Berichte untersuchten die grüne Synthese von AuNPs und AgNPs mittels Teeblattextrakt [19,20,21,22,23]. Kamal und Mitarbeiter berichteten die erfolgreiche Synthese von 25 nm AgNPs [19]. In einem anderen Bericht wurden kugelförmige AgNPs von 20 bis 90 nm mittels Teeblattextrakt synthetisiert [20]. Die synthetisierten AgNPs zeigten leichte antibakterielle Aktivität gegen E. coli. Kugelförmige AgNPs von 3,42–4,06 nm wurden auch von Loo und Mitarbeitern mittels Teeblattextrakt hergestellt [21]. Vaseeharan und Mitarbeiter synthetisierten antibakterielle AgNPs mittels Teeblattextrakt [22]. Die synthetisierten AgNPs waren effektiv gegen pathogene Vibrio harveyi Infektion. Begum und Mitarbeiter verwendeten Schwarztee-Blattextrakt zur Synthese sowohl von AuNPs als auch AgNPs [23]. Bislang wurden mostly kugelförmige AgNPs mittels Teeblattextrakt synthetisiert.

In diesem Bericht wurde Chitosan als Kappmittel für AuNPs verwendet. Chitosan wurde als Drug/Gene-Delivery-Vehikel aufgrund seiner hohen Biokompatibilität, niedrigen Allergenität, Biologischer Abbaubarkeit und niedriger Toxizität erforscht [24,25,26]. Chitosan stammt aus Chitin, das reichlich in den Exoskeletten von Insekten und Krustentieren wie Krabben, Hummern und Garnelen vorkommt. Chitin ist ein Polysaccharid, zusammengesetzt aus N-Acetyl-D-Glucosamin, verknüpft durch β(1-4)-glykosidische Bindungen. Chitosan kann durch einen heterogenen N-Deacetylierungsprozess aus Chitin gewonnen werden. Chitosan selbst besitzt antibakterielle, antifungale, antitumorale und antioxidative Aktivität [25]. Als Kappmittel kontaktiert Chitosan AuNPs direkt über einen elektrosterischen Mechanismus [26]. Chitosan-Nanopartikel beeinflussen den Mechanismus der zellulären Aufnahme durch A549-Zellen ohne Modifikation der Zytotoxizität [24]. Darüber hinaus ist der Deacetylierungsgrad von Chitosan einflussreicher als das Molekulargewicht auf zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität [24].

Die meisten Studien konzentrierten sich auf die Synthese kugelförmiger AgNPs mittels Teeblattextrakt. Hier wurde Grüntreextrakt zur Synthese von Goldnanosphären und Nanosternen genutzt. Die Nanosphären dienten als Seeds für die seed-vermittelte Synthese von Nanosternen. Zum Vergleich wurden Nanostäbe mit einer gängigen konventionellen Methode [27] synthetisiert. Drei verschiedene Formen von AuNPs (Nanosphären, Nanosterne und Nanostäbe) wurden mit Chitosan gekappt, um ihre Biokompatibilität und kolloidale Stabilität zu erhöhen. Diese AuNPs wurden durch UV-Vis-Spektrophotometrie, hochauflösende Transmissionelektronenmikroskopie (HR-TEM) und FT-IR charakterisiert. Hydrodynamische Größenmessungen mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Zeta-Potenzial-Messungen wurden vor und nach Chitosan-Kappung durchgeführt. Kolloidale Stabilität wurde in Salzwasserlösungen, Puffer und Zellkulturmedium bewertet. Zur Messung der Zytotoxizität wurde der MTT-Test an vier Krebszellen angewendet: AGS (humane Magenadenokarzinomzellen), HeLa (humane Zervixepitheladenokarzinomzellen), HepG2 (humane Hepatozellenkarzinomzellen) und HT29 (humane kolorektale Adenokarzinomzellen). Zelluläre Aufnahme von AuNPs in HepG2-Zellen wurde quantitativ mittels induktiv gekoppelter Plasma-Optischer Emissionsspektroskopie (ICP-OES) und Laserablation-induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) gemessen.

Materialien und Methoden

Materialien und Instrumentierung

Chlorgoldsauretrihydrat (HAuCl₄·3H₂O), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), Chitosan (aus Garnelenschalen, ≥ 75 % deacetyliert) und 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Alle anderen Reagenzien waren analytischer Grad. Ein Shimadzu UV-1800 oder UV-2600 Spektrophotometer wurde zur Aufnahme von UV-Vis-Spektren in einer Quarzküvette (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) genutzt. Hydrodynamische Größenmessungen mittels DLS und Zeta-Potenzial-Messungen wurden mit einem NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA) durchgeführt. Ein Varian 640 IR wurde für FT-IR-Spektren verwendet (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); das Probenmaterial wurde nach der KBr-Pressling-Methode vorbereitet. HR-TEM-Bilder wurden mit einem JEM-3010 bei 300 kV aufgenommen (JEOL, Tokyo, Japan); das Probenmaterial wurde auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter (Kohlenstoff Typ-B, 300 Mesh, Ted Pella, Redding, CA, USA) aufgebracht und 24 h bei 37 °C im Ofen getrocknet. Für Sonikation wurde ein Modell WUC-A22H verwendet (Daihan Scientific Co. LTD., Seoul, Republik Korea). Eine Zentrifuge 5424R (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) und ein FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, Republik Korea) wurden für Zentrifugation und Gefriertrocknung genutzt. Für die zelluläre Aufnahme von AuNPs wurden ein Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) und ein J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, USA) verwendet.

Herstellung des Grüntreextrakts

Das Hadong Green Tea Institute (Hadong, Gyeongnam, Republik Korea) stellte getrocknete Grüntreblätter als Geschenk zur Verfügung. Ein Mixer wurde verwendet, um Pulver der getrockneten Blätter herzustellen. Extraktion erfolgte durch Mischen von deionisiertem Wasser (2 L) und pulverisierten Blättern (200 g). Die Extraktion lief 1 h bei Umgebungstemperatur mit drei Wiederholungen unter Sonikation ab. Whatman-Filterpapiere wurden verwendet, um Wasserfraktionen zu filtern und unlösliche Materialien zu entfernen. Dann wurde der Filtrat zentrifugiert (3.000g, 18 °C, 25 min), und der Überstand wurde gesammelt. Der gesammelte Überstand wurde spritzenfiltrations, und der Filtrat wurde gefriertrocknet. Das gefriertrocknete Material wurde in deionisiertem Wasser gelöst, um eine Stammlösung mit einer Endkonzentration von 2 % (w/v) für die grüne Synthese im folgenden Abschnitt zu erstellen.

Synthese von Goldnanosphären mittels Extrakt

Der Nanosphärensyntheseprozess ist in Abb. 1a illustriert. Die im vorherigen Abschnitt beschriebene Stammlösung wurde für die Synthese verwendet. In einem Glasfläschchen wurden der Extrakt (Endkonzentration 0,03 %) und Chlorgoldsauretrihydrat (Endkonzentration 0,5 mM) gemischt, und Natriumhydroxid (Endkonzentration 1 mM) wurde hinzugefügt. Deionisiertes Wasser wurde zu einem Endvolumen von 2 ml hinzugefügt. Ofeninkubation wurde in einem Trockenschrank bei 80 °C für 2 h durchgeführt. Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) der Nanosphären wurde durch Aufnahme von UV-Vis-Spektren im Bereich 300–800 nm überwacht. Die Nanosphären wurden auch als Seeds für die Synthese von Nanosternen im folgenden Abschnitt verwendet.

Synthese von Goldnanosphären. a Schematisches Diagramm des Syntheseprozesses und b UV-Vis-Spektren der Nanosphären vor und nach Chitosan-Kappung. Ein Digitalfoto zeigt Nanosphären unmittelbar nach Synthese

Synthese von Goldnanosternen

Der Nanosternsyntheseprozess ist in Abb. 2a illustriert. Die Nanosphären (50 µl), wie im vorherigen Abschnitt synthetisiert, wurden mit einem Magnetrührer (750 rpm) auf einer Heizplatte bei Umgebungstemperatur gerührt. Chlorgoldsauretrihydrat (0,25 mM, 5 ml) wurde zu dieser Lösung hinzugefügt. Nach 15 s wurden zwei Lösungen gleichzeitig hinzugefügt: Silbernitrat (1 mM, 50 µl) und Ascorbinsäure (frisch hergestellt, 100 mM, 25 µl). Dann wurde die Mischung 5 min bei 750 rpm gerührt. UV-Vis-Spektren wurden im Bereich 300–1100 nm aufgenommen.

Synthese von Goldnanosternen. a Schematisches Diagramm des Syntheseprozesses und b UV-Vis-Spektren der Nanosterne vor und nach Chitosan-Kappung. Ein Digitalfoto zeigt Nanosterne unmittelbar nach Synthese

Synthese von Goldnanostäben

Der Nanostabsyntheseprozess ist in Abb. 3a illustriert. Für die Synthese von Goldnanostäben wurde seed-vermittelte Synthese gemäß einem früheren Bericht mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt [27]. Die Wachstumslösung wurde wie folgt hergestellt. In einem 20 ml Glasfläschchen wurden Chlorgoldsauretrihydrat (10 mM, 500 µl) und Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB, 100 mM, 9,5 ml) gemischt. Die Lösung war gelblich-braun. Als Nächstes wurde Ascorbinsäure (frisch hergestellt, 100 mM, 55 µl) hinzugefügt, und diese Lösung wurde gerührt, bis sie sich von gelblich-braun zu farblos verfärbte. Silbernitrat (10 mM, 100 µl) wurde hinzugefügt und 10 s geschüttelt. Diese finale Lösung wurde als Wachstumslösung bezeichnet. Die Saatlösung wurde wie folgt synthetisiert. In einem 20 ml Glasfläschchen wurden Chlorgoldsauretrihydrat (10 mM, 250 µl) und CTAB (100 mM, 9,75 ml) gemischt. Dann wurde eiskaltes, frisch hergestelltes Natriumborhydrid (10 mM, 600 µl) hinzugefügt und 2 min vortexiert. Die Lösung wurde als Saatlösung bezeichnet. Die Saatlösung (12 µl) wurde mit einer zuvor synthetisierten Wachstumslösung gemischt. UV-Vis-Spektren wurden im Bereich 400–900 nm aufgenommen.

Synthese von Goldnanostäben. a Schematisches Diagramm des Syntheseprozesses und b UV-Vis-Spektren der Nanostäbe vor und nach Chitosan-Kappung. Ein Digitalfoto zeigt Nanostäbe unmittelbar nach Synthese

Chitosan-Kappung von Nanosphären, Nanosternen und Nanostäben

Chitosan-Kappung wurde eingesetzt, um die kolloidale Stabilität und Biokompatibilität der AuNPs zu erhöhen. Chitosan wurde in 1 % Essigsäure gelöst, und die Endkonzentration wurde auf 0,01 % eingestellt. Dann wurde Sonikation durchgeführt, um Chitosan vollständig aufzulösen; diese Lösung wurde als Stammlösung für Chitosan-Kappung im folgenden Verfahren verwendet. Sowohl die zuvor synthetisierten Nanosphären als auch Nanosterne wurden mit der Chitosan-Stammlösung (0,01 %) gekappt. Die Chitosan-Stammlösung (30 %, v/v) wurde mit der AuNP-Lösung (70 %, v/v) gemischt. Die Mischung wurde 2 h bei 900 rpm gerührt, um die Chitosan-Kappung abzuschließen. Für Nanostäbe wurde überschüssiges CTAB verwendet, weshalb Zentrifugation (14.000 rpm, 15 min, 25 °C) durchgeführt wurde, um CTAB zu entfernen. Die Nanostäbe wurden aus dem Pellet gewonnen, und die Chitosan-Kappung wurde wie oben erwähnt durchgeführt. Dann wurden UV-Vis-Spektren aufgenommen.

Bewertung der kolloidalen Stabilität

Die kolloidale Stabilität von Nanopartikeln ist ein wichtiges Anliegen für diagnostische und therapeutische Anwendungen. Drei Arten von AuNPs mit Chitosan-Kappung und Nanosphären ohne Chitosan-Kappung wurden auf kolloidale Stabilität in folgenden Lösungen geprüft: deionisiertes Wasser, 5 % bovines Serumalbumin (BSA), 5 % NaCl, PBS (pH 7,4), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) und Vollmedium. Das Vollmedium war DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS). Ein Milliliter jeder AuNP-Lösung wurde mit der Testlösung (0,5 ml) wie oben gemischt. Die Mischung wurde 30 min bei 25 °C inkubiert, und UV-Vis-Spektren wurden aufgenommen.

Zellkultur und Zytotoxizität

Die folgenden Krebszelllinien wurden von der Korean Cell Line Bank (Seoul, Republik Korea) bezogen: AGS, HeLa, HepG2 und HT29. Der MTT-Test wurde durchgeführt, um die in vitro Zytotoxizität der AuNPs zu bewerten. DMEM mit Natriumpyruvat wurde verwendet. Zellkulturmedium enthielt 10 % fötales Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 Einheiten/ml). Zellen wurden in 100 mm Kulturschalen kultiviert und bei ca. 70 % Konfluenz gehalten. Vor der Zellkultur wurden die AuNPs der drei verschiedenen Formen Vakuumverdampfung unterzogen, um eine finale Au-Konzentration von 5 mM zu erhalten. In 96-Well-Platten wurden Zellen mit einer Dichte von 5,0 × 10³ Zellen/Well gesät und 24 h in einem Ofen bei 37 °C unter CO₂ (5 %) Atmosphäre inkubiert. Anschließend wurden fünf verschiedene AuNP-Konzentrationen (500 µM, 250 µM, 125 µM, 62,5 µM und 31,25 µM) behandelt und weitere 24 h bei 37 °C unter CO₂ (5 %) Atmosphäre inkubiert. Dann wurde MTT-Reagenz (5 µl, 5 % in deionisiertem Wasser) hinzugefügt und weitere 3 h in einem 37 °C Ofen unter CO₂ (5 %) Atmosphäre inkubiert. Die Absorption wurde bei 570 nm mit einem Fluoreszenz-Multidetektionsleser (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, USA) gemessen. Unbehandelte Zellen dienten als Kontrolle.

Zelluläre Aufnahme

Die zelluläre Aufnahme jedes AuNP-Typs wurde quantitativ mit HepG2-Zellen gemessen. In 24-Well-Platten wurden Zellen mit einer Dichte von 5,0 × 10⁴ Zellen/Well gesät und 24 h in einem Ofen bei 37 °C unter CO₂ (5 %) Atmosphäre inkubiert. Dann wurde 5 µM (Endkonzentration) jedes AuNP-Typs behandelt und weitere 24 h bei 37 °C unter CO₂ (5 %) Atmosphäre inkubiert. Nach Inkubation wurde die Lösung mit überschüssigen AuNPs entfernt, und die Zellen wurden mit Trypsin behandelt. Die Au-Konzentration in den trypsinisierten Zellen wurde quantitativ mittels ICP-OES und LA-ICP-MS gemessen, was die Konzentration der Au-Aufnahme in den Zellen lieferte. Die Kontrolle war 5 µM der ursprünglichen kolloidalen Lösung jedes AuNP-Typs, die ebenfalls mit ICP-OES und LA-ICP-MS analysiert wurde, um die Au-Konzentration zu erhalten.

Ergebnisse und Diskussion

UV-Vis-Spektren

UV-Vis-Spektren werden häufig aufgenommen, um die Synthese von AuNPs zu bestätigen. Die charakteristische SPR der AuNPs kann im sichtbaren-nahinfraroten Wellenlängenbereich beobachtet werden. Zudem induziert die Kappung von AuNPs generell entweder eine bathochrome (oder rote) oder hypsomchrome (oder blaue) Verschiebung. Darüber hinaus wird generell eine hypochrome Verschiebung zusammen mit roten und blauen Verschiebungen induziert. Wie in Abb. 1b gezeigt, wurden UV-Vis-Spektren im Bereich 300–800 nm überwacht. Nanosphären zeigten eine charakteristische SPR von 532 nm mit einer tief burgunderroten Farbe. Nach Chitosan-Kappung der Nanosphären wurde der maximale SPR auf 537 nm rotverschoben zusammen mit einer hypochromen Verschiebung (Abb. 1b). Ein breiter Bereich von SPR-Wellenlängen (600–800 nm) mit einer dunkelblauen Lösung wurde für die Nanosterne beobachtet (Abb. 2b). Die Chitosan-Kappung der Nanosterne zeigte eine hypochrome Verschiebung, bei der die Absorption niedriger war als bei AuNPs ohne Chitosan-Kappung (Abb. 2b). Nanostäbe zeigten zwei distinkte SPR-Wellenlängen von 514 nm und 815 nm mit der Bildung einer hellrosa Lösung (Abb. 3b). Die Chitosan-Kappung der Nanostäbe induzierte eine Blauverschiebung auf 797 nm zusammen mit einer hypochromen Verschiebung (Abb. 3b). Betrachtet man all diese Ergebnisse, so veränderte die Kappung der AuNPs mit Chitosan die SPR-Wellenlänge und induzierte Verschiebungen. Sorgfältige Untersuchung der UV-Vis-Spektren demonstrierte, dass die drei Arten von AuNPs erfolgreich mit Chitosan gekappt wurden.

Hydrodynamische Größe und Zeta-Potenziale

Als Nächstes wurden hydrodynamische Größe und Zeta-Potenziale gemessen; die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Ohne Chitosan-Kappung betrugen die hydrodynamischen Größen der Nanosphären und Nanosterne 28,4 und 97,8 nm. Die hydrodynamische Größe der Nanostäbe wurde nicht gemessen, da die hydrodynamische Größe gut an die kugelförmigen Formen der Nanopartikel angepasst war. Mit Chitosan-Kappung stieg die hydrodynamische Größe auf 190,7 nm für Nanosphären und auf 123,9 nm für Nanosterne. Chitosan-Kappung wurde durch einen Anstieg der hydrodynamischen Größe bestätigt. Die Änderung der Zeta-Potenziale spiegelte ebenfalls Chitosan-Kappung auf der AuNP-Oberfläche wider. Chitosan ist ein positiv geladenes Polysaccharid; daher führte Chitosan-Kappung zu positiven Zeta-Potenzialen für alle drei AuNP-Arten. Für die Nanosphären änderte sich das Zeta-Potenzial von −12,73 auf 42,28 mV. Das Zeta-Potenzial der Nanosterne änderte sich von −42,46 auf 47,44 mV. Im Fall der Nanostäbe wurde CTAB (ein kationisches Tensid) für die Synthese genutzt. Daher betrug das ursprüngliche Zeta-Potenzial ohne Kappung 27,96 mV. Die Chitosan-Kappung der Nanostäbe erhöhte das Zeta-Potenzial auf 33,23 mV. Daher deutete die Änderung der Zeta-Potenziale von negativ zu positiv für Nanosphären und Nanosterne klar auf erfolgreiche Kappung mit Chitosan hin. Darüber hinaus stieg das Zeta-Potenzial der Nanostäbe an, was suggeriert, dass die Oberfläche mit Chitosan gekappt wurde.

HR-TEM-Bilder

Mikroskopie ist entscheidend für Nanopartikel-Forschung und liefert essenzielle Informationen über Größe und Form von Nanopartikeln. Mikroskopie-Tools liefern eine Reihe detaillierter Informationen, wie Dispersionszustand, zwei- und dreidimensionale Morphologie und Topographie sowie relative Weichheit/Härte von Materialien. Die Nanosphären maßen 8,7 ± 1,7 nm, basierend auf dem Durchschnitt von 75 zufällig ausgewählten diskreten Nanopartikeln in HR-TEM-Bildern (Abb. 4). Die häufigste Größe war 8–9 nm (29,3 %), gefolgt von 9–10 nm (12,0 %). Mit Chitosan-Kappung blieb die Form der Nanosphären ohne Formänderung erhalten (Abb. 4c, d). Die kristalline Natur der Partikel wurde durch die in Abb. 4d gezeigten Gitterstrukturen klar angezeigt. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde auf 0,24 nm gemessen (Abb. 4d). Darüber hinaus wurde die Chitosan-Schicht auch visualisiert, wie durch die roten Pfeile in Abb. 4d angezeigt. Nanosterne wurden mittels HR-TEM visualisiert, wie in Abb. 5 gezeigt. Die Nanosterne maßen 99,0 ± 47,0 nm, repräsentierend den Durchschnitt von 19 diskreten Nanopartikeln. Die Gitterstruktur ist in einem vergrößerten Bild (Abb. 5c) angezeigt. Wie gezeigt, wurde der Abstand zwischen benachbarten Gittern auf 0,24 nm gemessen (Abb. 5c). Die roten Pfeile in Abb. 5c zeigen die Chitosan-Schicht. Nanostäbe wurden wie in Abb. 6 visualisiert. Die durchschnittliche Partikellänge und -breite betrugen 60,4 nm und 16,4 nm, basierend auf Messungen an 28 Partikeln. Das Aspektverhältnis, definiert als Partikellänge geteilt durch Partikelbreite, betrug 3,7. Die Gitterstruktur ist in Abb. 6c gezeigt, was die kristalline Struktur der Nanostäbe bestätigt. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde auf 0,23 nm gemessen (Abb. 6c). Die roten Pfeile zeigen die Chitosan-Schicht (Abb. 6c).

HR-TEM-Bilder von Goldnanosphären. Die Skalenbalken repräsentieren a 5 nm, b 20 nm, c 20 nm und d 5 nm. Bilder a und b wurden ohne Chitosan-Kappung aufgenommen, und c und d mit Chitosan-Kappung. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde auf 0,24 nm gemessen. Rote Pfeile zeigen die Chitosan-Schicht nach Kappung

HR-TEM-Bilder von Goldnanosternen. Die Skalenbalken repräsentieren a 200 nm, b 50 nm und c 5 nm. d Eine schematische Darstellung von Nanosternen mit einer durchschnittlichen Größe von 99,0 ± 47,0 nm. Bild a wurde ohne Chitosan-Kappung aufgenommen, und b und c mit Chitosan-Kappung. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde auf 0,24 nm gemessen. Rote Pfeile zeigen die Chitosan-Schicht nach Kappung

HR-TEM-Bilder von Goldnanostäben. Die Skalenbalken repräsentieren a 100 nm, b 200 nm und c 5 nm. d Eine schematische Darstellung von Nanostäben mit einer durchschnittlichen Länge und Breite von 60,4 nm und 16,4 nm. Bild a wurde ohne Chitosan-Kappung aufgenommen, und b und c mit Chitosan-Kappung. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde auf 0,23 nm gemessen. Rote Pfeile zeigen die Chitosan-Schicht nach Kappung

FT-IR-Spektren

Grüntee enthält diverse primäre und sekundäre Metaboliten. Speziell sind die Hauptbestandteile von Grüntee Polyphenole, einschließlich Epigallocatechin-3-gallat, (-)-Epicatechin-3-gallat, (-)-Epigallocatechin und (-)-Epicatechin [28]. FT-IR-Spektren wurden aufgenommen, um Informationen über funktionelle Gruppen zu erhalten, die zur Synthese von AuNPs beigetragen haben. Wir verglichen das FT-IR-Spektrum der Nanosphären mit dem Spektrum des Extrakts (Abb. 7). Die Hauptfunktionsgruppe, die höchstwahrscheinlich an der Reduktionsreaktion der Goldsalze beteiligt war, war –OH. Im Extrakt erschienen –OH-Funktionsgruppen bei 3255 cm⁻¹ (Abb. 7a). Nach Synthese verschob sich dieser Peak zu einer höheren Wellenzahl bei 3300–3341 cm⁻¹. Dieses Ergebnis demonstrierte, dass –OH-Funktionsgruppen aus Polyphenolen zu C=O oxidiert wurden, während Goldsalze zu AuNPs reduziert wurden. Bemerkenswert unterstützt das Auftreten von C=O-Funktionsgruppen bei 1716 cm⁻¹ in den Nanosphären klar die Oxidation von –OH-Funktionsgruppen während der Synthese (Abb. 7b).

FT-IR-Spektren von a Grüntee-Extrakt für Synthese und b Goldnanosphären

Bewertung der kolloidalen Stabilität unter verschiedenen Lösungen

Die kolloidale Stabilität von Nanopartikeln ist ein wichtiges Anliegen für diagnostische und therapeutische Anwendungen. Sechs verschiedene Lösungen wurden auf kolloidale Stabilität getestet: (i) deionisiertes Wasser, (ii) NaCl (5 %), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5 %), (v) DMEM und (vi) Vollmedium (DMEM mit 10 % FBS). Nach Mischen jedes AuNP-Typs mit der Testlösung wurden UV-Vis-Spektren aufgenommen; die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und Abb. 8 dargestellt. Eine hypochrome Verschiebung zusammen mit einer leichten roten oder blauen Verschiebung wurde für alle drei AuNP-Arten in den UV-Vis-Spektren beobachtet (Abb. 8a, c und e). Die Form der Spektren blieb erhalten, und keine Aggregation der kolloidalen Lösung wurde beobachtet (Abb. 8b, d und f). Dieses Ergebnis demonstrierte, dass die kolloidale Stabilität in den oben genannten Testlösungen recht gut beibehalten wurde.

Bewertung der kolloidalen Stabilität. a und b Nanosphären mit Chitosan-Kappung, c und d Nanosterne mit Chitosan-Kappung, e und f Nanostäbe mit Chitosan-Kappung, g und h Nanosphären ohne Chitosan-Kappung. DW repräsentiert deionisiertes Wasser

In Tabelle 2 wird die hypochrome Verschiebung als Prozentsatz der beibehaltenen Absorption ausgedrückt, wobei die Absorption der ursprünglichen Lösung auf 100 % gesetzt wird. In allen drei AuNPs wurde die kolloidale Stabilität am besten im Vollmedium beibehalten, das für die nachfolgenden Zytotoxizitätsexperimente verwendet wurde: Nanosphären (65,3 %), Nanosterne (93,4 %) und Nanostäbe (80,2 %). Die Proteinlösung, BSA (5 %), bot ebenfalls angemessene kolloidale Stabilität: Nanosphären (61,8 %), Nanosterne (70,2 %) und Nanostäbe (72,0 %). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Proteine, die die Nanopartikel bedecken, zusätzliche vorteilhafte Effekte auf die kolloidale Stabilität der AuNPs zusammen mit der Chitosan-Kappung haben. Die kolloidale Stabilität der Nanosphären ohne Chitosan-Kappung wurde ebenfalls bewertet (Abb. 8g, h). Alle Lösungen induzierten eine hypochrome Verschiebung. Unter den getesteten Lösungen zeigte nur die NaCl (5 %) Lösung eine große Rotverschiebung zusammen mit einer hypochromen Verschiebung.

Zytotoxizität

Ein MTT-Test wurde durchgeführt, um Zytotoxizität gegen vier Krebszelltypen zu messen (Abb. 9): AGS, HeLa, HepG2 und HT29. Die Zytotoxizität aller drei AuNP-Arten war abhängig von der Au-Konzentration. Unter den vier Zelltypen wurde die höchste Zytotoxizität für HepG2-Zellen beobachtet. Darüber hinaus zeigten Nanostäbe die höchste Toxizität gegen die vier Zelltypen, gefolgt von Nanosternen und schließlich Nanosphären. Speziell zeigten Nanostäbe eine sehr hohe Toxizität; daher wurde die Zytotoxizität von Nanostäben mit einem niedrigen Au-Konzentrationsbereich ebenfalls evaluiert (Abb. 9e). Bei Konzentrationen von nur 8 µM Au zeigten Nanostäbe konzentrationsabhängige Zytotoxizität. Gegen HepG2-Zellen betrug der IC₅₀-Wert 127,1 µM Au für Nanosphären, 81,8 µM Au für Nanosterne und 22,7 µM Au für Nanostäbe. Somit waren Nanostäbe am zytotoxischsten, gefolgt von Nanosternen, und Nanosphären waren am wenigsten zytotoxisch gegen HepG2-Zellen.

Zytotoxizität bewertet durch MTT-Test (31,25–500 µM Au-Konzentration). a AGS, b HeLa, c HepG2 und d HT29. e Niedrige Au-Konzentrationen (8–125 µM) wurden an HepG2-Zellen evaluiert

Es wurde berichtet, dass die Zytotoxizität von AuNPs durch Größe, Form und Oberflächenladung beeinflusst wird [29, 30]. Favi und Mitarbeiter untersuchten die Zytotoxizität von Au-Nanosphären (61 nm) und Au-Nanosternen (34 nm) gegen zwei Zelltypen (humane Hautfibroblasten und Ratten-Fettpad-Endothelzellen) [31]. In beiden Zelltypen wurde eine letale Konzentration bei 40 µg/ml für Nanosphären und bei 400 µg/ml für Nanosterne beobachtet. Ihre Ergebnisse suggerierten, dass Nanosphären zytotoxischer waren als Nanosterne, was nahelegt, dass Größe, Form und Oberflächenchemie höchstwahrscheinlich die Zytotoxizität von AuNPs beeinflussen. Woźniak und Mitarbeiter berichteten über die Zytotoxizität von AuNPs mit diversen Formen gegen HeLa und HEK293T (humane embryonale Nierenzellen), nämlich Nanosphären (~10 nm), Nanoflowers (~370 nm), Nanostäbe (~41 nm), Nanoprismen (~160 nm) und Nanosterne (~240 nm) [30]. Interessanterweise waren Nanosphären und Nanostäbe zytotoxischer als Nanoflowers, Nanoprismen und Nanosterne. Die Autoren erklärten, dass die kleine Größe der Nanopartikel und der Aggregationsprozess die Haupttreiber für die Zytotoxizität von Nanosphären und Nanostäben in ihrer Arbeit waren. Tatsächlich haben viele Studien den Größeneffekt von AuNPs auf Zytotoxizität adressiert [32, 33]. Je kleiner AuNPs werden, desto mehr nimmt ihre Aufnahme durch Zellen zu. Diese höhere Aufnahme resultiert in einer höheren Konzentration von AuNPs in der Zelle, was zu höherer Zytotoxizität gegen Zellen führt. Allerdings zeigt auch eine niedrige Konzentration von AuNPs in der Zelle hohe Zytotoxizität [34]. Die Konzentration von AuNPs in der Zelle beeinflusst Zytotoxizität; es ist jedoch wichtig, die Charakteristika von AuNPs zu berücksichtigen und zu verstehen. Die Zytotoxizität von AuNPs zweier verschiedener Formen (Nanosphären 43 nm, Nanostäbe 38 × 17 nm) wurde in Epithelzellen von Tarantola und Mitarbeitern evaluiert [35]. Nanosphären wurden als zytotoxischer als Nanostäbe bestimmt. Darüber hinaus induzierten Nanosphären eine Dysfunktion in epithelialen Zellmembranen, gemessen durch elektrische Zell-Substrat-Impedanzmessung [35]. Wie zuvor diskutiert, untersuchen viele Studien derzeit die Zytotoxizität verschiedener Formen von AuNPs in verschiedenen Zellen. Obwohl die Formen von AuNPs gleich bleiben mögen, beeinflussen viele Faktoren noch die Zytotoxizität von AuNPs. Bei der Bewertung der Zytotoxizität sollten Faktoren einschließlich Größe, Form, physikochemischer Oberflächeneigenschaften, Konzentration, Expositionszeit und Zelltyp berücksichtigt werden [34, 36,37,38]. Zusätzlich zu den Charakteristika von AuNPs sind zytotoxische Mechanismen einschließlich Störung der Zellmembran, oxidativer Stress, Zerstörung des Zytoskeletts und Verlust der Mitochondrienfunktion wichtig [38, 39]. Derzeit entstehen Autophagie und Lysosomenfunktionsstörung als Erklärungen für die Zytotoxizität von Nanomaterialien [40]. In Lysosomen induzieren Nanomaterialien Zytotoxizität durch lysosomal-eisen-vermittelten oxidativen Stress und Freisetzung von Cathepsinen und anderen assoziierten lysosomalen Hydrolasen, was mitochondriale Dysfunktion und Zelltod verursacht. In diesem Bericht waren Nanostäbe am zytotoxischsten gegen die vier getesteten Krebszelltypen. Daher wird unsere zukünftige Arbeit die detaillierten Mechanismen der Zytotoxizität untersuchen.

Zelluläre Aufnahme an HepG2-Zellen

HepG2-Zellen zeigten die höchste Zytotoxizität unter den vier Krebszelltypen; entsprechend wählten wir diesen Zelltyp für die Bewertung der zellulären Aufnahme. Zwei Instrumente, ICP-OES und LA-ICP-MS, wurden verwendet, um die Au-Konzentration in Zellen quantitativ zu analysieren, und die Ergebnisse sind in Abb. 10 dargestellt. Eine Au-Konzentration von 5 µM wurde für die Bewertung der zellulären Aufnahme verwendet, da bei dieser Konzentration keine Toxizität unter den vier Krebszelltypen beobachtet wurde. Die Aufnahme war am höchsten für Nanosphären (58,0 %), gefolgt von Nanostäben (52,7 %) und Nanosternen (41,5 %). Wie im vorherigen Abschnitt angezeigt, war die Zytotoxizität formabhängig (Nanostäbe > Nanosterne > Nanosphären). Die Reihenfolge der zellulären Aufnahme (Nanosphären > Nanostäbe > Nanosterne) stimmte jedoch nicht mit der Reihenfolge der Zytotoxizität überein. Die zelluläre Aufnahme von Nanosphären war am höchsten; jedoch war die Zytotoxizität dieser Partikel am niedrigsten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hohe zelluläre Aufnahme nicht immer hohe Zytotoxizität induziert. Wie zuvor erwähnt, sind diverse Faktoren einschließlich Größe, Form, physikochemischer Oberflächeneigenschaften, Konzentration, Expositionszeit und Zelltyp wichtig für die Beeinflussung der Zytotoxizität.

Zelluläre Aufnahme durch HepG2-Zellen

Die unterschiedlichen Aufnahmegrade der drei AuNP-Typen (41,5–58,0 %) hängen möglicherweise vom Wettbewerb zwischen Einhüllung (d. h., wie eine Membran ein Nanopartikel umschließt) unter thermodynamischer Antriebskraft und Rezeptor-Diffusionskinetik ab [41, 42]. Chithrani und Chan verglichen die zelluläre Aufnahme von Transferrin-beschichteten Au-Nanosphären und Au-Nanostäben durch HeLa-Zellen [42]. Bei gleicher Größe (d. h., dem gleichen Wert für Nanosphärendurchmesser und Nanostabbreite) zeigten Nanosphären höhere Aufnahme als Nanostäbe. Dieses Ergebnis ist konsistent mit unseren Beobachtungen im aktuellen Bericht über höhere Aufnahme von Nanosphären im Vergleich zu Nanostäben. Für Nanostabaufnahme ist Breite wichtiger als Länge, und ein steigendes Aspektverhältnis verringert die Aufnahmerate [42]. Die Größe der Nanosterne betrug 99,0 ± 47,0 nm, was sie zu den größten Partikeln unter den drei AuNP-Typen machte. Für große Nanopartikel (> 50 nm) führen langsame Rezeptor-Diffusionskinetik zu kurzen Einhüllungszeiten [42]. Daher ist die zelluläre Aufnahme großer Nanopartikel gering, d. h. Nanosterne im aktuellen Bericht. Chitosan wurde zur Kappung der AuNPs verwendet, um ihre kolloidale Stabilität und Biokompatibilität zu erhöhen. Chitosan-Kappung kann auch eine Rolle in der zellulären Aufnahme von AuNPs spielen, indem es mit Rezeptoren auf der Zelloberfläche interagiert. Eine detaillierte mechanistische Studie ist notwendig, um diese Frage zu klären.

Fazit

Die fortgesetzte Entwicklung der Nanotechnologie erfordert elaborate Form- und Größendesigns von Nanopartikeln für erfolgreiche Anwendungen, einschließlich als Drug-Delivery-Träger oder Vehikel für biologisch aktive Verbindungen wie Antikrebsmittel. Grüntreextrakt wurde als grünes Reduktionsmittel für die Synthese von Au-Nanosphären und Nanosternen verwendet. Interessanterweise war die Zytotoxizität von Nanostäben höher als die von Nanosphären und Nanosternen, während Nanosphären die niedrigste Zytotoxizität gegen vier Krebszelltypen zeigten. Zelluläre Aufnahme durch HepG2-Zellen war höchstwahrscheinlich form- und größenabhängig; Nanosphären zeigten die höchste Aufnahme durch die Zellen, während Nanosterne die niedrigste Aufnahme zeigten. Die Optimierung von Größe und Form zusammen mit Oberflächenmodifikation und Funktionalisierung wird zur Entwicklung von Nanopartikeln für zukünftige Anwendungen in der Nanomedizin führen.

Abkürzungen

AFM:

Rasterkraftmikroskopie

AgNPs:

Silbernanopartikel

AGS:

Humane Magenadenokarzinomzellen

AuNPs:

Goldnanopartikel

CTAB:

Cetyltrimethylammoniumbromid

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco's modified Eagle's medium

FBS:

Fötales Kälberserum

FT-IR:

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

HeLa:

Humane Zervixepitheladenokarzinomzellen

HepG2:

Humane Hepatozellenkarzinomzellen

HR-TEM:

Hochauflösende Transmissionelektronenmikroskopie

HT29:

Humane kolorektale Adenokarzinomzellen

ICP-OES:

Induktiv gekoppelte Plasma-Optische Emissionsspektroskopie

LA-ICP-MS:

Laserablation-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

SPR:

Oberflächenplasmonenresonanz