Amperometrischer Biosensor der Matrix-Metalloproteinase-7, verbessert durch Pd-funktionalisierte Kohlenstoff-Nanokomposite

Hintergrund

Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), ein Enzym, das die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix abbauen kann [1], wird für seine zentrale Rolle bei der Tumorprogression und Metastasierung hervorgehoben [2, 3]. Der Gehalt an MMP-7 in Serumproben ist mit Lymphknotenmetastasen bei Patienten mit einigen Krebsarten wie Speicheldrüsenkrebs [4], Kolonadenokarzinom [5] und hochgradigem Nierenzellkarzinom [6] verbunden. Aufgrund seiner verschiedenen Rollen in physiologischen Prozessen hat der hochempfindliche und genaue Nachweis von MMP-7 intensive Forschungsinteressen auf sich gezogen [7], was zur Entwicklung verschiedener Ansätze geführt hat, darunter Kolorimetrie [8], Elektrochemilumineszenz (ECL) [9] und Fluoreszenz Resonanzenergietransfer (FRET)-Analyse [10]. Dennoch liegt die Nachweisgrenze (LOD) dieser Ansätze typischerweise im Pikogrammbereich und ist damit nicht niedrig genug. Im Vergleich zu diesen Methoden bieten elektrochemische Biosensoren viel fortschrittlichere MMP-7-Detektionskapazitäten mit niedrigerer LOD im Femtogrammbereich [11]. Darüber hinaus wurden einige analytische Methoden entwickelt, um den dringenden Bedarf an ultrasensitiven elektrochemischen Nachweisen von MMP-7 unter Verwendung elektrochemischer Assays aufgrund ihrer geringen Kosten und Miniaturisierung zu decken [12].

In vielen elektrochemischen Protokollen ist eine enzymatische biokatalytische Reaktion bei der Signalverstärkung anwendbar, um die Leistung des amperometrischen Biosensors zu fördern [13, 14]. Es war jedoch allgemein bekannt, dass Enzyme, der am häufigsten verwendete Katalysator in katalytischen Reaktionen, offensichtliche Mängel sowohl in Bezug auf die umweltempfindliche Aktivität als auch geringe Stabilität aufwiesen [15,16,17,18,19]. Daher hat die Entwicklung eines hocheffizienten und stabilen Katalysators höchste Priorität bei der Konstruktion eines ultrasensitiven elektrochemischen Assays für den MMP-7-Nachweis. Pd ist ein Edelmetallwerkstoff mit überlegenen katalytischen Eigenschaften und besitzt eine hohe chemische Stabilität bei katalytischen Reaktionen [20, 21]. Darüber hinaus kann Kohlenstoffmaterial als chemisch inerter Träger in Katalysatoren fungieren, um Edelmetallmaterialien zu adsorbieren und die katalytischen Eigenschaften beizubehalten [22, 23].

Unter Berücksichtigung der obigen Situationen haben wir ein Pd-funktionalisiertes Kohlenstoff-Nanokomposit als Impedanzverstärker entwickelt, um die Empfindlichkeit eines amperometrischen Assays von MMP-7, der die folgenden zwei Funktionen hat, dramatisch zu erhöhen. (1) Kohlenstoff-Nanokugeln sind ein schlecht leitendes Material [24]; (2) Pd-Nanopartikel können die Oxidation von 4-Chlor-1-naphthol mit H₂ . katalysieren O₂ um in situ unlösliche Niederschläge zu erzeugen, die an Elektroden hochohmige Niederschläge bilden [25]. Diese beiden Faktoren erhöhen den spezifischen Widerstand und reduzieren den Strom erheblich, was die Empfindlichkeit des Biosensors auf einen niedrigen LOD von 17,38 fg mL ⁻¹ . erheblich verbessern kann . Das konstruierte Pd-funktionalisierte Nanokomposit für die katalytische Fällungsreaktion ist in amperometrischen Assays von MMP-7 mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit praktisch.

Methoden

Material

HAuCl₄ ·3H₂ O, H₂ PtCl₄ , 4-CN, Glucose, H₂ O₂ (30%), Thrombin aus Rinderserum (TBS) wurden von Alfa Aesar (Tianjin, China) bezogen. Graphenoxid (GO) wurde von JCNANO (Nanjing, China) bezogen. Rinderserumalbumin (BSA, Standardqualität) wurde kommerziell von Beijing Xinjingke Biotechnologies Co., Ltd. (Beijing, China) bezogen. Das Peptid (NH₂ -KKKRPLALWRSCCC-SH) wurde von Science Peptide Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) erhalten. Neuronenspezifische Enolase (NSE) und Prostata-spezifisches Antigen (PSA) wurden von Shanghai Linc-Bio Science Co. Ltd. (Shanghai) bezogen. Matrix-Metalloproteinase-2 (MMP-2) wurde von Yeasen Biotechnologies Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. MMP-7 wurde von Sino Biological Inc. (Beijing, China) bereitgestellt. Klinische Humanserumproben wurden von ZhongKe ChenYu Biotech (Beijing, China) gekauft. Alle wässrigen Lösungen wurden mit Reinstwasser (Widerstand> 18 MΩ cm) hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (PBS) enthält 0,1 M KCl und 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4).

Vorrichtung

Die Mikrowellensynthese wurde durch den CEM Discover® SP Mikrowellenreaktor (CEM, USA) durchgeführt. Rasterelektronenmikroskop(SEM)-Bilder wurden unter Verwendung von HITACHI S-4800 SEM (HITACHI, Japan) erhalten. Transmissionselektronenmikroskop(TEM)-Bilder wurden mit HITACHI H7650 TEM (HITACHI, Japan) erhalten. Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS) wurde mit HITACHI SU8010 SEM (HITACHI, Japan) bestimmt. Alle elektrochemischen Messungen wurden an der elektrochemischen Workstation CHI600 (Chenhua Instruments Co., Shanghai, China) durchgeführt. Eine Glaskohlenstoffelektrode (GCE) (4 mm Durchmesser) wurde als Arbeitselektrode verwendet, ein Platindraht und eine Ag/AgCl-Elektrode dienten als Gegenelektrode und Referenzelektrode, sodass ein drei elektrochemisches System im Experiment konstruiert wurde. Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen (HR-TEM) wurden von Tecnai G ² . angefertigt F30 TEM unter 300 kV Beschleunigung.

Synthese der Pd-funktionalisierten Kohlenstoff-Nanokomposite

Pd-funktionalisierte Kohlenstoff-Nanokomposite (Pd-CNCs) wurden gemäß einer zuvor veröffentlichten Literatur synthetisiert [26]. Kurz gesagt, 4 g Glucose wurden in 40 ml hochreinem Wasser gelöst, um eine klare Lösung zu bilden. Die obige Lösung wurde dann in einen 50 ml Teflon-ausgekleideten Edelstahlautoklaven überführt und 5 h bei 170 °C gehalten. Nach der Reaktion wurde die transparente Lösung dunkelbraun. Die erhaltenen Kohlenstoff-Nanokügelchen wurden durch Zentrifugation gesammelt und mehrmals mit ultrareinem Wasser/Ethanol gewaschen. Die resultierenden Produkte wurden in 8 ml Reinstwasser wieder entsorgt.

Um Pd-Nanopartikel auf Kohlenstoff-Nanosphären zu funktionalisieren [24], wurde 1 ml Kohlenstoff-Nanosphären-Suspension mit 25 μl HPdCl₄ . gemischt Lösung. Die Mischung wurde in einem Mikrowellen-Reaktionsgerät (250 W) bei 100 °C für 15 Minuten umgesetzt und dann auf natürliche Weise auf Raumtemperatur abgekühlt. Als nächstes wurden die erhaltenen Pd-Kohlenstoff-Nanokügelchen zentrifugiert, mit Reinstwasser gewaschen und in 1 ml Reinstwasser wieder abgesetzt.

Um die unspezifische Adsorption von MMP-7 zu vermeiden, wurde BSA auf den Pd-Kohlenstoff-Nanokügelchen weiter modifiziert. Die Nanokügelchen-Suspension wurde mit 100 μl BSA-Lösung (1 Gew.-%) 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach mehreren Zentrifugations- und Waschschritten wurden die BSA-modifizierten Pd-Kohlenstoff-Nanokügelchen erneut in Reinstwasser entsorgt und bei 4 °C für weitere Experimente gelagert.

Elektrodeposition von Au-rGO auf GCE

Vor der Modifizierung wurde das GCE mit einer 0,05-μm-Aluminiumoxid-Aufschlämmung poliert und mit Ultraschall in Reinstwasser bzw. Ethanol gewaschen. Die galvanische Abscheidungslösung wurde durch die folgenden Schritte konfiguriert [27]. Zuerst wurden 8 mg GO-Pulver in 20 ml Reinstwasser unter Ultraschall für 2 h dispergiert. Dann 200 μl HAuCl₄ Lösung (4 Gew.-%) wurde in die GO-Suspension gegeben Anschließend wurde die galvanische Abscheidung von Au-rGO auf GCE durch zyklische Voltammetrie (CV)-Technik im Bereich zwischen 1,5 und - 1,5 V mit einer Abtastrate von 50 mV s ^{- 1} in der obigen Elektroabscheidungslösung. Schließlich wurde das mit Au-rGO abgeschiedene GCE (Au-rGO/GCE) mit ultrareinem Wasser gewaschen, um die restliche Elektroabscheidungslösung zu entfernen, und dann mit Stickstoff bei Raumtemperatur luftgetrocknet.

Herstellung des Biosensors

Das Au-rGO/GCE wurde mit 40 μL Peptidlösung (50 μM) für 40 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde das modifizierte Peptid auf der GCE mit 50 μL Glutaraldehydlösung (0,10 Gew.-%) für weitere 30 Minuten aktiviert (Peptide/Au-rGO/GCE). Dann wurde 1 h lang 20 μl Pd-CNCs-Suspension auf die peptidmodifizierte Elektrode getropft (Pd-CNCs/Peptide/Au-rGO/GCE). Nach jedem Modifikationsschritt wurde die modifizierte Elektrode mit Reinstwasser gewaschen.

Elektrochemische Messung

Achtzig Mikroliter MMP-7-Lösung (1 ng ml ^-1 .) ) wurde mit den Pd-CNCs/Peptiden/Au-rGO/GCE für 1 h bei 37 °C inkubiert und ausreichend mit Reinstwasser gewaschen. Dann 50 μl 1,0 mM 4-CN-Lösung mit 10 mM H₂ O₂ wurde zugetropft, um die Fällungsreaktion für 50 Minuten fortzusetzen. Schließlich wurde die Messung der Rechteckwellenvoltammetrie (SWV) von − 0,2 bis 0,6 V in 5 mM [Fe(CN)₆ ] ^3−/4− phosphatgepufferte Lösung (0,1 M, pH = 7,4) mit einer Pulsamplitude von 25 mV und einem Anstiegspotential von 4 mV s ⁻¹ .

Ergebnisse und Diskussion

Prinzip des Peptidspaltungs-Biosensors

Der Konstruktionsprozess des auf Peptidspaltung basierenden Biosensors ist in Schema 1 veranschaulicht. Zuerst wurde Au-rGO durch ein elektrochemisches Verfahren auf der Glaskohlenstoffelektrode (GCE) abgeschieden, dann wurden Peptide auf Au-rGO durch Au-S-Bindungen immobilisiert. Pd-CNCs wurden als katalytischer Verstärker aufgebaut, und Glutaraldehyd wurde als chemischer Linker zwischen dem Peptid und den Verstärkern ausgewählt. 4-CN und H₂ O₂ wurden als katalysierte Fällungssubstrate verwendet, um die Impedanz zu erhöhen. Insbesondere wurde MMP-7 als Peptidspaltungsenzym zwischen Alanin (A) und Leucin (L) in Peptiden gewählt [8], was eine undeutliche Stromsignaländerung, gemessen durch SWV, verursachte. Die galvanische Abscheidung von Au-rGO auf dem GCE hat zwei Vorteile:(1) Au-rGO kann die Leitfähigkeit der Sensorgrenzfläche effektiv verbessern; und (2) es ermöglicht den Stellen, Peptide zu immobilisieren. Unter Ausnutzung der hohen Impedanz und katalytischen Leistung der Pd-CNCs wurde ΔI dann amplifiziert, indem die Pd-CNCs durch die spezifische Peptidspaltung (NH2-KKKRPLALWRSCCC-SH) ersetzt wurden. Dieses Phänomen ist auf die schlechte elektrische Leitfähigkeit von Pd-CNCs und die hohe Niederschlagsimpedanz zurückzuführen, die durch die Oxidation von 4-CN mit H₂ . erzeugt wird O₂ katalysiert durch Pd-CNCs.

Schematische Darstellung der Pd-funktionalisierten Kohlenstoff-Nanosphäre als Impedanzverstärker für den amperometrischen Assay von MMP-7

Die katalytische Präzipitationsreaktion auf der GCE wurde weiter durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) charakterisiert, indem Pd-CNCs auf der Oberfläche der Peptide/Au-rGO/GCE inkubiert wurden (Abb. 1a). Pd-CNCs wurden nach der Fällungsreaktion mit einer unlöslichen Schicht überzogen, was darauf hinweist, dass die unlösliche Schicht mit geringer Leitfähigkeit auf der modifizierten Elektrode gebildet wurde (Abb. 1b). Daher wurde ein Biosensor für den ultrasensitiven Nachweis von MMP-7 erfolgreich aus der Sensitivitätsverstärkung etabliert, die sowohl durch die Peptidspaltung als auch durch die katalytische Präzipitation angezogen wird.

SEM-Bilder von Pd-CNCs/Peptiden/Au-rGO/GCE (a ) behandelt mit katalytischer Fällungsreaktion (b )

Charakterisierung der Pd-CNCs

Durch ein typisches hydrothermales Verfahren wurden erfolgreich homogene Pd-CNCs hergestellt. Die Morphologien von Kohlenstoff-Nanokügelchen, Pd-Kohlenstoff-Nanokügelchen und Pd-CNCs wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und energiedispersive Röntgenspektrometrie (EDS) charakterisiert. Nach der Mikrowellenreaktion wurden Pd-Nanopartikel gebildet und auf den Kohlenstoff-Nanokugeln verteilt (Abb. 2b), was die erfolgreiche Herstellung von Pd-Kohlenstoff-Nanokugeln mit Durchmessern von 150 nm demonstriert (Abb. 2a). Die Morphologien von Pd-CNCs sind in Abb. 2c dargestellt. Die EDS-Ergebnisse bestätigen die chemische Zusammensetzung von Kohlenstoff-Nanopartikeln, Pd-Kohlenstoff-Nanosphären und Pd-CNCs, was zeigt, dass die Kohlenstoff-Nanopartikel C und O enthalten (Abb. 2d). Nach der Funktionalisierung von Pd-Nanopartikeln existierte Pd auch in den Spektren von Pd-Kohlenstoff-Nanokugeln (Abb. 2e), während S und N in den Spektren von Pd-CNCs von BSA stammen, das zur Blockierung von Pd-Kohlenstoff-Nanokugeln verwendet wurde ( Abb. 2f). Diese Ergebnisse zeigen intuitiv die erfolgreiche Synthese der katalytischen Pd-CNC-Enhancer. HR-TEM-Bilder von Pd-Kohlenstoff-Nanokügelchen (Abb. 3a) veranschaulichen, dass sich die funktionalisierten Pd-Nanopartikel (Abb. 3b) in einer kubisch-flächenzentrierten (FCC) Phase mit einer beobachtbaren (1,1,1)-Gitterebene befinden (Abb. 3c). Entsprechende Bilder der schnellen Fourier-Transformation (FFT) (Abb. 3d) unterstützen auch die FCC-kristalline Natur von Pd-Nanopartikeln.

TEM-Aufnahmen von Kohlenstoff-Nanokügelchen (a ), Pd-Kohlenstoff-Nanokügelchen (b ) und Pd-CNCs (c ) EDS von Kohlenstoff-Nanosphären (d ), Pd-Kohlenstoff-Nanokügelchen (e ) und Pd-CNCs (f )

HR-TEM-Bilder von Pd-Kohlenstoff-Nanokügelchen (a ), vergrößerte Bilder von Pd-Nanopartikeln (b, c ) und FFT-Bilder von Pd-Nanopartikeln (d )

Charakterisierung der Bauverfahren des Biosensors

Die Konstruktionsverfahren des Biosensors wurden durch SWV-Messungen (Abb. 4a) und elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) (Abb. 4b) überwacht. Im Vergleich zum Stromsignal von blankem GCE (Kurve blanker GCE) stieg der Spitzenstrom im Potentialbereich nach der galvanischen Abscheidung von Au-rGO auf ca. 420 μA (Kurve Au-rGO/GCE), was auf die hervorragende Leitfähigkeit von Au-rGO. Dann nahm der Signalstrompeak nach der Immobilisierung von Peptiden auf der Elektrode (Kurvenpeptide) ab und wurde nach der Verknüpfung zwischen Peptiden und Pd-CNCs aufgrund der hohen Impedanz der Peptide und Enhancer (Kurven-Pd-CNCs) weiter reduziert. Nach der Inkubation mit MMP-7 stieg der Spitzenstrom an (Kurve MMP-7-Spaltung), was durch die spezifische Spaltung von Peptiden durch MMP-7 und die teilweise Entfernung von Enhancern von der Elektrodenoberfläche verursacht werden kann. Unter den gleichen Bedingungen ist die aktuelle Änderung (ΔI₁ ) zwischen den Kurven „Pd-CNCs“ und „MMP-7-Spaltung“ wurde mit 48,7 μA berechnet. Dann wurde der Spitzenstrom nach der katalytischen Fällungsreaktion von 4-CN mit einer Stromspitze von 136,1 μA reduziert (Kurve MMP-7-Spaltungsfällung). Im Gegensatz dazu induzierte der Biosensor ohne MMP-7 nach der katalysierten Fällungsreaktion einen niedrigeren Strompeak (54,9 μA, Kurvenfällung), der als Blindsignal angegeben wurde. Unter diesen Umständen I₂ war die aktuelle Signaldifferenz zwischen den Kurven „Präzipitation“ und Kurve „MMP-7-Spaltungspräzipitation“ von 48,7 auf 81,2 μA ansteigend. EIS wurde auch verwendet, um die Herstellung des Biosensors zu überwachen. Der Elektronenübergangswiderstand entsprach dem Halbkreisdurchmesser der Nyquist-Plots (Abb. 4b). Zum Vergleich zeigt die Auftragung der Peptide/Au-rGO/GCE (Kurve Peptide) einen größeren Halbkreis und damit einen größeren Widerstand, als die von Au-rGO/GCE (Kurve Au-rGO/GCE) und blanker GCE (Kurve blank) GC), die den kleinsten Kreis aufweist, was darauf hinweist, dass Peptide auf der GCE erfolgreich modifiziert wurden. Die Resistenz nahm zu, wenn Peptide über Glutaraldehyd mit dem Enhancer verknüpft wurden (Kurven-Pd-CNCs). Der Durchmesser des Halbkreises nahm nach der Inkubation mit MMP-7 leicht ab (Kurve MMP-7-Spaltung), was auf die spezifisch von MMP-7 gespaltenen Peptide zurückgeführt werden kann. Im Gegensatz dazu stieg der Widerstand signifikant an, wenn der Biosensor in die Lösung von 4-CN und H₂ . getaucht wurde O₂ (Kurve Niederschlag)_. Sowohl bei der Peptidspaltung als auch bei der katalytischen Fällungsreaktion nahm die Resistenz offensichtlich ab (Kurve MMP-7-Spaltungsausfällung).

SWV (a ) und EIS (b ) Reaktionen des Modifikationsprozesses der Elektrode in 5 mM [Fe(CN)₆ ] ^3−/4- phosphatgepuffert (0,1 M, pH = 7.4)

Optimierung der Erkennungsbedingungen

Die Menge und Inkubationszeit von Peptiden als wichtige Faktoren für die Detektionsleistung des Biosensors wurden weiter optimiert. Es zeigte sich, dass das Stromsignal entsprechend abnahm, wenn die Peptidkonzentration von 20 auf 40 μM anstieg und zwischen 50 und 80 μM konstant gehalten wurde (Abb. 5a). Um eine unspezifische Adsorption zu vermeiden, wählten wir 50 μM für nachfolgende Messungen und optimierten dann die Inkubationszeit des 50 μM-Peptids (Abb. 5b). Der SWV-Strom nahm allmählich von 20 auf 40 Minuten ab und blieb dann nach 40 Minuten konstant. Daher wurden 40 Minuten als Inkubationszeit für Peptide gewählt. Auch die Spaltungsreaktionszeit ist ein wesentlicher Faktor für die analytische Leistungsfähigkeit des Biosensors (Abb. 5c). Das Signal des Biosensors nahm zu, wenn die Spaltungszeit zwischen 30 und 50 min lag, und blieb dann nach 50 min konstant, was darauf hindeutet, dass das Peptid vollständig gespalten war. Somit wurden 50 Minuten als Spaltungszeit für die folgenden Experimente gewählt. Die Fällungsreaktion, die auch die Empfindlichkeit des Biosensors beeinflusst (Abb. 5d), nahm innerhalb von 50 min zu und das elektrochemische Signal nahm kontinuierlich ab. Da das Stromsignal mit einer weiteren Verlängerung der Reaktionszeit konstant blieb, wurden 50 Minuten als Fällungsreaktionszeit für den folgenden Assay ausgewählt.

Auswirkungen der Peptidkonzentration (a ), Inkubationszeit von 50 μM Peptid (b ), Peptidspaltungszeit (c ) und Fällungsreaktionszeit (d ) zu den aktuellen Antworten des Biosensors

Leistung des vorgeschlagenen Biosensors

Nach Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen von MMP-7 unter optimalen Bedingungen wurde die Leistung des vorgeschlagenen Biosensors bestimmt. Wie in Fig. 6 gezeigt, nahm das SWV-Signal mit abnehmender Konzentration von MMP-7 ab. Das Kalibrierungsdiagramm zeigt eine gute lineare Beziehung zwischen den aktuellen Peaks und dem Logarithmus der Analytkonzentrationen im Bereich von 0,1 pg mL ⁻¹ bis 100 ng ml ⁻¹ . Die lineare Gleichung wurde zu (I = − 16,53lgCMMP-7-137,26) mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,9967. Die Nachweisgrenze des Biosensors betrug 17,38 fg mL ^–1 für MMP-7 bei einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3 (S/N = 3; ist die Standardabweichung des Signals in einer Blindlösung). Im Vergleich zu jüngsten Berichten zum Nachweis von Peptidspaltungen von MMP-7 zeigte der Biosensor eine bessere analytische Leistung (Tabelle 1).

a SWV-Reaktionen der elektrochemischen Detektion für MMP-7 in 5 mM [Fe(CN)₆ ] ^3−/4− phosphatgepuffert (0,1 M, pH = 7.4) bei Konzentrationen von 100 fg mL ⁻¹ bis 100 ng ml ⁻¹ . b Lineare Kalibrierkurve des Stroms und des Logarithmus der Konzentration von MMP-7. Die Fehlerbalken sind Standardabweichungen für n = 3

Bewertung der Leistung des Immunosensors

Um die Reproduzierbarkeit des Biosensors zu beurteilen, wurden drei modifizierte Elektroden mit 0,01, 0,1, 1, 10 und 100 ng mL ⁻¹ . inkubiert MMP-7. Die entsprechenden Standardabweichungen wurden mit 1,3 %, 1,4 %, 4,0 %, 1,0 % bzw. 3,0 % berechnet, was eine gute Reproduzierbarkeit des Biosensors anzeigt. MMP-2, NSE, PSA, TBS und BSA wurden als Ablenkungen verwendet, um die Spezifität dieses Biosensors zu analysieren. Es wurden keine offensichtlichen Reaktionen beobachtet, wenn der Biosensor mit einzelnen Mischungen von 1 ng ml ^–1 . inkubiert wurde MMP-7 mit (100 ng ml ⁻¹ jeweils) MMP-2, NSE, PSA, TBS und BSA. Im Vergleich zum Biosensor, der mit nur 1 ng mL ⁻¹ . inkubiert wurde MMP-7 waren die Stromsignale jeder Mischung fast gleich (Fig. 7a), was zeigt, dass der Biosensor eine ausgezeichnete Spezifität für MMP-7 aufweist. Um die Stabilität zu untersuchen, wurde der konstruierte Biosensor 28 Tage bei 4 °C gelagert und seine Leistung für den MMP-7-Nachweis alle 7 Tage bewertet (Abb. 7b). Die relativen Standardabweichungen (RSD) zwischen parallelen Experimenten betrugen alle weniger als 10 %, was auf eine bemerkenswerte Stabilität des Biosensors schließen lässt.

Aktuelle SWV-Antworten (a ) über die Entstörungsfähigkeit des Biosensors (die Fehlerbalken sind Standardabweichungen für n = 3). Die Konzentrationen der Ablenkungen:MMP-2 (100 ng mL ⁻¹ ), NSE (100 ng ml ⁻¹ ), PSA (100 ng ml ⁻¹ ), THR (100 ng ml ⁻¹ ) und BSA (100 ng ml ⁻¹ ), bzw. Die Mischung enthält all diese Ablenkungen (100 ng ml ^-1 ) und MMP-7 (1 ng ml ⁻¹ ). SWV-Antworten (b ) der vorgeschlagenen Biosensoren, die bei 4 °C für unterschiedliche Zeiträume zum Nachweis von 1 ng mL ⁻¹ . gelagert wurden MMP-7

Um die Praktikabilität der vorgeschlagenen Methode zu untersuchen, wurden Wiederfindungsexperimente durchgeführt. Die Wiederfindungen lagen zwischen 86,3 und 117,2 % (Tabelle 2), was ein weiteres Indiz für die vielversprechende Praktikabilität des Biosensors in klinischen Analysen ist.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend wurde ein Pd-funktionalisiertes Kohlenstoff-Nanokomposit als neuartiger Impedanzverstärker hergestellt, der vielversprechendes H₂ . offenbart O₂ katalytische Leistung für die 4-CN-Oxidation. Unter Ausnutzung der hohen Impedanz der unlöslichen oxidierten 4-CN-Präzipitation auf der Elektrode wurde ein amperometrischer Biosensor zum Nachweis von MMP-7 konstruiert. Der Biosensor besitzt eine vergleichbare Sensitivität, einen breiten Nachweisbereich, gute Praktikabilität und eine hervorragende Selektivität zum Nachweis von MMP-7, was auf eine potenzielle Anwendung in verschiedenen Bioanwendungen hindeutet. Unsere Arbeit unterstreicht die Bedeutung des Impedanzverstärkers für die Verbesserung der Leistung amperometrischer Assays und fördert die Herstellung neuer Verstärker mit fortschrittlicher katalytischer Aktivität und hoher Beständigkeit.

Abkürzungen

4-CN:

4-Chlor-1-Naphthol

BSA:

Rinderserumalbumin

EDS:

Energiedispersive Röntgenspektroskopie

FCC:

Kubikflächenmitte

FFT:

Schnelle Fourier-Transformation

GCE:

Glaskohlenstoffelektrode

GO:

Graphenoxid

HR-TEM:

Hochauflösendes Transmissionselektronenmikroskop

LOD:

Nachweisgrenze

MMP-2:

Matrix-Metalloproteinase-2

MMP-7:

Matrix-Metalloproteinase-7

NSE:

Neuronenspezifische Enolase

PBS:

Phosphatpufferlösung

Pd-CNCs:

Pd-funktionalisierte Kohlenstoff-Nanokomposite

PSA:

Prostataspezifisches Antigen

RSD:

Relative Standardabweichungen

SEM:

Rasterelektronenmikroskop

SWV:

Rechteckvoltammetrie

TBS:

Thrombin aus Rinderserum

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop