Schwefelsäure-unterstützte Synthese leuchtend roter karbonisierter Polymerpunkte für Zwei-Photonen-Bioimaging

Zusammenfassung

Rot-emittierende karbonisierte Polymerpunkte (CPDs) wurden aus wässriger p-Phenylendiamin (p-PD) Lösung unter katalytischem Einfluss von Schwefelsäure (H₂SO₄) hergestellt. Die resultierenden SA-CPDs (mittlerer Durchmesser ≈5 nm) zeigten die hellste Photolumineszenz unter den getesteten Säuren, mit einem Quantenausbeute (QY) von 21,4 % in Wasser und 16,5 % Gesamtausbeute. Anregung bei 300–580 nm erzeugte konsistent 600 nm Emission, unabhängig von der Anregungswellenlänge. Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen deuten darauf hin, dass transversales Wachstum protonierter Vorstufen energetisch begünstigt ist und die Bildung nanoskaliger CPDs antreibt. Zwei-Photonen-Photolumineszenz, emittierend bei 602 nm unter 850 nm Femtosekundenlaser-Anregung, wurde für HeLa-Zell-Imaging demonstriert, was das Potenzial von SA-CPDs in biomedizinischen Anwendungen hervorhebt.

Hintergrund

Kohlenstoffpunkte (CDs) haben aufgrund ihrer exzellenten Wasserlöslichkeit, optischen Stabilität, niedrigen Toxizität und kosteneffektiven Synthese breites Interesse geweckt. Sie werden in elektrochemischen Sensoren, Bioimaging, Katalyse, Licht-emittierenden Geräten und Optoelektronik erforscht. Bottom-up-Routen aus organischen Monomeren, Polymeren oder Naturprodukten werden für Großproduktion bevorzugt. Funktionale Gruppen wie –OH, –COOH, –C=O und –NH₂ durchlaufen bei erhöhten Temperaturen Dehydrierung und Karbonisierung zu fluoreszierenden Nanopartikeln.

Rot-emittierende CDs sind besonders wertvoll für Bioimaging wegen ihrer tieferen Gewebedurchdringung und minimaler Hintergrundinterferenz. Die meisten CDs zeigen jedoch anregungsabhängige Emission, was eine einzelne, stabile rote Photonenquelle selten macht. Phenylendiamin-Isomere (o-, m-, p-) wurden verwendet, um blaue, grüne und rote CDs zu generieren. Jüngste Arbeiten identifizierten p-PD-basierte Punkte als karbonisierte Polymerpunkte (CPDs) wegen ihrer anregungsunabhängigen Emission.

Hier präsentieren wir eine einfache, hochausbeutende, schwefelsäure-unterstützte hydrothermale Synthese rot-emittierender CPDs und demonstrieren ihre Zwei-Photonen-Imaging-Fähigkeit in HeLa-Zellen.

Methoden

Synthese roter CPDs aus säure-unterstützten p-PD-Systemen

Wir untersuchten H₂SO₄, HCl und HClO₄ als Protonendonatoren und bezeichneten die resultierenden CPDs als SA-CPDs, HC-CPDs und PA-CPDs. Reaktionsvariablen – Säure-zu-p-PD-Verhältnis, Vorläuferkonzentration, Temperatur und Zeit – wurden systematisch optimiert. Nach hydrothermaler Behandlung (200 °C, 2 h) wurde das Produkt durch Hexan (Entfernung unreagiertem p-PD) und Ethanol (Entfernung Säure) gereinigt, gefolgt von Zentrifugation bei 14.000 rpm, Filtration durch 0,22 µm Membran und optionaler Rotationsverdampfung zu trockenen Pulvern.

Charakterisierung und Messung

Hochauflösendes TEM (JEM-2100, 200 kV) bewertete Morphologie und Gitterstreifen. FT-IR-Spektren wurden mit einem Prestige-21 Spektrometer mit KRS-5 Fenstern aufgezeichnet. Fluoreszenz- und UV-Vis-Spektren wurden mit einem F-2500 Spektrophotometer und Lambda 950 Spektrometer erhalten. Zwei-Photonen-Emission wurde an einem Faserspektrographen (QE65000, Ocean Optics) gekoppelt an einen Femtosekundenlaser gemessen. Quantenausbeuten wurden mit Rhodamin B (QY = 56 % in Ethanol) als Referenz berechnet, folgend dem Verfahren in Supplementary File 1.

Berechnungsmethoden

Dichtefunktionaltheorie (DFT) Berechnungen wurden mit Gaussian 09 (B3LYP/6-311++G(d)) im PCM-Wassermodell durchgeführt, um die Energetik von longitudinalen und transversalen Wachstumspfaden zu bewerten.

Zellkultur und Behandlung

HeLa-Zellen (4 × 10⁴ Zellen ml⁻¹) wurden in DMEM (Gibco) ausgesät und bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 h inkubiert. SA-CPDs (40 µg ml⁻¹) wurden für 12 h zugesetzt, gefolgt von PBS-Waschungen. Imaging erfolgte an einem Konfokalmikroskop mit 850-nm Femtosekundenlaser (30 mW).

Ergebnisse und Diskussion

Optimierung der Herstellung roter CPDs

Alle Säuresysteme lieferten rote CPDs bei Temperaturen über 180 °C (2 h). Höhere Temperaturen (240 °C, 4–12 h) erhöhten Partikelgröße und verringerten Fluoreszenz. Optimale Bedingungen waren 200 °C, 2 h, mit Säure-zu-p-PD-Verhältnis 1 für H₂SO₄ und 3 für HCl und HClO₄. Der p-PD-Konzentrationsbereich (0,02–0,20 mol L⁻¹) war tolerierbar. Unter diesen Parametern erreichten SA-CPDs QY von 21,4 % und 16,5 % Ausbeute, übertreffend HC-CPDs und PA-CPDs.

TEM-Charakterisierung und FT-IR-Analyse

HR-TEM offenbarte monodisperse sphärische CPDs (mittlerer Durchmesser ≈5 nm) mit 0,21 nm Gitterabstand entsprechend Graphen (100) Ebenen. FT-IR-Spektren zeigten höhere Oberflächenoxidation in SA-CPDs mit ausgeprägten –OH und –COOH Merkmalen und reduzierten –NH₂ Signalen, was auf eine oxidiertere, hydrophilere Oberfläche hindeutet.

Vorgeschlagener Mechanismus für CD-Bildung

DFT-Berechnungen zeigen, dass transversales Wachstum (−1.406 kJ mol⁻¹) signifikant günstiger ist als longitudinales Wachstum (−616 kJ mol⁻¹), was zu planaren Intermediaten führt, die sich zu sphärischen CPDs selbstassemblieren.

Optische Eigenschaften

SA-CPDs zeigen starke UV-Absorption bei 290 nm (π→π*), mit zusätzlichen Bändern bei 430 und 510 nm (Phenazin-Amin-Übergänge). Anregungsspektren peaken nahe 580 nm, passend zur 600 nm Emission, und Fluoreszenz bleibt anregungsunabhängig über 220–580 nm, was die CPD-Natur bestätigt.

Zelluläres Imaging

Zwei-Photonen-Anregung bei 850 nm erzeugte 602 nm Emission vor Pulverisierung und 529 nm Emission danach, mit erhöhter Intensität. Konfokalbilder von HeLa-Zellen, inkubiert mit SA-CPDs, zeigten zytoplasmatische Lokalisation, mit stärkerer grüner Kanal-Fluoreszenz aufgrund der blau-verschobenen Emission.

Schlussfolgerungen

Wir demonstrierten eine einfache, skalierbare, schwefelsäure-unterstützte hydrothermale Methode zur Herstellung heller roter CPDs (≈5 nm, QY = 21,4 %, Ausbeute = 16,5 %). Die CPDs emittieren bei 600 nm unter 300–580 nm Anregung und bei 602 nm unter 850 nm Zwei-Photonen-Anregung. Ihre anregungsunabhängige, hochhelle Fluoreszenz und effiziente zelluläre Aufnahme machen sie zu vielversprechenden Kandidaten für Tiefengewebe-Imaging und andere Bio-Anwendungen.

Abkürzungen

CDs:

Kohlenstoffpunkte

CPDs:

Karbonisierte Polymerpunkte

HC-CPDs:

CPDs synthetisiert aus p-PD mit HCl-Unterstützung

PA-CPDs:

CPDs synthetisiert aus p-PD mit HClO₄-Unterstützung

SA-CPDs:

CPDs synthetisiert aus p-PD mit H₂SO₄-Unterstützung

QYs:

Quantenausbeuten

p-PD:

p-Phenylendiamin