Stabile Carbon-Dot-Frameworks mit überlegener antibakterieller Wirksamkeit

Zusammenfassung

Kohlenstoffpunkte (CDs) werden aufgrund ihrer aktiven Oberfläche häufig als Antimikrobiotika eingesetzt, doch einige CDs leiden unter Instabilität. Daher sind die entsprechenden Anwendungen, wie die antibakterielle Aktivität, für den langfristigen Einsatz möglicherweise nicht zuverlässig. In dieser Arbeit synthetisieren wir CDs mit blauer Fluoreszenz durch einen hydrothermalen Prozess. Anschließend wurde Polyethylenimin (PEI) zur Assemblierung von CDs zu CD-basierten Frameworks (CDFs) verwendet. Die CDFs zeigten zwar gequenchte Fluoreszenz, jedoch stabilere Eigenschaften, basierend auf Untersuchungen mit dem Rasterelektronenmikroskop und Zeta-Potenzial-Messungen. Sowohl CDs als auch CDFs weisen antibakterielle Aktivität gegen Gram-negative Escherichia coli (E. coli) und Gram-positive Staphylococcus aureus (S. aureus) auf, doch CDFs zeigten eine bessere antibakterielle Leistung, wobei S. aureus bei einer minimalen Hemmkonzentration (MHK) von 30 µg/mL vollständig inhibiert werden konnte. Dies zeigt, dass CDFs sowohl die Stabilität als auch die antibakterielle Aktivität verstärken, was sie für praktische Anwendungen vielversprechender macht.

Einleitung

Bakterielle Infektionen stellen eine ernste Bedrohung für das menschliche Leben dar, und die Entwicklung wirksamer Mittel zur Desinfektion von Bakterien ist von großer Nachfrage [1]. Verschiedene Antibiotika wurden zur Behandlung bakterieller Infektionen eingesetzt, doch der übermäßige Gebrauch von Antibiotika führt zu anderen Problemen wie Nebenwirkungen und Resistenzbildung [2]. Nanomaterialien, einschließlich antimikrobieller Polymere [3], metallischer Nanomaterialien [4] und kohlenstoffbasierter Nanomaterialien [5, 6], wurden als Alternativen zu klassischen Antibiotika verwendet [7]. Sowohl Resistenz- als auch Toxizitätsprobleme lassen sich dadurch lindern [8]. In jüngster Zeit werden CDs [9, 10] und Nanocluster (NCs) [11] erfolgreich zur Bekämpfung bakterieller Infektionen eingesetzt, da sie biokompatibel [12], aktiv [13] und aufgrund ihrer ultra-kleinen Größe leicht durch Zirkulation entfernt werden können [14, 15]. Besonders haben Forscher festgestellt, dass CDs eine hervorragende Fähigkeit zum Abfangen freier Radikale aufweisen, die stärker sein kann als die vieler traditioneller Anti-Infektions-Medikamente [16, 17, 18]. Allerdings leiden einige ultra-kleine Antimikrobiotika unter schlechter Stabilität aufgrund der größeren oxidativen Oberfläche [19]. Es ist dringend erwünscht, effektivere antibakterielle Wirkstoffe für den langfristigen Einsatz zu entwickeln.

Um den Anforderungen praktischer Anwendungen gerecht zu werden, sollten Antimikrobiotika folgende Eigenschaften aufweisen: (a) Exzellente Stabilität, die über einen bestimmten Zeitraum in einer Umgebungsatmosphäre unverändert bleibt; (b) Exzellente Biokompatibilität und geringe Toxizität; (c) Hohe antibakterielle Aktivität. Größere Nanomaterialien neigen dazu, stabiler zu sein, könnten aber aufgrund der kleineren aktiven Oberfläche eine relativ schwächere antibakterielle Aktivität aufweisen. In Anbetracht sowohl der Schwächen kleiner als auch großer Nanomaterialien berichten wir über die Assemblierung kleiner CDs zu großen CDFs durch einfaches Hinzufügen von Polyethylenimin (PEI) (Abb. 1). Die CDs wurden nicht verschmolzen, sondern behielten ihre Morphologie als Bausteine bei. Daher zeigten die gesamten CDFs größere Größen, demonstrierten jedoch eine ausgezeichnetere Stabilität, ohne die aktiven Eigenschaften der CDs zu verlieren. Darüber hinaus stellten wir fest, dass CDFs im Vergleich zu CDs eine verstärkte antibakterielle Aktivität gegen sowohl Gram-negative Escherichia coli (E. coli) als auch Gram-positive Staphylococcus aureus (S. aureus) aufwiesen, was auf ihre breitbandige antibakterielle Leistung hinweist, obwohl viele CDs nur Gram-positive Bakterien eliminierten [20]. Zudem förderten die CDFs die Proliferation von PC12-Zellen (eine Zelllinie, die aus einem Phäochromozytom der Ratten-Nebennierenmark gewonnen wurde), was großes Potenzial für Anwendungen zur Nervenregeneration zeigt [21]. Diese Arbeit legt nahe, dass die Assemblierung kleiner CDs zu großen CDFs nicht nur die Stabilität erhöht, sondern auch die antibakterielle Aktivität verstärkt.

Materialien und Methoden

Materialien und Instrumente

Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS) wurde mit einem ESCALAB250Xi XPS-Instrument aufgezeichnet. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde mit einem JEM-2100-Mikroskop bei 200 kV durchgeführt. Die Fluoreszenz der Materialien wurde mit einem F97-Fluoreszenzspektrometer ermittelt. Die FDA/PI-Färbung der Bakterienzellen wurde im Tapping-Modus mit einem Leica DFC450C-Mikroskop aufgezeichnet. Die Fluoreszenzlebensdauer wurde mit einem Time-Correlated Single-Photon Counting (TCSPC)-System unter Verwendung eines Nanolog-Spektrofluorometers (Horbia JY, Japan) gemessen. Ultraviolett-visible Spektroskopie (UV-Vis) wurde mit einem UV-1600-Instrument durchgeführt. Die bakterielle Bildgebung wurde mit einem Konfokalmikroskop (Olympus FLUOVIEW FV1000 c) beobachtet. Alle Reagenzien waren analytischen Grades. Deionisiertes Wasser wurde in allen Experimenten verwendet. Cell Counting Kit-8 wurde von Beyotime Biotechnology bezogen.

Herstellung von CDs und CDFs

L-Cystein (1,0 g) wurde in 10,0 mL deionisiertem Wasser gelöst und gut vermischt. Anschließend wurde der pH-Wert der Lösung mit 1,0 M NaOH auf 9,0 eingestellt. Die Lösung wurde in einen hydrothermalen Reaktor überführt und bei 160 °C für 24 h erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die resultierende Lösung mittels Dialyse (MW 7000 cut off) für einen Tag dialysiert. Die erhaltenen CDs wurden für die folgenden Charakterisierungen und Experimente verwendet. Zur Herstellung der CDFs wurden 40 µL von 1% PEI zu 1 mL der CDs gegeben. Das Gemisch wurde 1 h ruhen gelassen. Das Produkt wurde mit derselben Methode wie bei der Reinigung der CDs dialysiert. Für die HR-TEM-Charakterisierung wurden die Proben in ein kleines Volumen konzentriert, auf eine Silikagel-Säule aufgebracht und mit Methanol und Dichlormethan eluiert, um weiter gereinigte Produkte zu erhalten.

Toxizitätsbewertung

PC12-Zellen wurden in 96-Well-Platten für 12 h ausgesät und anschließend mit CDs und CDFs in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde mit einem Cell Counting Kit-8 Assay (CCK-8) untersucht. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (5 mg/mL in PBS) wurde im Verhältnis 1/10 des Kulturvolumens hinzugefügt, und die Zellen wurden wieder in den Inkubator zurückgebracht. Danach wurden die Überstände verworfen und 200 µL Dimethylsulfoxid (DMSO) zu jedem Well hinzugefügt. Die Kristalle wurden durch 10-minütiges Schütteln der Platten gelöst. Die Absorption bei 490 nm wurde mit einem Mikroplattenleser (Varioskan LUX Multimode Reader) gemessen. Leerkontroll-Wells wurden für alle Absorptionsmessungen einbezogen.

Antibakterielle Experimente

E. coli und S. aureus wurden in Abwesenheit und Gegenwart von CDs und CDFs bei 37 °C mit 250 rpm Schütteln inkubiert. Das Wachstum der Bakterienzellen in Lysogeny-Brühe (LB) wurde mit dem Mikroplattenleser bei 600 nm Wellenlänge (OD600) gemessen. LB-Medium diente als Leerkontrolle. OD600 steht für die Zelldichte, und die relative Zelllebensfähigkeit wurde basierend auf dem Vergleich zwischen den kultivierten Bakterienzellen in Gegenwart der Materialien und der Kontrollgruppe (OD600 der Bakterienzellen in Abwesenheit von CDs oder CDFs) berechnet. Lebende/tote Bakterien wurden durch das FDA/PI-Färbeprotokoll [22] bewertet.

Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)

Die intrazelluläre ROS-Produktion wurde in Bakterienzellen vor und nach der Behandlung mit CDs und CDFs für 12 h mittels einer 2′,7′-Dichlorfluorescin-Diacetat (DCFH-DA)-Sonde gemäß den Anweisungen gemessen. Die Fluoreszenz wurde bei einer Emissionswellenlänge von 525 nm mit Anregung bei 488 nm detektiert.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung der Materialien

Größenuntersuchungen

Abbildung 2 zeigt das REM des Pulvers für CDFs mit relativ niedrigerer (Abb. 2a0) und höherer Vergrößerung (Abb. 2b0) nach mehrstündiger Exposition an der Luft. Man kann sehen, dass die CDFs gut verteilt waren und eine durchschnittliche Größe von ca. 25 nm aufwiesen. CDs sollten basierend auf TEM- und AFM-Studien (Zusatzdatei 1: Abbildung S1) monodisperse kleine Größen zeigen, doch diese kleinen Partikel zeigten Aggregation bei der Beobachtung mit REM nach einer gewissen Zeit an der Luft (Zusatzdatei 1: Abbildung S2). Andererseits behielten CDFs ihre Morphologie bei, obwohl sie der Umgebungsatmosphäre ausgesetzt waren. Dies deutet darauf hin, dass die erhaltenen CDFs für praktische Anwendungen vielversprechender sind. CDFs wurden weiter durch TEM charakterisiert (Abb. 2b1). Es ist zu sehen, dass CDFs Assemblierstrukturen mit kleinen CDs als Bausteinen aufwiesen. Die hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HR-TEM) (Abb. 2b2) zeigte, dass die Bausteine der CDFs Gitterstreifen mit einem d-Abstand von 0,21 nm aufwiesen, was der (100)-Ebene von Graphit entspricht, was klassischen CDs ähnelt [23, 24, 25]. Daher verlieren die assemblierten CDFs nicht die Eigenschaften der CDs, was die Vorteile sowohl der gesamten großen Frameworks als auch der inneren kleinen Bausteine kombinieren kann.

Zeta-Potenzial

Zeta-Potenzial-Untersuchungen wurden verwendet, um den Grad der elektrostatischen Abstoßung von CDs und CDFs zwischen benachbarten geladenen Teilchen im Dispersionssystem zu messen (Abb. 3). Es zeigte sich, dass der Zeta-Potenzial-Peak der CDs, die der Umgebungsatmosphäre ausgesetzt waren, nicht gut ausgeprägt war. Zudem wurden mehrere Zeta-Potenzial-Peaks mit großen Abweichungen erhalten (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass die CDs ziemlich instabil und nicht reproduzierbar waren. Andererseits lag der Zeta-Potenzial-Peak für CDFs in einem relativ stabilen Bereich. Auch zeigten wir basierend auf dreifachen Messungen viel kleinere Zeta-Abweichungen, was zeigt, dass CDFs stabiler waren und die Dispersionssysteme Proben mit höherer Reinheit aufwiesen.

Fluoreszenzeigenschaften

Fluoreszenz-Emissionsspektren wurden verwendet, um den Assemblierungsprozess von CDs zu CDFs zu überwachen (Abb. 4). Mit der Titration von PEI nahm die Fluoreszenzemission bei 350 nm allmählich ab (Abb. 4a). Es wurde jedoch keine signifikante Verschiebung der Fluoreszenzspektren beobachtet, was zeigt, dass keine Aggregation stattfand. Die Assemblierstruktur der CDFs ändert die gesamte Größe der CDs, was die Fluoreszenz beeinflusst. Gleichzeitig quenchten sich benachbarte CDs gegenseitig. Auch die Oberflächenchemie spielt eine wichtige Rolle für die Fluoreszenzeigenschaften. Stickstoff- und Schwefelatome auf der Oberfläche der CDs können Energiefallen erzeugen. Die helle Fluoreszenz der CDs wird auf die defektoberfläche mit vielen Carbonyl- und Aminogruppen zurückgeführt. Nach der Funktionalisierung mit PEI wurde die Oberfläche der CDFs von Aminogruppen dominiert, was zusammen mit der Größenvergrößerung die Fluoreszenz quenchte. Der Vergleich des Fluoreszenzverhaltens von CDs und CDFs wurde weiter durch TCSPC untersucht, um die photogenerierten Ladungsrekombinationspfade der Materialien zu verstehen (Abb. 4b). Die Emission wurde bei 430 nm überwacht. Die Fluoreszenzabfälle erforderten einen zweikomponentigen exponentiellen Fit. Die Zeitkonstanten und relativen Amplituden sind in Tabelle S1 zusammengefasst. Es zeigte sich, dass die Lebensdauer der dominierenden Komponente für CDs 2,45 ns betrug, während die der anderen Komponente 7,47 ns betrug. Andererseits betrug die Lebensdauer der dominierenden Komponente für CDFs 1,98 ns, während die andere Komponente eine Lebensdauer von 7,30 ns zeigte. Es wurde keine signifikante Änderung der Lebensdauer zwischen CDs und CDFs beobachtet, was ebenfalls darauf hindeutete, dass die Eigenschaften der CDs sich nicht wesentlich änderten, während sie zu CDFs assembliert wurden [26].

Toxizität

Zur Bewertung der Sicherheit der Materialien wurde die Toxizität der CDs und CDFs gegenüber PC12-Zellen untersucht. MTT-Assays wurden durchgeführt, um den Einfluss der Materialien auf die Zelllebensfähigkeit zu untersuchen (Abb. 5). Nach Inkubation von PC12 mit CDs und CDFs wurde die Zelllebensfähigkeit innerhalb von 24 h nicht stark beeinflusst. Interessanterweise förderten beide Kohlenstoffmaterialien die Proliferation von PC12, was eine wichtige Rolle bei der Therapie von Nervenschäden spielt. Diese Ergebnisse zeigen die geringe Toxizität der Materialien und dass sie für den Nervenschutz mit Beteiligung von PC12-Zellen vielversprechend sind [27].

Antibakterielle Untersuchungen

Die antibakterielle Aktivität der CDs und CDFs wurde zunächst durch Messung der Bakteriendichte in Gegenwart dieser Wirkstoffe bei 600 nm bewertet [28]. Abbildung 6 zeigt einen erheblichen antibakteriellen Effekt sowohl der CDs als auch der CDFs gegen sowohl S. aureus als auch E. coli Zellen. Besonders war die Lebensfähigkeit der S. aureus Zellen fast 0, wenn mehr als 30 µg/mL der CDFs verwendet wurden. Ebenso wurden E. coli Zellen durch sowohl CDs als auch CDFs desinfiziert. CDs zeigten multiple Ladungen (Abb. 3a). Andererseits wiesen CDFs unbedeutende Ladungen auf (Abb. 3b), was die bakterielle Adhäsion unter schwacher Abstoßung unterdrücken und somit leichter mit der bakteriellen Oberfläche interagieren könnte. Im Vergleich zeigen CDFs eine höhere antibakterielle Aktivität, basierend auf dem Phänomen, dass ein relativ größerer Anteil der Zellen abgetötet wird, wenn mehr als 6 µg/mL der Materialien verwendet werden. Die verstärkte antibakterielle Aktivität der CDFs ist möglicherweise auf den Synergieeffekt der CDs als Bausteine sowie die stabileren Oberflächenladungen zurückzuführen. Um den antibakteriellen Mechanismus tiefer zu verstehen, wurde das ROS gemessen, das nicht-fluoreszierendes DCFH zu fluoreszierendem DFC oxidieren konnte (Abb. 6c). Beide Kohlenstoffmaterialien induzierten nach der Behandlung von E. coli keine signifikante ROS-Produktion. Allerdings verstärkten CDFs die intrazelluläre ROS bei Interaktion mit S. aureus bemerkenswert. Da ROS bakterielle DNA, RNA und Proteine schädigen können, erleichterte der erhöhte Wert die Desinfektion der Bakterien. Darüber hinaus wurde ROS mit H₂O₂ stimuliert. Es ist erwähnenswert, dass die ROS-Produktionen im Vergleich zur H₂O₂-Behandlung allein alle dramatisch gefördert wurden, wobei CDFs die höchste Verstärkung zeigten. Dies deutete darauf hin, dass die Kombination von H₂O₂ mit diesen beiden Kohlenstoffmaterialien die antibakterielle Aktivität weiter verstärken könnte, insbesondere für die CDFs.

Einige CDs wurden zuvor zur Desinfektion von S. aureus berichtet, die in Tabelle 2 zum Vergleich aufgelistet sind. Die aktuellen CDFs zeigten eine wettbewerbsfähige MHK. Darüber hinaus förderten CDFs im Gegensatz zur reinen Verringerung der untersuchten Zelllebensfähigkeit die Zellproliferation von PC12, was ihre Vielseitigkeit bei der Behandlung bakterieller Infektionen zeigt.

Die Integrität der bakteriellen Membran nach der Behandlung mit CDs und CDFs wurde durch das Live/Dead-Färbeexperiment untersucht (Abb. 7). Die grüne FDA-Färbung zeigt nur lebende Zellen an, während die rote PI-Färbung spezifisch tote Bakterien mit gebrochener Membran färbt, lebende Zellen mit intakter Membran bleiben ungefärbt [30, 31]. Wie in den Fluoreszenzbildern gezeigt, war im CDs-behandelten Proben offensichtliche rote Fluoreszenz zu sehen, und eine viel höhere Dichte toter Zellen war in den CDFs-behandelten Proben zu sehen.

Basierend auf den obigen Vergleichen schließen wir, dass CDFs vielversprechend für die Abtötung sowohl Gram-positiver als auch Gram-negativer Bakterienzellen sind. Daher wurden E. coli und S. aureus vor und nach der Behandlung mit 30 µg/mL CDFs durch REM charakterisiert (Abb. 8). Wie in Abb. 8a, c gezeigt, weisen Bakterien vor der Behandlung mit CDFs eine reguläre Oberfläche auf. Nach Inkubation mit CDFs veränderte sich die Morphologie der Bakterienzellen einschließlich S. aureus (Abb. 8b) und E. coli (Abb. 8d) drastisch. Zudem brachen die Membranen vieler Bakterienzellen auseinander. Einige kleine Materialien wurden auf der Oberfläche der Bakterien beobachtet, die von den angehefteten CDFs stammten. Dies deutet darauf hin, dass CDFs Bakterienzellen durch Beschädigung der Membranen desinfizieren können [32].

Da sowohl CDs als auch CDFs fluoreszierend sind, wurden 6 µg/mL der Wirkstoffe für die bakterielle Bildgebung während des Desinfektionsprozesses untersucht. Die Bildgebung von S. aureus wurde untersucht und in Abb. 9 gezeigt. Interessanterweise wurde festgestellt, dass sowohl CDs als auch CDFs für die Bildgebung von S. aureus verwendet werden konnten. Allerdings zeigten CDFs eine höhere Aufnahmeeffizienz, da die Bakterienzellen aus Hell- und Dunkelfeld fast überlagerten. Andererseits wurde nur ein Teil der S. aureus Zellen durch CDs gefärbt. Zudem waren die Bakterienzelldichten bei der Behandlung mit CDFs geringer, was zeigt, dass CDFs S. aureus bei gleicher Dosierung effizienter desinfizierten als CDs. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass CDFs als alternative Farbstoffe für die Bildgebung verschiedener Bakterienzellen verwendet werden können.

Schlussfolgerungen

Die Assemblierung von CDs zu CDFs führt zu einer robusteren antibakteriellen Aktivität. Es wird gefolgert, dass die Assemblierstruktur stabilere Eigenschaften ermöglicht, aber die antibakterielle Aktivität der CDs verstärkt. Diese Arbeit bietet auch einen neuen Weg, kleine Nanomaterialien zu Frameworks für praktischere Anwendungen zu assemblieren.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Artikel enthalten.

Abkürzungen

CDs:

Kohlenstoffpunkte (Carbon dots)

CDFs:

Kohlenstoffpunkt-basierte Frameworks (Carbon dots-based frameworks)

PEI:

Polyethylenimin

E. coli:

Escherichia coli

S. aureus:

Staphylococcus aureus

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

HR-TEM:

Hochauflösende TEM

XPS:

Röntgen-Photoelektronenspektroskopie

MHK:

Minimale Hemmkonzentration (Minimum inhibitory concentration)

NCs:

Nanocluster

TCSPC:

Time-correlated single-photon counting

CCK-8:

Cell Counting Kit-8 Assay

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies (Reactive oxygen species)

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

ZP:

Zeta-Potenzial