Rasterkraftmikroskopie-basierte Nanoskopie von chondrogen differenzierenden menschlichen Fettstammzellen:Nanostruktur und Integrin-β1-Expression

Hintergrund

Osteoarthritis (OA) ist eine häufige degenerative Gelenkerkrankung älterer Menschen [1], wobei die degenerative Arthrose durch eine fortschreitende Zerstörung des Gelenkknorpels gekennzeichnet ist. Knorpel ist hochorganisiert ohne Blutgefäße, Nerven oder Lymphgewebe [2]. Die extrazelluläre Matrix (ECM) besteht hauptsächlich aus Kollagen II und Glykoprotein und ist sehr wichtig für die Knorpelhomöostase. Da Knorpel avaskulär ist, ist seine Fähigkeit zur Selbsterneuerung begrenzt. Obwohl OA-Behandlungen (sowohl chirurgische als auch nicht-chirurgische) die Symptome von OA-Patienten, insbesondere Schmerzen, schnell lindern können, können sie die normale Struktur und Funktion des Gelenkknorpels nicht wiederherstellen [3]. Zukünftig wird die Behandlung wahrscheinlich Tissue Engineering mit Stammzellen und Gerüsten umfassen, um Defekte und degenerativen Gelenkknorpel zu reparieren [4]. Mesenchymale Stammzellen sind multipotente Stromazellen, die je nach Kombination von Wachstumsfaktoren ein osteogenes, adipogenes, chondrogenes und myogenes Potenzial aufweisen [5]. Die Analyse der mesenchymalen Stammzelldifferenzierung hat gezeigt, dass Wnt/β-Catenin, Säugetier-Target von Rapamycin (mTOR), Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) und andere Wege eine wichtige Rolle bei der Differenzierung spielen [6,7,8]. Der zugrunde liegende Mechanismus, durch den die chondrogene Differenzierung induziert wird, bleibt jedoch unklar. Dies gilt insbesondere für den Mechanismus, durch den extrazelluläre Signale intrazelluläre Signalwege aktivieren. Wir haben festgestellt, dass sich Integrin β1 während der chondrogenen Differenzierung verändert. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass Integrin β1 aufgrund seiner Beteiligung an verschiedenen Signalwegen der Gewebedifferenzierung eine wichtige Rolle bei der chondrogenen Differenzierung von menschlichen Fettstammzellen (hADSc) spielen könnte. Bei dieser Untersuchung lag der Fokus auf dem Wnt/β-Catenin-Signalweg.

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Interaktionen zwischen Zellen und der extrazellulären Umgebung durch Transmembranproteine, insbesondere Mitglieder der Integrinfamilie, reguliert werden [9]. Integrine bestehen aus heterodimeren Transmembran-Glykoproteinen von nicht kovalent gebundenen α- und β-Ketten [10]. Theoretisch sind 64 Integrine bekannt, von denen nur 24 gefunden wurden. Integrine spielen eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Adhäsion, der ECM-Zell-Adhäsion, der Zellsignalübertragung und der Organisation des Aktin-Zytoskeletts [11]. Die ECM spielt eine wichtige Rolle bei der Gewebehomöostase und dass die ECM Integrine reguliert. Integrine vermitteln viele grundlegende Prozesse, einschließlich Zelladhäsion, Migration, Proliferation, Differenzierung, Zelltod, Wundheilung, Gewebeentwicklung und Organogenese. Während der chondrogenen Differenzierung mesenchymaler Stammzellen ist die Expression von Integrin β1 mit dem SOX-Signalweg und mit Kollagen II verbunden. Der Fokus dieser Untersuchung lag auf dem Integrin-β1-Dimer, da es das prominenteste β-Dimer unter den Knorpelheterodimeren ist und bekanntermaßen mit vielen verschiedenen α-Dimeren wechselwirkt [12]. Das Differenzierungscluster 29 (CD29) ist eine Integrin-β1-Untereinheit, die mit sehr späten Antigenrezeptoren assoziiert ist und auf fast allen Zellen und Gewebetypen exprimiert wird.

Hier wurde Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet, um uns zu helfen, die Veränderungen während der chondrogenen Differenzierung von hADSc zu messen. Als sehr hochauflösende Art der Rastersondenmikroskopie bietet AFM eine neue Möglichkeit, die Morphologie und Zellmembran einzelner Zellen in Flüssigkeiten im Nanomaßstab zu erkennen. In der Zwischenzeit wurde das System der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) kombiniert mit Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet, um die Ligand-Rezeptor-Bindung an lebenden Zellen zu messen. Das SMFS-System reagierte empfindlicher auf die Veränderungen der Rezeptoren in der Zellmembran, und die Bilder der Bindungskraft wurden sichtbar gemacht. In dieser Arbeit wurde die Integrin-β1-Ligand-Rezeptor-Bindung durch Integrin-β1-funktionalisierte AFM-Spitzen untersucht. Bei Anwendung von AFM wurde festgestellt, dass die chondrogene Differenzierung die hADSc-Zellform verändert und die Zellrauigkeit erhöht. Diese Anwendung stellte eine Methode zur Verfügung, mit der die chondrogene Differenzierung durch direkte Messung von Integrin-β1-Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen und Veränderungen der Zelloberflächen-Ultrastruktur beurteilt werden kann, wodurch die Untersuchung und das Screening von Zelloberflächen auf visualisierte Weise verbessert werden. Die chondrogene Differenzierung verändert die Membranzusammensetzung und -struktur sowie die intrazellulären Zytoskelett-Interaktionen. Diese Veränderungen der zellulären Morphologie, Ultrastruktur und Ligand-Transmembran-Rezeptor-Bindung dienen als nützliche Marker für die Bewertung von chondrogenen Differenzierungsmechanismen.

Methoden

Zellkultur und Reagenzien

Für diese Untersuchung wurden Zellen von drei chirurgischen Patienten (mittleres Alter 20 Jahre) wie zuvor beschrieben isoliert [13]. Einverständniserklärungen wurden von allen Patienten eingeholt. Die ethische Genehmigung für diese Studie wurde vom First Affiliated Hospital der Jinan University eingeholt (Ergänzungsformular). Die Zellen wurden in Basalmedium gehalten, das glukosearmes Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Life Technologies, CA, USA) enthielt, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS, Life Technologies, CA, USA), 100 Einheiten/ ml Penicillin (Life Technologies, CA, USA), 100 μg/ml Streptomycin (Life Technologies, CA, USA), 0,11 mg/ml Natriumpyruvat (Life Technologies, CA, USA) und L-Glutamin (Life Technologies, CA, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ . gehalten mit Mediumwechsel alle 3 Tage.

In-vitro-Unterscheidung

Für die chondrogene Induktion wurden hADSc der vierten bis achten Passage mit einer hohen Zelldichte (2  ×   105/10 ml) ausgesät und in chondrogenem Medium mit DMEM/F12, ergänzt mit 1% FBS, 1% Insulin-Transferrin-Selen ( ITS) + Supplement (Cyagen, Guangzhou, China), 10 ng/ml Transforming Growth Factor-beta1 (TGF-β1) (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey, USA), 100 ng/ml insulinähnliche Wachstumsfaktoren-1 ( IGF-1) (Peprotech, Peprotech, Rocky Hill, New Jersey, USA), 10-7 M Dexamethason (Sigma, St. Louis, MO, USA) und 50 μg/ml Ascorbinsäure (Sigma, St. Louis, MO , VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Das Medium wurde alle 2 Tage mit frisch zugegebenem TGF-β1 und IGF-1 gewechselt. Die Chondrogenese wurde durch Färbung mit Alcianblau und Toluidinblau bestimmt.

Um eine osteogene und adipogene Differenzierung zu induzieren, wurden Zellen der vierten bis achten Passage mit dem osteogenen bzw. adipogenen Medium 2 Wochen lang behandelt. Osteogenes Medium bestand aus DMEM, ergänzt mit 10-7 M Dexamethason (Sigma, St. Louis, MO, USA), 50 μg/ml Ascorbinsäure (Sigma, St. Louis, MO, USA) und 10 mmol/l β-Glycerin Phosphat (Sigma, St. Louis, MO, USA). Die Osteogenese wurde durch Färbung mit Alizarinrot beurteilt.

Adipogenes Medium bestand aus DMEM, ergänzt mit 0,5 mmol/l 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 μmol/l Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,1 mmol/l Indomethacin (Sigma, St. Louis, MO, USA). Die adipogene Differenzierung wurde durch Oil Red O-Färbung bewertet.

Identifizierung von hADSc-Oberflächenantigenen durch Durchflusszytometrie

Die hADSCs wurden mit Trypsin verdaut und dann zweimal mit DMEM gespült, bevor sie bei einer Zelldichte von 2 × 10 ⁷ . resuspendiert wurden Zellen/ml. Die Zellsuspension (50 μl; 1 × 10 ⁶ Zellen) wurde in 1,5 ml-Epoxid-Epoxidröhrchen gegeben und dann mit Anti-CD34-, Anti-CD44-, Anti-CD45-, Anti-CD73-, Anti-CD90-, Anti-CD106-, Anti-HLA-DR- und Anti-CD105-Antikörpern für . inkubiert 20 min bei 37 °C im Dunkeln. Anti-CD34, Anti-CD44 und Anti-CD45 wurden von CST (Beverly, MA, USA) erhalten; andere Antikörper wurden von Abcam (Cambridge, MA, USA) bezogen. Dann wurde die Zellsuspension bei × 500g . zentrifugiert für 5 min, gefolgt vom Entfernen des Überstands und Resuspendieren der Zellen in 200 μl Färbepuffer. Alle Schritte wurden vor der Analyse durch Durchflusszytometrie zweimal wiederholt.

Immunblotting-Analyse (IB)

Die Zellen wurden für das Immunblotting gesammelt, wie zuvor beschrieben [14]. Die verwendeten primären Antikörper waren Anti-β-Catenin (ab32572), Anti-Integrin β1 (ab30394) und Anti-Kollagen II (ab34712), erhalten von Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-β-Actin (8H10D10, 1:2000), Anti-GSK-3β (27C10, 1:1000) und Anti-SOX (92G2, 1:1000) wurden von Cell Signaling Technology (CST, Beverly, MA, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Sekundäre HRP-konjugierte Antikörper (1:1000–1:3000) wurden von CST gekauft.

Immunfluoreszenz

Zur chondrogenen Differenzierung wurden die Zellen 0, 6 und 12 Tage lang behandelt, verdaut und auf dem Glas in 24-Well-Platten (Costar353047, Corning, New York, USA) für 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden zweimal mit eiskalter Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen, die mit 4 % Paraformaldehyd 15 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert wurde. Nach der Blockierung wurden die Zellen mit dem primären Antikörper, der mit Integrin β1 reaktiv ist, 1 h lang inkubiert, gefolgt von einer 1 h langen Inkubation im Dunkeln mit Alexa Fluor 488-markiertem Anti-Maus-IgG (H + L) (CST #4408, MA, USA ), 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, Sigma, MO, USA). Für die Phalloidin-Färbung wurden die Zellen nach dem Blockieren mit 0,2 % Triton X-100 für 30 Minuten permeabilisiert, dann wurden die Zellen mit DAPI und Phalloidin-Alexa-Flour 573 (Life technologies, CA, USA) 1 h lang inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die subzelluläre Lokalisation von Integrin β1 und die Veränderung des filamentösen Aktins (F-Aktin) während der Knorpeldifferenzierung mit einem konfokalen Laser Scan Mikroskop (ZEISS, LSM 700, Oberkochen, Deutschland) beurteilt.

AFM-Tipps-Vorbereitung

Die Si3N4-Spitzen (DNP-10, Bruker Corp) mit einer Federkonstante (0,06 N/m) wurden durch den Anti-CD29-Antikörper wie folgt chemisch modifiziert [15]. Die Spitzen wurden mit Aceton, ultraviolettem Licht und Piranha-Lösung (H₂ .) gereinigt SO₄ :H₂ O₂ = 3:1, v /v ) für verschiedene Zeiten (5 Minuten, 30 Minuten und 10 Minuten). Nach gründlichem Spülen mit gereinigtem Wasser wurden Spitzen durch Inkubation mit einer Lösung von 1% 3-APTES (Sigma, St. Louis, MO, USA) in Ethanol für 30 Minuten gebildet. Die Spitzen wurden dreimal mit Reinstwasser gewaschen und 1 h mit 2,5%iger Glutaraldehydlösung (Sigma, St. Louis, MO, USA) behandelt. Überschüssiges Glutaraldehyd wurde dreimal mit Wasser gewaschen. Schließlich wurden die Spitzen in eine Anti-Integrin-β1-Lösung (1 mg/ml) eingelegt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die modifizierten Sonden wurden vor den Experimenten mit PBS gewaschen.

AFM-Messungen

AFM (Bioscope Catalyst, Bruker, USA) wurde verwendet, um die hADSc-Morphologie und ultrastrukturelle Veränderungen während der chondrogenen Differenzierung zu untersuchen. Die genaue Kraftkonstante der AFM-Spitzen wurde in PBS gemessen. Um Morphologie und Ultrastruktur zu beurteilen, wurden die Zellen mehrmals mit PBS gewaschen. Dann wurde eine 4%ige Paraformaldehydlösung in eine 3,5-cm ² .-Lösung gegeben Kulturschale für 15 Min. Nachdem die Zellen mit PBS gewaschen wurden, wurden die Zellen bis zur Verwendung in PBS bei 4 °C gelagert. Die Federkonstante der Spitzen reichte von 4,2 bis 5,8 N/m im Kontaktmodus. Morphologie- und Ultrastrukturbilder von hADSc wurden in PBS bei Raumtemperatur mit AFM aufgenommen. Im Kontaktmodus wurden Ultrastrukturbilder um die Kerne von hADSc aufgenommen. Die Nanoscope-Analysesoftware wurde verwendet, um die Zelloberflächen-Ultrastruktur für mehr als 15 verschiedene 10 × 10 μm-Bilder für mindestens 15 verschiedene Zellen in (Tag 0, 6, 12) Gruppen zu bewerten. Die Bindungskraft zwischen den Integrin-β1-modifizierten AFM-Spitzen und den CD29-Rezeptoren von lebendem hADSc wurde während verschiedener chondrogener Zeiträume (0, 6 und 12 Tage) analysiert. Die Bindungskraft wurde im Annäherungs-Rückzug-Modus eines AFM-Systems (Bioscope Catalyst, Bruker, USA) gemessen. Um die Integrin-β1-Abtrennungsereignisse lebender Zellen zu untersuchen, wurden die Integrin-β1-Antikörper-modifizierten Spitzen bei Annäherungs- und Rückzugsgeschwindigkeiten von 500 nm/s verwendet. Die Kraftkonstante der funktionalisierten Spitzen betrug 0,058 ± 0,006 N/m. Die Schwellenkraft auf Zellen betrug 800 pN. Der Anti-Integrin-β1-Antikörper (100 μg/ml) wurde den Zellen für 30 Minuten vor den Kraftmessexperimenten zugesetzt. Integrin-β1-blockierende und blanke Sonden wurden auch als Kontrollen verwendet, um die unspezifische Bruchkraft zwischen Integrin-β1-Antikörper-modifizierten Spitzen und Zellen nachzuweisen. Zur Quantifizierung der Integrin-β1-Ligand-Rezeptor-Bindungswahrscheinlichkeit wurden spezifische Wechselwirkungskraftkurven mit Integrin-β1-Antikörper-funktionalisierten Sonden gemessen. Mehr als 400 Kraftkurven wurden in einem einzigen Experiment gemessen, wobei die Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten zusammengefasst wurden. So wurden etwa 1200 ursprüngliche Kraft-Weg-Kurven in jedem Vergleichsexperiment von 30 bis 40 verschiedenen Zellen mit der Nanoscope-Analysesoftware des Instruments aufgenommen. Durch Mittelung der Kraftwerte für mindestens drei unabhängige Experimente wurde die Wirkung der chondrogenen Induktion auf die Wechselwirkungskraft zwischen Integrin-β1-Ligand und CD29-Rezeptoren auf der Zelloberfläche bestimmt.

Reverse Transkription und Echtzeit-PCR

Es wurden TRIzol® Plus RNA Purification Kits (Life Technologies, CA, USA) verwendet und 1 μg RNA wurde mit einem High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers mit geringfügigen Modifikationen in cDNA revers transkribiert. Integrin β1 und GAPDH wurden mittels qRT-PCR mit genspezifischen Primern quantifiziert:5′-TGGAGGAAATGGTGTTTGC-3′ (Integrin β1-Sense) und 5′-CGTTGCTGGCTTCACAAGTA-3′ (Integrin β1-Antisense); 5'-CTGACTTCAACAGCGACACC-3' (GAPDH-Sinn) und 5'-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT-3' (GAPDH-Antisense). Für die Real-Time-PCR wurde Step One Real-Time-PCR (Applied Biosystems) mit Fast SYBR@GREEN Master Mix (Life Technologies, CA, USA) durchgeführt. Die Expression des Zielgens wurde auf GAPDH als internen Standard normalisiert und unter Verwendung der vergleichenden 2-ΔΔCT-Methode berechnet. Jeder Assay wurde dreifach durchgeführt.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt, wobei die Daten als mittlere ± ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt wurden. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde von t . durchgeführt Prüfung. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppenmittelwerten wurden durch eine Einweg-ANOVA-Analyse bestimmt, gefolgt vom T2-Test von Bonferroni und Tamhane (gleiche Varianzen wurden nicht angenommen). Werte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Bewertung von hADSc

Mesenchymale Stammzellen sind multipotente Stromazellen mit osteogenem, adipogenem, chondrogenem und myogenem Potenzial. Es gibt zwei Hauptmethoden, um hADSc zu identifizieren, Zelloberflächen-CD-Marker und die Fähigkeit zur Differenzierung [16]. Wie in Zusatzdatei 1:Abbildung S1 und Zusatzdatei 2:Abbildung S2 gezeigt, waren die abgeleiteten Zellen hADSc. Dann wurde die Zellproliferation von Passage 3 hADSc durch den MTT-Assay bestimmt (zusätzliche Datei 3:Abbildung S3).

Induzierte Veränderungen der Morphologie und Oberflächenultrastruktur während der hADSc-Chondrogenese

AFM wird immer verwendet, um Zellmorphologie und Ultrastruktur im Nanomaßstab zu detektieren [17]. Die Form einer Zelle hängt mit ihrer spezialisierten Zellfunktion und der Gewebeorganisation zusammen. In einigen Krebsforschungen kann AFM als High-Imaging-Technik verwendet werden, um morphologische Veränderungen zur Bewertung von Arzneimittelwirkungen zu analysieren. Darüber hinaus wird die Form der mesenchymalen Stammzellen während der chondrogenen Induktion verändert [18]. Während Veränderungen der Zellform für die Differenzierung notwendig zu sein scheinen, ist wenig darüber bekannt, ob die Zellmorphologie frühere Entwicklungsstadien der mesenchymalen Stammzelldifferenzierung beeinflusst. Daher wurden Morphologie- und Membran-Ultrastruktur-Änderungen während der hADSc-Chondrogenese durch AFM ausgewertet, da diese Veränderungen wichtig sind [19] und die Funktion von Zellen direkt beeinflussen können [20]. Oberflächenmorphologie und ultrafeine Struktur von hADSc wurden während der chondrogenen Differenzierung für unterschiedliche Zeiträume untersucht (Abb. 1 und Abb. 2). Die Morphologie und Oberflächenultrastruktur waren offensichtlich in jeder Vergleichsgruppe unterschiedlich. Am Tag 0 hatten die Zellen eine längliche Spindelform mit einer relativ glatten Oberfläche. Die Zellmembranarchitektur war homogen. Nach der chondrogenen Induktion wurden an den Tagen 6 und 12 signifikante Veränderungen der Zellmorphologie beobachtet. Die meisten Zellen schrumpften allmählich in eine polygonale Form (Abb. 1a) mit einer Abnahme des durchschnittlichen Zelllänge/Breite-Verhältnisses während der chondrogenen Differenzierung (Abb. 1b). Zahlreiche Studien zeigen, dass die Veränderungen der Zellmorphologie mit dem Zytoskelett von Zellen übereinstimmen [21]. Wir fanden auch die Veränderungen des Zytoskeletts während der chondrogenen Differenzierung, was in den letzteren Ergebnissen erklärt wurde.

Merkmale der hADSc-Morphologie während der Chondrogenese. a Morphologische Bilder von ganzen hADSc wurden nach 0, 6 und 12 Tagen der chondrogenen Differenzierung erhalten. Die Bilder wurden durch ein Höhen- und Spitzenkraftfehlerbildmodell von Nanoscope analysiert. b Das durchschnittliche Längen-/Breitenverhältnis der Zellen wurde nach der chondrogenen Differenzierungsbehandlung nach 0, 6 und 12 Tagen gemessen. *p < 0,05, **p < 0.01

Eigenschaften der hADSc-Membranultrastruktur während der chondrogenen Differenzierung. a Veränderungen der Zellmembran-Ultrastruktur wurden nach chondrogener Differenzierung für 0, 6 und 12 Tage bewertet. b Die Oberflächenrauheitsparameter Ra und Rq der Zellen wurden während der chondrogenen Induktion von hADSc für 0, 6 und 12 Tage gemessen

Wie in Abb. 2a gezeigt, änderte sich auch die Ultrastruktur der Zellmembran; Teilchen wurden vergrößert und waren heterogen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Ra und Rq den Rauheitswert bestimmen, um die Veränderung in unterschiedlich behandelten Zellmembranen zu bewerten [22]. Rq ist ungefähr der quadratische Mittelwert der Rauheit, \(\mathrm{Rq}=\sqrt{\frac{\sum_{t-1}^N{\left( Zn-\overline{Z}\right)}^2 }{N-1}}\); \( \mathrm{Rq}=\sqrt{\frac{\sum_{\mathrm{t}-1}^{\mathrm{N}}{\left(\mathrm{Zn}-\overline{\mathrm{Z }}\right)}^2}{\mathrm{N}-1}}; \) Ra ist ungefähr die mittlere Rauheit, \( \mathrm{Ra}=\frac{1}{N}{\sum}_{ t-1}^N1\mid Zi-\overline{Z}\mid\). Um die Rauheit zu erhalten, beträgt die Scangröße 10 μm × 10 μm. Wie in Abb. 2b gezeigt, nahmen sowohl Ra als auch Rq von zwei verschiedenen Bereichen während der Chondrogenese von hADSc zu. Die Ra- und Rq-Werte der Zellen am Tag 0 waren niedrig, was auf eine glatte Oberfläche hindeutet (Abb. 2b). Die Werte für Ra und Rq stiegen gleichzeitig mit der chondrogenen Differenzierung an, was eine größere Heterogenität und rauere Zelloberflächen zeigt (Abb. 2a). Basierend auf den beobachteten Veränderungen führte die chondrogene Differenzierung zu Veränderungen der Zellmorphologie und des Verhältnisses von Zellhöhe/Breite (Abb. 1a, b). Es gibt Studien, die zeigen, dass ECM die Zelladhäsion durch die Regulierung von Integrinen regulieren könnte [11]. Daher deuteten erhöhte Rauheitswerte auf Veränderungen der ECM und der Ultrastruktur der Zellmembran während der Chondrogenese hin. Diese Daten zeigen, dass die chondrogene Differenzierung die Zellmorphologie, die ECM und die Zellmembranstruktur beeinflusst.

Zytoskelettale Veränderungen während der chondrogenen Induktion von hADSc

Während der Stammzelldifferenzierung stehen Veränderungen der Zellmorphologie und der Membranstruktur mit dem Zytoskelett der Zelle in Verbindung, gefolgt von der Entwicklung linienspezifischer zellulärer Eigenschaften [21]. Wie in Abb. 3a gezeigt, zeigen die roten und blauen Fluoreszenzsignale jeweils F-Aktin und DAPI an. Das Zellzytoskelett hat sich während der chondrogenen Induktion in Abb. 3a stark verändert. Einerseits verliefen die Mikrofilamente des Zytoskeletts in der Gruppe von Tag 0 entlang der langen Zellachse, während sich die Mikrofilamente des Zytoskeletts in einer radialen Anordnung ausbreiteten, wenn hADSc 12 Tage lang mit chondrogener Differenzierung behandelt wurde. Andererseits war die Verteilung der Zellmikrofilamente in der Gruppe von Tag 0 homogen, aber die Mikrofilamente waren hauptsächlich an der Peripherie von hADSc verteilt, das 12 Tage lang mit chondrogener Differenzierung behandelt wurde.

Organisation des Zytoskeletts und Lokalisation von Integrin β1 auf chondrogen differenzierendem hADSc. a Veränderungen im Zytoskelett wurden während der Chondrogenese von hADSc durch konfokale Mikroskopie nachgewiesen. b Die Lokalisation von Integrin β1 wurde während der chondrogenen Differenzierung durch konfokale Mikroskopie gemessen. Zytoskelett und Zellkern wurden mit F-Aktin bzw. DAPI gefärbt. Die roten und blauen Fluoreszenzsignale zeigen jeweils F-Aktin und DAPI an

Chondrogene Differenzierung veränderte die Bindungswahrscheinlichkeit von Integrin β1 an Rezeptoren auf hADSc

AFM ist auch ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Bindungskraft zwischen Liganden und ihren Rezeptoren, um die Membran-Rezeptor-Signaltransduktion auf Zelloberflächen deutlich zu machen [23]. Durch AFM werden Veränderungen zwischen Integrin β1 und seinen Rezeptoren auf visuelle, einfache und spezifische Weise gemessen. Die Interaktion des Integrin-β1-Ligand-Rezeptors auf lebenden Zellen ist eine Möglichkeit, den Bindungsprozess an der Zellmembran zu erforschen. Das Verfahren zur Funktionalisierung der AFM-Spitze ist die Kopplung von Integrin β1 an AFM-Spitzen durch Verknüpfung von APTES und Glutaraldehyd. Diese Spitzen wurden zum Nachweis der Bindung von Integrin β1 an CD29-Rezeptoren auf Zelloberflächen verwendet (Fig. 4a). Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) wurde verwendet, um die Verteilung der Anti-Integrin-β1-Trennkraftverteilung in lebenden Zellen innerhalb lokalisierter Regionen einzelner lebender hADSc zu bestimmen (Abb. 4b). Repräsentative Kraftkurven sind in Abb. 4c, d gezeigt, die eine Einzelmolekülkurve (Abb. 4c) und zwei Paare von Bruchpeakkurven (Abb. 4d) darstellen. Blockierungsexperimente und Experimente mit bloßen AFM-Spitzen wurden durchgeführt, um die Spezifität der erhaltenen Kraftkurven zu überprüfen. Blanke AFM-Spitzen erkannten keine spezifische Kraftspitze (Abb. 4e). Blanke AFM-Experimente zeigten, dass die unspezifische Bindungswahrscheinlichkeit der Integrin-β1-Ligand-Rezeptor-Interaktion auf der Oberfläche von hADSc weniger als 1% betrug. Für Blockierungsexperimente wurde der Anti-Integrin-β1-Antikörper mit Zellen für 30 Minuten inkubiert und dann wurden Kraftkurven mit Integrin-β1-funktionalisierten Spitzen aufgezeichnet. Der blockierende Antikörper reduzierte die Kraftkurven um 90 % (Abb. 4f). Es gab keinen Unterschied in der Bindungswahrscheinlichkeit von Integrin-β1-Ligand-Rezeptor auf Zelloberflächen zwischen den drei Gruppen nach Behandlung mit Anti-Integrin-β1-Antikörpern (Abb. 4g). Diese Ergebnisse zeigen, dass Antikörper-modifizierte AFM-Spitzen sehr nützlich waren, um die Kraft zu detektieren, und dass die Integrin-β1-funktionalisierten AFM-Spitzen spezifisch waren.

AFM-Kraftmessungen mit Integrin-β1-funktionalisierter AFM-Spitze an lebendem hADSc. a Schematische Darstellung der Strategie zur Immobilisierung von Integrin β1 auf einer AFM-Spitze. b Schematische Darstellung der Einzelmolekülkraft gemessen zwischen Integrin-β1-funktionalisierten AFM-Spitzen und lebendem hADSc. c, d Repräsentative Kraftkurven mit Integrin-β1-modifizierten AFM-Spitzen auf hADSc und e nachdem das System mit der Lösung des monoklonalen Integrin-β1-Antikörpers blockiert wurde. f Die Bindungswahrscheinlichkeit von Integrin-β1-funktionalisierten Spitzen auf hADSc vor und nach der Blockierung durch den Integrin-β1-Antikörper an Tag 0. g Die Bindungswahrscheinlichkeit von CD29-funktionalisierten Spitzen auf hADSc nach Blockierung durch den Integrin-β1-Antikörper nach 0, 6 und 12 Tagen. ***p < 0,001, n.s.. kein signifikanter Unterschied

Die Bindungskraft (Bruchkraft) ist die Wechselwirkungskraft zwischen Liganden und ihren Rezeptoren [24]. Veränderungen der Morphologie und Oberflächen-Ultrastruktur von Plasmamembranen hängen mit vielen Prozessen der Zellbiologie wie Differenzierung, Apoptose und Zellmigration zusammen. Während der Differenzierung wird angenommen, dass Veränderungen im Zytoskelett mit Veränderungen von Integrinen, insbesondere von Integrin β1, in Zusammenhang stehen. Integrin β1 (CD29) ist sehr wichtig bei der Zelladhäsion an ECM und bei der Zell-Zell-Adhäsion. Es kann auch mit intrazellulären Proteinen interagieren und Signalmoleküle stimulieren, die mit dem Aktin-Zytoskelett verwandt sind [25]. In dieser Studie wurden Veränderungen der Zytoskelett- und Zellmorphologie während der hADSc-Chondrogenese durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und AFM beobachtet. Während der chondrogenen Differenzierung können Veränderungen des Zytoskeletts, der Morphologie und der Oberflächenultrastruktur ein neuer und zuverlässiger Indikator für den Zellzustand sein. Integrin β1, der CD29-Rezeptor, wird über die Zelloberfläche verteilt, wie durch Immunfluoreszenz beurteilt (Abb. 3b). Bindungsstärke und Stabilität von Integrin-β1-Ligand-Rezeptor-Komplexen während der hADSc-Chondrogenese wurden nach 0, 6 und 12 Tagen der Differenzierung bewertet. Pro Tag wurden insgesamt 1200 Kurven mit durchschnittlichen Bruchkräften von 61,8 ± ± 22,2 pN, 60 ± 20,2 pN bzw. 67,2 ± 22,0 pN aufgenommen (Abb. 5a–c). Die Verteilung der Kraftgröße wurde als Kraftmittelwert + . analysiert SD (Abb. 5d). Es gab keinen signifikanten Unterschied im Kraftmittelwert zwischen den Tagen 0 und 6. Es gab einen Unterschied im Kraftmittelwert zwischen den Tagen 0 und 12. Die Stärke der Bindungskraft nahm am Tag 12 zu. Unterdessen Rupturereignisse an den Tagen 0, 6 und 12 waren 19,58 ± 1,74 %, 28,03 ± 2,05 % bzw. 33,4 ± 1,89 % (Abb. 5e). Die erhöhte Bindungswahrscheinlichkeit deutet auch darauf hin, dass Integrin β1 (CD29) eine wichtige Rolle bei der chondrogenen Differenzierung spielt und über Signalwege die Informationen für die chondrogene Differenzierung liefern könnte. Daher können erhöhte Integrin-β1-Nanodomänen während der chondrogenen Differenzierung die Bindungsstärke des CD29-Ligand-Rezeptors an lebendem hADSc grundlegend beeinflussen. Veränderungen der Morphologie und Oberflächenultrastruktur von Plasmamembranen gingen mit Veränderungen der Integrin-β1-Proteinstruktur, Konformation, Bindungsstärke und Stabilität von Integrin-β1-Ligand-Rezeptor-Komplexen auf Zellen einher. Zusammenfassend spielt Integrin β1 eine notwendige Rolle bei der chondrogenen Differenzierung von hADSc.

Bindungskraft und Bindungswahrscheinlichkeit, gemessen an der Oberfläche lebender hADSc durch Integrin-β1-funktionalisierte AFM-Spitzen. a–c Histogramme der Bindungskraft des Integrin-β1-Antikörper-Rezeptors, die während der chondrogenen Differenzierung von hADSc für 0, 6 und 12 Tage erhalten wurden. d Bindungskräfte für Integrin-β1-Rezeptoren wurden nach 0, 6 und 12 Tagen der chondrogenen Differenzierung von hADSc erhalten. e Die Bindungswahrscheinlichkeit des Integrin-β1-Rezeptors wurde während der chondrogenen Differenzierung von hADSc für 0, 6 und 12 Tage nachgewiesen. *p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001, k.A. kein signifikanter Unterschied

Hochregulierung von Integrin β1 während der hADSc-Chondrogen-Differenzierung

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Mitglieder der Integrinfamilie eine wichtige Rolle bei der Zelldifferenzierung spielen. Darüber hinaus können Integrine die Interaktion zwischen der extrazellulären Umgebung und Zellen regulieren und Signaltransduktionswege durch verbundene Proteine ​​steuern [26]. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Bindungswahrscheinlichkeit durch die Dichte und Konformation des Transmembranproteins (Rezeptoren) auf der Zelloberfläche beeinflusst werden kann [27]. Die Integrin-Konformation kann ein geschlossenes Kopfstück mit geringer Affinität zum Liganden oder ein offenes Kopfstück mit hoher Affinität zum Liganden sein [28, 29]. Die Expression von Integrin β1 wurde sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationaler Ebene mit erhöhter Collagen-II-Expression hochreguliert, die für Chondrozyten charakteristisch ist (Fig. 6a, b). Als solche war die hochregulierte Integrin-β1-Expression konsistent mit einer erhöhten Bindungswahrscheinlichkeit ohne Rücksicht auf die Konformation.

The role of integrin β1 and β-catenin/SOX pathway in regulating hADSc chondrogenic differentiation. a Protein integrin β1 was up-regulated during chondrogenesis of hADSc as assessed by western blotting. Cartilage differentiation up-regulated collagen II expression at different days. b The mRNA of integrin β1 was up-regulated during chondrogenic differentiation of hADSc. c Measurement of proteins associated with the β-catenin/SOX pathway during chondrogenic differentiation of hADSc for 0, 6, and 12 days. *p < 0,05, **p  < 0.01

The Role of Integrin β1 in Chondrogenic Differentiation Regulated by the β-catenin/SOX Signaling Pathway

Previous studies have shown Wnt/β-catenin, PI3K, and mTOR signaling pathways to be related to integrin β1 [30,31,32]. Each is important in mesenchymal stem cell differentiation. Likewise, studies have demonstrated SOX and collagen II to be regulated by integrin β1 during chondrogenesis of hADSc. SOX is a hallmark component of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Hence, we hypothesized that chondrogenic differentiation was regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1. SOX, GSK-3β, β-catenin, and integrin β1 were all increased during chondrogenesis of hADSc (Fig. 6c), with integrin β1 inducing cell signaling. These data demonstrate chondrogenic differentiation to be regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1.

Prospective and Limitations

In this work, changes in cellular morphology, the structure of the membrane, and the binding probability of integrin β1 ligand–receptors were demonstrated to be useful image markers to evaluate the chondrogenic differentiation process. This is a new method for evaluation of morphology, membrane ultrastructure, and changes in transmembrane proteins during chondrogenic differentiation. There are limitations to this study. Although increased binding probability was related to the high expression of integrin β1, the conformation of integrin β1 during chondrogenesis was not investigated. Further work is necessary to determine the conformation of integrin β1 during chondrogenic differentiation. Integrin β1 was demonstrated to participate in the β-catenin/SOX signaling pathway during chondrogenesis of hADSc. However, the relationship between integrin β1 and β-catenin/SOX signaling pathway is still not fully established. Further work is necessary to identify the exact role of integrin β1 in this pathway.

Schlussfolgerungen

In the present work, a novel method (AFM) was employed to evaluate chondrogenic induction in hADSc. Cell surface ultrastructural changes were assessed by AFM imaging. AFM was used to investigate the binding force and binding probability between integrin β1 ligand and its receptors on the surface of hADSc by integrin β1-functionalized AFM tips. Based on AFM data, during chondrogenesis, cell morphology was changed from an elongated spindle shape to a polygonal shape with increased cell roughness. By use of integrin β1-functionalized AFM tips, the binding probability and force magnitude of integrin β1 ligand–receptor on the surface of hADSc were found to increase during chondrogenic induction. By immunoblot, integrin β1 was demonstrated to participate in the β-catenin/SOX signaling pathway, which regulated the chondrogenesis of hADSc. Taken together, these results and the established methodology contribute to a better understanding of cell morphology and roughness. Further, the data provide thermodynamic and kinetic insight into the integrin β1 ligand-binding process, at the single-molecule level. This AFM method will be useful for investigation of signaling pathways in living hADSc during chondrogenesis. Changes in the cellular nanostructure, as well as structure of the membrane, and the binding probability of transmembrane proteins are useful markers to evaluate chondrogenic differentiation mechanisms. This AFM method can be used to understand the mechanism of mesenchymal stem cell differentiation in tissue engineering and will be useful for an enhanced understanding of mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation.

Abkürzungen

AFM:

Rasterkraftmikroskopie

CD:

Cluster of differentiation

DAPI:

4′,6-diamidino-2-phenylindole

DMEM:

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

ECM:

Extracellular matrix

F-Aktin:

Filamentöses Aktin

FBS:

Fötales Rinderserum

hADSc:

Human adipose-deprived stem cells

IB:

Immunoblotting analysis

IBMX:

3-isobutyl-1-methylxanthine

IGF-1:

Insulin-like growth factors-1

ITS:

Insulin transferrin selenium

mTOR:

Mammalian target of rapamycin

OA:

Osteoarthritis

PBS:

Phosphate buffer solution

PI3K:

Phosphoinositide 3-kinase

SD:

Standardabweichung

SMFS:

Single-molecule force spectroscopy

TGF-β1:

Transforming growth factor-beta1