SOX2 moduliert den CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-Signalweg zur Kontrolle von Proliferation und Selbsterneuerung zervikaler Krebsstammzellen

Zusammenfassung

Die Rolle von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) im Zervixkarzinom (CC) wurde dargestellt. Wir untersuchen den Effekt von Sex-determinierendes Region Y-Box 2 (SOX2)/lncRNA Colon Cancer-Associated Transcript-1 (CCAT1)/MicroRNA-185-3p (miR-185-3p)/Forkhead Box Protein 3 (FOXP3) auf Proliferation und Selbsterneuerungsfähigkeit von CC-Stammzellen. Expression von miR-185-3p, SOX2, CCAT1 und FOXP3 wurde in CC-Geweben und -Zellen getestet. Der Zusammenhang zwischen SOX2/CCAT1-Expression und klinisch-pathologischen Merkmalen bei CC-Patienten wurde verifiziert. Loss-of-function und Gain-of-function Untersuchungen wurden an CD44⁺HeLa-Zellen durchgeführt, um biologische Funktionen und Selbsterneuerungskapazität zu diskutieren. Schließlich wurden die Beziehungen zwischen SOX2, CCAT1, FOXP3 und miR-185-3p verifiziert. miR-185-3p-Expression war erniedrigt, während SOX2, CCAT1 und FOXP3-Expression in CC-Geweben und -Zellen erhöht waren. SOX2- und CCAT1-Expression korrelierten mit Tumorgröße, Lymphknotenmetastase (LNM) und FIGO-Stadium (International Federation of Gynecology and Obstetrics). Downregulation von SOX2 oder CCAT1 und Upregulation von miR-185-3p resultierten in Inhibition von Proliferation, Invasion, Migration und Zellsphärezahl sowie Apoptosebeschleunigung von CD44⁺HeLa-Zellen. SOX2 konnte an CCAT1 binden, was miR-185-3p-Expression beeinflusste, und FOXP3 wurde von miR-185-3p gezielt.

Einleitung

Zervixkarzinom (CC) ist die vierthäufigste Todesursache bei Frauen weltweit mit geschätzten 570.000 Fällen und 311.000 Todesfällen 2018. Diese komplexe Erkrankung wird durch vielfältige Faktoren beeinflusst, einschließlich genetischer Effekte und viraler Infektion. Durch Entwicklung von Human-Papillomvirus (HPV) Co-Testing und HPV-Impfung führen Früherkennungsverfahren von zervikaler Dysplasie und Krebs zu Reduktion von Inzidenz, Morbidität und Mortalität. Für frühe CC-Patienten wird Chirurgie empfohlen: fertilitätserhaltende Chirurgie, Konisation, radikale Trachelektomie, pelvine Lymphknotendissektion, pelvine Radiotherapie und Brachytherapie. Aufgrund von Metastasen oder Rezidiven bei fortgeschrittenen CC-Patienten bleibt die Prognose schlecht. Daher ist es dringend, neue und effektive prognostische Marker und therapeutische Strategien zur Verbesserung der CC-Behandlung zu identifizieren.

Sex-determinierendes Region Y-Box 2 (SOX2) ist kritisches Mitglied der SOX-Transkriptionsfaktorfamilie, hauptsächlich in embryonalen und adulten Stammzellen exprimiert, auch in Tumorstammzellen. SOX2 moduliert Radio-Resistenz in CC über Hedgehog-Signalweg. Eine Studie zeigte, dass SOX2 entscheidend für Erhaltung der Krebsstammzell-Subpopulation in CC-Zelllinien ist. Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) sind RNA-Moleküle mit >200 Nukleotiden. LncRNA Colon Cancer-Associated Transcript-1 (CCAT1) liegt auf Chromosom 8q24.21 und gilt als "Hotspot" für genetische Mutationen im Kolonkarzinom. CCAT1 beschleunigt Zellproliferation und Invasion in CC. Jia et al.: CCAT1 steigert dramatisch Proliferation, Migration und Invasion von CC-Zellen. Eine Studie zeigte, dass CCAT1 den malignen Grad entzündlicher Darmerkrankungen durch Schädigung der Darmbarriere via Reduktion von miR-185-3p erhöht. miRNAs regulieren Genexpression umgekehrt durch mRNA-Reduktion und Translationssuppression. In-vitro-Experimente zeigten, dass miR-185-3p Radio-Resistenz von Nasopharynxkarzinom moduliert. Eine Studie implizierte miR-185 in Ovarialkarzinom-Cisplatin-Resistenz in vivo und in vitro. Forkhead Box Protein 3 (FOXP3) ist Transkriptionsfaktor der FOX-Proteinfamilie, zuerst in regulatorischen T (Treg) Zellen gefunden, essenziell für Erhaltung und Prozess von Treg-Zellen. FOXP3 korreliert mit Lymphangiogenese von CC. FOXP3-Level dramatisch mit FIGO-Stadium und Tumorgröße von CC verknüpft. In dieser Studie untersuchten wir daher die Effekte der SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-Achse auf Proliferation und Selbsterneuerung von CC-Stammzellen.

Materialien und Methoden

Ethikgenehmigung und Einwilligung

Experimente mit Menschen entsprachen der Deklaration von Helsinki. Studie genehmigt vom Institutional Review Board des Ersten Krankenhauses der Jilin-Universität. Alle Teilnehmer unterschrieben informierte Einwilligung.

Studienobjekte

Dezember 2016 bis Dezember 2018: 39 CC-Gewebe und entsprechende angrenzende Normalgewebe von CC-Patienten, in flüssigem Stickstoff konserviert. Einschlusskriterien: (1) CC bestätigt durch Pathologie von Biopsien in Transzervikal- und Zervikalkanälen, Zervixabstrich-Zytologie, Zervix-Jodtest, Vaginalspekulum und Zervixwirbelresektion. (2) Keine Radio-/Chemotherapie 2 Wochen vor OP. Ausschlusskriterien: (1) Patienten mit Radio-/Chemotherapie, (2) Ablehnung Probenentnahme, (3) Immunsystemstörungen.

Zellauswahl und -kultur

CC-Zelllinien (SiHa, HeLa, CaSki, HCC94, C33A) und humane zervikale epitheliale immortalisierte Zelllinie H8 von Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). SiHa, HeLa, HCC94 in High-Glucose DMEM mit 10 % FBS; CaSki, C33A, H8 in RPMI-1640 mit 10 % FBS (37 °C, 5 % CO₂). Zellen alle 2 Tage passagiert.

CC-Stammzell-Sortierung (CD44⁺HeLa-Zellen)

CC-Stammzellen aus HeLa-Zelllinie durch Zellsuspensionskultur separiert. HeLa-Zellen in serumfreiem IMDM in Ultra-Low-Adhesion-Petrischale 21 Tage, Medium haliquantitativ alle 3-5 Tage ausgetauscht. Einige Zellen bildeten Sphären → HeLa-Sphere-Forming Cells (SFCs). Sphärische Zellen identifiziert und analysiert. Trypsin-Detachment, 1 × 10⁶ Zellen/ml. CD44-Antikörper, Sortierung via Durchflusszytometrie. CD44-positive HeLa = Tumorstammzellen; CD44-negative = Nicht-Stammzellen. CC-Stammzellen in DMEM/F12 mit 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, B27, 1 % Penicillin/Streptomycin.

Zellbehandlung

CD44⁺HeLa-Zellen transfiziert mit: sh-SOX2, sh-SOX2-NC, sh-CCAT1, sh-CCAT1-NC, miR-185-3p-Mimic, Mimic-NC, sh-CCAT1 + miR-185-3p-Inhibitor, sh-CCAT1 + Inhibitor-NC. Oligonukleotide von GenePharma (Shanghai, China). Trypsin-Detachment, 6-Well-Platte, 3 × 10⁶ Zellen/Well. Bei 60 % Konfluenz serumfreies Medium 1 h. Transfektion mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

RT-qPCR

RNA aus Geweben/Zellen mit Trizol (Invitrogen) extrahiert. 1 μg RNA via Moloney Murine Leukemia Virus RTase Kit (Invitrogen) in cDNA. cDNA in Echtzeit-PCR-System. Primer von Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Tabelle 1). U6 = Loading Control für miR-185-3p; GAPDH für SOX2, CCAT1, FOXP3. Analyse via 2^−ΔΔCt-Methode.

Western Blot

Gesamtprotein extrahiert, Konzentration via Bicinchoninsäure-Kits (AmyJet Scientific, Wuhan, China). Protein mit Loading Buffer, 5 min gekocht, Eisbad, Zentrifugation. 10 % SDS-PAGE, Transfer auf Membran. 5 % Magermilch 1 h blockiert, Primärantikörper: SOX2 (1:1000, Jiangsu Rui sitan), FOXP3 (1:1000, Abcam), GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology), Sekundärantikörper HRP-markiert, Konservierungsfolie, Belichtung. Bio-Rad Gel Doc EZ Imager (Bio-Rad, USA) für Entwicklung. Proteinbilder via ImageJ2x analysiert.

CCK-8 Assay

CCK-8 Kits (Beyotime, Shanghai). 1 × 10⁴ Zellen in 96-Well-Platte, Inkubation. 0, 24, 48, 72 h: 10 μl/Well CCK-8, 1 h. OD bei 450 nm mit Multiskan Spectrum Mikroplattenleser. 6 Wells für Mittelwert. Zellwachstumskurve: Zeit als Abszisse, relative Zelllebensfähigkeit als Ordinate. OD = Zellproliferation.

Durchflusszytometrie

1 × 10⁶ Zellen, 1500 rpm zentrifugiert, 200 μl Binding Buffer, 5 μl PI, 5 μl Annexin V-FITC, 400 μl Buffer. Apoptoserate via Durchflusszytometer (BD Biosciences).

Kratztest (Scratch Test)

Transfizierte Zellen detacht, Zellsuspension (1 × 10⁶ Zellen/ml) in 6-Well-Platte, 80-90 % Konfluenz. Quer- und Längskratzer mit 10-μl-steriler Pipettenspitze entlang Lineal. Originalmedium durch Vollmedium ersetzt, Weiterkultur. Migration bei 0 h und 72 h unter Mikroskop beobachtet, gleiche Stelle fotografiert.

Transwell-Assay

Transfizierte Zellen trypsinisiert, 1000 g zentrifugiert, DMEM gespült. Voll hydratisierte Transwell-Kammer in 24-Well-Platte (600 ml 10 % FBS-DMEM/Well). Zellsuspension (5 × 10⁵ Zellen/ml, 200 μl) in obere Kammer (1:8 Matrigel 80 μl), 500 μl 20 % FBS-DMEM in untere Kammer. 24 h Kultur, 500 μl 4 % PFA Fixierung, 0,1 % Kristallviolett Färbung. Obere Kammer-Oberfläche/Rand mit Wattestäbchen abgewischt. 5 zufällige Felder, Zählung unter Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon, Japan).

Sphärenbildungsassay

Zellen in Low-Adsorption 6-Well-Platte mit serumfreiem Suspensionsmedium, 200 Zellen/Well. Nach 2 Wochen Sphärenbildungsrate unter Nikon Eclipse TE2000-S beobachtet. Rate = mittlere Sphärenzahl / ausgesäte Zellen × 100 %.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) Assay

ChIP Kit (Upstate, NY, USA). SOX2 (1:1000, Re-stem Biotech, Jiangsu, China) und normales Kaninchen-IgG (12-370, Millipore, USA) für Immunpräzipitation von vernetzten Protein-DNA-Komplexen. CD44⁺HeLa mit 1 % PFA fixiert, DNA-Protein-Vernetzung. Ultraschall: 200-300 bp Chromatinfragmente. Präzipitierte Chromatin-DNA zurückgewonnen, via RT-qPCR analysiert.

RNA Pull-Down Assay

Biotin-markierte miR-185-3p Wildtyp (WT) und Mutanttyp (MUT) Plasmide (50 nM) in CD44⁺HeLa transfiziert. Nach 48 h: Zelllyse (Ambion, Austin, Texas). 50 ml Lysat portioniert. Restlysat mit M-280 Streptavidin-Beads (Sigma) vorbeschichtet mit RNase-freier Hefe-tRNA (Sigma) inkubiert. 2× kaltes Lysat, 3× Low-Salt-Buffer, 1× High-Salt-Buffer gewaschen. Antagonistisches miR-185-3p-Probe als NC. Gesamt-RNA via Trizol, CCAT1-Level via RT-qPCR.

Dual-Luciferase-Reportergen-Assay

Potentielle Bindungsstellen E1, E2 von SOX2 auf CCAT1-Promotor via https://jaspar.genereg.net/ vorhergesagt. CCAT1-Promotorsequenz mit SOX2/CCAT1-Bindungsstelle E1 synthetisiert; CCAT1 3'UTR WT (E1-WT) und MUT (E1-MUT) Vektoren gebildet. In pmirGLO (Beyotime) kloniert. CCAT1-WT/pmirGLO oder CCAT1-MUT/pmirGLO ko-transfiziert mit sh-SOX2 oder sh-SOX2-NC in CD44⁺HeLa für 2 Tage, Lyse, Luciferase-Aktivität via Takara Detektionssystem (Dalian, China).

Bioinformatik-Website für Bindungsstellen von CCAT1 und miR-185-3p. Verifikation via Dual-Luciferase: CCAT1 3'UTR mit miR-185-3p-Bindungsstelle konstruiert. CCAT1 3'UTR WT und MUT ko-transfiziert mit Mimic-NC und miR-185-3p-Mimics in CD44⁺HeLa für 2 Tage, Lyse, Luciferase via Takara. Gleiche Methode für Target-Beziehung miR-185-3p und FOXP3.

Statistische Analyse

Alle Daten via SPSS 21.0 (IBM Corp.). Messdaten als Mittelwert ± SD. t-Test für Zwei-Gruppen-Diskrepanzen; Einfaktorielle ANOVA mit Tukey's Post-hoc für Mehrgruppen. Kategoriale Variablen via Fisher's Exact Test. p < 0,05 = signifikant.

Ergebnisse

miR-185-3p erniedrigt, SOX2, CCAT1, FOXP3 erhöht in CC-Geweben; SOX2/CCAT1 korrelieren mit Tumorgröße, LNM, FIGO-Stadium

Bei Untersuchung der SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-Achse auf Proliferation und Selbsterneuerung von CC-Stammzellen wurden miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 in CC-Geweben und angrenzenden Normalgeweben via RT-qPCR und Western Blot getestet. Ergebnis (Abb. 1a-c): miR-185-3p reduziert, SOX2, CCAT1, FOXP3 erhöht in CC-Geweben.

Abb. 1: miR-185-3p Expression erniedrigt, SOX2, CCAT1, FOXP3 erhöht in CC-Geweben. a Vergleich SOX2-mRNA, CCAT1, miR-185-3p, FOXP3-mRNA in CC vs. angrenzend normal. b Proteinbänder SOX2 und FOXP3 in CC vs. angrenzend normal. c Vergleich SOX2 und FOXP3 Protein-Expression. *p < 0,05 vs. angrenzend normal. Daten als Mittelwert ± SD, t-Test für Zwei-Gruppen.

Beziehung SOX2/CCAT1-Expression zu klinisch-pathologischen Merkmalen (Tabelle 2). Überexprimierte SOX2 und CCAT1 in CC assoziiert mit Tumorgröße, LNM, FIGO-Stadium → höhere Expression bei größeren Tumoren, LNM, fortgeschrittenem FIGO.

miR-185-3p reduziert, SOX2, CCAT1, FOXP3 erhöht in CD44⁺HeLa-Zellen

miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 in H8 und CC-Zelllinien (SiHa, CaSki, HeLa, HCC94, C33A) getestet. Ergebnis (Abb. 2a-c): miR-185-3p degradiert, SOX2, CCAT1, FOXP3 erhöht in CC-Zelllinien. HeLa-Zellen zeigten größten Expressionsunterschied zu H8 → ausgewählt und sortiert. HeLa-SFCs via Suspensionskultur, CD44-Expression vor/nach Sortierung via Durchflusszytometrie identifiziert. Ergebnis (Abb. 2d): CD44-Positivrate in HeLa-SFCs markant höher vs. vor Sortierung → erfolgreiche CC-Stammzellsortierung. Sortierte Stammzellen = CD44⁺HeLa. Dann Expression in HeLa vs. CD44⁺HeLa (Abb. 2e-g): SOX2, CCAT1, FOXP3 upreguliert, miR-185-3p downreguliert in CD44⁺HeLa.

Abb. 2: miR-185-3p reduziert, SOX2, CCAT1, FOXP3 erhöht in CD44⁺HeLa. a Vergleich SOX2-mRNA, CCAT1, miR-185-3p, FOXP3-mRNA in H8 und CC-Zelllinien. b Proteinbänder SOX2, FOXP3 in H8 und CC-Zelllinien. c Vergleich SOX2, FOXP3 Protein in H8 und CC-Zelllinien. d CD44-Expressionsrate HeLa vor/nach Sortierung (Durchflusszytometrie). e Vergleich SOX2-mRNA, CCAT1, miR-185-3p in HeLa vs. CD44⁺HeLa. f SOX2-Proteinband HeLa vs. CD44⁺HeLa. g Vergleich SOX2-Protein HeLa vs. CD44⁺HeLa. ^p < 0,05 vs. H8; &p < 0,05 vs. HeLa. Daten als Mittelwert ± SD, t-Test (Zwei-Gruppen), ANOVA + Tukey (Mehrgruppen).

Downregulation von SOX2 und CCAT1 verringert Proliferation, Migration, Invasion, Sphärenbildung und erhöht Apoptose in CD44⁺HeLa

SOX2 und CCAT1 in CD44⁺HeLa stillgelegt, um Effekte auf Proliferation und Selbsterneuerung von CC-Stammzellen zu erforschen. Via CCK-8, Durchflusszytometrie, Kratztest, Transwell, Sphärenbildung: Proliferation, Migration, Invasion, Sphärenbildungsrate unterdrückt, Apoptose gefördert durch SOX2- und CCAT1-Inhibition (Abb. 3a-i). Zeigt: SOX2- oder CCAT1-Silencing inhibiert Proliferation und Selbsterneuerung von CC-Stammzellen.

Abb. 3: Downregulation von SOX2/CCAT1 verringert Proliferation, Migration, Invasion, Sphärenbildung, erhöht Apoptose. a CCK-8 Zellwachstumskurve sh-CCAT1/sh-SOX2. b Durchflusszytometrie Apoptose sh-CCAT1/sh-SOX2. c Apoptoserate Vergleich. d Migration Kratztest. e Migration Vergleich. f Invasion Transwell. g Invasion Vergleich. h Sphärenbildung Selbsterneuerung. i Sphärenbildungsrate Vergleich. a p < 0,05 vs. sh-SOX2-NC; b p < 0,05 vs. sh-CCAT1-NC. Daten als Mittelwert ± SD, ANOVA + Tukey.

Depletiertes miR-185-3p kehrt Rolle der CCAT1-Downregulation in CD44⁺HeLa um

Untersuchung, ob miR-185-3p am Prozess von CCAT1-Regulation von Proliferation/Selbsterneuerung beteiligt. CD44⁺HeLa transfiziert mit miR-185-3p-Mimic oder ko-transfiziert sh-CCAT1 + miR-185-3p-Inhibitor. Ergebnis: Upregulation von miR-185-3p reduzierte signifikant Proliferation, Migration, Invasion, Sphärenbildungsrate, erhöhte Apoptose. miR-185-3p-Inhibitor kehrte Rolle der downregulierten CCAT1 in Proliferation, Migration, Invasion, Apoptose, Sphärenbildung um (Abb. 4a-i).

Abb. 4: Überexprimiertes miR-185-3p unterdrückt Proliferation, Migration, Invasion, Sphärenbildung, erhöht Apoptose. a CCK-8 Wachstumskurve miR-185-3p-Mimic. b Durchflusszytometrie Apoptose miR-185-3p-Mimic. c Apoptoserate Vergleich. d Migration Kratztest. e Migration Vergleich. f Invasion Transwell. g Invasion Vergleich. h Sphärenbildung Selbsterneuerung. i Sphärenbildungsrate Vergleich. a p < 0,05 vs. sh-SOX2-NC; b p < 0,05 vs. sh-CCAT1-NC; c p < 0,05 vs. Mimic-NC; d p < 0,05 vs. sh-CCAT1+Inhibitor-NC. Daten als Mittelwert ± SD, ANOVA + Tukey.

Niedrig exprimierte SOX2 und CCAT1 erniedrigen FOXP3 und erhöhen miR-185-3p in CD44⁺HeLa

SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-Expression in CD44⁺HeLa nach Transfektion sh-SOX2, sh-CCAT1, miR-185-3p-Mimic, ko-transfektion sh-CCAT1 + miR-185-3p-Inhibitor untersucht. Ergebnis (Abb. 5a-d): sh-SOX2 → SOX2, CCAT1, FOXP3 ↓, miR-185-3p ↑. sh-CCAT1 → CCAT1, FOXP3 ↓, miR-185-3p ↑. miR-185-3p-Mimic → miR-185-3p ↑, FOXP3 ↓. sh-CCAT1 + miR-185-3p-Inhibitor → FOXP3 ↑, miR-185-3p ↓.

Abb. 5: Niedrig exprimierte SOX2/CCAT1 erniedrigen FOXP3, erhöhen miR-185-3p. a Expression sh-SOX2-NC vs. sh-SOX2. b Expression sh-CCAT1-NC vs. sh-CCAT1. c Expression Mimic-NC vs. miR-185-3p-Mimic. d Expression sh-CCAT1+Inhibitor-NC vs. sh-CCAT1+miR-185-3p-Inhibitor. a p < 0,05 vs. sh-SOX2-NC; b p < 0,05 vs. sh-CCAT1-NC; c p < 0,05 vs. Mimic-NC; d p < 0,05 vs. sh-CCAT1+Inhibitor-NC. Daten als Mittelwert ± SD, ANOVA + Tukey.

SOX2 bindet an CCAT1, beeinflusst miR-185-3p; FOXP3 ist Target-Gen von miR-185-3p

Potentielle Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren im CCAT1-Promotor via https://jaspar.genereg.net/ vorhergesagt: SOX2 und CCAT1 haben potentielle Bindungsstellen im CCAT1-Promotor (Abb. 6a). ChIP-qPCR (Abb. 6b): Im Vergleich zu IgG-Gruppe mehr CCAT1-Promotor-Fragmente in SOX2-Gruppe an E1-Bindungsstelle angereichert → SOX2 bindet an CCAT1-Promotor an E1, reguliert CCAT1. Dual-Luciferase (Abb. 6c): Luciferase-Aktivität unterdrückt in Zellen ko-transfiziert mit sh-SOX2 und E1-WT → SOX2 bindet an CCAT1.

Abb. 6: SOX2 bindet CCAT1, beeinflusst miR-185-3p; FOXP3 Target von miR-185-3p. a Bindungsstellen-Vorhersage SOX2/CCAT1-Promotor (Bioinformatik). b ChIP-qPCR Verifikation SOX2-CCAT1-Bindung. c Dual-Luciferase Verifikation SOX2-CCAT1-Bindungsstelle. d Bindungsstellen-Vorhersage CCAT1/miR-185-3p. e Dual-Luciferase Verifikation CCAT1/miR-185-3p-Bindung. f RNA Pull-Down Verifikation CCAT1/miR-185-3p in Zellen. g Target-Vorhersage miR-185-3p/FOXP3. h Dual-Luciferase Identifikation miR-185-3p/FOXP3-Targeting. Daten als Mittelwert ± SD, t-Test (Zwei-Gruppen).

Jefferson-Website sagte CCAT1-miR-185-3p-Bindung voraus (Abb. 6d). Dual-Luciferase (Abb. 6e): Luciferase-Aktivität verringert in Zellen mit miR-185-3p-Mimic + CCAT1-WT → miR-185-3p bindet CCAT1. RNA Pull-Down (Abb. 6f): CCAT1-Anreicherung in Bio-miR-185-3p-WT-Zellen markant erhöht; Bio-miR-185-3p-MUT keine signifikante Differenz → CCAT1 adsorbiert miR-185-3p, beeinflusst dessen Expression.

Target-Beziehung miR-185-3p/FOXP3 via Jefferson vorhergesagt (Abb. 6g). Dual-Luciferase (Abb. 6h): Relative Luciferase-Aktivität dramatisch reduziert nach FOXP3-WT + miR-185-3p-Mimic Ko-Transfektion in CD44⁺HeLa; FOXP3-MUT + miR-185-3p-Mimic keine Auswirkung → miR-185-3p targetet FOXP3.

Diskussion

CC ist vierthäufigste Malignität bei Frauen weltweit nach Brust-, Darm- und Lungenkrebs. CC-Zellen mit positiver SOX2-Expression zeigen Krebsstammzell-Merkmale. CCAT1 essentielles onkogenes lncRNA in CC, fördert CC-Zellwachstum und Invasion. CCAT1 Expression markant erhöht in CC-Geweben vs. angrenzend normal. CCAT1-Überexpression in CC positiv mit Tumorgröße korreliert. CCAT1 beschleunigt CC-Zellproliferation, Koloniebildung, Invasion. Knockdown von CCAT1 reduziert Zelllebensfähigkeit, invasive/migratorische Fähigkeiten. Funktionelle Effekte von SOX2/CCAT1 in anderen Krebsarten ähnlich wie in CC.

Unsere Studie: CCAT1 bindet miR-185-3p; downregulierte CCAT1 und überexprimiertes miR-185-3p unterdrückten Proliferation und Selbsterneuerung von CC-Stammzellen. CCAT1 und miR-185-3p negativ korreliert. Reduktion von miR-185-3p in radio-resistenten Nasopharynxkarzinom-Fällen. Upregulation von miR-185-3p unterdrückt invasive/metastatische Eigenschaften von Nasopharynxkarzinom. Zou et al.: Wiederhergestelltes miR-185 reprimiert Brustkrebs-Wachstum/Invasion. miR-185-Upregulation reduziert Proliferation, Invasion, Koloniebildung in NSCLC in vitro. In vitro/vivo: miR-185-Überexpression unterdrückt Proliferation, Invasion, Migration, Tumorwachstum in NSCLC. Anti-Tumor-Rolle von miR-185-3p konsistent mit Vorarbeiten.

miR-185-3p targetet FOXP3, onkogenes Gen in CC, reguliert CC-Stammzell-Aktivitäten. FOXP3, Regulator von SOX2 Krebsstammzell-Marker in Kolonkarzinom, in CC upreguliert. Erhöhtes FOXP3 fördert Tumorsphärenbildung und stimuliert Stammzelleigenschaften in NSCLC.

Fazit

Zusammenfassend haben wir erstmals gezeigt, dass SOX2-Transkription CCAT1 aktiviert, wodurch miR-185-3p inhibiert und FOXP3 reguliert wird, um Proliferation und Selbsterneuerung von CC-Stammzellen zu fördern – ein potenzieller therapeutischer Ansatz für CC. Allerdings bestehen Limitationen: relativ kleine Stichprobengröße. Klinische Studien könnten die Wirksamkeit für CC-Behandlung weiter prüfen.