Preußisch-Blau-Nanopartikel-markierte mesenchymale Stammzellen:Bewertung von Zelllebensfähigkeit, Proliferation, Migration, Differenzierung, Zytoskelett und Proteinexpression in vitro

Hintergrund

Mesenchymale Stammzellen, eine Art adulter Stammzellen, besitzen ein entzündungshemmendes, regeneratives Potenzial und können in verletztes Gewebe einwandern, um die Wiederherstellung geschädigter Funktionen zu unterstützen [1]. Sie können sich unter der spezifischen Mikroumgebung in mehrere Zelltypen differenzieren und können leicht aus adultem und fetalem Gewebe gewonnen werden [2]. So wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) aufgrund dieser hervorragenden Eigenschaften in der regenerativen Medizin und onkologischen Therapie als vielversprechendes Werkzeug eingesetzt [3, 4]. Das Schicksal von MSCs nach der Transplantation in den Körper bleibt jedoch unklar, und ein nicht-invasives MSC-Tracking ist in vivo erforderlich, um die Effizienz der Transplantation und ihr Schicksal, ihre Eigenschaften und ihre Lokalisation zu bewerten [5]. Kürzlich wurde die Magnetresonanztomographie (MRT) als wirksame Technologie weit verbreitet, um die strukturellen und funktionellen Informationen mesenchymaler Stammzellen in vitro und in vivo zu untersuchen [6].

In den letzten Jahren wurden mehrere Nanopartikel zur Markierung von MSCs als vielversprechendes Werkzeug für die nicht-invasive Bildgebung von Zellen verwendet, um ihre Verteilung und ihr Schicksal in vivo und in vitro zu erfassen und sogar zur Behandlung von Tumoren verwendet [7]. Beispielsweise werden superparamagnetische Eisenoxid (SPIO)-Nanopartikel und Quantenpunkte (QDs) seit vielen Jahren zur Markierung von Zellen verwendet [8, 9]. Und fluoreszierende magnetische Nanopartikel (FMNPs) wurden zur Markierung von MSCs verwendet, um die gezielte Bildgebung und synergistische Therapie von Magenkrebszellen in vivo zu realisieren [10]. Für diese neuartigen Markierungen ist eine sorgfältige und vollständige Analyse der Zelltoxizität erforderlich, da alles eine toxische Dosis hat und die nachgeschaltete Zellfunktion stören kann [11]. Zum Beispiel wurden die MRT-Kontrast-Eisenoxid-Nanopartikel der Bildung von ROS zugeschrieben und können den Zelltod verursachen [12].

Kürzlich wurde für Preußisch-Blau-Nanopartikel (PBNPs) gezeigt, dass sie das Potenzial haben, ein MRT-Kontrastmittel zu sein [13,14,15]. Preußischblau gilt als praktisches, wirtschaftliches, sicheres und umweltfreundliches Medikament und wurde von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) in der Klinik zur Therapie der radioaktiven Belastung zugelassen. Wichtig ist, dass die PBNPs sowohl in Wasser als auch in biologisch nachahmenden Umgebungen wie Blutserum hoch dispergierbar und stabil waren, ohne dass innerhalb von 1 Woche eine Aggregation auftrat [16] und eine gute photothermische Stabilität aufwiesen, die die PBNPs bei praktischen Anwendungen wiederverwenden konnte [17]. Liang et al. [13] demonstrierten erstmals, dass PBNPs mit starker Absorption im NIR-Bereich als hervorragendes Kontrastmittel zur Verbesserung der photoakustischen Bildgebung verwendet werden können. PBNPs mit einheitlicher Größe und guter kolloidaler Stabilität können auf einfache Weise aus kostengünstigen chemischen Mitteln hergestellt werden.

Die PBNPs wurden zur Markierung einiger Tumorzellen als MRT-Agens in der Forschung verwendet [18], aber es wurden nur wenige Studien über die Anwendung von PBNPs in den MSCs berichtet. Hier berichten wir, dass PBNP-markierte mesenchymale Stammzellen in vitro normale Zelllebensfähigkeit, Proliferation, Migration, Zytoskelett, Differenzierung und Proteinexpression zeigten. Es sind weitere Arbeiten erforderlich, wenn dies in vivo Realität ist und um sicherzustellen, dass die gezielte intraläsionale Abgabe von PBNP-markierten MSCs so wichtig ist, wie dies bei der Zellverfolgung vermutet wird.

Methoden

Zellkultur

Maus-MSCs C3H10T1/2 wurden von Nanjing KeyGen Biotech erhalten. Inc. Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM; Hyclone, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Israel) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Hyclone, USA) bei 37 °C mit 5 % CO₂ Sättigung und das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt. Nach vier Passagen wurden die Zellen für Experimente verwendet.

Vorbereitung von PBNPs

Bei einer typischen Synthese wurden zunächst 2,5 mmol Zitronensäure (490 mg) zu 20 ml 1,0 mM wässrigem FeCl₃ . gegeben Lösung unter Rühren bei 60 °C. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise 20 ml 1,0 mM wässriges K₄ . gegeben [Fe(CN)₆ ] Lösung mit 0,5 mmol Citronensäure (98 mg) bei 60 °C. Es bildete sich sofort eine klare hellblaue Dispersion. Nach 30 Minuten ließ man die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, wobei das Rühren weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt wurde. Dann wurde der Dispersion ein gleiches Volumen Ethylalkohol zugesetzt und 20 min bei 10.000 U/min zentrifugiert, um ein Pellet aus Nanopartikeln zu bilden. Letzteres wurde durch Zugabe des gleichen Volumens Ethylalkohol und Zentrifugation wieder abgetrennt.

Charakterisierung von PBNPs

Die Infrarotspektroskopie der synthetisierten PBNPs wurde mit einem Infrarotspektrophotometer (IR; Thermo Fisher Nicolet IS10) gemessen. Die Morphologie der synthetisierten PBNPs wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; JEM 2100F) untersucht. Die feldabhängige Magnetisierung von PBNPs wurde mit einem Vibrationsprobenmagnetometer (VSM; Lakeshore 7307) untersucht. Eine Röntgenbeugungsanalyse (XRD) wurde unter Verwendung von Bruker D8 ADVANCE A25X (XRD) durchgeführt. Der Polydispersitätsindex der PBNPs wurde mit Zetasizer Nano ZS bestimmt.

Intrazelluläre Verteilung von PBNPs und Ultrastruktur markierter C3H10T1/2-Zellen

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde durchgeführt, um die intrazelluläre Verteilung von PBNPs zu beurteilen. Nachdem das Medium entfernt worden war, wurden die Zellen mit PBS gespült und dann mit 0,25% Trypsin verdaut. Dann wurden die Zellen zum Zentrifugieren (2000 U/min, 5 min) in ein 1,5-ml-EP-Röhrchen überführt. Dann wurde der Überstand entfernt und die Zellen wurden mit 0,25% Glutaraldehyd und 1% Osmiumsäure fixiert. Nachdem die Zellen erneut gespült wurden, wurden die Zellen jeweils 20 Minuten lang in 50 % Ethanol, 70 % Ethanol, 90 % Ethanol, 90 % Aceton und 100 % Aceton dehydratisiert. Dann wurden die Zellen über Nacht bei 4 °C eingebettet. Dann wurde eine 3% Uranacetat-Citrat-Doppelfärbung in Schnitten durchgeführt. Schließlich wurden Bilder von TEM gesammelt.

Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurde durchgeführt, um die Ultrastruktur von markierten C3H10T1/2-Zellen zu beurteilen. Nachdem das Medium entfernt wurde, wurden die Zellen mit PBS gespült und mit 3% Glutaraldehyd fixiert, wobei 4 °C über Nacht vorgekühlt wurden. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gespült und 1 h mit 1 % Osminsäure bei 4 °C fixiert. Nachdem die C3H10T1/2-Zellen erneut gespült wurden, wurden die Zellen in aufsteigenden Alkoholen (30 % Ethanol, 50 % Ethanol, 70 % Ethanol, 80 % Ethanol, 90 % Ethanol, 95 % Ethanol und 100 % Ethanol) für 2 × . dehydratisiert jeweils 10 Minuten. Dann wurden die Zellen jeweils 15 Minuten lang in 70 %, 80 %, 90 %, 95 % und 100 % Acetonitrillösung eingetaucht. Dann wurden Vakuumtrocknung und Sprühbeschichtung von Gold durchgeführt. Schließlich wurden Bilder von SEM gesammelt.

Zelllebensfähigkeitsanalysen der PBNPs

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des MTT (Sigma, USA) bewertet. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten bei 1 × 10 ³ . ausgesät Zellen pro Well bei 37 °C mit 5 % CO₂ Atmosphäre. Nach der Inkubation über Nacht wurde das Kulturmedium durch 100 μl frisches Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen von PBNPs (0, 5, 10, 20, 40 und 80 μg/ml) ersetzt, und dann wurden die Zellen für weitere 1 bis 3 Tage kultiviert. Das Kulturmedium wurde entfernt und die Zellen wurden mit 20 μL MTT (5 mg/ml) bei 37 °C 4 h lang inkubiert. Die ausgefallenen violetten Farbstoffkristalle wurden in 150 μL Dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich, USA) 10 min lang durch leichtes Schütteln gelöst. Der Wert der optischen Dichte (OD) wurde bei einer Wellenlänge von 490 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts gemessen. Die Ergebnisse der Zellen wurden als Prozent lebensfähige Zellen ausgedrückt.

Proliferations-Assay

Vergleich mit MTT, MTS, WST-1 und XTT, RTCA erlaubt die Analyse des gesamten Experimentzeitraums und erfordert keine Markierung, die Zellkulturexperimente negativ beeinflusst [19]. Daher wurde das xCELLigence-System (Roche/ACEA Biosciences) verwendet, um die Zellproliferation in Echtzeit zu messen. Kurz gesagt, Zellen wurden in E-Plate-16 (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, USA) bei 5 × 10 ³ . ausgesät Zellen pro Well mit 150 μl Komplettmedium. Nach 24 h Wachstum wurde das Medium durch frisches Medium mit verschiedenen Konzentrationen von PBNPs ersetzt und weitere 96 h inkubiert. Dieses System maß die elektrische Impedanz, die durch die Zellanhaftung auf den Mikroelektroden-integrierten Zellkulturplatten erzeugt wurde [20], um die quantitativen Informationen über die Zellzahl und Lebensfähigkeit in Echtzeit durch das RTCA-DP-Instrument bereitzustellen [21]. Die Zellproliferation wurde in den folgenden 4 Tagen regelmäßig alle 15 Minuten gemessen.

Echtzeitüberwachung der Zellmigration

Die C3H10T1/2-Zellmigration wurde unter Verwendung eines Echtzeit-Zellinvasions- und -migrations-(RT-CIM)-Testsystems (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, USA) gemessen. Zellen haben die Fähigkeit, die Impedanz zu erhöhen, um so „Zellindex“-Auslesungen zu erzeugen, wenn sie die Sensoren berühren und an ihnen aufgrund der Zellmigration von der oberen Kammer in die untere Kammer durch die Membran haften. Einfach gesagt, Zellen wurden in der oberen Kammer mit einer Dichte von 4 × 10 ⁴ . ausgesät pro Vertiefung in serumfreiem Medium in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von PBNPs. Die unteren Kammern von CIM-Platten wurden mit 165 μL Komplettmedium mit 10 % FBS gefüllt. Die Zellmigration wurde mit dem RTCA DP-Instrument alle 10 Minuten über einen Zeitraum von 100 Stunden überwacht. Der Zellindex (CI) wurde verwendet, um die Ergebnisse widerzuspiegeln. Der Wert von CI wurde aus der Änderung der elektrischen Impedanz abgeleitet, wenn die lebenden Zellen mit der biokompatiblen Mikroelektrodenoberfläche in der Mikroplattenvertiefung interagieren, um die Zellzahl, Form und Adhärenz effektiv zu messen. Je mehr migrierte Zellen, desto größer der Zellindex.

Untersuchung der zellulären Migration mittels Transwell-Assay

Nach 48 stündiger Kultivierung mit unterschiedlichen PBNP-Konzentrationen werden die Zellen mit einer Dichte von 2 × 10 ⁶ Zelle/cm ² wurden in einer Transwell-Kammer (8 μm Porengröße; BD FalconTM, USA) für 24 h bei 37 °C und 5 % CO₂ . kultiviert . Nach der Kultivierung wurde die Innenkammer gereinigt und die gewanderten Zellen am Boden der Kammer wurden fixiert und mit 0,1% Kristallviolett gefärbt. Auf jeden Schritt folgte dreimaliges Waschen mit PBS für 5 Minuten. Die migrierten Zellen wurden in verschiedenen Sichtfeldern unter Verwendung eines inversen Phasenkontrastmikroskops (CK2, Olympus, Japan) fotografiert.

In-vitro-Zelldifferenzierung

C3H10T1/2-Zell-markierte oder unmarkierte PBNPs wurden induziert, sich in zwei nachgeschaltete Zelllinien von Adipozyten oder Osteozyten zu differenzieren. Nachdem die Zellen in einer Sechs-Well-Platte die Konfluenz erreicht hatten, wurden die Zellen in osteogenem Induktionsmedium (10 % FBS/DMEM mit 10 nM Dexamethason, 50 μM Ascorbinsäure, 10 mM β-Glycerophosphat, Sigma) oder adipogenem Induktionsmedium (10 %) kultiviert. FBS/DMEM mit 1 μM Dexamethason, 0,5 mM Isobutylmethylxanthin, 10 μM Insulin, Sigma). Nach 3 Wochen wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit 4% Polyoxymethylen fixiert und mit Alizarin Red oder Oil Red O (Sigma) gefärbt. Die induzierten Zellen wurden bei verschiedenen Sichtfeldern unter Verwendung eines inversen Phasenkontrastmikroskops (CK2, Olympus, Japan) fotografiert.

Immunfluoreszenz-Assay zur F-Aktin-Visualisierung

MSCs wurden mit verschiedenen Konzentrationen von PBNPs auf einer 24-Well-Platte für 48 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden 10 min mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, 5 min mit 0,2 % Triton-100 permeabilisiert, 30 min bei Raumtemperatur mit 1 % BSA in PBS blockiert und dann mit Phalloidin kultiviert (1:100, Thermo Fisher Scientific .). , USA) und DAPI (1:800, Thermo Fisher Scientific, USA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Fluoreszenzmikroskopie wurde auf einem Nikon Eclipse Ti-S Mikroskop mit NIS Elements Software durchgeführt

Proteinexpression durch Western-Blot-Analyse

Die Proteinexpression der Zellen wurde mittels Western-Blot-Analyse ausgewertet. Die MSCs wurden mit dem Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen von PBNPs (0, 25, 50 μg/ml) auf Sechs-Well-Platten für 24 h kultiviert, zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in 100 μl PIPA-Puffer (Beyotime) mit . abgekratzt Proteasehemmer und Natriumorthovanadat (Beyotime, China). Nach 30 Minuten wurden die Proben bei 14.000 U/min für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, dann wurden die Proteinkonzentrationen der Proben mit dem BCA-Kit (Beyotime, China) bestimmt. Die gleiche Menge an Proteinen wurde in 10 % SDS-PAGE-Gelen (Beyotime, China) elektrophoretisiert und auf eine PVDF-Membran (GE Healthcare) übertragen. Die Membranen wurden mit 5% Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween20 (TBST) bei Raumtemperatur für 2 h blockiert und dann mit Anti-β-Catenin (1:1000, CST, USA), Anti-Vimentin (1:1000 .) inkubiert , Abiocode) und Anti-β-Actin (1:1000, CST, USA) über Nacht bei 4 °C. Die Membranen wurden dreimal für jeweils 5 Minuten gewaschen und dann mit den entsprechenden Sekundärantikörpern 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Signale wurden mit ECL und ECL-plus (Beyotime, China) detektiert und dem Molecular Image® ChemiDoc™ XRS+ System (Bio-Rad Inc., USA) mit Image Lab™ Software unter Verwendung verbesserter Chemilumineszenz ausgesetzt.

Zelluläre Bildgebungsuntersuchung der zellulären Markierungseffizienz mittels MRT

MSCs wurden mit verschiedenen Konzentrationen (25 und 50 μg/ml) von PBNPs behandelt, und die Kontrollzellen wurden mit fertigem Medium ohne PBNPs für 48 h kultiviert, dreimal mit PBS-Puffer gewaschen, trypsiniert, gesammelt und dann in 1 ml 1 . eingebettet % (w /v ) Agaroselösung für bildgebende Untersuchungen. Darüber hinaus wurden die mit 50 μg/ml PBNPs markierten MSCs 14 Tage lang zur osteogenen Differenzierung induziert und dann auf die MRT-Signalwirkung untersucht. Die T2-gewichtete Bildgebung wurde mit einer Inversion Recovery Gradientenechosequenz mit TE = 23 ms, TR = 400 ms, NEX = 2.0, einer Schichtdicke von 2 cm, einem FOV von 20 × 20 cm und einer Matrixgröße von 384 × . durchgeführt 256.

Statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden als Mittelwert  ± SD von mindestens drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Die Behandlungsgruppen wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und Student's t . verglichen Test verwendet wurde. p < 0,05 wurde als signifikanter Unterschied akzeptiert.

Ergebnisse und Diskussion

PBNP-Charakterisierung

Zur Charakterisierung der PBNPs (Abb. 1a) mit einem Durchmesser von 20–25 nm wurde eine Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) durchgeführt. Für die Morphologie zeigten die PBNPs eine quaderförmige Struktur. Abbildung 1b zeigt die Infrarotspektroskopie der synthetisierten PBNPs. Die PBNPs zeigten einen typischen Absorptionspeak von Fe ³⁺ -CN um 2085,23 nm, was mit dem von PBNPs übereinstimmt. Feldabhängige Magnetisierungsmessungen wurden außerdem verwendet, um die magnetischen Eigenschaften der PBNPs zu untersuchen. Abbildung 1c zeigt Magnetisierungskurven der PBNPs bei Raumtemperatur, die den Superparamagnetismus der PBNPs demonstrieren. Abbildung 1d zeigt die Beugungspeaks bei 200, 220, 400 und 420, die mit dem XRD-Muster von PBNPs bestätigt wurden. Darüber hinaus betrug der Polydispersitätsindex von PBNPs 0,16, was auf eine einheitliche Partikelgrößenverteilung hinweist.

PBNP-Charakterisierung. a Morphologie der PBNPs. b UV-Vis-Absorptionsspektren der PBNPs. c Feldabhängige Magnetisierung von PBNPs. d XRD-Muster von PBNPs

Zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität von PBNPs

Um die zelluläre Aufnahme der PBNPs in MSCs weiter zu bestätigen, wurde die zelluläre Mikromorphologie der obigen C3H10T1/2-Zellen, die mit und ohne PBNPs behandelt wurden, untersucht. Abbildung 2 zeigt SEM- und TEM-Bilder von C3H10T1/2-Zellen nach der Inkubation für 48 Stunden mit und ohne PBNPs. Aus den SEM-Bildern zeigte die Ultrastruktur der markierten C3H10T1/2-Zellen im Vergleich zu den Kontroll-C3H10T1/2-Zellen keine offensichtlichen Veränderungen. Aus den TEM-Bildern zeigten die Kontroll-C3H10T1/2-Zellen ohne die Inkubation mit den PBNPs eine typische zelluläre Mikromorphologie mit offensichtlichen zellulären Mikrostrukturen. Nach Inkubation mit den PBNPs wurde jedoch eindeutig eine zufällige Verteilung der PBNPs im Zytoplasma der C3H10T1/2-Zellen beobachtet. Und einige PBNPs schienen in Vesikel im Zytoplasma der Zellen lokalisiert zu sein. Obwohl die zufällige Verteilung der PBNPs im Zytoplasma der C3H10T1/2-Zellen beobachtet wurde, war der genaue Mechanismus der intrazellulären Aufnahme unklar. Wir schlagen vor, dass die Internalisierung der PBNPs in C3H10T1/2-Zellen über einen ähnlichen Mechanismus erfolgen könnte, wie in der vorherigen Studie gezeigt wurde, die berichtet hatte, dass verschiedene anorganische Nanopartikel, einschließlich Preußischblau-Poly(l-lysin), Gold, Silber und Metalloxide, leicht durch Endozytose von Zellen aufgenommen werden [15, 22, 23].

SEM- und TEM-Bilder der C3H10T1/2-Zellen nach der Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen von PBNPs für 48 h. a REM-Bilder. b TEM-Bilder. ↑, intrazellulär verteilte PBNPs

Um die Zytotoxizität und den Zelllebensfähigkeitstest in MSCs zu bewerten, wurde die MTT-Methode durchgeführt. Die Zellen wurden 1 bis 3 Tage bei 37 °C unter 5 % CO₂ . inkubiert mit verschiedenen Konzentrationen von PBNPs, die in DMEM suspendiert sind. Drei unabhängige Studien wurden durchgeführt und die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden angegeben. Abbildung 3 zeigt, dass die Lebensfähigkeit von MSCs, die mit PBNPs (5, 10, 20, 40, 80 μg/ml) behandelt wurden, nach 24 bis 72 Stunden relativ zu den Kontrollzellen war. Die Ergebnisse zeigten, dass die PBNPs für Zellen, die mit der gleichen Menge an PBNPs wie MTT behandelt wurden, nicht toxisch waren. Darüber hinaus wurde ein Echtzeit-Proliferationsassay mit dem xCELLigence-Instrument verwendet, um die Wachstumskurven von MSCs zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Wachstumskurven von MSCs durch diese Konzentrationen von PBNPs nicht signifikant beeinflusst wurden (Abb. 4a), und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde gezählt und in Abb. 4b nach Behandlung in 24, 48, 72 und 96 h gezeigt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PBNPs keinen Einfluss auf die Proliferation von MSCs haben.

Die Lebensfähigkeit von C3H10T1/2-Zellen in Gegenwart verschiedener Mengen an PBNPs, bestimmt durch die MTT-Methode

Die Proliferation von C3H10T1/2-Zellen in Gegenwart verschiedener Mengen an PBNPs, bestimmt durch RT-CIM-Assay. a Die Wachstumskurven von C3H10T1/2-Zellen. b Die Zelllebensfähigkeit von C3H10T1/2-Zellen nach der Behandlung in 24, 48, 72 und 96 h

Zellenmigrationsfähigkeit

Die Migration von MSCs, die mit verschiedenen Konzentrationen von PBNPs behandelt wurden, wurde mit dem Transwell-Assay und einer neuen Technik, dem RT-CIM-Assay-System, getestet. Aus dem Transwell-Assay zeigten die markierten Zellen keine offensichtlichen Veränderungen in der Migration. Durch die Verwendung des RT-CIM-Testsystems wurde die Zellmigration in Echtzeit überwacht, was genauere Daten widerspiegelte und die Zellmigrationsfähigkeit genauer vorhersagen konnte. Aus dem RT-CIM-Testsystem wanderten die markierten Zellen zwar zu Beginn der Markierung langsamer als die unmarkierten Zellen. Nach 72 und 96 Stunden gab es jedoch keinen signifikanten Unterschied in der Zellmigration zwischen markierten Zellen und unmarkierten Zellen, was darauf hindeutet, dass hohe Konzentrationen von PBNPs die MSC-Motilität nicht beeinflussten (Abb. 5).

Die Migration von C3H10T1/2-Zellen in Gegenwart verschiedener Mengen an PBNPs. a Die Migration von C3H10T1/2-Zellen bestimmt durch RT-CIM-Assay. b Der Zellindex von C3H10T1/2-Zellen nach der Behandlung in 12, 24, 48, 72 und 96 h. c Die Migration von C3H10T1/2-Zellen, bestimmt durch den Transwell-Assay (Vergrößerung × 200)

In-vitro-Zelldifferenzierung

Die Pluripotenz von markierten und unmarkierten MSCs wurde durch Färbung mit Alizarin Red und Oil Red O untersucht. Abbildung 6 zeigt, dass markierte MSCs erfolgreich in Adipozyten und Osteozyten differenziert werden können, wie dies bei unmarkierten MSCs der Fall war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die PBNPs die Differenzierungskapazität der Zellen nicht beeinträchtigten, wodurch die Pluripotenz der markierten MSCs erhalten blieb.

In-vitro-Zelldifferenzierung von Zellen mit oder ohne PBNPs. Oil Red O-Färbung für Adipozyten und Alizarin Red-Färbung für Osteozyten. Bilder wurden 3 Wochen nach der Beschriftung aufgenommen (Vergrößerung × 200  )

Einfluss der Markierung von PBNPs auf das Zytoskelett

Um die Wirkung von PBNPs auf das Zytoskelett von MSCs zu untersuchen, wurde ein Immunfluoreszenz-Assay von F-Aktin verwendet. Die Phalloidin-Färbung zeigt nach 48 h Markierung keine Veränderung der roten Aktinfilamente des Zytoskeletts im Vergleich zu unmarkierten MSCs. Ein Vergleich der Integrität und Verteilung von Aktinfilamenten in den markierten und unmarkierten Zellen über 48 Stunden ergab keine Veränderungen (Abb. 7).

Immunfluoreszenz von C3H10T1/2-Zellen in Gegenwart verschiedener Mengen an PBNPs für 48 h (Vergrößerung × 400). ↑, Zytoskelett

Western Blot-Analyse

Wnt-Signalwege spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation von Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose, Gewebebildung und dem Stammzellschicksal [24]. β-Catenin ist also das funktionelle Protein von MSCs. Darüber hinaus ist das Vimentin der mesenchymale Biomarker und auch das funktionelle Protein von MSCs [25]. Diese beiden Proteine ​​stehen im Zusammenhang mit der biologischen Funktion von MSCs. Die Expressionen von β-Catenin und Vimentin wurden durch Western-Blot-Analyse bewertet. Abbildung 8 zeigt, dass die Expression von β-Catenin und Vimentin von MSCs, die 48 h lang mit verschiedenen Konzentrationen von PBNPs behandelt wurden, im Vergleich zur Expression von MSCs, die ohne PBNPs behandelt wurden, keine signifikanten Veränderungen aufwies. Diese Ergebnisse zeigten, dass PBNPs die Expression von β-Catenin und Vimentin von MSCs nicht verändern können, was die Stabilität der biologischen Funktion von MSCs nach Behandlung mit PBNPs zeigte.

Western Blot zeigt die Expression von β-Catenin und Vimentin von MSCs, die 48 h lang mit und ohne PBNPs behandelt wurden. Der Gehalt an β-Catenin und Vimentin wurde mit der Software ImageJ quantifiziert

In-vitro-MRT

MSCs haben wie andere Stammzellen das Potenzial, Knochen-, Knorpel-, Fett-, Muskel- und Herzzellen zu differenzieren, die zu einer wichtigen Quelle für die regenerative Medizin geworden sind. Und die Verfolgung der Migration und des Ergebnisses von MSCs ist so wichtig, um die Rolle und das Ergebnis von exogenen MSCs bei der Reparatur von Defekten zu bewerten. Die Magnetresonanztomographie (MRT) half, MSCs nach der klinischen Verabreichung zu beobachten, und ein MRT-Kontrastmittel ist erforderlich. Das Potenzial von PBNPs als wirksames T2-gewichtetes zelluläres MRT-Kontrastmittel wurde nachgewiesen [14], und einige andere Studien zeigten auch, dass die Oberflächenmodifikation von PBNPs ihre Leistung in der MRT verbessert [17, 26]. Derzeit wird die PBNP-Markierung in einer Vielzahl von Zellen verwendet. Dumontet al. beschrieben PBNPs als Mittel für MRT und fluoreszenzbasierte Bildgebung von pädiatrischen Hirntumoren [27]; Pereraet al. entwickelten die Gadolinium-inkorporierten PBNPs zur Früherkennung von Tumoren im Magen-Darm-Trakt [28]; und Cano-Mejia et al. kombinierte Preußisch-Blau-Nanopartikel (PBNP)-basierte photothermische Therapie (PTT) mit Anti-CTLA-4-Checkpoint-Hemmung zur Behandlung von Neuroblastomen [29]. Es gibt jedoch selten verwandte Berichte über PBNP-markierte MSCs. Darüber hinaus bleibt unklar, ob es nach der Markierung von PBNPs einen negativen Einfluss auf die Zellfunktion und Lebensfähigkeit von MSCs gibt

Um zu untersuchen, ob die PBNPs die Fähigkeit besitzen, den T2-gewichteten MRT-Kontrast von Zellen zu verstärken, inkubierten wir die MSCs mit oder ohne PBNPs und untersuchten die MRT-Signalwirkung. Um die zeitliche Stabilität der Markierung zu überwachen und zu untersuchen, ob die PBNPs ihre Bildgebungsfähigkeit verlieren würden, wenn sich die MSCs differenzierten, inkubierten wir die MSCs mit PBNPs und induzierten die MSCs 14 Tage lang zur osteogenen Differenzierung und untersuchten dann die MRT-Signalwirkung. Wie in Abb. 9 gezeigt, zeigten die Pellets der mit PBNPs inkubierten MSCs einen deutlichen MRT-Signalverdunkelungseffekt und der SI-Wert der markierten MSCs unterschied sich deutlich von den unmarkierten MSCs. Bemerkenswerterweise zeigten die markierten MSCs auch eine deutliche Verdunkelungswirkung des MRT-Signals, wenn die Differenzierung induziert wird. Diese Ergebnisse zeigten, dass PBNPs das Potenzial haben, als wirksames T2-Kontrastmittel für die zelluläre Bildgebung von MSCs verwendet zu werden und das Kontrastmittel auch nach der Zelldifferenzierung langfristig zurückhalten können.

T2-gewichtete MRT-Phantome von MSCs. a Querschnitt. b Quantitative Analyse des SI-Wertes. **P < 0,001 vs. Kontrolle

Es gibt viele veröffentlichte Daten von MSCs, die mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) markiert wurden, aber die Anwendung von MNPs war durch ihre Zytotoxizität begrenzt. Bei der Abgabe von MNPs an das Zielgewebe verteilt sich die Mehrheit der MNPs häufig in Leber und Milz, sodass die Toxizität von MNPs nicht vernachlässigt werden kann [30]. Costa C fand beispielsweise heraus, dass SPIONs Zytotoxizität gegenüber neuronalen Zellen und Gliazellen hervorrufen können [31]. Wie oben erwähnt, zeigten die PBNPs keine nachweisbare Zytotoxizität und hatten keine Auswirkungen auf die Zelleigenschaften von MSCs, einschließlich Zytoskelett, Zellmorphologie und funktionelles Protein. Somit würde die Stärke der Verwendung von PBNPs als wirksames T2-gewichtetes zelluläres MRT-Kontrastmittel in Bezug auf die Zytotoxizität gezeigt.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir die PBNPs in das Tracking mesenchymaler Stammzellen eingeführt und das Überleben, das Migrationspotenzial und die Zelleigenschaften von MSCs nach der Markierung mit den PBNPs untersucht. Darüber hinaus haben wir das Potenzial von PBNPs als wirksames T2-gewichtetes MRT-Kontrastmittel für die zelluläre MRT von MSCs gezeigt. PBNPs können effektiv zur Markierung von MSCs verwendet werden und beeinflussen die biologischen Eigenschaften von MSCs nicht. Diese Schlussfolgerung ebnete dem Label von MSCs einen neuen Weg.

Abkürzungen

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

DMSO:

Dimethylsulfoxid

FBS:

Fötales Rinderserum

MRT:

Magnetresonanztomographie

MSC:

Mesenchymale Stammzelle

NIR:

Nahes Infrarot

OD:

Optische Dichte

PBNP:

Preußischblaues Nanopartikel

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

VSM:

Vibrationsprobenmagnetometer