Bewertung der Modulation von Diphenyl-N-(Trichloracetyl)amidophosphat-DNA-Bindung und Zytotoxizität in menschlichen Leukämiezellen durch C60-Fulleren

Zusammenfassung

Ein neuer Vertreter der Carbacylamidophosphate – Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL), das zwei Phenoxy-Substituenten in der Nähe der Phosphorylgruppe enthält, wurde synthetisiert, durch Elementaranalyse, IR- und NMR-Spektroskopie identifiziert und als zytotoxisches Agens allein und in Kombination mit C₆₀-Fulleren getestet.

Laut molekularen Simulationsergebnissen können C₆₀-Fulleren und HL mit DNA interagieren und einen starren Komplex bilden, stabilisiert durch Stapelwechselwirkungen der HL-Phenylgruppen mit C₆₀-Fulleren und DNA-G-Nukleotid sowie durch Wechselwirkungen der HL-CCl₃-Gruppe durch Ion-π-Bindungen mit dem C₆₀-Molekül und elektrostatische Bindungen mit DNA-G-Nukleotid.

Mittels MTT-Test wurde die zytotoxische Aktivität von HL gegen humane leukämische CCRF-CM-Zellen mit einem IC₅₀-Wert von 10 µM nach 72 h Inkubation nachgewiesen. Unter kombinierter Einwirkung von 16 µM C₆₀-Fulleren und HL wurde der IC₅₀-Wert bei niedrigerer 5 µM HL-Konzentration und früherer 48 h Inkubationsperiode detektiert; zudem trat der zytotoxische Effekt von HL bereits bei niedriger 2,5 µM Konzentration auf, bei der HL allein keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit hatte. Die Bindung von C₆₀-Fulleren und HL an die kleine DNA-Furche mit Bildung eines stabilen Komplexes wird als einer der möglichen Gründe für ihre synergistische Hemmung der CCRF-CEM-Zellproliferation angenommen.

Die Anwendung von C₆₀-Fulleren in Kombination mit 2,5 µM HL zeigte keine schädliche Wirkung auf die strukturelle Stabilität der Erythrozytenmembran. Somit potenzierte die kombinierte Wirkung von C₆₀-Fulleren und HL in niedriger Konzentration den zytotoxischen Effekt von HL gegen humane Leukämiezellen und war nicht von hämolytischem Effekt begleitet.

Hintergrund

Der Vertreter der Kohlenstoffnanostrukturen C₆₀-Fulleren besitzt einzigartige physikalisch-chemische Eigenschaften und biologische Aktivität nicht nur als Antioxidans oder Photosensibilisator, sondern auch als Modifikator der toxischen Wirkung von Antikrebsmedikamenten aufgrund seiner Fähigkeit, in Zellen einzudringen und als Drug-Carrier zu fungieren [1–4]. C₆₀-Moleküle können mit Chemotherapeutika wie Doxorubicin, Cisplatin und Paclitaxel interagieren und Komplexe bilden, die den therapeutischen Effekt verstärken [5–8].

Carbacylamidophosphate (CAPh) sind organische Moleküle, die aufgrund ihrer besonderen Struktur, biologischen Aktivität und biomedizinischen Anwendungsperspektiven Aufmerksamkeit erregt haben [9–12]. Die Anwesenheit von Peptid- und Phosphoramidgruppen, kombiniert im Fragment C(O)N(H)P(O) des Moleküls, bestimmt dessen Interaktion mit biologischen Molekülen und Zellmembranen. Variation der Substituenten in der Nähe der Phosphoryl- und Carbonylgruppen ermöglicht die Modulation stereochemischer und pharmakologischer Eigenschaften von CAPh. Insbesondere zeigten verschiedene CAPh-Vertreter antineoplastische Aktivität [13, 14].

Kürzlich bestätigten wir, dass der CAPh-Vertreter Dimethyl-N-(benzoyl)-amidophosphat in millimolaren Konzentrationsbereichen die Lebensfähigkeit leukämischer L1210-Zellen verringerte und dass seine toxische Wirkung durch C₆₀-Fulleren verstärkt wurde [15]. Wir zeigten auch, dass die Einführung zusätzlicher aromatischer Substituenten und der elektronegativen CCl₃-Gruppe in die CAPh-Struktur zu einer Erhöhung der Toxizität führte [16]. So wurde ein signifikanter toxischer Effekt von Dimorfolido-N-trichloracetylphosphoramid gegen humane Leukämiezellen verschiedener Herkunft gezeigt, aber seine effektive Konzentration war noch hoch, und keine Toxizitätsverstärkung nach kombinierter Wirkung mit C₆₀-Fulleren wurde beobachtet. In Fortsetzung dieser Untersuchungen synthetisierten wir einen neuen CAPh-Vertreter Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL), der zwei Phenoxy-Substituenten statt Morfolido-Gruppen in der Nähe der Phosphorylgruppe besitzt (Abb. 1).

Abb. 1. Struktur von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL).

Ziel der Forschung war es, die biologische Aktivität von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) allein oder in Kombination mit C₆₀-Fulleren mittels In-silico-Analyse ihrer Interaktion mit DNA und In-vitro-Studie zytotoxischer Effekte gegen menschliche leukämische Zelllinien zu bewerten.

Methoden/Experimentell

Chemikalien

RPMI 1640 Flüssigmedium, Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin/Streptomycin und L-Glutamin (Biochrom, Deutschland), Dimethylsulfoxid (DMSO) (Carl Roth GmbH+Co, Deutschland), MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., USA), HCl (Kharkivreachim, Ukraine).

Charakterisierung der chemischen Verbindung

Zur Erhöhung der Löslichkeit erhielten wir das Natriumsalz von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) gemäß folgender Reaktionen (Abb. 2).

Abb. 2. Schema der Löslichkeit von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) in Natriumsalz.

Die Trichlorphosphazotrichloracetyl-Lösung (0,035 M) in 200 ml Chloroform wurde langsam zu einer gut gerührten Natriumphenolat-Suspension (0,106 M, 12,3 g) in 150 ml Chloroform gegeben (Abb. 2; Stufe 1). Die Mischungstemperatur durfte nicht über 40–50 °C steigen. Das Rühren wurde etwa 1 h fortgesetzt, dann wurde die Lösung auf 70 °C erhitzt und 20 min unter diesen Bedingungen gerührt. Das resultierende Produkt Triphenoxyphosphazotrichloracetyl wurde abdestilliert. Dann wurden 40 ml 1 M NaOH hinzugefügt und 90 min unter Rückfluss erhitzt (Abb. 2; Stufe 2). Das resultierende Gemisch wurde abdestilliert. Der feste Niederschlag von Natrium-HL wurde dreimal mit Diethylether gewaschen und aus i-Propanol als weißes kristallines Pulver (80 % Ausbeute) rekristallisiert. Farblose Kristalle von NaL·3H₂O, geeignet für Röntgenanalyse, wurden durch langsame Verdampfung einer i-PrOH:H₂O (9:1 v/v) Lösung erhalten. Die Verbindung ist luftstabil, hochlöslich in Wasser und Alkoholen. Schmp. 215 °C.

HL wurde durch Elementaranalyse und IR- und NMR-Spektroskopie identifiziert: Elementaranalysen (C, H, N) wurden mit dem EL III Universal CHNOS Elementaranalysator durchgeführt. IR-Spektralmessungen erfolgten für Proben als KBr-Presslinge an einem Perkin-Elmer Spectrum BX FT-IR Spektrometer mit 2 cm⁻¹ Auflösung und 8 Scans, die zur Mittelung zufälliger Absorptionsartefakte im Spektralbereich 4000–400 cm⁻¹ kombiniert wurden. ¹H-NMR-Spektren in DMSO-d6-Lösungen wurden auf einem AVANCE 400 Bruker NMR-Spektrometer bei Raumtemperatur aufgezeichnet.

HL: IR (cm⁻¹): 1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Amid II); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sh (νPN).

¹H NMR (DMSO-d₆): 7,05 (t, 2H, γ-CH₂); 7,205, 7,255 (dt, 8H, α- und β-CH₂).

Für CCl₃C(O)N(Na)P(O)(OC₆H₅)₂ wurde die elementare Zusammensetzung bestimmt, %: C 40,58, H 2,35, N 3,15; und berechnet, %: C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Synthese und Charakterisierung von C₆₀-Fulleren

Eine hochstabile wässrige Kolloidlösung von C₆₀-Fulleren (200 µM, Reinheit > 99,5 %, Nanopartikel-Durchschnittsgröße bis 50 nm) wurde an der Technischen Universität Ilmenau (Deutschland) synthetisiert wie in [17, 18] beschrieben.

Zellkultur

Die Experimente wurden an der humanen akuten T-Zell-leukämischen CCRF-CM-Zelllinie durchgeführt. Zelllinie wurde vom Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bezogen: CCRF-CM (ACC 240). Zellen wurden in RPMI 1640 Medium kultiviert, supplementiert mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 2 mM Glutamin, in 25 cm² Flasks bei 37 °C mit 5 % CO₂ in befeuchtetem Inkubator.

Zellen in RPMI 1640 Medium wurden mit C₆₀-Fulleren (16 µM) oder HL (2,5, 5 und 10 µM) separat und zusammen für 24, 48 und 72 h inkubiert. Zellüberleben ohne Zugabe von HL oder C₆₀-Fulleren wurde als 100 % angesehen (Kontrollprobe enthielt 0,05 M DMSO).

Zelllebensfähigkeit (MTT) Assay

Zelllebensfähigkeit wurde durch den MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] Reduktionstest bewertet [19]. Zu den angegebenen Inkubationszeitpunkten wurden 100 µl Aliquots (0,5 × 10⁴ Zellen) in 96-Well-Mikrotiterplatten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gegeben, 10 µl MTT-Lösung (5 mg/ml in PBS) zu jedem Well hinzugefügt und die Platten weitere 2 h bei 37 °C inkubiert. Das Kultivierungsmedium wurde dann durch 100 µl DMSO ersetzt; die Formazan-Bildung wurde durch Absorptionsmessung bei 570 nm mit einem Mikroplattenleser Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Schweiz) bestimmt.

Tiere

Die Studie wurde an weißen männlichen Ratten der „Wistar“-Linie mit 170 ± 5 g Gewicht durchgeführt. Die Tiere wurden unter Standardbedingungen im Vivarium des ESC „Institute of Biology and Medicine“, Taras-Schewtschenko-Nationaluniversität Kiew, gehalten. Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Alle Experimente entsprachen den internationalen Prinzipien der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren unter Kontrolle des Bioethik-Komitees der genannten Institution.

Schätzung der Erythrozyten-Hämolyse

Erythrozyten wurden aus heparinisiertem Blut der „Wistar“-Rattenlinie gewonnen und in 0,85 % NaCl-Lösung auf 0,700 o.u. bei 630 nm am Scinco-Spektrophotometer (Deutschland) verdünnt. Hämolyse der Erythrozyten wurde durch 0,001 N HCl verursacht. Die Hämolysekinetik wurde spektrophotometrisch (λ = 630 nm) alle 10 s während 2 min gemessen. Der Prozentsatz hämolisierter Erythrozyten wurde wie in [20] dargestellt berechnet. Erythrozyten wurden in 0,85 % NaCl-Lösung mit C₆₀-Fulleren (16 µM) oder HL (2,5 und 10 µM) separat und zusammen 1 h inkubiert. Erythrozyten ohne Zugabe von HL oder C₆₀-Fulleren wurden als 100 % angesehen (Kontrollprobe enthielt 0,05 M DMSO).

In-silico-Studie

Das Doppelhelix-DNA-Molekül wurde als Template aus der PDB (Protein Data Bank) verwendet. Die Interaktion des DNA-Moleküls mit HL separat und in Kombination mit C₆₀-Fulleren wurde untersucht. Wir berücksichtigten folgende DNA-Strukturen: 2MIW (CCATCGCTACC – Interkalation von Verbindungen in die kleine Furche der DNA-Helix), 1XRW (CCTCGTCC – Interkalation in die kleine Furche) und 2M2C (GCGCATGCTACGCG – Bindung an große und kleine Furchen). Wir wandten den Algorithmus des systematischen Dockings (SDOCK+) an, integriert im QXP-Paket (diese Methode demonstriert alle möglichen Konformationen der untersuchten Strukturen mit minimalem RMSD-Wert) [21]. Wir generierten 300 potenziell mögliche Komplexe mit DNA, die besten zehn wurden mittels einer im QXP-Paket integrierten Scoring-Funktion für die nächste Stufe ausgewählt [22].

Die Interaktionen des DNA-Moleküls mit HL separat und in Kombination mit C₆₀-Fulleren wurden durch folgende Parameter charakterisiert: (1) Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen, (2) Kontaktflächenbereich von DNA und entsprechender Struktur, (3) Abstand zwischen DNA und dockter Struktur, und (4) Gesamtenergie der Bindungsstruktur.

Zur Beurteilung der Stabilität der Komplexe von chemischer Verbindung mit C₆₀-Fulleren führten wir kurze Molekulardynamik-Simulationen (MD, 100 ps) mit Gromacs [23] gemäß dem Nosé-Poincaré-Anderson-Algorithmus (NPA) [24, 25] basierend auf dem OPLS-AA-Kraftfeld [26, 27] durch.

Die Berechnungen erfolgten mit folgenden Parametern: Temperatur (in Kelvin) – 300; Druck (in Kilopascal) – 100; Bindungen involvierende Wasserstoffatome oder Liganden wurden durch den Algorithmus [25] begrenzt.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SD von mehr als vier unabhängigen Experimenten dargestellt. Mittelwert (M) und Standardabweichung (SD) wurden für jede Gruppe berechnet. Statistische Analyse erfolgte mittels Two-Way ANOVA gefolgt von Post-hoc Bonferroni-Tests. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet. Datenverarbeitung und Plotting erfolgten mit IBM PC unter Verwendung spezialisierter Anwendungen GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., USA).

Ergebnisse und Diskussion

In-silico-Studie

Interaktion von HL mit DNA

Es zeigte sich, dass HL in DNA interkalieren und einen stabilen Komplex bilden kann, wenn es in einer kleinen DNA-Furche über AGC-GCTA-Nukleotide gebunden ist (Abb. 3a). Dabei bildeten sich Stapelwechselwirkungen zwischen der Nukleinbase des A-Nukleotids und der HL-Phenylgruppe sowie elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der CCl₃-Gruppe und dem C-Nukleotid. Nach MD-Simulation betrugen die RMSD-Werte für DNA-Doppelhelix und HL 3,3 bzw. 1,62 Å. Die Nukleotidumgebung von HL (GCA-CTA) veränderte sich teilweise und die Stapelwechselwirkung ging verloren, während eine Wasserstoffbrücke zwischen G-Nukleotid und CO-Gruppe von HL gebildet wurde.

Abb. 3. Interaktion von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) mit DNA-Molekül: a, b Bindung an kleine und große Furchen; c Interkalation in eine kleine Furche. Verwendete DNA-Struktur aus PDB-Datenbank: a, b—2M2C und c—1XRW.

Bindung von HL an eine große DNA-Furche erfolgte über TCG-AT-Nukleotide (Abb. 3b). Dabei bildete sich eine Wasserstoffbrücke zwischen der CO-Gruppe von HL und der Nukleinbase des A-Nukleotids und Stapelwechselwirkungen zwischen beiden HL-Phenylgruppen und den Nukleinbasen von C- und G-Nukleotiden. Zudem bestand die Wahrscheinlichkeit einer elektrostatischen Bindung zwischen der HL-CCl₃-Gruppe und den Nukleinbasen von AT-Nukleotiden.

Nach MD-Simulation wurden keine Veränderungen in der Nukleotidumgebung von HL detektiert. Die RMSD-Werte für DNA und HL betrugen 2,77 und 1,58 Å. Dadurch verschwand die Stapelwechselwirkung zwischen C-Nukleotid und Phenylgruppe.

Im Fall der HL-Interkalation in DNA bestand ihre Umgebung aus CG-CG-Nukleotiden (Abb. 3c). Stapelwechselwirkungen mit CG-Nukleotiden traten auf: eine Phenylgruppe war zwischen den Nukleinbasen eingeklemmt und die andere bildete eine Stapelwechselwirkung mit C-Nukleotid.

Nach MD-Simulation betrugen die RMSD-Werte für DNA-Doppelhelix und HL 1,71 und 1,89 Å. Die Nukleotidumgebung von HL änderte sich nicht. Eine der Phenylgruppen bildete eine Ion-π-Wechselwirkung mit der Nukleinbase des G-Nukleotids, das um 1,12 Å verschoben erschien.

Die erhaltenen Energieparameter belegten, dass die Energie sterischer Stöße zwischen DNA und HL sowie innerhalb von HL selbst unbedeutend war (Tabelle 1).

Wir führten eine vergleichende Analyse der Energieparameter der HL-Bindung an kleine und große DNA-Furchen oder seiner Interkalation in eine kleine DNA-Furche durch. Bump-Werte betrugen 6,2 kJ/mol bei HL-Interkalation in DNA und 2,5 kJ/mol bei Bindung an kleine und große DNA-Furchen (Tabelle 1). Int-Werte waren 8,7 kJ/mol bei Interkalation, 6,3 kJ/mol bei Bindung an große Furche und 3,6 kJ/mol bei Bindung an kleine Furche. Diese Daten zeigten, dass HL-Bindung an eine kleine Furche der DNA am stabilsten war.

Kombinierte Interaktion von HL und C₆₀-Fulleren mit DNA

Früher demonstrierten wir mittels Computersimulation, dass C₆₀-Moleküle mit DNA interagieren und einen stabilen C₆₀+DNA-Komplex bilden können, wenn sie an der kleinen DNA-Furche binden [15]. Wie in Abb. 4 gezeigt, kann C₆₀-Fulleren auch Ion-π-Bindungen mit CCl₃-Gruppen des HL-Moleküls bilden.

Abb. 4. Kombinierte Interaktion von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) und C₆₀-Fulleren mit DNA (HL+C₆₀ oder C₆₀+HL Versionen): a, b Bindung an kleine und große Furchen, c, d Interkalation in kleine und große Furchen. Verwendete DNA-Strukturen der PDB-Datenbank: a, b—2M2C, c—1XRW, und d—2MIW.

Wir verwendeten zwei Versionen der molekularen Modellierung der HL, C₆₀-Fulleren und DNA Interaktion, die in [16] vorgeschlagen wurden und sich als nützlich für die Interpretation von MD-Simulationsergebnissen erwiesen. Wir nutzten die 1XRW PDB-Struktur des DNA-Moleküls in der Version, wo zunächst HL und dann C₆₀-Molekül in DNA interkalieren (HL+C₆₀) und die 2MIW PDB-Struktur – in der Version, wo zunächst C₆₀-Molekül und dann HL in DNA interkalieren (C₆₀+HL).

Die Bindung an eine kleine DNA-Furche im Fall der HL+C₆₀-Version erfolgte über GCTA-GCAT-Nukleotide (Abb. 4a). Phenylgruppen füllten eine kleine Furche und gingen Stapelwechselwirkungen ein: eine Gruppe mit C₆₀-Fulleren und die andere mit der Nukleinbase des G-Nukleotids. Elektrostatische Wechselwirkungen entstanden zwischen der CCl₃-Gruppe von HL und sowohl der Nukleinbase des G-Nukleotids als auch C₆₀-Fulleren.

Laut MD-Simulationsergebnissen war die DNA-Doppelhelix in diesem Fall durch erhebliche Mobilität charakterisiert (RMSD-Wert 3,08 Å), RMSD-Wert für HL war 2,04 Å, während C₆₀-Fulleren praktisch unbeweglich blieb. Als Ergebnis wurde die Nukleotidumgebung der HL+C₆₀-Struktur durch TGC-GCATG verändert. Außerdem erschienen eine Wasserstoffbrücke zwischen der Aminogruppe von HL und DNA und Stapelwechselwirkungen zwischen den Nukleotiden der GC-Basen und C₆₀-Fulleren.

Die Bindung von HL+C₆₀ an eine große DNA-Furche erfolgte über C-ATCC-Nukleotide (Abb. 4b). Wasserstoffbrücken bildeten sich zwischen der HL-CO-Gruppe und der Nukleinbase des A-Nukleotids. Phenylgruppen füllten eine große DNA-Furche und gingen Stapelwechselwirkungen mit C₆₀-Fulleren ein.

Laut MD-Simulationsergebnissen wurde die Nukleotidumgebung der HL+C₆₀-Struktur nicht verändert: RMSD-Werte für DNA und HL betrugen 3,14 und 2,24 Å, C₆₀-Fulleren blieb praktisch unbeweglich. In diesem Fall verschwanden alle Wechselwirkungen zwischen HL und C₆₀-Fulleren und HL interagierte nur sterisch mit DNA. Es wird vermutet, dass als Ergebnis C₆₀-Fulleren sowie HL aus der großen DNA-Furche herausgedrängt würden.

Bei Interkalation von HL+C₆₀ in eine kleine DNA-Furche (Abb. 4c) erfolgte die Bindung mit CGT-GAG-Nukleotiden. C₆₀-Fulleren wurde in eine kleine DNA-Furche eingebaut und interagierte sterisch mit ihr. HL-Phenylgruppen bildeten Stapelwechselwirkungen mit den Nukleinbasen von CG-CG-Nukleotiden. Laut MD-Simulation betrugen die RMSD-Werte für DNA und HL 2,29 und 2,13 Å, C₆₀-Fulleren blieb praktisch unbeweglich, und die CCl₃-Gruppe von HL ging eine elektrostatische Wechselwirkung mit der Nukleinbase des G-Nukleotids ein.

Im Fall der C₆₀+HL-Version erfolgte die Bindung an eine kleine DNA-Furche (Abb. 4d) über CGC-GCC-Nukleotide. Eine der HL-Phenylgruppen bildete einen Stapel mit C₆₀-Fulleren und die andere mit G-Nukleotid. Die CCl₃-Gruppe von HL bildete eine elektrostatische Bindung mit der Nukleinbase des C-Nukleotids. Laut MD-Analyse betrugen die RMSD-Werte für DNA und HL in diesem Fall 2,35 und 2,75 Å, C₆₀-Fulleren blieb unbeweglich, und die Nukleotidumgebung der C₆₀+HL-Struktur wurde durch CGCT-GC verändert. Zusätzlich drang das C₆₀-Molekül tiefer in DNA ein und bildete eine Stapelwechselwirkung mit der Nukleinbase des C-Nukleotids.

Laut berechneten Energieparametern war der im Fall der C₆₀+HL-Interkalation in eine kleine DNA-Furche gebildete Komplex der steifste (Bump-Wert 20,0 kJ/mol) (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu betrug dieser Parameter im Fall der HL+C₆₀-Interaktion mit DNA nur 6,2 kJ/mol bei Interkalation in eine kleine Furche, 7,8 kJ/mol bei Bindung an eine kleine Furche und 8,8 kJ/mol bei Bindung an eine große Furche. Zudem zeigten die Energieparameter, dass die Bildung starker Wasserstoffbrücken im HL+C₆₀+DNA-Komplex nur bei Bindung an eine große Furche möglich war, wenn der Hbnd-Wert −2,3 kJ/mol betrug, bei anderen Interaktionstypen war er null oder −1,0 kJ/mol (Tabelle 1). Außerdem wurden laut MD-Ergebnissen in diesem Fall sowohl C₆₀-Fulleren als auch HL aus der großen DNA-Furche verdrängt.

Daher wird C₆₀+HL-Bindung an eine kleine DNA-Furche als die wahrscheinlichste Version der kombinierten Interaktion von C₆₀-Fulleren, HL und DNA vorgeschlagen.

In-vitro-Studie der biologischen Effekte von HL

CCRF-CEM Zellen Lebensfähigkeit

In In-vitro-Experimenten wurde der langfristige Einfluss von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) im Bereich 2,5–10 µM auf die Lebensfähigkeit humaner leukämischer CCRF-CEM-Zellen mittels MTT-Test geschätzt. Zellen wurden 24, 48 und 72 h in RPMI 1640 Medium mit entweder 16 µM C₆₀-Fulleren oder HL allein oder deren Kombination inkubiert. Lebensfähigkeit von Zellen ohne C₆₀ oder HL wurde als 100 % betrachtet.

Nach 24 h Inkubation wurde kein Effekt von HL auf die Lebensfähigkeit von CCRF-CEM-Zellen beobachtet (Abb. 5). Bei längerer Inkubation wurde die zytotoxische Aktivität von HL in 5 und 10 µM Konzentration offensichtlich, die Zelllebensfähigkeit wurde nach 48 h um 25 und 33 % inhibiert und fiel weiter nach 72 h.

Abb. 5. Lebensfähigkeit von CCRF-CEM-Zellen inkubiert mit Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) in verschiedenen Konzentrationen. (M ± m, n = 8); *p < 0,05 im Vergleich zu Kontrollzellen.

Es ist zu beachten, dass eine 50 %ige Abnahme der CCRF-CEM-Zellenlebensfähigkeit (IC₅₀) nach 72 h unter Einwirkung von HL in 10 µM Konzentration detektiert wurde (Abb. 5). Kürzlich zeigten wir, dass ein anderer CAPh-Vertreter, Dimorfolido-N-trichloracetylphosphorylamid, eine 50 %ige Abnahme der CCRF-CEM-Zellenlebensfähigkeit nach 72 h in 1 mM Konzentration verursachte [16]. Der vergleichende Analyse dieser Daten zeigt, dass die Einführung von Phenoxy- statt Morfolido-Gruppen in die Struktur des CAPh-Derivats die effektive toxische Konzentration gegen Leukämiezellen um zwei Größenordern senkte. Wir nehmen an, dass die konformationelle Flexibilität des –P(O)(OC₆H₅) Kerns eine effektivere Interaktion dieser Verbindung mit DNA ermöglichte.

Kein Einfluss von alleinigem C₆₀-Fulleren auf die Zellenlebensfähigkeit während der Inkubationsperiode wurde detektiert (Daten nicht gezeigt). Gleichzeitig zeigen die Ergebnisse in Abb. 6, dass C₆₀-Fulleren die zytotoxische Aktivität von HL gegen CCRF-CEM-Zellen intensivierte. Unter kombinierter Einwirkung von C₆₀-Fulleren und HL wurde eine 50 %ige Abnahme der Zellenlebensfähigkeit bei niedrigerer HL-Konzentration (5 µM) und früherer Periode (48 h) beobachtet als unter Einwirkung von HL allein. Zudem wurde nach 72 h kombinierter Einwirkung der zytotoxische Effekt von HL in niedriger 2,5 µM Konzentration detektiert, bei der HL allein keinen Einfluss auf die Zellenlebensfähigkeit hatte (Abb. 6).

Abb. 6. Lebensfähigkeit von CCRF-CEM-Zellen inkubiert mit Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) allein oder in Kombination mit 16 µM C₆₀-Fulleren. (M ± m, n = 8); *p < 0,05 vs. Kontrolle; ^#p < 0,05 vs. HL.

Somit wurde gezeigt, dass C₆₀-Fulleren zytotoxische Effekte von HL potenziert und die Empfindlichkeit leukämischer Zellen signifikant erhöht. In Anbetracht dessen, dass C₆₀-Fulleren in der Lage ist, sich über 24 h in leukämischen Zellen anzureichern [28] und in intrazellulären Kompartimenten zu lokalisieren [29–31], insbesondere im Zellkern [32, 33], sollte seine Interaktion mit der kernären DNA aktiv proliferierender Krebszellen nicht ausgeschlossen werden.

Die In-vitro-Daten stimmen mit den In-silico-Ergebnissen überein und demonstrieren, dass die initiale Bindung von C₆₀-Molekül und dann von HL an die kleine DNA-Furche mit Bildung eines stabilen Komplexes einer der möglichen Gründe für ihre synergistische Hemmung der CCRF-CEM-Zellproliferation sein könnte.

Erythrozyten-Resistenz gegen Hämolyse

Bei der Bewertung des antikrebs Potenzials von HL und C₆₀-Fulleren-Kombination ist es wichtig, mögliche Effekte auf nicht-maligne Zellen, insbesondere Blutzellen, zu berücksichtigen.

Die Untersuchung der Erythrozyten-Resistenz gegen saure Hämolyse ermöglicht die Aufklärung des Einflusses pharmakologischer Substanzen auf Membranebene. Die Hämolyse-Dynamik reflektiert die Dynamik der Disruption der Erythrozyten-Plasmamembran und somit die Stabilität ihrer strukturellen Organisation. In Abb. 7 ist die Abhängigkeit des Prozentsatzes der Hämolyse von der Zeit für Erythrozyten dargestellt, die 1 h in NaCl-Lösung ohne Zusätze (Kontrolle) und mit entweder HL oder C₆₀-Fulleren allein oder in Kombination inkubiert wurden. Kein Einfluss von 16 µM C₆₀-Fulleren auf Erythrozyten-Hämolyse wurde detektiert (nicht gezeigt). HL in 2,5 µM Konzentration allein oder in Kombination mit C₆₀ beeinflusste die Erythrozyten-Resistenz gegen Hämolyse nicht (Abb. 7). Unter Einwirkung von HL in 10 µM Konzentration wurde eine Beschleunigung der Hämolyse mit Maximum bei 20 s detektiert. Kombinierte Einwirkung von 10 µM HL und C₆₀-Fulleren führte zu weiterer Hämolyse-Intensivierung mit 60 % hämolysierten Erythrozyten nach 20 s.

Abb. 7. Erythrozyten-Resistenz gegen Hämolyse in Gegenwart von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) separat und in Kombination mit 16 µM C₆₀-Fulleren. (M ± m, n = 8).

Die erhaltenen Daten zeigten, dass die Anwendung von C₆₀-Fulleren in Kombination mit 2,5 µM HL keine schädliche Wirkung auf die strukturelle Stabilität der Bluterythrozytenmembran hatte und gleichzeitig die zytotoxische Aktivität von HL in dieser niedrigen Konzentration gegen Leukämiezellen signifikant erhöhte. Trotz des synergistischen zytotoxischen Effekts von C₆₀-Fulleren und HL in 10 µM Konzentration gegen Leukämiezellen schien die Anwendung ihrer Kombination durch Intensivierung des hämolytischen Effekts begrenzt.

Schließlich ist im Kontext der obigen In-vitro-Studie wichtig zu betonen, dass eine Wasser/Festkörper-Grenzfläche eingeschlossenes Wasser aufweist, das auch sowohl Transport- als auch thermodynamische Eigenschaften von Nanostrukturen [34, 35] und deren Interaktion mit Zellmembranen [36] beeinflussen kann.

Es gibt Literaturdaten zur intrazellulären Lokalisierung von Carbacylamidophosphat-Derivaten, insbesondere zum Eindringen von Phosphoramidaten in Zellen. So können Phosphoramidat-Derivate die Membran von MDA-231 Brustkrebs- und Lungenkrebszelllinien (H460, H383, H2009) durchdringen [37]. Nitrobenzyl-Phosphoramid-Mustards zeigten Permeation durch Zellmembranen und Lokalisation in Mitochondrien von NTR⁺ Säugetierzellen [10]. Es ist nicht ausgeschlossen, dass C₆₀-Fulleren, der in der Lage ist, die Membran der Krebszelle durch passive Diffusion oder Endozytose [28, 30, 32] zu durchdringen, mit Anreicherung im Kern und Mitochondrien [30, 32, 33], als Transporter kleiner Antitumor-Moleküle fungieren könnte [38–40].

Schlussfolgerungen

Ein neuer Vertreter der Carbacylamidophosphate-Derivate mit zwei Phenoxy-Substituenten in der Nähe der Phosphorylgruppe, Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL), wurde synthetisiert und als zytotoxisches Agens allein und in Kombination mit C₆₀-Fulleren getestet. Laut molekularen Simulationsergebnissen bildete sich bei Bindung von C₆₀-Fulleren und dann HL an eine kleine DNA-Furche ein starrer Komplex, stabilisiert durch Stapelwechselwirkungen der HL-Phenylgruppen mit C₆₀-Fulleren und DNA-G-Nukleotid sowie durch Wechselwirkungen der HL-CCl₃-Gruppe durch Ion-π-Bindungen mit C₆₀-Molekül und elektrostatische Bindungen mit DNA-G-Nukleotid.

Mittels MTT-Test wiesen wir zytotoxische Aktivität von HL gegen humane leukämische CCRF-CM-Zellen mit IC₅₀-Wert von 10 µM nach 72 h Behandlung nach. Der zytotoxische Effekt von HL wurde durch C₆₀-Fulleren verstärkt. Unter kombinierter Einwirkung von 16 µM C₆₀-Fulleren und HL wurde der IC₅₀-Wert bei niedrigerer 5 µM HL-Konzentration und früherer 48 h Inkubationsperiode detektiert, und der zytotoxische Effekt von HL trat bei niedriger 2,5 µM Konzentration auf, bei der HL allein keinen Einfluss auf die Zellenlebensfähigkeit hatte.

Zuvor zeigten wir einen signifikanten toxischen Effekt von Dimorfolido-N-trichloracetylphosphoramid gegen humane Leukämiezellen verschiedener Herkunft, aber seine effektive Konzentration war hoch und keine Toxizitätsverstärkung nach kombinierter Wirkung mit C₆₀-Fulleren wurde beobachtet [16]. Wir nehmen an, dass die Einführung flexibler –P(O)(OC₆H₅) Gruppen statt Morfolido-Gruppen in das CAPh-Derivat zur Senkung seiner toxischen Konzentration gegen humane Leukämiezellen beitrug, indem es seine effektive Interaktion mit C₆₀-Molekül und DNA sicherte. Die Bindung von C₆₀-Fulleren und HL an die kleine DNA-Furche mit Bildung eines stabilen Komplexes wird als einer der möglichen Gründe für ihre synergistische Hemmung der CCRF-CEM-Zellproliferation angenommen.

Wir zeigten, dass die Anwendung von C₆₀-Fulleren in Kombination mit 2,5 µM HL keine schädliche Wirkung auf die strukturelle Stabilität der Bluterythrozytenmembran hatte, während die Kombination von C₆₀-Fulleren mit 10 µM HL durch Intensivierung des hämolytischen Effekts begrenzt erschien.

Somit wurde gezeigt, dass C₆₀-Fulleren den zytotoxischen Effekt von HL potenziert und die Empfindlichkeit humaner Leukämiezellen signifikant erhöht. Eine Kombination von C₆₀-Fulleren mit HL in niedriger Konzentration von 2,5 µM könnte für weitere biomedizinische Studien vielversprechend sein.

Abkürzungen

DMSO:

Dimethylsulfoxid

DNA:

Desoxyribonukleinsäure

FBS:

Fetales bovines Serum

HL:

Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat

IR:

Infrarotspektroskopie

MD:

Molekulardynamik

MTT:

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid

NMR:

Kernspinresonanz

RPMI - 1640 Medium:

Roswell Park Memorial Institute Medium