Selbstorganisationsstabilität und Variabilität von bakteriellen Mikrokompartiment-Hüllproteinen als Reaktion auf Umweltveränderungen

Einführung

Bakterielle Mikrokompartimente (BMCs) sind proteinartige Organellen, die strukturell viralen Kapsiden ähneln und das Zytoplasma von Bakterien aufteilen [1]. Sie sind in Bakterienstämmen weit verbreitet [2] und ermöglichen es Bakterien, wichtige Stoffwechselwege in Abwesenheit von membrangebundenen Organellen in Eukaryoten zu kompartimentieren [3, 4]. BMCs werden durch eine semipermeable Proteinhülle gebildet, die einen luminalen Enzymkern einkapselt. Die Hülle besteht aus drei Arten von Strukturproteinkomponenten, darunter BMC-H (mit einer Pfam00936-Domäne), BMC-T (mit zwei Pfam00936-Domänen) und BMC-P (mit einer Pfam03319)-Domäne [5,6,7, 8,9]. Die Hauptbestandteile der Schale sind BMC-H, die als Hexamere mit konvexen und konkaven Oberflächen erscheinen und die Schalenfacetten mit ihrer konkaven Seite nach außen decken [10] (Abb. 1). BMC-P bildet Pentamere, von denen vorgeschlagen wird, dass sie die Scheitel der ikosaedrischen Form abdecken, und BMC-T bildet Pseudohexamere, die sich in den Schalenfacetten befinden, die vermutlich für die Schalenpermeabilität verantwortlich sind.

Bakterielle Mikrokammer, Schalenorganisation und Selbstmontage. a Hunderte von Kopien von BMC-Hüllproteinhomologen ordnen sich selbst an, um eine ikosaedrische Proteinorganelle zu bilden. BMC-H-Proteine, in Gelb, bilden die Facetten und BMC-P-Proteine, in Rot, besetzen die Eckpunkte. b AFM-Topographen von Schalenfacetten bestehend aus Hoch_5815 BMC-H-Hexameren. Dynamische Ereignisse (Kreise) wurden mit HS-AFM innerhalb von Sekunden beobachtet

Spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen sorgen für die Selbstorganisation von BMC-Proteinen, um hochdefinierte Architekturen zu bilden, um ihre metabolische Funktionalität zu erfüllen. Es wird angenommen, dass die lateralen Wechselwirkungen zwischen Schalenproteinen der Hauptfaktor für die Bestimmung der Selbstorganisationseigenschaften der ikosaedrischen Schale sind [10]. Es wurde beobachtet, dass BMC-H-Homologe verschiedene Formen bilden können, einschließlich zweidimensionaler Blätter [11, 12], Nanoröhren [13, 14, 15, 16, 17] und Filamentstrukturen [15, 18, 19, 20] .

Aufgrund der Selbstorganisation, der selektiven Permeabilität und der Enzymverkapselungseigenschaften der natürlich vorkommenden Organellen wurden BMCs als ideales System mit großem Potenzial in der Biotechnologie angesehen, einschließlich des bioinspirierten Baus nanoskaliger Bioreaktoren durch Umhüllen von Stoffwechselenzymen und der Erzeugung neuer molekularer Gerüste mit neue Funktionen [21,22,23,24,25,26]. Allerdings müssen noch einige Schlüsselfragen im BMC-Bioengineering angegangen werden, beispielsweise wie stabil die BMC-Strukturen sind und wie die Selbstorganisation und Bildung von BMC-Proteinaggregaten effektiv manipuliert und bewertet werden kann. Untersuchungen der Strukturen und des Aufbaus von BMC-Schalen und ganzen BMCs wurden mit Röntgenkristallographie, Elektronenmikroskopie (EM), Fluoreszenzmikroskopie und dynamischer Lichtstreuung (DSL) durchgeführt [10, 11, 16, 22, 27, 28 ,29,30,31]. Vor kurzem haben wir Hochgeschwindigkeits-AFM (HS-AFM) genutzt, um die erste Visualisierung des dynamischen Selbstorganisationsprozesses von BMC-H-Proteinen durchzuführen [12].

In dieser Arbeit verwenden wir HS-AFM, um die Strukturdynamik von BMC-H-Patches unter unterschiedlichen pH- und ionischen Bedingungen zu überwachen, was Einblicke in die Modulation des BMC-Hüllproteinaufbaus bietet und ein leistungsstarkes Werkzeug für die quantitative Bewertung mit molekularer Auflösung bietet , zur Stabilität und Variabilität der Selbstorganisation des BMC-Hüllproteins.

Methoden

Probenvorbereitung

Das gereinigte BMC-H-Protein (Hoch_5815) aus Haliangium ocraceum wurde freundlicherweise von Dr. Kerfeld (Lawrence Berkeley National Laboratory) zur Verfügung gestellt. Für den Pufferaustausch Lagerproben mit ~ 80 mg mL ⁻¹ in Tris-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂ ) wurden auf 0.5 mg mL ⁻¹ . verdünnt Verwenden des gewünschten Puffers vor der AFM-Bildgebung (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1). Der Kontrollpuffer ist 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) und 10 mM MgCl₂ .

Rasterkraftmikroskopie

Gewünschte Puffer wurden für die Probenabsorption bei Glimmer und AFM-Bildgebung verwendet. Nach 5-minütiger Absorption auf dem Glimmer wurden Hoch_5815 mit dem gewünschten Puffer gespült, um immobilisierte Proteine ​​zu entfernen, und dann mit AFM abgebildet (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1). HS-AFM-Bilder wurden bei 30 oder 40 Hz in Lösung im AC-Modus mit einem JPK NanoWizard ULTRA speed AFM aufgenommen, der mit einem ULTRA Speed ​​2,8 μm Scanner und Ultra-Short Cantilever USC-0,3 MHz Sonden (NanoWorld) ausgestattet war. Minimale Belastungskräfte von ~ 100 PicoNewton wurden während der AFM-Bildgebung angewendet, um Störungen der Proteinassemblierung zu reduzieren [12, 32,33,34,35,36].

Bildverarbeitung und -analyse

Die Bildanalyse wurde zunächst mit JPK SPM Data Processing (JPK) durchgeführt. Die HS-AFM-Bildanalyse wurde mit einem benutzerdefinierten Makro auf Image SXM (http://www.ImageSXM.org.uk) durchgeführt, wie zuvor beschrieben [12]. Um die Größen von Hoch_5815-Patches zu analysieren, wurden Bilder mit 512 × 512 Pixeln, die mit einer Abtastrate von 30 Hz aufgenommen wurden, abgeflacht, um jegliche XY-Neigung zu entfernen, und Z-Schwellenwert, gefolgt von einer binären Umwandlung, um Protein gegenüber Nicht-Protein anzuzeigen. Die Partikelanalyse wurde verwendet, um die Oberfläche der Proteine ​​in diesen binären Bildern zu berechnen. Patches wurden als durch> 3 Pixel (~ 2 nm) getrennte Objekte definiert, um einzelne Patches gegenüber benachbarten Patches zu identifizieren. Anfängliche Tests zeigten, dass bei einer größeren Anzahl von Pixeln benachbarte Patches als ein einzelnes kontinuierliches Patch gezählt werden könnten, während bei Verwendung einer kleineren Pixelzahl die Lücken zwischen einzelnen Hexameren in Patches als Grenze zwischen Patches falsch gezählt werden könnten. Um die Proteindynamik zu analysieren, wurden Bildserien von 256 × 256 Pixeln, die mit einer Scangeschwindigkeit von 40 Hz aufgenommen wurden, analysiert, was eine zeitliche Auflösung von ungefähr 6,4 s pro Frame ergab. Binäre Bilder wurden vom vorherigen Bild in der Serie subtrahiert, um unterschiedliche AFM-Bilder zu zeigen. Eine Partikelanalyse der Differenzbilder wurde verwendet, um die Fläche der zusammengesetzten und zerlegten Proteine ​​zu zählen. Die zur Berechnung der dynamischen Rate verwendete Gleichung sieht wie folgt aus:

wo N stellt die Summe der weißen und schwarzen Pixel in einem Differenzbild mit Schwellenwert dividiert durch die Anzahl der Pixel dar, die einem einzelnen Hexamer bei diesem Maßstab entsprechen (zusätzliche Datei 1:Abbildung S3, Abbildung S5). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer multivariaten ANOVA oder einer Zweiwege-ANOVA wie angegeben durchgeführt.

Ergebnisse

Wir verwendeten die BMC-H-Proteine ​​(Hoch_5815) aus einem Myxobakterium Haliangium ocraceum , die in Escherichia coli . exprimiert wurden und charakterisiert als Hexamere mit einer sechszähligen Symmetrie [12]. Hoch_5815-Hexamere könnten sich auf der zweiten Zeitskala zu einschichtigen Schichten selbst anordnen, die die grundlegenden strukturellen Komponenten der ikosaedrischen BMC-Architektur darstellen (Abb. 1a). Die HS-AFM-Bildgebung ermöglicht es uns, den dynamischen Aufbau und die organisatorische Flexibilität von Blattfragmenten zu visualisieren (Abb. 1b) und die Patchgröße und dynamische Rate von BMC-H-Proteinen mithilfe der entwickelten bildgebenden Analyse (siehe Abschnitt „Methoden“) quantitativ abzuschätzen.

Reaktion auf pH-Schwankung

Wir haben die Veränderungen der Patchgröße als Hinweis auf die Gesamtfähigkeit von Hoch_5815 zur Selbstorganisation gemessen. Die Patchgröße nimmt mit steigendem pH-Wert von 3 auf 10 zu (Abb. 2a; zusätzliche Datei 1:Abbildung S2, Tabelle S1), was darauf hindeutet, dass ein hoher pH-Wert für die Selbstorganisation von Hoch_5815-Proteinen günstiger ist als Bedingungen mit niedrigem pH-Wert. Dies unterscheidet sich etwas vom Aufbauverhalten von RmmH-Proteinen, die sich bei pH 6 als unlöslich erwiesen, bei pH 8 geordnete Anordnungen von Nanoröhren bilden und bei pH 10 zum Zerfall neigen [13]. Darüber hinaus beobachteten wir ein hohes Maß an struktureller Variabilität der HOCH_5815-Selbstorganisation (wie durch eine große SD in Abb. 2a, Zusätzliche Datei 1:Abbildung S2 angezeigt).

Auswirkungen des Umgebungs-pH-Werts auf die Selbstorganisation von Hoch_5815. a Die mittleren Oberflächen der einzelnen Patches von Hoch_5815, bestimmt durch AFM (n = 50) (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S2). b Die durch HS-AFM bestimmten mittleren Raten dynamischer Ereignisse (n = 50). *p < 0,05, ns nicht signifikant (multivariate ANOVA)

AFM-Bildgebung zur Selbstorganisation von Hoch_5815-Proteinen in Schalenblättern hat gezeigt, dass die Bildung von Schalenblättern einer Kombination aus dem Auf- und Abbau von Hexameren zugeschrieben wird [12]. Wir untersuchten ferner die Geschwindigkeiten der Hoch_5815-Selbstorganisationsdynamik und dynamischen Ereignisse bei verschiedenen pH-Werten (zusätzliche Datei 1:Tabelle S2), um die Stabilität der Hoch_5815-Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geschwindigkeit der Selbstorganisationsdynamik ist bei pH 7 am höchsten und nimmt sowohl unter sauren als auch unter alkalischen Bedingungen ab (Abb. 2b; Zusatzdatei 1:Abbildung S3). Insbesondere nimmt sie unter sauren Bedingungen schnell ab, insbesondere von pH 7 auf pH 6, und erscheint zwischen pH 4 und pH 3 relativ konstant, wie in Abb. 2b gezeigt.

Es ist wahrscheinlich, dass der pH-Wert einen großen Einfluss auf die elektrostatischen Eigenschaften von Aminosäureresten hat, die sich an der Hexamer-Hexamer-Grenzfläche befinden. Die unter sauren Bedingungen beobachtete verringerte Dynamik und kleinere Größe der Schalenflecken veranschaulichen, dass Hoch_5815 eine verringerte Fähigkeit zur Selbstorganisation besitzt. Die unter alkalischen Bedingungen beobachtete reduzierte Dynamik und größere Größe der Schalenflecken deuten auf stabile Hexamer-Hexamer-Wechselwirkungen hin, während die erhöhte Dynamik der Hoch_5815-Hexamere flexible Hexamer-Hexamer-Wechselwirkungen im neutralen pH-Zustand impliziert.

Antwort auf die Variation der Salzkonzentration

Wir haben auch überprüft, ob die Salzkonzentration des Puffers Auswirkungen auf die Montage von Hoch_5815 hat. Bei niedrigen Konzentrationen (100–200 mM) von MgCl₂ , CaCl₂ , und KCl, Hoch_5815-Proteine ​​bilden relativ kleinere Flecken als diejenigen, die bei höheren Konzentrationen (300–500 mM) zusammengebaut werden (Abb. 3a; zusätzliche Datei 1:Abbildung S4). Bei 500 mM beobachteten wir zwei- oder mehrschichtige Hoch_5815-Blätter (Zusatzdatei 1:Abbildung S4). Diese Beobachtungen stimmen mit der früheren Erkenntnis überein, dass eine höhere Ionenstärke die Bildung umfangreicherer und gut geordneter 2D-Kristalle durch CcmK, die Hüllenproteine ​​von Carboxysomen für die Kohlenstoffassimilation, erleichtern könnte [37]. Die durch RmmH gebildeten hochgeordneten Nanoröhren wurden jedoch zerlegt, wenn die NaCl-Konzentration von 50 auf 500  mM erhöht wurde [13], was auf die möglicherweise unterschiedlichen Mechanismen hindeutet, die die Bildung von flachen Schichten und röhrenförmigen Formen durch Schalenhexamere vermitteln.

Auswirkungen der Salzkonzentration auf die Selbstorganisation von Hoch_5815. a Die mit AFM gemessenen mittleren Patchflächen in einem Bereich von 100–500 mM CaCl₂ , MgCl₂ , und KCl (n = 50). Der Anstieg der Salzkonzentration führte zu einer größeren Patchgröße. Zwischen 200 und 300 mM (***p <0,001, *p < 0,05, ns nicht signifikant, Zwei-Wege-ANOVA). b Die mittleren Raten dynamischer Ereignisse, die aus Hochgeschwindigkeits-AFM-Bildserien in einem Bereich von 100–500 mM CaCl₂ . bestimmt wurden , MgCl₂ , und KCl (n = 50). Jede Änderung der Salzkonzentration um 100 µM führte zu einer signifikanten Änderung der Rate dynamischer Ereignisse (***p <0,001, *p < 0,05, ns nicht signifikant, zweifache ANOVA)

Darüber hinaus sind die Variationen der Hoch_5815-Selbstorganisation, die durch die Veränderungen in MgCl₂ . verursacht werden, und KCl-Konzentrationen sind relativ ähnlich. Im Gegensatz dazu ist die Änderung der Patchgröße am ausgeprägtesten (bis zu einem 3000-fachen Anstieg), wenn CaCl₂ Die Konzentration wird von 200 auf 300 mM erhöht (Abb. 3a), was auf die höhere Empfindlichkeit der Hoch_5815-Selbstorganisation gegenüber CaCl₂ . hinweist als zu MgCl₂ oder KCl.

Die dynamische Geschwindigkeit der Selbstorganisation von Hoch_5815 wird auch durch Änderungen der Puffersalzkonzentration beeinflusst. Der Anstieg von MgCl₂ , CaCl₂ , oder KCl-Konzentrationen könnten zu einer Abnahme der dynamischen Hoch_5815-Rate führen (Abb. 3b; Zusätzliche Datei 1:Abbildung S5). Angesichts der Zunahme der Patchgröße, die bei höheren Salzkonzentrationen beobachtet wurde (Abb. 3a), scheint es, dass die lateralen Wechselwirkungen zwischen Hoch_5815-Hexameren bei hohen Salzkonzentrationen stabiler sind. Veränderungen von CaCl₂ Konzentration hatte eine ausgeprägtere Reaktion, und es gab eine signifikante Verschiebung der Rate dynamischer Ereignisse zwischen 200 und 300 mM (Abb. 3b), während die Reaktionen auf die Veränderungen von MgCl₂ und KCl sind relativ ähnlich und stimmen mit den Änderungen der Patchgröße überein (Abb. 3a). Interessanterweise wurden die höchsten Anteile von Montageereignissen gegenüber Demontageereignissen unter 400 mM MgCl₂ . beobachtet , CaCl₂ , oder KCl (zusätzliche Datei 1:Tabelle S2). Dies führte zur Bildung großer und stabiler einschichtiger Hoch_5815-Anordnungen unter 400 mM Salz (zusätzliche Datei 1:Abbildung S4). Die bei 500 µmM beobachteten Doppelschichtanordnungen sind ebenfalls stabil und weisen eine geringe Hexamerbewegung auf.

Flexibilität der BMC-H-Proteinmontage

Durch die Reduzierung der Scankraft auf 100 pN haben wir die Auswirkungen des AFM-Spitzenscanns auf den Aufbau von BMC-Proteinen minimiert und AFM-Bilder einzelner Hexamere mit molekularer Auflösung erhalten (Abb. 4). Sowohl Montage- als auch Demontageereignisse sind in derselben Ansicht zu sehen, was die dynamische Natur der BMC-Shell-Assemblys anstelle von Tip-Scanning-Artefakten bestätigt [12]. Die HS-AFM-Bildgebung zeigte auch die Variabilität der Hoch_5815-Proteinaggregationen. Bei der Bildgebung der Proben bei pH 7,5 in Gegenwart von nur 10 mM MgCl₂ , überraschenderweise beobachteten wir gelegentlich die Bildung faserartiger Strukturen zusammen mit dem Zerfall von Hoch_5815-Hexameren auf der zweiten Zeitskala (Abb. 4a). Diese faserartigen Strukturen könnten dicht parallel gepackt sein, ähnlich den Nanoröhrenbündeln, die aus Schalenhexameren aufgebaut sind [13,14,15,16]. Der Abstand zwischen zwei Fasern beträgt jedoch 3,72 ± 0,31 nm (n = 30) und ihre durchschnittliche Höhe beträgt 2,46 ± 0,22 nm (n = 30), weniger als bei Schalenschichten, die aus Hoch_5815-Hexameren gebildet werden (3,45 ± 0,16 nm, n = 25) (Abb. 4b–f). Diese Faserstrukturen sind während der Bildgebung ziemlich flexibel und dynamisch und könnten gerade oder gewundene Architekturen mit unterschiedlichen Größen aufweisen. Angesichts des gleichzeitigen Auftretens der Faserstrukturen mit der Zerlegung der Hoch_5815-Hexameren und ihrer geringeren Höhe im Vergleich zu den einschichtigen Hexamerblättern vermuten wir, dass diese faserartigen Strukturen durch die einzelnen aus den Hexameren zerlegten Hoch_5815-Peptide gebildet werden (Abb. 4g) . Es ist wahrscheinlich, dass die Substratabsorption unter bestimmten Pufferbedingungen (z. B. niedrige Ionenstärke) zur Anlagerung der Alpha-Helix-Seiten von Hoch_5815-Peptiden an die Substratoberfläche und zur linearen Bindung der Peptide an benachbarte Peptide führen könnte, obwohl dies angenommen wird dass Intra-Hexamer-Wechselwirkungen wahrscheinlich stark sind [5]. Der detaillierte Mechanismus, der der Variabilität der Hüllprotein-Aggregation zugrunde liegt, muss noch weiter aufgeklärt werden.

Bildung und Dynamik von Faserstrukturen zusammen mit den Schalenblattanordnungen unter HS-AFM. a Auftreten von faserähnlichen Strukturen beim Zerlegen von Hüllenblättern aus Hoch_5815-Hexameren, wie durch AFM-Bilderserien gezeigt. b AFM-Topograph von Faserstrukturen. c Querschnittsanalyse (gestrichelte Linie im Feld b ) zeigt einen Abstand von 3,72 ± 0,31 nm (n = 30) zwischen benachbarten Faserstrukturen, und die durchschnittliche Höhe beträgt 2,46 ± 0,22 nm (n = 30). d AFM-Topograph von Schalenflecken aus Hoch_5815-Hexameren. e Querschnittsanalyse (gestrichelte Linie im Feld d ) zeigt, dass die durchschnittliche Höhe der Hoch_5815-Hexamere 3,45 ± 0,16 nm (n = 25). f Die faserartigen Strukturen weisen eine geringere Höhe auf als flache Platten aus Hoch_5815 Hexameren (*p <  0,05, Zweiwege-ANOVA). g Vorgeschlagene Organisation und Bildung der faserartigen Struktur, die eine Kette von Hoch_5815-Monomeren darstellt

Diskussion

BMCs umfassen Hunderte von Proteinen, die sich selbst anordnen, um die höher geordneten Strukturen zu bilden. Die BMC-Hülle, bestehend aus zahlreichen Proteinhomologen, ist ein ideales System zur Untersuchung der Protein-Selbstorganisation und -Wechselwirkungen. Als leistungsstarke Technik zur Analyse der Biomembranorganisation, des Proteinaufbaus und der physikalischen Wechselwirkungen, die für die physiologischen Funktionen biologischer Systeme von großer Bedeutung sind [32, 35, 38, 39], wurde AFM genutzt, um die Organisations- und Selbstorganisationsdynamik von BMC-Hüllenproteine ​​und die Architekturen und mechanischen Eigenschaften von BMC-Strukturen [12, 30, 31, 40, 41, 42]. Diese Arbeit stellt unseres Wissens die erste quantitative Bestimmung der Selbstorganisationsdynamik von BMC-Hüllproteinen bei der Bildung zweidimensionaler Schichten als Reaktion auf Umweltveränderungen mit AFM dar. Die Ergebnisse unterstreichen die inhärente Variabilität und Umweltabhängigkeit der BMC-H-Protein-Selbstorganisation. Im Vergleich zu EM und DSL bietet AFM ein großes Potenzial bei der Überwachung der dynamischen Aktionen der BMC-Protein-Selbstorganisation in Echtzeit mit molekularen Details.

Protein-Protein-Interaktionen sind von wesentlicher Bedeutung für die Bildung und Gestaltung der BMC-Schale [10]. Auch die Proteinkonzentration ist als entscheidender Faktor für die Schalenbildung dokumentiert [41, 43]. Darüber hinaus haben In-vitro-Löslichkeitsstudien gezeigt, dass der pH-Wert und die Ionenstärke in Lösung die strukturelle Stabilität von BMCs [17, 27] sowie das Montageverhalten von BMC-Hüllproteinen bei der Bildung zweidimensionaler Schichten beeinflussen könnten [37, 41 ], Nanoröhren [13, 17] und Nanokäfige [28], die an ihren Einfluss auf die Viruskapsid-Assemblierung erinnern [44, 45]. Wir fanden auch Proteinausfällungen und keine Bildung von Flecken, wenn pH> 10 und <  3 oder die Salzkonzentration <  10 mM oder> 600 mM (unveröffentlichte Daten) war. Hier haben wir weiter gezeigt, dass die Tendenz und Dynamik der Anordnung vom pH-Wert und der Salzkonzentration abhängig sind. Obwohl sich Schalenproteine ​​in einem weiten pH-Bereich selbst anordnen können, scheint die neutrale pH-Umgebung in der Lage zu sein, die Montagedynamik zu verbessern (Abb. 2b). Es wurde gefunden, dass Kationen mit einer Konzentration von ≥ 300 mM die Bildung von zweidimensionalen Schichten fördern; 400 mM Kationen scheinen für die Bildung großer und stabiler einschichtiger Schichten wünschenswert zu sein (Abb. 3). Diese Bedingungen stimmen mit den zytosolischen Bedingungen von Bakterienzellen überein und sind physiologisch relevant. Unter den meisten physiologisch relevanten Bedingungen ist beispielsweise der pH-Wert des E. coli Cytosol beträgt ungefähr 7,4–7,8 [46] und die Ionenkonzentration beträgt ungefähr 100–400 µM, was für Proteininteraktionen, Protein-Ligand-Bindung, Signalübertragung, Aufrechterhaltung elektrostatischer Membranpotentiale und Proteingradienten über Membranen hinweg von entscheidender Bedeutung ist [47, 48]. Obwohl noch weiter untersucht werden muss, wie Wechselwirkungen zwischen Proben und dem Glimmersubstrat die Selbstorganisation von BMC-Proteinen beeinflussen, bietet uns die AFM-Bildgebung die Möglichkeit, die dynamischen Veränderungen der Selbstorganisation von BMC-Proteinen als Reaktion auf Umweltvariationen quantitativ zu analysieren.

Die hier beschriebene umgebungsabhängige Montagedynamik von BMC-Proteinen bei der Bildung von Schalenfragmenten könnte ihr Verhalten bei der Bildung der gesamten BMC darstellen. Tatsächlich scheinen die 3D-BMC-Strukturen die dynamisch erhaltenen Organellen zu sein, die in der Natur entworfen wurden. BMCs weisen eine bemerkenswerte strukturelle Flexibilität und Heterogenität auf; die mechanische Weichheit der BMC-Schalenstrukturen, die durch AFM-Nanoindentation bestimmt wurde [30] und die Nichtgleichgewichtsdynamik der BMC-Assemblierung, die durch Computersimulationen aufgedeckt wurde, [49] verdeutlichten die Unterschiede zwischen BMC und robusten Virus-Assemblies. Ebenso wurde die Korrelation der Biosynthese von Carboxysomen mit Licht und Chaperonen aufgeklärt [50, 51]. Vor kurzem wurde gezeigt, dass CcmK3 und CcmK4 in Abhängigkeit vom pH-Wert Heterohexamere bilden und die Carboxysomhülle verkappen können, was möglicherweise ein Mittel zur Regulierung der Permeabilität der Carboxysomhülle und des CO₂ . darstellt Assimilation in der hochdynamischen Mikroumgebung [52]. Der genaue Mechanismus, der dem Einfluss der Umgebungsbedingungen in Lösung auf den thermodynamischen Aufbau von BMC-Proteinen zugrunde liegt, muss noch untersucht werden, beispielsweise durch eine Kombination aus experimentellen Studien und Computersimulationen.

Angesichts der Selbstorganisation von BMC-Strukturen besteht ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von BMCs und dem Design neuer BMC-basierter Nanobioreaktoren, molekularer Gerüste und Biomaterialien in biotechnologischen Anwendungen, z . Fortgeschrittene Kenntnisse über die strukturelle Widerstandsfähigkeit und Variabilität von BMCs als Reaktion auf Umweltveränderungen werden nicht nur Strategien zur Herstellung robuster BMC-basierter Nanostrukturen in heterologen Wirten, d. h. E. coli oder Pflanzen [31, 53, 54], sondern ebnen auch den Weg für die Modulation der Bildung von 2D-Nanomaterialien sowie das Öffnen und Schließen von Proteinkäfigen auf der Basis von BMC-Schalen, wodurch die funktionelle Regulation und der gezielte molekulare Transport erleichtert werden. Zuvor haben wir die Machbarkeit des genetischen Modifikationsansatzes gezeigt, um die spezifischen Kontakte an den Grenzflächen von Schalenproteinen und ihr Selbstorganisationsverhalten zu manipulieren [12]. Diese Studie stärkt unsere Toolbox zur Bewertung und Manipulation der BMC-Schalen-Selbstmontage in unterschiedlichen Umgebungen.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir HS-AFM genutzt, um quantitative Untersuchungen der BMC-Hüllprotein-Selbstorganisation unter verschiedenen pH- und Salzbedingungen durchzuführen. Es wurde gezeigt, dass die Bildung größerer einschichtiger Patches von Schalenhexameren bei einer Salzkonzentration von 400 mM gefördert wird, und ein neutraler pH-Wert führte zu einer höheren dynamischen Geschwindigkeit der Hexamer-Selbstorganisation. Der organisatorische Übergang von Hüllenproteinen von hexameren Anordnungen zu faserähnlichen Anordnungen wurde ebenfalls visualisiert. Diese Studie zeigte, dass Umweltbedingungen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Organisation und Selbstorganisation von BMC-Hüllenproteinen spielen.

Abkürzungen

BMC:

Bakterielles Mikrofach

BMC-H:

Bakterielles Mikrokompartiment Hexamer

BMC-P:

Bakterielles Mikrokompartiment Pentamer

BMC-T:

Bakterien-Mikrokompartiment-Trimer

DSL:

Dynamische Lichtstreuung

E. coli :

Escherichia coli

EM:

Elektronenmikroskopie

HS-AFM:

Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie