Untersuchung von ROS und Zellzyklusarrest in den genotoxischen Effekten von Goldnanostäbchen-Kern/Silbermantel-Nanostrukturen

Zusammenfassung

Um die durch Silbernanopartikel (AgNPs) und Silberionen in der Leber induzierte Genotoxizität zu verstehen, wurden in dieser Studie eine konstruierte Goldnanostäbchen-Kern/Silbermantel-Nanostruktur (Au@Ag NR) und humanisierte Hepatozyten HepaRG-Zellen verwendet. Die Beteiligung von oxidativem Stress und Zellzyklusarrest an der durch 0,4–20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR induzierten DNA- und Chromosomenschädigung wurde durch Kometenassay, γ-H2AX-Assay und Mikronukleus-Test untersucht. Weiterhin wurde die Verteilung von Au@Ag NR analysiert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl Ag⁺ als auch Au@Ag NR zu DNA-Spaltung und Chromosomenschädigung (Klastogenität) in HepaRG-Zellen führten und dass der im Zellkern zurückgebliebene Au@Ag NR weiterhin Ag⁺ freisetzen kann, was die Schäden verschlimmert, die hauptsächlich durch Zellzyklusarrest und ROS-Bildung verursacht werden. Die Ergebnisse offenbaren die Korrelation zwischen intrazellulärer Anreicherung, Ag⁺-Ionenfreisetzung und der potenziellen Genotoxizität von AgNPs.

Einleitung

Silbernanopartikel (AgNPs), 1 bis 100 nm groß, können ein breites Spektrum antimikrobieller Eigenschaften aufweisen, indem sie in Pathogene eindringen und die innere Sulfhydrylgruppe ihrer Stoffwechselenzyme inaktivieren. Sie zeigten potente bakteriostatische und bakterizide Wirkungen gegen Escherichia Coli, Neisseria gonorrhoeae und Chlamydia trachomatis und werden breit als medizinische Beschichtungen, Haushaltsprodukte sowie Wundauflagen eingesetzt. Überzeugende Beweise zeigen, dass Nanopartikel in der Lage sind, in den Zellkern einzudringen und die Synthese und Transkription von DNA zu beeinträchtigen. In einer früheren Studie berichteten wir, dass eine einzelne intravenöse Dosis von 5 mg/kg AgNPs bemerkenswerte Chromosomenbrüche in Knochenmarkzellen von Sprague-Dawley-Ratten hervorrufen konnte. Eine einzelne intraperitoneale Injektion von 10 mg/kg oder mehr AgNPs induzierte sowohl DNA- als auch Chromosomenschäden. Flower et al. schlugen vor, dass AgNPs bei Dosen von 50 und 100 µg ml⁻¹ innerhalb von fünf Minuten nach Verabreichung DNA-Schäden auslösen könnten, was die Genotoxizität von schnell freigesetztem Silber (Ag) unterstreicht. Angesichts des Risikos übermäßiger Exposition hat die Untersuchung von Nano-Genotoxikologie oder dem DNA-Schaden und kanzerogenen Potenzial von konstruierten Nanomaterialien viel Aufmerksamkeit erhalten.

Die Hauptmechanismen für AgNP-induzierte genetische Schäden werden in der Überproduktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Entzündung und Zellzyklusstörung gesehen. Wie in früheren Studien vorgeschlagen, könnten AgNPs entweder direkt über oxidativen Schaden mit DNA interagieren und in der Interphase auf DNA-Ebene und in der Mitose auf chromosomaler Ebene eingreifen, oder mit Nukleoproteinen und dem mitotischen Spindelapparat interagieren, um Zellzyklus-Checkpoints zu stören. Allerdings ist noch unklar, ob die durch AgNPs induzierte Genotoxizität teilweise den Nanopartikeln oder vollständig den freigesetzten Ag⁺-Ionen zuzuschreiben ist.

Die Untersuchung der Genotoxizität von AgNPs ist schwierig aufgrund der instabilen und ununterbrochenen Freisetzung von Silber in Geweben, was die Lokalisierung der AgNPs und die Differenzierung des Nanokerns vom Ag erschwert. Unsere Gruppe hat kürzlich eine Goldnanostäbchen-Kern/Silbermantel (Au@Ag NR) Nanostruktur für die Untersuchung der durch Nanopartikel induzierten Toxizität entwickelt. Der Goldkern von Au@Ag NR ist physiologisch inert im Gewebe und konnte als interner Standard zur Überwachung der Freisetzung von Ag⁺-Ionen aus dem Stab durch Überwachung der Änderung des Ag/Au-Verhältnisses, gemessen mittels induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS), verwendet werden. Mit dieser Methode können die unterschiedlichen Ursprünge der Toxizitäten identifiziert werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass die aus der Schale von Au@Ag NR freigesetzten Ag⁺-Ionen Nierenoxidativen Schaden verursachten und schließlich zu morphologischen Veränderungen und Beeinträchtigung der Filtrationsfunktion des Glomerulus führten. Jiang et al. schlugen vor, dass sowohl partikelspezifische Aktivität als auch intrazelluläre Silberionenfreisetzung durch Au@Ag NR zur toxischen Reaktion von Granulosazellen beitragen. Wir nutzten Au@Ag NR auch als Modell, um das in-vivo-Genotoxizitätspotenzial von AgNPs zu untersuchen und demonstrierten, dass Klastogenität, und nicht Mutagenität, die primäre Form der durch sowohl die Ag-Schale als auch die freigesetzten Ag⁺-Ionen induzierten Genotoxizität ist, während es keinen Unterschied in ihren Toxizitätsmustern gab.

Die Leber ist eines der Hauptorgane, die zur Anreicherung von AgNPs neigen, und wird als Zielorgan/Gewebe für AgNP-induzierte Genotoxizität erkannt. Unsere frühere Studie zeigte, dass acht Wochen nach intravenöser Verabreichung einer Dosis Au@Ag NR noch etwas Silber (8,26 ± 3,90 µg/g) und Gold (80,07 ± 64,72 µg/g) in den Lebern von SD-Ratten verblieben. In dieser Studie versuchten wir, die Rollen von Zellzyklusarrest und reaktivem oxidativem Stress auf AgNP-induzierte Chromosomen- und DNA-Schäden mittels Au@Ag NR in humanen hepatomabgeleiteten HepaRG-Zellen zu identifizieren. Genotoxizitätsassays, einschließlich Kometenassay, γ-H2AX-Assay und Mikronukleus-Test, wurden parallel mit oxidativem Radikalfänger durchgeführt, um den Beitrag reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) an DNA/Chromosomenschäden zu untersuchen, während Zellapoptose, Zellzyklus und verwandte Proteine bestimmt wurden, um die Mechanismen zu erforschen, durch die AgNPs die Synthese und Replikation von DNA unterbrechen. Weiterhin wurde die intrazelluläre Anreicherung und Verteilung von Au@Ag NR durch Kombination von ICP-MS und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht, um die Rolle von Nanopartikeln und freigesetzten Ag-Ionen zu differenzieren.

Materialien und Methoden

Zellkultur und Behandlung

Die humane Hepatom-Zelllinie HepaRG (Thermo Fisher Scientific) wurde in dieser Studie verwendet. Zellen wurden in RPMI 1640 mit 10 % fötalem Rindserum (FBS, Australien-Ursprung, Gibco) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung (Gibco) in einer feuchten Atmosphäre von 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert. Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von Au@Ag NR für 24 h bzw. 72 h behandelt, und die Konzentrationen wurden gemäß IC₅₀ bestimmt, geschätzt durch Zellviabilitätsassay. Zur Untersuchung der Rolle von ROS in der Genotoxizität wurde 1 mM N-Acetyl-L-cystein (NAC, Sigma-Aldrich) 1 h vor der Behandlung mit Au@Ag NR angewendet.

ATP-Zellwachstums/Viabilitätsassay

Die Zellen wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 5 × 10³/Well ausgesät. Nach 24 h Inkubation wurde das Medium aspiriert und die Zellen wurden für 24 h bzw. 48 h verschiedenen Konzentrationen von Au@Ag NR ausgesetzt. Ein breites Konzentrationsspektrum wurde hergestellt, und vier Wells pro Behandlung wurden in einem Behandlungszeitraum durchgeführt. Die Zytotoxizität von Au@Ag NR wurde durch Adenosintriphosphat (ATP) Assay (CellTiter-Glo® 2.0 Assay, Promega) untersucht, der die zelluläre metabolische Aktivität durch Quantifizierung der ATP-Menge misst, ein wichtiger Stoffwechselparameter in lebensfähigen Zellen. Die lumineszenten Signale, die die Mengen lebensfähiger Zellen widerspiegeln, wurden mit VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer) detektiert, und IC₅₀-Werte wurden als Konzentration von Au@Ag NR für halbmaximale Viabilität durch Prism 7 (GraphPad Prism 7, CA, USA) geschätzt. Der Viabilitätsquotient wird mit folgender Gleichung berechnet: Viabilitätsquotient (%) = RLU_sample / RLU_vehicle × 100 %, wobei RLU die relative Lichteinheit als Mittelwert von vier Wells darstellt, RLU_vehicle Zellen ohne Nanostäbchen-Behandlung und RLU_sample Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Au@Ag NR behandelt wurden.

Konzentrationsbestimmung von Silber und Gold in Zellen

Die Zellproben wurden in Salpetersäure mit einem Mikrowellen-Aufschlusssystem aufgeschlossen. Nach dem Aufschluss wurden die Proben mit einer Mischung aus 1 % Salpetersäure und Salzsäure vorbereitet. Die Mengen an Ag und Au in den Lösungen wurden durch ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer) bestimmt. TEM-Analyse wurde verwendet, um das Vorhandensein von Au NR und Au@Ag NR in der Zelle zu bestimmen. Die Zellproben wurden in einer Mischung aus 2,5 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd für 2 h bei 4 °C fixiert. Die Zellpellets wurden fixiert und dreimal in Phosphatpuffer (pH 7,4) gespült und in 1 % Osmiumtetroxid für 2 h bei 4 °C nachfixiert. Die Proben wurden anschließend dreimal in destilliertem Wasser gespült und für 15 min in verschiedenen Ethanolkonzentrationen (50 %, 70 %, 90 % und 100 % Ethanol) nacheinander dehydriert. Anschließend wurde Propylenoxid bei 1:1 und 1:3 Verdünnungen auf das Harz bei 20–26 °C für 2 h aufgebracht. Polymerisation erfolgte durch stufenweises Erhitzen bei 35 °C für 16 h, 45 °C für 8 h, 55 °C für 14 h und 65 °C für 48 h. Ultradünne Schnitte wurden 25 min mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und mit einem Transmissionelektronenmikroskop (H-7650, HITACHI, Japan) analysiert.

Konventioneller und modifizierter Kometenassay

Die Zellen wurden in 12-Well-Platten mit Dichten von 2 × 10⁵/Well bzw. 3 × 10⁵/Well für 24- bzw. 72-h-Behandlung ausgesät. Wasserstoffperoxid (H₂O₂) bei einer Konzentration von 200 µmol wurde den Zellen als Positivkontrolle für eine Stunde ausgesetzt. Für jedes Sample wurden zwei Wells sowohl für die konventionelle Behandlung als auch für die Formamidopyrimidin-Glykosylase (Fpg)-Behandlung vorbereitet. Der konventionelle Kometenassay wurde unter alkalischen Bedingungen (pH > 13) wie zuvor beschrieben durchgeführt. Für die Fpg-behandelten Wells wurde eine zusätzliche Fpg-Behandlung vor dem DNA-Entwindungsverfahren angewendet, und die Objektträger wurden dreimal für je 5 min in einen Enzympuffer (0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0,2 mg ml⁻¹ BSA) getaucht. Das Fpg (New England Biolabs, Inc., UK) wurde 1:50.000 mit Enzympuffer verdünnt. Einhundert Milliliter Aliquots des verdünnten Enzyms wurden zu jedem Gel auf den Mikroskopobjektträgern gegeben und in einer Feuchtkammer bei 37 °C für 30 min inkubiert. Die verbleibenden Schritte waren identisch mit der konventionellen Behandlung. Die Kometenassays wurden in Triplicate durchgeführt. Mindestens 50 Zellen pro Sample wurden unabhängig mit einem Nikon Eclipse 80i Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) ausgewertet, während Komet 6.0 (Andor Technology, Belfast, UK) zur Analyse des Mittelwerts von Prozent DNA im Schweif und Olive Tail Moment (OTM) jedes Samples verwendet wurde.

Quantifizierung von γ-H2AX-Foki durch Durchflusszytometrie und High-Content-Screening

Für die Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie wurden Zellen in 12-Well-Platten mit Dichten von 2 × 10⁵/Well bzw. 3 × 10⁵/Well für 24- bzw. 72-h-Behandlung ausgesät, während für den High-Content-Screening-Assay Zellen in 96-Well-Platten mit Dichten von 6 × 10³/Well bzw. 1 × 10⁴/Well für 24- bzw. 72-h-Behandlung ausgesät wurden. Als Positivkontrolle wurde 2 µM Methylmethansulfonat (MMS, Sigma-Aldrich) parallel zu den Zellen für eine Stunde angewendet. Die Zellen wurden in Tris-gepuffertem Salzlösung (TBS) gespült und mit 4 % Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur fixiert. Nach Waschen mit TBS wurden die Zellen mit 50 µl eiskaltem Methanol für 30 min bei -20 °C inkubiert. Die Zellen wurden weitere dreimal in TBS gespült, und das Blockierungsreagenz (TBS mit 0,3 % Triton X-100 und 10 % Ziegenserum) wurde für 1 h angewendet. Der primäre Antikörper (Maus anti-phospho-H2AX Ser139, Millipore) wurde 1:200 mit Blockierungsreagenz verdünnt und über Nacht bei 4 °C mit den Zellen inkubiert. Die Platte wurde erneut dreimal mit TBS gespült, und der sekundäre Antikörper (Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus, Life Technologies), verdünnt mit Blockierungsreagenz im Verhältnis 1:20, wurde anschließend hinzugefügt. Die Proben wurden 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur belassen, und 2 µg ml⁻¹ (20 µl/Well) DAPI (Invitrogen) wurde jedem Well hinzugefügt. Die Fluoreszenz wurde mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) oder High Content Analysis System (Operetta CLS, PerkinElmer) gemessen. Für den Durchflusszytometrie-Assay wurden Daten von mindestens 10.000 Zellen pro Gruppe analysiert, und die Experimente wurden in Triplicate durchgeführt; für High-Content-Analyse wurden 20 Sichtfelder in jedem Well und mindestens fünf Wells in jeder Gruppe analysiert.

Cytokinesis-block Mikronukleus Cytom (CBMN-cyt) Assay

CBMN-cyt wurde gemäß dem von Fenech et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt. Zellen wurden in 12-Well-Platten mit Dichten von 2 × 10⁵/Well bzw. 3 × 10⁵/Well für 24- bzw. 72-h-Behandlung ausgesät. 0,2 µg ml⁻¹ Mitomycin C (MMC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Japan) wurde den Zellen als Positivkontrolle für 24 h ausgesetzt. 3 µg ml⁻¹ Cytochalasin B wurde nach 24- bzw. 72-h-Behandlung angewendet, um den Cytokinese-Prozess zu blockieren, und die Zellen wurden nach 40 h geerntet. Die Proben wurden mit 5 % Giemsa nach Hypotonie mit vorgewärmtem 0,075 mol L⁻¹ KCl und Fixierung mit einer 3:1 Mischung aus Methanol und Essigsäure gefärbt. Triplicate Wells pro Gruppe wurden vorbereitet, und mindestens 1000 binukleierte Zellen pro Well wurden untersucht.

Messung von MDA, gesamtem GSH und SOD Gehalt

Die Zellen wurden in 12-Well-Platten mit Dichten von 5 × 10⁵/Well bzw. 3 × 10⁵/Well für 24- bzw. 72-h-Behandlung kultiviert. Anschließend wurden die Zellen geerntet und dreimal mit Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) gespült. Die Mengen an Malondialdehyd (MDA) in den Zellhomogenaten wurden mit einer Thiobarbitursäure-basierten Methode (Nanjing Jiancheng Bio-engineering Institute, Nanjing, China) bestimmt. Die Mengen an gesamtem Glutathion (GSH) und Superoxiddismutase (SOD) wurden mittels Gesamtglutathion-Quantifizierung und SOD-Assay-Kits (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kumamoto, Japan) bestimmt. Optische Dichten (O.D.) jedes Wells wurden mit VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer) gemessen.

Durchflusszytometrische Analyse des Zellzyklus

Die Zellen wurden in 6-Well-Platten mit Dichten von 1 × 10⁶/Well bzw. 5 × 10⁵/Well für 24- bzw. 72-h-Behandlung kultiviert und anschließend mit 70 % Ethanol bei 4 °C über Nacht fixiert. Die Proben wurden dreimal mit PBS gespült und mit PI/Rnase-Färbepuffer (BD Biosciences) für 15 min bei Raumtemperatur gefärbt. Zellpopulationen in G0/G1, S und G2/M Phase unter 20.000 Zellen wurden durch Anwenden von Regionen mit FL2 Fläche versus FL2 Breite bestimmt. Analyse erfolgte durch Durchflusszytometrie (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) und FlowJo (BD Bioscience), und die Experimente wurden in Triplicate durchgeführt.

Durchflusszytometrische Analyse der Zellapoptose

Die Zellen wurden in 6-Well-Platten mit Dichten von 1 × 10⁶/Well bzw. 5 × 10⁵/Well für 24- bzw. 72-h-Behandlung kultiviert. Sie wurden anschließend zweimal mit PBS gespült und mit 500 µl 1× Bindungspuffer (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Bioscience) verdünnt, um die Suspension auf ca. 1 × 10⁶ Zellen/ml einzustellen, und anschließend wurden 100 µl Verdünnung mit 5 µl FITC Annexin V und 5 µl PI gemischt. Die Proben wurden 15 min bei Raumtemperatur gefärbt, und mindestens 10.000 Zellen wurden analysiert, um die Zellpopulation in früher und später Apoptose durch Anwenden von Regionen mit FL1H versus FL2H mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) und FlowJo (BD Bioscience) zu bestimmen. Die Experimente wurden in Triplicate durchgeführt.

Western Blot Analyse

Die Zellen wurden in einem 75-cm²-Flasken mit Dichten von 1 × 10⁷/Well und 6 × 10⁶/Well für 24- bzw. 72-h-Behandlung kultiviert. Die Zellen wurden mit RIPA-Lysepuffer mit Proteaseinhibitor (PMSF) lysiert, und die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Proteinkuantifizierungskit (Beyotime Biotechnology, China) bestimmt. Die Konzentrationen der Proben wurden vor Denaturierung durch Erhitzen bei 95 °C für 3 min mit RIPA-Lysepuffer angepasst. Die Proteinproben wurden durch Elektrophorese auf 12 % SDS-Polyacrylamidgelen getrennt und auf Nitrocellulosemembranen (Millipore) transferiert. Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch für 30 min blockiert und mit primären Antikörpern gegen p53 (SC-137174, Santa Cruz), p21 (SC-6246, Santa Cruz) und β-Actin (sc-47778, Santa Cruz) sowie sekundären Antikörpern Ziege anti-Maus IgG(H+L)-HRP (SE131, solabio) inkubiert. Die Expressionslevel der Zielproteine in den Proben wurden mit einer verstärkten Chemilumineszenz (ECL) Methode visualisiert und mit ImageJ System (National Institutes of Health) analysiert.

Statistische Analysen

Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um die statistische Signifikanz von Unterschieden zwischen Negativkontroll- und Behandlungsgruppen zu testen, gefolgt von Dunnett-Mehrfachvergleichstest mit SPSS (Version 22, IBM, Armonk, NY, USA), und Daten wurden als statistisch signifikant bei P < 0,05 betrachtet. Die Abbildungen wurden mit GraphPad Prism 7 für Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) erstellt.

Ergebnisse

Charakterisierung von Au NR und Au@Ag NR

Goldnanostäbe (Au NRs), Goldnanostäbchen-Kerne und Silbermantel-Nanostrukturen (Au@Ag NR) wurden wie zuvor beschrieben konstruiert, hergestellt und charakterisiert. Kurz gesagt, die mittleren Durchmesser und Längen betragen 15,0 ± 2,5 nm, 66,7 ± 2,5 nm für Au NRs und 26,2 ± 3,0 nm, 72,7 ± 8,9 nm für Au@Ag NRs. Die Ag-Manteldicke beträgt ca. 5 nm. Die Zeta-Potenziale von PDDAC-beschichteten Au NRs und Au@Ag NRs dispersiert in Wasser betrugen 37,7 ± 1,6 mV bzw. 52,5 ± 1,4 mV. Das Ag/Au-Gewichtsverhältnis des hergestellten Au@Ag NR wurde auf 2,3 geschätzt. Die Charakterisierungsergebnisse sind in Abb. 1 dargestellt.

Zellviabilität

Die Zytotoxizität von Au@Ag NR gegenüber HepaRG-Zellen wurde durch ATP-Viabilitätsassay untersucht (Tabelle 1), und die Zellen wurden für 24 bzw. 48 h bei Konzentrationen von 0,125 bis 160 µg ml⁻¹ Au@Ag NR ausgesetzt. Au@Ag NR induzierte signifikante zytotoxische Effekte sowohl zeit- als auch dosisabhängig nach 24 und 48 h Exposition, mit % Viabilität IC₅₀ bei 20 µg ml⁻¹ und 6 µg ml⁻¹, angepasst durch die Software GraphPad Prism 7.0. In Anbetracht der Gesamtzytotoxizität wurden die Behandlungszeiträume auf 24 h und 72 h angepasst, während die angewendeten Konzentrationen auf 0,8 µg ml⁻¹, 4 µg ml⁻¹ und 20 µg ml⁻¹ festgelegt wurden. Zusätzlich wurde Au NR als inerter Kontrolle einbezogen, und der Au-Gehalt in der AuNR-Gruppe war derselbe wie bei 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR, was 16 µg ml⁻¹ entspricht. Im Gegensatz dazu wurde 1 mM NAC-Vorbehandlung in der Au@Ag NR + NAC-Gruppe als Kontrolle für oxidativen Stress-Response eingesetzt (Konzentration von Au@Ag NR ist 20 µg ml⁻¹).

Zellverteilung von Au NR und Au@Ag NR

Die Verteilung von Au- und Ag-Gehalt in den HepaRG-Zellen wurde durch ICP-MS analysiert. Wie in Tabellen 2 und 3 gezeigt, stieg der Ag-Gehalt dosisabhängig an. Allerdings kann das Antioxidans N-Acetyl-L-cystein (NAC) als Radikalfänger die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln einschränken, da geringerer Ag-Gehalt beobachtet wurde, obwohl dieselbe Konzentration von Au@Ag NR (20 µg ml⁻¹) in dieser Gruppe angewendet wurde. Der Rückgang des Ag/Au-Verhältnisses von 24 auf 72 h deutete auf eine kontinuierliche Freisetzung von Ag⁺ aus der Schale von Au@Ag NR hin. Auch war die zelluläre Aufnahme von Ag viel höher als die von Au (Tabelle 4). Darüber hinaus zeigten TEM-Daten, dass die meisten Au NR und Au@Ag NR als Agglomerate in den Zellen zurückgeblieben sind. Die Nanostäbchenstrukturen waren deutlich in den Zellen nach Exposition gegenüber Au NR oder Au@Ag NR ohne Eindringen in den Zellkern zu sehen (Abb. 2).

DNA-Schädigung

Die durch Au@Ag NR ausgelöste DNA-Schädigung wurde sowohl durch Kometenassay als auch γH2AX-Assay bewertet (Abb. 3). Aus dem Kometenassay war zu beobachten, dass 0,8 bis 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR signifikante DNA-Schäden hervorrufen konnten. Nach 24- bzw. 72-h-Exposition gegenüber Au@Ag NR stiegen sowohl % Schweif-DNA als auch OTM der Zellen sowohl zeit- als auch konzentrationsabhängig an. Zusätzlich wurde DNA-Schädigung assoziiert mit oxidativer Stressinduktion in den mit 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR behandelten Zellen durch den Fpg-Enzym-modifizierten Kometenassay beobachtet (Abb. 3a, b). Zur Bewertung des Ausmaßes von Doppelstrangbrüchen, die eine höhere Korrelation zur Krebsentstehung aufweisen, wurden sowohl γ-H2AX-positive Zellen als auch mittlere Fluoreszenzintensitäten in γ-H2AX-positiven Zellen analysiert. Nach 24-h-Exposition gegenüber Au@Ag NR wurde kein Unterschied zwischen den Gruppen in γ-H2AX-positiven Zellen gefunden. Allerdings verursachte die 4 µg ml⁻¹ Au@Ag NR-Gruppe nach 72-h-Behandlung einen signifikanten Anstieg. Signifikante Erhöhungen der Fluoreszenzintensitäten wurden in allen Au@Ag NR-Gruppen nach 72 h im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle beobachtet (Abb. 3c–e, P < 0,05).

Chromosomenschädigung

Die Bildung von Mikronuklei ist ein signifikanter Biomarker für die Identifizierung von Chromosomenschäden, was eine kritischere Schädigung des genetischen Materials als DNA-Brüche darstellt. Der Anteil binukleierter Zellen mit Mikronukleus wurde wie in Abb. 4c dargestellt bewertet. Au@Ag NR erhöhte die Mikronukleusbildung in einem konzentrationsabhängigen Muster. Nach 24-h-Exposition betrugen die Mikronukleus-Anteile in Zellen, behandelt mit 4 µg ml⁻¹ Au@Ag NR und 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR, 1,133 ± 0,145 % bzw. 1,567 ± 0,318 %, beide signifikant höher als in der Fahrzeugkontrollgruppe. Nach 72-h-Exposition betrug der Mikronukleus-Anteil in Zellen, behandelt mit 4 µg ml⁻¹ Au@Ag NR, 1,767 ± 0,233 %, signifikant höher als die Fahrzeugkontrolle; der Anteil in Zellen, behandelt mit 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR, betrug 2,167 ± 0,252 %, signifikant höher als sowohl in der Fahrzeugkontrollgruppe als auch in der 16 µg ml⁻¹ Au NR-Gruppe (0,700 ± 0,153 %). Im Gegensatz dazu wurde kein Unterschied zwischen Zellen, behandelt mit 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR + NAC, und Fahrzeugkontrolle gefunden, was die Beteiligung von ROS an der durch Au@Ag NR induzierten Chromosomenbruchbildung nahelegt.

Einfluss von Au@Ag NR auf ROS-Bildung

Um die Rolle der ROS-Bildung in Au@Ag NR-induzierten DNA- und Chromosomenschäden weiter zu erforschen, wurden MDA, GSH und SOD-Level geschätzt. Ein signifikanter Anstieg der MDA-Bildung (P < 0,05) wurde nach Exposition gegenüber 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR für sowohl 24 als auch 72 h beobachtet (Abb. 5a). Weiterhin zeigten die GSH- und SOD-Level in Zellen, exponiert gegenüber Au@Ag NR, signifikante Reduktion (P < 0,05) in zeit- und konzentrationsabhängiger Weise. Diese Ergebnisse deuteten auf ein Ungleichgewicht zwischen Oxidation und Antioxidation hin, erzeugt durch die Exposition gegenüber Au@Ag NR (Abb. 5b, c).

Einfluss von Au@Ag NR auf Zellzyklus und Apoptose

Nach 72-h-Exposition gegenüber Au@Ag NR wurde ein Anstieg der Zellzahlen in Phase G2/M in 4 µg ml⁻¹ Au@Ag NR, 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR und Au@Ag NR + NAC-Gruppe beobachtet, mit Anteilen von 32,63 % ± 1,77 %, 32,267 % ± 2,17 % und 32,967 % ± 4,25 % (Abb. 6a, b), die signifikant größer waren als in der Fahrzeugkontrollgruppe (22,37 % ± 0,92 %). Gleichzeitig konnte Zellapoptose, induziert durch Au@Ag NR, nach 72-h-Exposition beobachtet werden, und die späte Apoptose-Rate von Zellen, behandelt mit 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR und 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR + NAC, betrug 78,90 ± 1,19 % bzw. 70,20 ± 4,50 % (Abb. 6c, d). Au@Ag NR induzierte mehr späte Apoptose als frühe Apoptose, und die NAC-Behandlung konnte die späte Apoptose-Rate, ausgelöst durch Au@Ag NR, lindern.

Die Expressionslevel von p21 und p53 wurden durch Western Blots detektiert, und ein ähnliches Muster wurde beobachtet. Die Expressionslevel von p53 und p21 in Zellen, behandelt mit 4 µg ml⁻¹ und 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR, waren deutlich erhöht (P < 0,05) und signifikant erniedrigt in Zellen, behandelt mit sowohl 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR als auch NAC (P < 0,05, verglichen mit 20 µg ml⁻¹ Au@Ag NR Gruppe, Abb. 6e–h). Es ist bekannt, dass p53-Protein ein Kernmolekül ist, das die G2/M-Checkpoint-Aktivierung als Reaktion auf DNA-Schäden vermittelt, und p21 wird als p53-abhängiger Zellzyklusinhibitor erkannt. Daher könnte Au@Ag NR die DNA-Replikation beeinträchtigen und die DNA-Reparatur durch Zellzyklusarrest behindern.

Diskussion

Derzeit sind die Rollen der freigesetzten Ag⁺ und AgNPs bei der Erzeugung von Genotoxizität noch nicht geklärt. Frühere Studien unserer Gruppe und anderer haben gezeigt, dass während Ag⁺ die Hauptquelle für die Einführung von Toxizitäten ist, Nanopartikel auch hochtoxisch sein können. Beispielsweise könnten AgNPs zur Genotoxizität beitragen, indem sie die Bildung von Hydroxylradikalen induzieren. Weiterhin wurden durch AgNPs im Vergleich zu Ag⁺ allein schwerwiegendere Chromosomenschäden, oxidativer Stress und Apoptose eingeführt, was darauf hindeutet, dass unterschiedliche Wege beteiligt sein könnten. Wir verwendeten Au@Ag NR als Modellmaterial, um die Formen und Verteilungen von AgNPs in Zellen zu verstehen, und die Mengen an intrazellulärem Ag und Au wurden durch ICP-MS bestimmt. Das Ag/Au-Gewichtsverhältnis des hergestellten Au@Ag NR wurde auf 2,3 geschätzt. Nach 24-h-Exposition stieg es jedoch in den mit Au@Ag NR behandelten Zellen drastisch auf 16,5 an, was darauf hindeutet, dass große Mengen Ag innerhalb dieses Zeitraums aus der Schale von Au@Ag NR freigesetzt wurden. Als der Expositionszeitraum von Au@Ag NR auf 72 h verlängert wurde, sank das Au/Au-Gewichtsverhältnis auf 1,7, was anzeigt, dass Ag⁺ aus der Zelle freigesetzt wurde und der Nanostab die Hauptform von Au@Ag NR in der Zelle in diesem Stadium war. Daher lässt sich ableiten, dass einmal Au@Ag NR in die Zelle eingedrungen ist, Ag⁺ innerhalb von 24 h schnell aus seiner Schale gelöst und allmählich in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt wurde, während Au@Ag NR selbst für einen längeren Zeitraum in der Zelle verblieb.

Oxidativer Stress wird als einer der wichtigsten toxikologischen Mechanismen von Nanopartikeln angesehen. N-Acetylcystein (NAC) ist ein Thiol, ein mukolytisches Mittel und Vorläufer von L-Cystein, welches Glutathion reduziert. NAC ist auch eine Quelle von Sulfhydrylgruppen in Zellen und übt ROS-Fänger-Aktivität durch Interaktion mit OH· und H₂O₂ aus. In dieser Studie waren die GSH- und SOD-Level nach Exposition gegenüber Au@Ag NR signifikant erniedrigt, während der MDA-Level in konzentrations- und zeitabhängiger Weise anstieg, was anzeigt, dass Au@Ag NR oxidativen Stress in den Zellen einführte.

Die Potenziale von Ag und Au@Ag NR, in das genetische Material einzugreifen, wurden durch eine Reihe von Genotoxizitätsassays weiter untersucht. Bemerkenswert ist, dass Ko-Kultur von NAC mit Au@Ag NR die ROS-Bildung lindern konnte, was wiederum die Beteiligung von oxidativem Stress an der durch Au@Ag NR ausgelösten Genotoxizität unterstützt. In dieser Studie wurden Kometenassay und γ-H2AX-Assay durchgeführt, um zu bestätigen, dass Au@Ag NR mit DNA interagieren und bestimmte DNA-Schäden induzieren kann, und das Reparatur-Endonuklease Fpg wurde in den Kometenassay einbezogen, um oxidativen DNA-Schaden zu identifizieren. Das Fpg konnte oxidierte Pyrimidine erkennen und oxidierte Purine, z. B. 8-Hydroguanin, entfernen, um apurinische oder apyrimidinische Stellen zu erzeugen, die Lücken in den DNA-Strängen einführen konnten. Der durch oxidativen Stress induzierte DNA-Bruch konnte anschließend durch einen weiteren Kometenassay bestimmt werden. Mei et al. beobachteten, dass 5-nm-große AgNPs oxidativen Läsions-spezifischen DNA-Schaden durch Einsatz von hOGG1, EndoIII und Fpg-Endonukleasen im Kometenassay induzierten. Li et al. schlugen ebenfalls vor, dass sowohl PVP- als auch silica-beschichtete AgNPs (15–100 nm und 10–80 nm) zu einem signifikanten Anstieg von DNA-Brüchen in Mäusehepatozyten in Gegenwart von hOGG1 und EndoIII führen könnten. Die Bildung von γ-H2AX-Foki, die eine frühe zelluläre Antwort auf genotoxischen Stress darstellt, ist der empfindlichste und spezifischste Biomarker für die Detektion von DSBs. Wie in dieser Studie demonstriert, waren γ-H2AX-Foki in Zellen, exponiert gegenüber Au@Ag NR, nach 24 h markant erhöht, und ein weiterer Anstieg konnte nach 72 h beobachtet werden. Die Reduktion in der 20 µg ml⁻¹ Gruppe könnte auf die Zytotoxizität für HepaRG-Zellen bei höherer Konzentration zurückzuführen sein. Ähnliche Ergebnisse wurden für AgNPs mit verschiedenen Beschichtungen beobachtet. Weiterhin deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Au@Ag NR Chromosomenschäden in HepaRG-Zellen induzieren kann, da die Mikronukleus-Raten signifikant erhöht waren. Dies ist konsistent mit früheren Studien, in denen AgNP-induzierte erhöhte Mikronukleus-Raten in HaCaT- und TK6-Zellen berichtet wurden. Im Gegensatz dazu konnte die Zugabe des oxidativen Radikalfängers NAC die durch Au@Ag NR induzierte Mikronukleusbildung inhibieren. Zusammen genommen deuten diese Daten auf die Beteiligung von oxidativem Stress an AgNP-induziertem Klastogenitätsrisiko in vitro hin.

Frühere Studien haben den Zellzyklusarrest und die Zytotoxizität untersucht, die durch AgNPs induziert werden. Mit verlängerter Expositionszeit könnte der Einfluss von AgNPs auf Zellzyklus und Apoptose verstärkt werden und umgekehrt die Zytotoxizität und Genotoxizität verschlimmern. Normalerweise werden Zellzyklus-Checkpoints (z. B. G2/M) von Zellen initiiert, wenn sie DNA-Schäden erfahren, und dieser Mechanismus dient dazu, die Zelle davon abzuhalten, in die Mitose (M-Phase) einzutreten. Der G2/M-Zellzyklusarrest zeigt an, dass ein zunehmender Prozentsatz von Zellen in der G2-Phase zur DNA-Reparatur gehindert wird. Zellen, die erfolgreiche DNA-Reparatur erfahren, würden weiter zur Mitose fortschreiten; jedoch würden für jene mit fatalen Schäden irreversibler G2/M-Zellzyklusarrest und Zellapoptose eintreten. Wir beobachteten, dass Au@Ag NR die Mehrheit der HepaRG-Zellen in G2/M-Phase arrestieren, späte Zellapoptose induzieren und die Expressionslevel von p53 und p21 erhöhen konnte, welche wichtige Proteine sind, die mit der Regulation von Zellzyklen assoziiert sind. Da p53 auch Apoptose induzieren kann, wenn DNA nicht ordnungsgemäß repariert werden kann, könnte p21 indirekt an Zellapoptose durch Zellzyklusarrest in einem p53-abhängigen Pfad über Down-Regulation des nukleären Proteins ICBP90 für DNA-Replikation und Zellzyklusregulation teilnehmen. Darüber hinaus wurden Apoptose und G2/M-Arrest durch Aktivierung des p53/p21-Systems in HepG2-Zellen nach Verabreichung von Knoblauchextrakten berichtet. Daher könnte geschlossen werden, dass der durch oxidativen Stress ausgelöste DNA/Chromosomenschaden die Expression von p53 und p21 fördern könnte, was anschließend Zellzyklusarrest induziert. Die Verlängerung des Expositionszeitraums von Au@Ag NRs an DNA/Chromosomen während der Replikation könnte die Genotoxizität oder Apoptose weiter verschlimmern.

Fazit

Genotoxizität, induziert durch AgNPs, kann sowohl dem durch Nanopartikel induzierten oxidativen Stress als auch den freigesetzten Ionen zugeschrieben werden. Diese Studie verwendete Au@Ag NR als Modell, um die Verteilung und Freisetzungsverhalten von Ag nach Eintritt der Nanopartikel in die Zellen zu bestimmen. In Anbetracht der unterschiedlichen Formen von Au@Ag NR in der Zelle wurde nach Exposition Ag⁺ schnell aus der Silberschale gelöst. Ag⁺ und Au@Ag NR konnten Zytotoxizität und Genotoxizität (Klastogenität) in den Zellen hervorrufen, und der im Zellkern zurückgebliebene Au@Ag NR kann weiteres Ag⁺ freisetzen, um den Schaden zu verschlimmern, der hauptsächlich durch Zellzyklusarrest und ROS-Bildung verursacht wird (zusammengefasst in Abb. 7). Insgesamt offenbaren diese Daten die Korrelation zwischen intrazellulärer Anreicherung, Ag⁺-Freisetzung sowie der potenziellen Genotoxizität von AgNPs.