Komplexierung mit C60-Fulleren erhöht die Wirksamkeit von Doxorubicin gegen leukämische Zellen in vitro

Ergebnisse und Diskussion

HPLC-MS/MS-Analyse von C₆₀ -Dox-Komplexe

Für die chromatographische Trennung verwendeten wir die Umkehrphasenbedingungen und erwarteten, dass während des Trennungsprozesses hydrophobes C₆₀ Moleküle werden viel stärker auf der Säule zurückgehalten als die des polareren Dox [41]. Die Elution mit der polaren mobilen Phase sollte offensichtlich zur Zersetzung des Komplexes und zur Freisetzung von freiem Dox führen, das eine höhere Affinität zur mobilen Phase besitzt und durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden kann.

Um das Vorhandensein des Komplexes in Lösung zu bestätigen, wurde eine Konzentration von 1 µM Dox als optimal für die analytische Analyse gewählt. Unter isokratischen Flussbedingungen die Retentionszeit für freies Dox und Dox als Bestandteil der Komplexe mit C₆₀ war unterschiedlich – 11,66 bzw. 9,44  min (Abb. 1). Darüber hinaus waren die Chromatographie-Peaks von Dox, die von den Komplexen freigesetzt wurden, breiter und mit beobachtetem "Peak-Tailing". Die festgestellte Verschiebung der Retentionszeiten sowie unterschiedliche Pickformen weisen auf eine Zersetzung von C₆₀ . hin -Dox-Konjugate auf der Säule Fulleren-Moleküle, die eine höhere Affinität zur C18-Säule besitzen. Daher besetzt die Nanostruktur einen Teil der aktiven Bindungsstellen und stört die Bindung von Dox an diese Stellen richtig, wodurch der Trennprozess beeinflusst wird. Dies führt zu einer kürzeren Retention (verringerte Zeit, die Dox benötigt, um durch die Säule zu gehen) sowie zu Peakgrenzen und -tailing für Dox, das aus dem Komplex freigesetzt wird, im Vergleich zu freiem Arzneimittel. Ein sehr ähnliches Phänomen wurde von Lie et al. [42] während der chromatographischen Trennung von C₆₀ nichtkovalente Komplexe mit Pullulan. Die Unterschiede in den Chromatogrammen des freien Dox und der aus den Komplexen freigesetzten wiesen offensichtlich auf die Anwesenheit von C₆₀ . hin -Dox-Komplexe in Lösung.

Chromatogramme zur Überwachung mehrerer Reaktionen von freiem Dox (1 μM), C₆₀ -Dox 1:1 und C₆₀ -Dox 2:1 (1 μM Dox-äquivalente Konzentration) Komplexe unter isokratischem Fluss (Acetonitril, 0,1% Ameisensäure in H₂ O, 80:20, v :v ), Vorläufer → Produktionenübergang:544,2 → 130.2 und 361,1 m/z; a.u. beliebige Einheiten

Spektroskopische und fluorometrische Analyse

Die optischen Eigenschaften von Dox werden durch den Elektronenübergang im π-komplexierten System seiner aromatischen Ringe und Ketongruppen bestimmt [43]. Das typische Absorptionsspektrum von Dox liegt im Wellenlängenbereich λ < 600 nm mit einem breiten Band bei 480 nm (Abb. 2a). Das UV/Vis-Absorptionsspektrum von reinem C₆₀ kolloidale Wasserlösung hat drei typische Absorptionsbanden mit Maxima bei 220, 265 und 350 nm und einen langen kleinen breiten Schwanz bis in den roten Bereich des sichtbaren Lichts [34, 44]. Daher sind die entsprechenden Kontrollspektren von freiem C₆₀ wurden von den Komplexspektren abgezogen. Die beobachteten Absorptionsspektren beider 50 μM-Komplexe waren denen von freiem 50 μM Dox ähnlich, es wurde jedoch ein hypochromer Effekt von 30 % beobachtet (Abb. 2a), der auf eine Dox-Fixierung an C₆₀ . hinweist Oberfläche aufgrund von π-π-Stapelwechselwirkungen.

Optische Charakterisierung von Komplexen. Optische Dichtespektren von freiem Dox und C₆₀ -Dox-Komplexe (a ). Fluoreszenzemissionsspektren von freiem Dox und C₆₀ -Dox-Komplexe in einer Dox-äquivalenten Konzentration von 3 bis 50 μM (b ); a.u. beliebige Einheiten

Das langwellige Absorptionsmaximum von Dox (λ = 480 nm) wurde als Anregungswellenlänge zum Verfolgen seiner Fluoreszenz verwendet. Das Fluoreszenzspektrum weist ein breites Band auf, das aus drei Peaks bei 560, 594 und 638 nm mit einem Maximum bei 594 nm besteht (Abb. 2b) [43], während C₆₀ weist in diesem Spektralband keine nachweisbare Fluoreszenz auf. C₆₀ - Die Fluoreszenz der Dox-Komplexe wurde in einer Reihe von Verdünnungen mit einer Dox-äquivalenten Konzentration von 3 bis 50 µM bestimmt. Unabhängig von der Verdünnung ist die Fluoreszenz von Dox (λ_ex = 480 nm, λ_em = 594 nm) in den Komplexen wurde durch C₆₀ . gelöscht (Abb. 2b). Somit schien die Fluoreszenz von Dox in beiden Komplexen bei einer Konzentration von 3 µM Dox-Äquivalent um 50% gelöscht zu sein. Die beobachtete Dox-Fluoreszenzlöschung wird der starken Elektronenaufnahmefähigkeit von C₆₀ . zugeschrieben [3] und intramolekularer Energietransfer im angeregten Zustand, typisch für nichtkovalente Dox-Komplexe [18, 36, 45], was auf die räumliche Nähe der Komponenten hinweist.

Größenverteilungsanalyse durch dynamische Lichtstreuung

Die Größe und Stabilität eines nanopartikulären Krebsmedikaments hängt im Wesentlichen von der Zusammensetzung des Zellkulturmediums, der Ionenstärke und der Proteinkonzentration ab. Der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser von 1 μM C₆₀ -Dox 1:1- und 2:1-Komplexe in physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) wurden mit 135 ±   5 nm bzw. 134 ± 6 nm bestimmt, was mit den Daten früherer Untersuchungen übereinstimmt [20]. Um die Stabilität in Zellkulturmedium abzuschätzen, 1-μM C₆₀ -Dox-Komplexe wurden 72 Stunden lang bei 37 °C in RPMI, ergänzt mit 10 % FBS, inkubiert. Das Muster der Partikelgrößenverteilung in diesem Medium (Abb. 3) wird dem hohen Proteingehalt sowie seiner wahrscheinlichen Aggregation zugeschrieben [46, 47].

Hydrodynamische Größe (Durchmesser, nm) von 1 μM С₆₀ -Dox-Komplexe in RPMI-Zellkulturmedium ergänzt mit 10 % FBS bei 0 (a ) und 72 Stunden (b ) Inkubation. Intensität (%) Prozentsatz der gesamten Streulichtintensität

Die dynamischen Lichtstreuungsdaten von 1 μM C₆₀ - Die hydrodynamische Durchmesserverteilung von Dox 1:1- und 2:1-Nanokomplexen in FBS-supplementierter Zellkultur zeigte, dass ihre Größe bei sofortiger Messung 138 ± 6 nm und 139 ± 5 nm betrug (Abb. 3a) und 146 ± 4 nm und 144 ± 5 ​​nm betrug nm nach 72 h Inkubationszeit (Abb. 3b).

Die festgestellte Stabilität des Maximums (ca. 140 nm) zeigte, dass es keine zusätzliche Aggregation des C₆₀ . gab -Dox-Komplexe während einer längeren Inkubation in FBS-supplementiertem Zellkulturmedium, die ihre Eignung für in vitro-Studien bestätigten.

Zelllebensfähigkeit

Die Lebensfähigkeit menschlicher Leukämiezellen verschiedener Linien wurde durch den MTT-Test nach 24, 48 und 72  h Inkubation in Gegenwart von C₆₀ . geschätzt -Dox-Komplexe sowie von freiem Dox getrennt in äquivalenten Konzentrationen. C₆₀ allein in Konzentrationen, die denen in den Komplexen äquivalent waren, hatte keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit von Leukämiezellen (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 4 zeigt die zeit- und konzentrationsabhängige Abnahme der Lebensfähigkeit von Leukämiezellen unter Dox-Behandlung. Es wurde gezeigt, dass das Medikament eine Toxizität gegenüber Leukämiezellen im nanomolaren Bereich aufweist. Es wurde festgestellt, dass die Empfindlichkeit von Leukämiezellen gegenüber Dox der Reihenfolge Molt-16 ˃ THP1 ˃ Jurkat ˃ CCRF-CEM (weniger empfindlich) entspricht.

Lebensfähigkeit von CCRF-CEM-, Jurkat-, THP1- und Molt16-Leukämiezellen, behandelt mit gleichen Dosen von freiem Dox oder C₆₀ -Dox-Komplexe für 24, 48 und 72 h (*p ≤ 0,05 im Vergleich zum kostenlosen Dox, **p ≤ 0,05 im Vergleich zum C₆₀ -Dox 1:1-Komplex, n = 5)

Unter Einwirkung von 100 nM Dox wurde die Lebensfähigkeit von CCRF-CEM-Zellen auf 84 ± 7, 50 ± 4 bzw. 34 ± 7 % im Vergleich zur Kontrolle nach 24, 48 bzw. 72 h verringert. Das vergleichbare Muster der toxischen Wirkung von 100 nM Dox wurde in Jurkat-Zellen gefunden. Die Lebensfähigkeit von THP1-Zellen nach Behandlung mit 100 µnM Dox-Zellen betrug nach 24, 48 bzw. 72 Stunden 50 ± 4, 47 ± 5 und 13 ± 4 %. Die halbmaximalen inhibitorischen Dox-Konzentrationen (IC50) für CCRF-CEM-, THP1- und Jurkat-Zellen nach 72 h Inkubation wurden auf 80 ± 9, 43 ± 5 bzw. 38 ±   6 nM geschätzt. Diese Daten entsprechen Literaturdaten [48, 49]. Molt-16-Zellen schienen gegenüber dem Arzneimittel am empfindlichsten zu sein, da seine toxische Wirkung im Bereich von 1 bis 25 &mgr;nM in allen Zeiträumen der Zellinkubation nachgewiesen wurde. Die Lebensfähigkeit von Molt-16-Zellen, die mit 5 nM Dox behandelt wurden, war nach 24, 48 bzw. 72 h auf 75 ± 4, 28 ± 4 bzw gleich nur 2,0 nM. Die ähnlich hohe Sensitivität von Molt-16-Zellen mit 10-mal intensiverer Apoptose-Induktion im Vergleich zu Jurkat-Zellen unter Behandlung mit einem pflanzlichen Alkaloid wurde zuvor von Cai et al. [50].

Mit freiem Dox behandelte Zellen wurden als Kontrolle verwendet, um die Lebensfähigkeit unter Einwirkung von C₆₀ . zu beurteilen -Dox-Komplexe in den äquivalenten Dosen des Arzneimittels. Der Wert von IC50 für das kostenlose Dox und C₆₀ -Dox-Komplexe wurden für jeden Zeitpunkt und jede Zelllinie berechnet und sind in Abb. 4 aufgeführt.

Es wurde gezeigt, dass sowohl C₆₀ -Dox-Komplexe besaßen im Vergleich zu freiem Dox ein höheres toxisches Potenzial gegen menschliche leukämische Zelllinien (Abb. 4).

Zusammenfassend zeigten unsere zahlreichen Experimente für die vier Zelllinien eine Vielzahl von bis zu 3,5-fach erhöhten Toxizitäten. C₆₀ -Dox 1:1-Komplex hat im Vergleich zum 2:1-Komplex eine höhere Toxizität gezeigt. Der weniger ausgeprägte Effekt (IC50-Abnahme auf das ≥ 2,5-fache im Vergleich zu freiem Dox) des 2:1-Komplexes kann der höheren Konzentration von C₆₀ . zugeschrieben werden als seine Komponente. Aufgrund seiner antioxidativen Aktivität [11, 13] ist ein Überschuss an C₆₀ kann Zellen vor Dox-assoziiertem oxidativem Stress schützen [27].

Intrazelluläre Akkumulation von freiem Dox und C₆₀ -Dox-Komplexe

Um eine mögliche Korrelation der verstärkten toxischen Wirkung von C₆₀ . zu untersuchen -Dox-Komplexe mit einer effektiveren intrazellulären Wirkstoffakkumulation, der zellulären Aufnahme von freiem Dox und C₆₀ -Dox wurde studiert. Da Dox eine starke Absorption und Fluoreszenz im sichtbaren Spektralbereich besitzt [43, 45] (Abb. 2), ist die Verfolgung von Dox-Komplexen mit nicht-invasiven, direkt fluoreszenzbasierten Techniken möglich. CCRF-CEM-Zellen wurden in Gegenwart von 1 μM Dox oder C₆₀ . inkubiert -Dox-Komplexe in arzneimitteläquivalenter Konzentration, untersucht mit Fluoreszenzmikroskopie und durchflusszytometrisch, um den intrazellulären Spiegel des akkumulierten Arzneimittels nach 1-, 3- und 6-stündiger Behandlung zu quantifizieren (Abb. 5). Die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Probe wurde aus logarithmischen FACS-Histogrammen durch den Wert des jeweiligen roten Dox-Fluoreszenzsignals (λ_ex = 488 nm, λ_em = 585/29 nm) und in Tabelle 2 dargestellt. Autofluoreszenz von unbehandelten Zellen wurde als Negativkontrolle verwendet (Fig. 5a).

Intrazelluläre Akkumulation von 1 μM freiem und C₆₀ komplexierte Dox. Durchflusszytometrie (a ) und fluoreszierende Mikroskopiebilder (b ) von CCRF-CEM-Zellen, inkubiert mit Dox und C₆₀ -Dox im Verhältnis 1:1 und 2:1 für 1, 3 und 6 h. Maßstabsleiste 20 μM

Die zeitabhängige Akkumulation von 1 µM Dox wurde durch Verstärkung der Fluoreszenzintensität geschätzt (Abb. 5, Tabelle 2). Die fluoreszenzmikroskopischen Bilder veranschaulichen, dass C₆₀ -Dox-Komplexe wurden schneller internalisiert als freies Arzneimittel, was durch eine viel hellere intrazelluläre Fluoreszenz belegt wurde (Abb. 5b). Die mittleren Fluoreszenzintensitäten der CCRF-CEM-Zellen, behandelt mit 1:1 C₆₀ -Dox-Komplex bei einer Dox-Äquivalentkonzentration von 1 µM, wurden im Vergleich zu freiem Dox nach 1, 3 bzw. 6 h um das 1,5-, 1,7- und 2,2-fache erhöht. 2:1 C₆₀ -Dox-Komplex zeigte eine verzögerte intrazelluläre Arzneistoffakkumulation, die das gleiche Niveau wie der 1:1-Komplex nach 6 Stunden erreichte (Abb. 5, Tabelle 2).

Die erhaltenen Daten zeigten, dass die Dox-Komplexierung mit C₆₀ förderte den Eintritt in die Zellen, beeinflusste jedoch nicht deren Lokalisation. Die Kontrollfärbung der untersuchten Zellen mit dem DNA-bindenden Farbstoff Hoechst 33342 zeigte seine Kolokalisation mit dem Dox-Signal (Daten nicht gezeigt). Offensichtlich sind Dox-Moleküle aus C₆₀ Komplexe und das freie Medikament traten in die Zellkerne ein, die ihre antiproliferative Wirkung durch DNA-Schäden widerspiegeln [26,27,28]. Eine erhöhte intrazelluläre Aufnahme eines Arzneimittels nach Komplexierung mit C₆₀ weist darauf hin, dass letztere als Förderer des Wirkstofftransports fungieren. C₆₀ Es wurde gezeigt, dass die Nanostruktur die zelluläre Plasmamembran durch passive Diffusion [51] und/oder Endozytose/Pinozytose [52, 53] transmigriert, während solche kleinen Moleküle wie Dox nur über passive Diffusion eindringen können. Der C₆₀ Struktur ähnelt der Struktur von Clathrin [54, 55], dem Hauptbestandteil der Hülle der Vesikelbildung während der Endozytose. Daher C₆₀ kann als Transporter für kleine aromatische Moleküle fungieren [56]. Im Gegenteil, eine kovalente Bindung zwischen Träger und Fracht führt zu einer strukturellen Veränderung des Wirkstoffmoleküls. Folglich werden das Akkumulationsmuster und die Interaktion mit intrazellulären Zielen verändert, was zu einem vollständigen oder teilweisen Verlust der Wirkstofffunktion führt. Liuet al. [15] zeigte, dass C₆₀ mit zwei über eine Amidbindung gebundenen Dox-Molekülen wurde überwiegend im Zytoplasma verteilt.

Schlussfolgerung

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von C₆₀ -Dox-Komplexe mit einem Verhältnis von 1:1 und 2:1 der Komponenten wurden bestimmt und ihre Toxizität gegenüber menschlichen Leukämiezellen CCRF-CEM, Jurkat, Molt-16 und THP1 wurde abgeschätzt.

Die HPLC-MS/MS-Analyse zeigte deutliche Unterschiede in den Chromatogrammen von freiem Dox und denen, die von C₆₀ . freigesetzt wurden -Dox-Komplexe. Komplexierung von C₆₀ mit Dox wurde durch hypochromen Absorptionseffekt und Fluoreszenzlöschung in C₆₀ . bestätigt -Dox-Komplexe. Wir haben festgestellt, dass die Größe von C₆₀ -Dox-Komplexe um 140  nm wurden in Gegenwart von Protein und verlängerter Inkubation im Medium zurückgehalten. Studien an menschlichen leukämischen Zelllinien ergaben, dass C₆₀ -Dox-Komplexe besaßen eine höhere Zytotoxizität im Vergleich zum freien Wirkstoff in äquivalenten Konzentrationen. Nach 72 h Inkubation der Zellen war der IC50-Wert für 1:1- und 2:1-Komplexe im Vergleich zu IC50 für das freie Arzneimittel auf das 3,5- bzw. 2,5-fache verringert. Komplexierung mit C₆₀ förderte den Eintritt von Dox in Leukämiezellen. Eine Behandlung von CCRF-CEM-Zellen für 6 h mit C₆₀ -Dox-Komplexe in einer Konzentration von 1 µM Dox-Äquivalent wurde von einer 2,2-fachen Erhöhung des intrazellulären Wirkstoffspiegels im Vergleich zur Behandlung mit freiem Dox gefolgt.

Unsere Ergebnisse bestätigen die Funktion von C₆₀ als Nanocarrier und die Perspektive seiner Anwendung zur Optimierung der Dox-Effizienz gegen Leukämiezellen. Da Dox für viele Antitumormittel nur eine repräsentative oder Modellsubstanz ist, erwarten wir, dass unsere Erkenntnisse auf andere Medikamente übertragbar sind. Die Erhöhung der Aufnahme eines Medikaments in Tumorzellen und/oder seiner Antitumoreigenschaften kann auf neue Behandlungsstrategien hinweisen. Die Komplexierung von Medikamenten mit Nanocarriern kann dazu dienen, ihre wirksame Dosisleistung zu reduzieren und damit die unerwünschten Nebenwirkungen abzuschwächen.

Änderungsverlauf

Abkürzungen

C₆₀ :

C₆₀ Fulleren

DMSO:

Dimethylsulfoxid

Dox:

Doxorubicin

ESI:

Elektrospray-Ionisation

FBS:

Fötales Rinderserum

HPLC-MS/MS:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

IC50:

Halbmaximale Hemmkonzentration

LOD:

Nachweisgrenze

LOQ:

Bestimmungsgrenze

MRM:

Multiple reactions monitoring

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung