Zielgerichtete Endothelzellen mit multifunktionalen GaN/Fe-Nanopartikeln

Hintergrund

In den letzten Jahren wurden viele Anstrengungen unternommen, um Krebs und verwandte Krankheiten mit Hilfe der Nanotechnologie zu bekämpfen. Einer der gängigsten Ansätze basiert auf Nanopartikeln, die als Wirkstoffträger genutzt werden können [1, 2]. Dieser Ansatz hat jedoch Einschränkungen im Zusammenhang mit der Notwendigkeit, die Nanopartikel mit Erkennungsliganden für die Wirkstoffadsorption und kovalenten Bindung zu beschichten, oder durch die Notwendigkeit, Wirkstoffe in Nanopartikeln einzukapseln. Ein alternativer therapeutischer Ansatz besteht darin, Nanopartikel für die direkte Zelltherapie zu verwenden, d. h. um Zielorte zum Zwecke der biologischen Behandlung der Krankheit zu erreichen [3]. Beispielsweise könnten mit magnetischen Nanopartikeln beladene Endothelzellen mittels eines angelegten Magnetfelds zu Stellen einer arteriellen Verletzung geführt werden. Neben therapeutischen Anwendungen kann die Nanopartikel-unterstützte Zellführung auch für die In-vitro-Zelltrennung und die zelluläre Beschichtung dreidimensionaler Konstrukte nützlich sein [4]. In diesem Artikel zeigen wir, dass Endothelzellen GaN/Fe-basierte Nanopartikel aufnehmen und dass dieses Phänomen verwendet werden kann, um die räumliche Verteilung von Zellen in vitro zu kontrollieren.

Methoden

Nanopartikelsynthese

Dünne GaN-Schichten wurden auf mit Fe₂ . legierten ZnO-Nanopartikeln aufgewachsen O₃ von HVPE in zwei Schritten. Zunächst wurde die Nukleationsschicht 5 min bei 600 °C abgeschieden. Anschließend wurde die Temperatur auf 800 °C erhöht und 10 min bei dieser Temperatur gehalten. Der zweite Temperaturbereich ist für die Zersetzung des ZnO-Kerns und die Verbesserung der kristallinen Qualität von GaN erforderlich. Das GaN-Wachstum wurde von unserer Gruppe bereits zuvor ausführlich beschrieben [5, 6]. Kurz gesagt, wir verwendeten metallisches Gallium, Ammoniak (NH₃ ) Gas, Chlorwasserstoff (HCl) Gas und Wasserstoff (H₂ ) als Trägergase. Im Prozess des GaN-Wachstums werden HCl, NH₃ , und H₂ die Durchflussraten betrugen 20, 600 bzw. 3500 sccm.

Zellkultur

Schweine-Aorten-Endothelzellen wurden aus Aorten durch vorsichtiges Abkratzen der Endothelzellschicht mit einem Skalpell isoliert. Die Zellen wurden in einem Standardinkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ . kultiviert in EGM™-2 (Endothelial Growth Factor Medium 2, Lonza). Die Zellteilung wurde mit TrypLE™Select(1X) (Gibco®) durchgeführt. Für alle Experimente wurden Zellen zwischen Passage 3 und 8 verwendet. Zellen wurden mit grünem Fluoreszenzprotein (GFP) durch lentivirale Transduktion markiert, wie an anderer Stelle beschrieben [7].

XTT-Assay

Der XTT-Assay wurde 24 h nach dem Mediumwechsel gestartet, als neues, mit Nanopartikeln angereichertes Medium zugegeben wurde. Das Kulturmedium wurde dann durch frisches EGM2-Medium mit XTT-Reagenz im Verhältnis 2:1 ersetzt. Das XTT-Reagenz besteht aus 0,1 ml Elektronenkopplungsreagenz in 5 ml XTT. Nach 4 h Inkubation bei 37 °C mit 5% CO₂ , wurde die Extinktion auf einem Paradigm-Multimode-Plattenlesegerät gemessen.

Zellenzählung

Nach 2 Tagen Inkubation von Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Nanopartikeln wurden die Zellen 10 min in 4% Paraformaldehyd fixiert, mit PBS gewaschen und mit DAPI (1:7500 verdünnt in PBS) 10 min gefärbt. Ein zufälliges Sichtfeld wurde aus sechs unabhängigen Vertiefungen mit einer hochauflösenden Kamera fotografiert, die auf einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) installiert war. Die computergestützte Software DotCount v1.2 [8] wurde verwendet, um die relative Zellzahl in jedem Well zu quantifizieren und mit der Kontrolle zu vergleichen.

Transmissionselektronenmikroskopie

Die Transmissionselektronenmikroskopie wurde nach 1-tägiger Inkubation der Zellen mit Nanopartikeln durchgeführt. Nachdem die Zellen eine Konfluenz von 50% erreicht hatten, wurde das Kulturmedium durch ein Medium ersetzt, das mit 50 &mgr;g/ml GaN/Fe-Nanopartikeln ergänzt war, und die Zellen wurden für weitere 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, in 2 % Glutaraldehyd und 2 % Formaldehyd bei Raumtemperatur für 2 h fixiert und dann über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Proben wurden in 0,1 M Natriumcacodylat gewaschen und in 1% OsO₄ . nachfixiert in 0,1 M Natriumcacodylat für 1 h. Nach der Fixierung wurden die Proben in einer abgestuften Acetonreihe entwässert und in EPON eingebettet. Die Polymerisation wurde 2 Tage bei 60 °C durchgeführt. Dünne Schnitte von ~50 nm Dicke wurden auf Formvar-beschichteten Kupferschlitzgittern gesammelt und mit 4% Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt. Zellschnitte wurden im Detail mit einem Transmissionselektronenmikroskop FEI Tecnai 20 bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV untersucht.

Ergebnisse und Diskussion

Multifunktionale magnetische Nanopartikel wurden durch Aufwachsen einer GaN-Schicht auf Opfer-Nanopartikeln aus ZnO, legiert mit Fe₂ ., hergestellt O₃ . Nach dem Aufwachsen der GaN-Schicht unter Verwendung von Hydrid-Dampfphasenepitaxie (HVPE) wird der ZnO-Kern zersetzt. Die resultierenden chemisch stabilen Nanopartikel bestehen hauptsächlich aus einer GaN-Schale mit magnetischen Eigenschaften, die auf die Diffusion von Eisenatomen im abgeschiedenen GaN sowie auf das Vorhandensein von Fe-Atomen in der dünnen ZnO-Legierung mit Fe₂ O₃ auf der inneren Oberfläche der GaN-Schale. Diese Nanopartikel wurden elektronenmikroskopisch untersucht. Nach dem HVPE-Wachstumsprozess von GaN bleiben die einkristallinen Nanopartikel mit transversalen Größen von 20 bis 100 nm räumlich getrennt (Abb. 1). Die Ergebnisse der Röntgenbeugungs- und Raman-Spektroskopie-Charakterisierung (Abb. 1c, d) der Nanopartikel vor und nach dem GaN-Wachstum zeigen die Zersetzung des ZnO-Kerns und die Bildung von GaN-Nanopartikeln. Chemische Analysen der Nanopartikel mittels energiedispersiver Röntgenanalyse (EDX) bestätigen das Wachstum der GaN-Schicht und die Zersetzung des ZnO-Kerns (Abb. 1e, f). Beachten Sie, dass das resultierende Material eine relativ hohe (ungefähr 50%) Fe-Konzentration im Vergleich zu den anfänglichen Nanopartikeln aufweist.

Analyse von Nanopartikeln. a SEM-Bild von GaN-Nanopartikeln, die auf Opfer-Nanopartikeln aus ZnO, legiert mit Fe₂ ., gewachsen sind O₃ . b TEM-Aufnahme der resultierenden GaN/Fe-Nanopartikel. c XRD-Muster des anfänglichen ZnFe₂ O₄ Nanopartikel und daraus resultierendes GaN/ZnFe₂ O₄ Nanopartikel. d Raman-Spektren der anfänglichen und resultierenden Nanopartikel nach dem GaN-Wachstum. e EDX-Analyse von mit Fe₂ . legiertem ZnO O₃ Nanopartikel. f EDX-Analyse der resultierenden Nanopartikel nach dem Wachstum der GaN-Schicht

GaN/Fe-basierte Nanopartikel wurden mit primären porcinen Aorten-Endothelzellen inkubiert. Wie bereits gezeigt, werden GaN-Nanopartikel von den Endothelzellen in Konzentrationen von weniger als 100 μg/ml toleriert [5]. Während des Inkubationsprozesses nehmen Endothelzellen den Großteil der Nanopartikel im umgebenden Kulturmedium auf, während die Zellmigration und -proliferation aufrechterhalten werden. Dennoch stellten wir eine gewisse Abnahme der Anzahl lebensfähiger Zellen mit einer Zunahme der Konzentration von Nanopartikeln in den Kulturmedien fest. Diese Tendenz wird durch die in Abb. 2 dargestellten Ergebnisse des XTT-Tests bestätigt.

Einfluss von Nanopartikeln auf die Lebensfähigkeit von Zellen. Konzentrationsabhängige XTT-Reduktion, gemessen nach 1 Tag der Inkubation von Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Nanopartikeln. Die Zahl der am Ende des XTT-Tests gezählten Zellen wird relativ zu unbehandelten Zellen ausgedrückt. Die Werte werden als Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei unabhängigen Experimenten mit sechs Wiederholungen ausgedrückt

Um zu verstehen, wie GaN/Fe-Nanopartikel mit Zellen interagieren und ihre Lokalisation innerhalb der Zellen zu identifizieren, führten wir eine gründliche morphologische Analyse mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) durch. Nach 1-tägiger Inkubation von porcinen Aorten-Endothelzellen mit 50 μg/ml Nanopartikeln erwiesen sich die Nanopartikel als in Vesikeln innerhalb der Zellen lokalisiert (Abb. 3a). Im Zytoplasma oder im Zellkern wurden keine Nanopartikel gefunden. Der Aufnahmeprozess von Nanopartikeln ist in Abb. 3b–d dargestellt. Die meisten Nanopartikel werden von Zellen über einen der klassischen Aufnahmewege aufgenommen, nämlich durch Mikropinozytose, Clathrin-vermittelte Endozytose oder Caveolin-vermittelte Endozytose [9]. Der Internalisierungsprozess hängt vom Zelltyp und der lokalen Zellumgebung sowie von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Partikels selbst (z. B. Größe, Form, Oberflächenladung) ab. Im Fall von Endothelzellen wurde berichtet, dass die Caveolin-vermittelte Endozytose aufgrund des Vorkommens von Caveolin in diesem Zelltyp einen größeren Einfluss auf die Nanopartikelaufnahme hat als andere Mechanismen [10, 11].

TEM-Bilder von einer einzelnen Endothelzelle, die mit GaN/Fe-Nanopartikeln inkubiert wurde. a Verteilung von Nanopartikeln in zellulären Vesikeln. b –d Der Aufnahmeprozess von Nanopartikeln in Vesikel. Rote Pfeile weisen auf Nanopartikel hin, die im TEM aufgrund der hohen Atomdichte im Vergleich zu biologischen Medien dunkler erscheinen

Aufgrund des zuvor erwähnten Einbaus einer großen Menge an Fe weisen die resultierenden Nanopartikel Ferromagnetismus zusammen mit der dem GaN-Halbleitermaterial inhärenten Piezoelektrizität auf [12, 13]. Diese beiden grundlegenden Eigenschaften können zur Fernaktivierung einiger Prozesse in den Nanopartikeln und/oder deren kontrollierter Führung und räumlicher Verteilung in relevanten Medien genutzt werden. Piezoelektrische Eigenschaften können verwendet werden, um eine elektrische Polarisation in GaN-Nanopartikeln zu induzieren, beispielsweise durch ein angelegtes Ultraschallfeld. Auf diese Weise kann man den Zellen elektrische Signale übermitteln, um bestimmte zelluläre Prozesse zu aktivieren oder zu hemmen. Die durch den Fe-Gehalt verliehenen magnetischen Eigenschaften ermöglichen eine dynamische Visualisierung und Kontrolle der räumlichen Position von Zellen. Um die letztere Möglichkeit experimentell zu demonstrieren, wurden Endothelzellen in EGM™-2-Medium, ergänzt mit 50 μg/ml GaN/Fe-Nanopartikeln, 3 Tage lang inkubiert (bis 70–80 % Zellkonfluenz). Anschließend wurden die Zellen von der Oberfläche abgelöst und in EGM™-2 resuspendiert. Beachten Sie, dass die Ablösung von Zellen mit TrypLE™ Select und Zentrifugation weder die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflusst noch zur Freisetzung von Nanopartikeln aus den Zellen geführt hat (Daten nicht gezeigt). Unmittelbar nach der Aussaat wurden die Zellen in einem Standardinkubator bei 37 °C unter 5 % CO₂ . inkubiert , wo die Kulturplatte auf Dauermagneten platziert wurde. Abbildung 4 zeigt die Verteilung von mit Nanopartikeln beladenen Endothelzellen in An- und Abwesenheit eines Magnetfelds. 4a zeigt mit Nanopartikeln beladene Zellen, die in Abwesenheit eines Magnetfelds inkubiert wurden, während in 4b Endothelzellen ohne Nanopartikel in einem Magnetfeld inkubiert wurden. Diese Bilder zeigen in beiden Fällen eine zufällige Verteilung der Zellen. Die Inkubation von mit Nanopartikeln beladenen Zellen in einem Magnetfeldgradienten führt zu einer vordefinierten Verteilung der Zellen in bestimmten Bereichen gemäß der Magnetfeldkarte. Abbildung 4c zeigt Zellen in der Kulturplatte nach 1 Tag Inkubation im Magnetfeld, das von sieben kreisförmigen Seltenerd-Neodym-Magneten mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Dicke von 1 mm erzeugt wird. Abbildung 4d veranschaulicht die Zellverteilung nach der Inkubation in dem Magnetfeld, das von einem einzelnen ringförmigen Magneten mit einem Durchmesser von 7 mm und einer Dicke von 1 mm erzeugt wird. In beiden Fällen wurden die Magnete unterhalb der Kulturplatte platziert.

Führung von mit Nanopartikeln beladenen Endothelzellen mit einem Magnetfeld. Die Kontrollgruppe zeigt die räumliche Verteilung von a Endothelzellen gezielt mit Nanopartikeln und inkubiert in Abwesenheit von Magnetfeldern und b Nanopartikel-freie Endothelzellen, die im Magnetfeld inkubiert wurden. c , d Die Verteilung von Endothelzellen, auf die Nanopartikel nach 1 Tag Inkubation in einem Magnetfeld abzielen

Schlussfolgerungen

Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass die GaN/Fe-basierten Nanopartikel mit magnetischen Eigenschaften von Endothelzellen aufgenommen und in Vesikel gespeichert werden. Die mit GaN/Fe-Nanopartikeln beladenen Endothelzellen können durch angelegte Magnetfelder kontrolliert geführt werden. Diese Ergebnisse eröffnen neue Möglichkeiten, dreidimensionales Gewebe in vitro zu entwickeln oder Zellen in vivo gezielt auf Gewebeverletzungsstellen zu richten. Darüber hinaus ebnet die Anwesenheit von GaN-Nanopartikeln mit inhärenten piezoelektrischen Eigenschaften in den Zellen den Weg für die elektrische Fernstimulation zellulärer biologischer Prozesse. Dieser vielversprechende Ansatz wird in unseren Labors untersucht.

Abkürzungen

EDX:

Energiedispersive Röntgenanalyse

EGM™-2:

Endothelialer Wachstumsfaktor-Medium

Fe:

Bügeleisen

Fe₂ O₃ :

Eisenoxid (III)

GaN:

Galliumnitrid

GFP:

Grünes Fluoreszenzprotein

H₂ :

Wasserstoff

HCl:

Chlorwasserstoff

NH₃ :

Ammoniak

OsO₄ :

Osmiumtetroxid

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

XRD:

Röntgenbeugung

ZnO:

Zinkoxid