Formabhängige Zytotoxizität und zelluläre Aufnahme von Goldnanopartikeln, die mit Grüntee-Extrakt synthetisiert wurden

Einführung

Pflanzen enthalten natürliche primäre und sekundäre Metaboliten, einschließlich Flavonoide, Saponine, Alkaloide, Steroide, Cumarine, Tannine, Phenole, Terpenoide, Kohlenhydrate, Proteine ​​und Aminosäuren. In letzter Zeit wurden Pflanzenextrakte für die Synthese von Nanomaterialien verwendet, insbesondere von metallischen Nanopartikeln wie Gold-, Silber-, Titanoxid-, Kupfer-, Palladium-, Zinkoxid- und Platin-Nanopartikeln [1]. Diverse sekundäre Pflanzenstoffe sind aktiv an der Umwandlung von Metallsalzen in metallische Nanopartikel als Reduktionsmittel beteiligt. Darüber hinaus spielen Pflanzenextrakte als Stabilisierungsmittel eine Rolle, um die kolloidale Stabilität metallischer Nanopartikel in Lösung zu erhalten. Chemische Reduktionsmittel sind im Allgemeinen schädlich und giftig für lebende Organismen. Grün, umweltfreundlich und nachhaltig ist dagegen die Verwendung von Pflanzenextrakten bei der Synthese metallischer Nanopartikel. Zur Synthese metallischer Nanopartikel werden verschiedene Pflanzenteile wie Stängel, Früchte, Samen, Blätter und Blüten verwendet [1, 2]. Umfangreiche Übersichten haben die grüne Synthese von Goldnanopartikeln (AuNPs) unter Verwendung von Pflanzenextrakten als Reduktionsmittel untersucht [2,3,4]. Bei dieser grünen Strategie wird der Syntheseschritt in einem Schritt und in einem Topf durchgeführt. Darüber hinaus ist das Verfahren einfach, unkompliziert, kostengünstig und umweltfreundlich. Größe, Form und Topographie von AuNPs hängen von der Konzentration der Goldsalze und -extrakte, der Reaktionszeit, der Reaktionstemperatur und dem pH-Wert der Lösung ab. Zur Charakterisierung von AuNPs werden spektroskopische und mikroskopische Techniken eingesetzt, darunter UV-Vis-Spektrophotometrie, Röntgenbeugung, Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM), Rasterelektronenmikroskopie ( SEM) und hydrodynamische Größen- und Zetapotentialmessungen. Diese grünen AuNPs werden als Katalysatoren, Antioxidantien und antimikrobielle und Antikrebsmittel eingesetzt [5,6,7,8].

Im Labor der Autoren werden Pflanzenextrakte (Artemisia capillaris , Leonurus japonicus , Polygala tenuifolia , Caesalpinia sappan , Bupleurum falcatum , und Garcinia mangostana ) wurden als Reduktionsmittel verwendet, um sowohl AuNPs als auch Silbernanopartikel (AgNPs) grün zu synthetisieren [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. Der Luftteil von A. capillaris wurde extrahiert und für die Synthese von AgNPs und AuNPs verwendet [9, 15, 16]. Die hergestellten AgNPs zeigten eine ausgezeichnete antibakterielle Aktivität gegen Escherichia coli , Enterobacter cloacae , Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella aerogenes , und Klebsiella oxytoca verglichen mit dem des Extrakts allein [15]. Dieses Ergebnis zeigte, dass die synergistische Wirkung der Kombination von AgNPs und dem Extrakt zu einer verstärkten antibakteriellen Aktivität beitrug. Interessanterweise wurden AgNPs synthetisiert mit A. capillaris in Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid zeigte antibakterielle Wirkung gegen Methicillin-resistente Staphylococcus aureus [16]. Außerdem wurden AuNPs synthetisiert mit A. Kapillaren zeigten katalytische Aktivität gegenüber der 4-Nitrophenol-Reduktionsreaktion [9]. L. japonicus Extrakt wurde für die Synthese von AgNPs verwendet, die eine bemerkenswerte Verbesserung der antibakteriellen Aktivität aufweisen [10]. Wir beobachteten, dass die antibakterielle Aktivität gegenüber gramnegativen Bakterien größer war als die gegenüber grampositiven Bakterien. Der Wurzelextrakt von P. tenuifolia wurde auch für die Synthese von AuNPs und AgNPs verwendet [11, 17]. Bei AuNPs bzw. AgNPs, die mit P synthetisiert wurden, wurde eine verstärkte gerinnungshemmende Aktivität und antibakterielle Aktivität beobachtet. tenuifolia Extrakt. Interessanterweise wurden AgNPs mit C synthetisiert. sappan Extrakt zeigte eine wirksame antibakterielle Aktivität gegen Methicillin-resistente S. aureus [18]. Der Auszug von G. Mangostana produzierten asymmetrische hantelförmige AgNPs mit apoptotischen Effekten [14].

Frühere Berichte haben die grüne Synthese von AuNPs und AgNPs unter Verwendung von Teeblattextrakt untersucht [19,20,21,22,23]. Kamal und Mitarbeiter berichteten über die erfolgreiche Synthese von 25 nm-AgNPs [19]. In einem anderen Bericht wurden kugelförmige AgNPs mit einer Größe von 20 bis 90 nm mit Teeblattextrakt synthetisiert [20]. Die synthetisierten AgNPs zeigten eine leichte antibakterielle Aktivität gegen E. coli . Kugelförmige AgNPs mit einer Größe von 3,42 bis 4,06 nm wurden auch von Loo und Mitarbeitern unter Verwendung von Teeblattextrakt hergestellt [21]. Vaseeharan und Mitarbeiter synthetisierten antibakterielle AgNPs mit Teeblattextrakt [22]. Die synthetisierten AgNPs waren wirksam gegen pathogene Vibrio harveyi Infektion. Begum und Mitarbeiter verwendeten Schwarztee-Blattextrakt, um sowohl AuNPs als auch AgNPs zu synthetisieren [23]. Bisher wurden meist kugelförmige AgNPs unter Verwendung von Teeblattextrakt synthetisiert.

Im vorliegenden Bericht wurde Chitosan als Verkappungsmittel für AuNPs verwendet. Chitosan wurde aufgrund seiner hohen Biokompatibilität, geringen Allergenität, biologischen Abbaubarkeit und geringen Toxizität als Vehikel für die Wirkstoff-/Genabgabe untersucht [24,25,26]. Chitosan stammt aus Chitin, das in den Exoskeletten von Insekten und Krebstieren wie Krabben, Hummer und Garnelen reichlich vorhanden ist. Chitin ist ein Polysaccharid bestehend aus N -Acetyl-D-glucosamin, verbunden durch β(1-4)-glykosidische Bindungen. Chitosan kann durch ein heterogenes N . aus Chitin gewonnen werden -Deacetylierungsprozess. Chitosan selbst besitzt antibakterielle, antimykotische, antitumorale und antioxidative Aktivität [25]. Als Verkappungsmittel kontaktiert Chitosan AuNPs direkt über einen elektrosterischen Mechanismus [26]. Chitosan-Nanopartikel beeinflussen den Mechanismus der zellulären Aufnahme durch A549-Zellen, ohne die Zytotoxizität zu verändern [24]. Darüber hinaus hat der Deacetylierungsgrad von Chitosan einen größeren Einfluss als das Molekulargewicht auf die zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität [24].

Die meisten Studien haben sich auf die Synthese von kugelförmigen AgNPs unter Verwendung von Teeblattextrakt konzentriert. Hier wurde Grünteeblattextrakt verwendet, um Goldnanosphären und Nanosterne zu synthetisieren. Die Nanokügelchen wurden als Keime für die durch Keime vermittelte Synthese von Nanosternen verwendet. Zum Vergleich wurden Nanostäbchen nach einer gängigen konventionellen Methode synthetisiert [27]. Drei verschiedene Formen von AuNPs (Nanosphären, Nanosterne und Nanostäbchen) wurden mit Chitosan bedeckt, um ihre Biokompatibilität und kolloidale Stabilität zu erhöhen. Diese AuNPs wurden durch UV-Vis-Spektrophotometrie, hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HR-TEM) und FT-IR charakterisiert. Hydrodynamische Größenmessungen durch dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zetapotentialmessungen wurden vor und nach dem Abdecken mit Chitosan durchgeführt. Die kolloidale Stabilität wurde in Salzlösungen, Puffer und Zellkulturmedium bewertet. Um die Zytotoxizität zu messen, wurde der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Test auf vier Krebszellen angewendet:AGS (humane Magen-Adenokarzinom-Zellen), HeLa (humanes epitheliales Cervix-Adenokarzinom Zellen), HepG2 (menschliche Hepatozytenkarzinomzellen) und HT29 (menschliche kolorektale Adenokarzinomzellen). Die zelluläre Aufnahme von AuNPs in HepG2-Zellen wurde quantitativ durch induktiv gekoppelte Plasma-Emissionsspektroskopie (ICP-OES) und Laserablation induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) gemessen.

Materialien und Methoden

Materialien und Instrumente

Chlorgoldsäure-Trihydrat (HAuCl₄ ·3H₂ O), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), Chitosan (aus Garnelenschalen, ≥ 75 % deacetyliert) und 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid wurden von Sigma-Aldrich (St . Louis, MO, USA). Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Qualität. Ein Shimadzu UV-1800- oder UV-2600-Spektrophotometer wurde verwendet, um UV-Vis-Spektren in einer Quarzküvette (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) aufzunehmen. Durch DLS durchgeführte hydrodynamische Größenmessungen und Zetapotentialmessungen wurden unter Verwendung eines NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA) durchgeführt. Ein Varian 640 IR wurde verwendet, um FT-IR-Spektren aufzunehmen (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); die gemessene Probe wurde nach dem KBr-Scheibenverfahren hergestellt. HR-TEM-Bilder wurden unter Verwendung eines JEM-3010 aufgenommen, der bei 300 kV betrieben wurde (JEOL, Tokio, Japan); die Probe wurde auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter (Kohlenstoff Typ B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, USA) geladen und bei 37 °C für 24 h im Ofen trocknen gelassen. Zur Beschallung wurde ein Modell WUC-A22H verwendet (Daihan Scientific Co. LTD., Seoul, Republik Korea). Zum Zentrifugieren bzw. Gefriertrocknen wurden eine Centrifuge 5424R (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) und eine FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, Republik Korea) verwendet. Für die zelluläre Aufnahme von AuNPs wurden ein Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) und ein J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, USA) verwendet.

Zubereitung von Grüntee-Extrakt

Das Institute of Hadong Green Tea (Hadong, Gyeongnam, Republik Korea) stellte uns freundlicherweise getrocknete Grünteeblätter zur Verfügung. Ein Mischer wurde verwendet, um Pulver der getrockneten Blätter herzustellen. Die Extraktion wurde durch Mischen von entionisiertem Wasser (2 µl) und pulverisierten Blättern (200 µg) durchgeführt. Die Extraktion wurde 1 Stunde lang durch Beschallung bei Umgebungstemperatur mit drei Wiederholungen fortschreiten gelassen. Whatman-Filterpapiere wurden verwendet, um Wasserfraktionen zu filtern, um unlösliche Materialien zu entfernen. Dann wurde das Filtrat zentrifugiert (3.000g Kraft, 18 °C, 25 min) und der Überstand wurde gesammelt. Der gesammelte Überstand wurde mit einer Spritze filtriert und das Filtrat wurde gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wurde in entionisiertem Wasser gelöst, um eine Stammlösung mit einer Endkonzentration von 2 % (w/v ) für die im folgenden Abschnitt beschriebene grüne Synthese.

Synthese von Gold-Nanosphären mit Extrakt

Der Nanokügelchen-Syntheseprozess ist in Abb. 1a veranschaulicht. Zur Synthese wurde die im vorigen Abschnitt beschriebene Stammlösung verwendet. In einem Glasfläschchen wurden der Extrakt (Endkonzentration 0,03 %) und Chlorgoldsäure-Trihydrat (Endkonzentration 0,5 µM) gemischt und Natriumhydroxid (Endkonzentration 1 µM) zugegeben. Entionisiertes Wasser wurde zugegeben, um ein Endvolumen von 2 ml zu ergeben. Die Ofeninkubation wurde in einem Trockenofen bei 80 °C für 2 h durchgeführt. Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) der Nanokügelchen wurde durch Aufnahme von UV-sichtbaren Spektren über den Bereich von 300~800 nm überwacht. Die Nanokugeln wurden auch als Keime für die im folgenden Abschnitt beschriebene Synthese von Nanosternen verwendet.

Synthese von Gold-Nanosphären. a Ein schematisches Diagramm des Syntheseprozesses und b UV-sichtbare Spektren von Nanosphären vor und nach Chitosan-Capping. Ein digitales Foto zeigt Nanokugeln unmittelbar nach der Synthese

Synthese von Gold-Nanosternen

Der Nanostern-Syntheseprozess ist in Abb. 2a veranschaulicht. Die wie im vorherigen Abschnitt beschrieben synthetisierten Nanokügelchen (50 µl) wurden mit einem Magnetstab auf einer Heizplatte bei Umgebungstemperatur gerührt (750 µl/min). Chlorogoldsäure-Trihydrat (0,25 mM, 5 ml) wurde dieser Lösung zugesetzt. Nach 15 s wurden zwei Lösungen gleichzeitig zugegeben:Silbernitrat (1 µM, 50 µL) und Ascorbinsäure (frisch zubereitet, 100 µM, 25 µL). Dann wurde die Mischung 5 min bei 750 U/min gerührt. UV-sichtbare Spektren wurden im Bereich von 300~1100 nm aufgenommen.

Synthese von Goldnanosternen. a Ein schematisches Diagramm des Syntheseprozesses und b UV-sichtbare Spektren von Nanosternen vor und nach Chitosan-Capping. Ein digitales Foto zeigt Nanosterne unmittelbar nach der Synthese

Synthese von Goldnanostäbchen

Der Nanostäbchen-Syntheseprozess ist in Abb. 3a veranschaulicht. Für die Synthese von Goldnanostäbchen wurde gemäß einem früheren Bericht mit geringfügigen Modifikationen eine keimvermittelte Synthese durchgeführt [27]. Die Wachstumslösung wurde wie folgt hergestellt. In einem 20 ml Glasfläschchen wurden Chlorogoldsäure-Trihydrat (10 ml, 500 ml) und Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB, 100 mm, 9,5 ml) gemischt. Die Lösung war gelblich-braun. Als nächstes wurde Ascorbinsäure (frisch hergestellt, 100 µM, 55 µl) zugegeben und diese Lösung wurde gerührt, bis sie von gelblich-braun nach farblos wechselte. Silbernitrat (10&mgr;mM, 100&mgr;l) wurde zugegeben und 10 Sekunden lang geschüttelt. Diese endgültige Lösung wurde als Wachstumslösung bezeichnet. Die Impflösung wurde wie folgt synthetisiert. In einem 20 ml Glasfläschchen wurden Chlorogoldsäure-Trihydrat (10 ml, 250 ml) und CTAB (100 ml, 9,75 ml) gemischt. Dann wurde eiskaltes, frisch zubereitetes Natriumborhydrid (10&mgr;mM, 600&mgr;l) zugegeben und 2 min gevortext. Die Lösung wurde als Impflösung bezeichnet. Die Impflösung (12 µl) wurde mit einer zuvor synthetisierten Wachstumslösung vermischt. UV-sichtbare Spektren wurden im Bereich von 400~900 nm aufgenommen.

Synthese von Goldnanostäbchen. a Ein schematisches Diagramm des Syntheseprozesses und b UV-sichtbare Spektren von Nanostäbchen vor und nach Chitosan-Capping. Ein digitales Foto zeigt Nanostäbchen unmittelbar nach der Synthese

Chitosan-Bedeckung von Nanokugeln, Nanosternen und Nanostäbchen

Chitosan-Capping wurde verwendet, um die kolloidale Stabilität und Biokompatibilität von AuNPs zu erhöhen. Chitosan wurde in 1% Essigsäure gelöst und die Endkonzentration wurde auf 0,01% eingestellt. Dann wurde eine Ultraschallbehandlung durchgeführt, um das Chitosan vollständig aufzulösen; diese Lösung wurde als Vorratslösung für das Chitosan-Capping im folgenden Verfahren verwendet. Sowohl Nanokugeln als auch Nanosterne, die zuvor synthetisiert wurden, wurden mit der Chitosan-Stammlösung (0,01 %) verschlossen. Die Chitosan-Stammlösung (30 %, v/v ) wurde mit der AuNP-Lösung (70 %, v/v ). Die Mischung wurde 2 h bei 900 U/min gerührt, um das Chitosan-Capping zu vervollständigen. Für Nanostäbchen wurde CTAB im Überschuss verwendet und somit wurde eine Zentrifugation (14.000 U/min, 15 min, 25 °C) durchgeführt, um CTAB zu entfernen. Die Nanostäbchen wurden aus dem Pellet gewonnen und das Chitosan-Capping wurde wie oben erwähnt durchgeführt. Dann wurden UV-sichtbare Spektren aufgenommen.

Bewertung der Kolloidstabilität

Die kolloidale Stabilität von AuNPs ist für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen wichtig. Die drei Arten von AuNPs mit Chitosan-Überkappung und Nanokügelchen ohne Chitosan-Überkappung wurden in den folgenden Lösungen auf kolloidale Stabilität untersucht:entionisiertes Wasser, 5 % Rinderserumalbumin (BSA), 5 % NaCl, PBS (pH   7,4), modifiziertes Eagle-Medium von Dulbecco ( DMEM) und Vollmedium. Das Vollmedium war DMEM, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt. Ein Milliliter jeder Art von AuNP-Lösung wurde mit der Testlösung wie oben erwähnt (0,5 ml) gemischt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 25 °C inkubiert und UV-sichtbare Spektren wurden aufgenommen.

Zellkultur und Zytotoxizität

Die folgenden Krebszelllinien wurden von der Korean Cell Line Bank (Seoul, Republik Korea) erworben:AGS, HeLa, HepG2 und HT29. Der MTT-Assay wurde durchgeführt, um die In-vitro-Zytotoxizität von AuNPs zu bewerten. Es wurde DMEM verwendet, das Natriumpyruvat enthielt. Das Zellkulturmedium enthielt 10 % fötales Rinderserum, 2 µM L Glutamin, 1 % Penicillin (100 µl/ml) und Streptomycin (100 µl/ml). Die Zellen wurden in 100-mm-Kulturschalen kultiviert und bei ungefähr 70 % Konfluenz gehalten. Vor der Zellkultur wurden die AuNPs mit drei verschiedenen Formen einer Vakuumverdampfung unterzogen, um eine endgültige Au-Konzentration von 5 mM zu erhalten. Auf 96-Well-Platten wurden die Zellen mit einer Dichte von 5.0 × 10 ³ . ausgesät Zellen/Vertiefung, und die Inkubation wurde 24 Stunden lang in einem Ofen bei 37 °C unter CO₂ . durchgeführt (5 %) Atmosphäre. Als nächstes wurden fünf verschiedene Konzentrationen von AuNPs (500 µM, 250 µM, 125 µM, 62,5 µM und 31,25 µM) behandelt und im Ofen für weitere 24 Stunden bei 37 °C unter einem CO₂ . inkubiert (5 %) Atmosphäre. Als nächstes wurde MTT-Reagenz (5 µl, 5 % in entionisiertem Wasser) zugegeben und in einem 37 °C warmen Ofen unter einem CO₂ . inkubiert (5 %) Atmosphäre für weitere 3 h. Die Extinktion wurde bei 570 nm unter Verwendung eines Fluoreszenz-Multidetektionslesegeräts (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, USA) gemessen. Unbehandelte Zellen wurden als Kontrolle verwendet.

Mobile Aufnahme

Die zelluläre Aufnahme jedes AuNP-Typs wurde quantitativ unter Verwendung von HepG2-Zellen gemessen. Auf 24-Well-Platten wurden die Zellen mit einer Dichte von 5.0 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Vertiefung, und die Inkubation wurde 24 Stunden lang in einem Ofen bei 37 °C unter CO₂ . durchgeführt (5 %) Atmosphäre. Als nächstes wurden 5 µM (Endkonzentration) jeder Art von AuNP-Lösung behandelt und im Ofen für weitere 24 Stunden bei 37 °C unter einem CO₂ . inkubiert (5 %) Atmosphäre. Nach der Inkubation wurde die überschüssige AuNPs enthaltende Lösung entfernt und die Zellen wurden mit Trypsin behandelt. Die Au-Konzentration in den trypsinisierten Zellen wurde quantitativ durch ICP-OES und LA-ICP-MS gemessen, die die Konzentration der Au-Aufnahme in den Zellen lieferten. Die Kontrolle bestand aus 5 µM der ursprünglichen kolloidalen Lösung jedes AuNP-Typs, die auch durch ICP-OES und LA-ICP-MS analysiert wurde, um die Au-Konzentration zu erhalten.

Ergebnisse und Diskussion

UV-sichtbare Spektren

UV-sichtbare Spektren werden häufig aufgenommen, um die Synthese von AuNPs zu bestätigen. Die charakteristische SPR von AuNPs kann über den sichtbaren bis nahen Infrarot-Wellenlängenbereich beobachtet werden. Darüber hinaus induziert das Capping von AuNPs im Allgemeinen entweder eine bathochrome (oder rote) oder eine hypsochrome (oder blaue) Verschiebung. Darüber hinaus wird im Allgemeinen eine hypochrome Verschiebung zusammen mit Rot- und Blauverschiebungen induziert. Wie in Abb. 1b gezeigt, wurden UV-Vis-Spektren über einen Bereich von 300–800 nm überwacht. Nanosphären zeigten einen charakteristischen SPR von 532 nm mit einer tiefen Burgunderfarbe. Nach dem Chitosan-Capping der Nanosphären wurde das maximale SPR zusammen mit einer hypochromen Verschiebung auf 537 nm rotverschoben (Abb. 1b). Für die Nanosterne wurde ein breiter Bereich von SPR-Wellenlängen (600~800 nm) mit einer dunkelblauen Lösung beobachtet (Abb. 2b). Die Chitosan-Überdeckung der Nanosterne zeigte eine hypochrome Verschiebung, wobei die Absorption geringer war als die von AuNPs ohne Chitosan-Überdeckung (Abb. 2b). Nanostäbchen zeigten zwei unterschiedliche SPR-Wellenlängen von 514 nm und 815 nm unter Bildung einer hellrosa Lösung (Abb. 3b). Die Chitosan-Überkappung von Nanostäbchen induzierte eine Blauverschiebung zu 797 nm zusammen mit einer hypochromen Verschiebung (Abb. 3b). Unter Berücksichtigung all dieser Ergebnisse veränderte das Abdecken von AuNPs mit Chitosan die SPR-Wellenlänge und induzierte Verschiebungen. Eine sorgfältige Untersuchung der UV-sichtbaren Spektren zeigte, dass die drei Arten von AuNPs erfolgreich mit Chitosan bedeckt wurden.

Hydrodynamische Größe und Zetapotentiale

Als nächstes wurden die hydrodynamische Größe und das Zetapotential gemessen; die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Ohne Chitosan-Überkappung betrugen die hydrodynamischen Größen von Nanokugeln und Nanosternen 28,4 bzw. 97,8  nm. Die hydrodynamische Größe der Nanostäbchen wurde nicht gemessen, da die hydrodynamische Größe gut an die Kugelform der Nanopartikel angepasst war. Mit Chitosan-Capping wurde die hydrodynamische Größe für Nanokügelchen auf 190,7 nm und für Nanosterne auf 123,9 nm erhöht. Chitosan-Capping wurde durch eine Zunahme der hydrodynamischen Größe bestätigt. Die Änderung der Zetapotentiale spiegelte auch die Chitosanüberdeckung auf der Oberfläche von AuNPs wider. Chitosan ist ein positiv geladenes Polysaccharid; Daher führte das Chitosan-Capping zu positiven Zeta-Potentialen für alle drei Arten von AuNPs. Für die Nanokügelchen wurde das Zeta-Potential von − 12,73 auf 42,28 mV verändert. Das Zetapotential der Nanosterne wurde von − 42,46 auf 47,44 nm verändert. Im Fall der Nanostäbchen wurde CTAB (ein kationisches Tensid) zur Synthese verwendet. Somit betrug das ursprüngliche Zeta-Potential 27,96  mV ohne Kappen. Die Chitosan-Überkappung von Nanostäbchen erhöhte das Zeta-Potential auf 33,23 nm. Daher zeigte die Änderung der Zetapotentiale von negativen zu positiven Werten für die Nanokügelchen und Nanosterne eindeutig ein erfolgreiches Capping mit Chitosan an. Darüber hinaus erhöhte sich das Zeta-Potential der Nanostäbchen, was darauf hindeutet, dass die Oberfläche mit Chitosan bedeckt war.

HR-TEM-Bilder

Die Mikroskopie ist für die Nanopartikelforschung von entscheidender Bedeutung, da sie wesentliche Informationen über die Größe und Form von Nanopartikeln liefert. Mikroskopie-Tools liefern eine Reihe detaillierter Informationen, wie z. B. den Dispersionszustand, die zwei- und dreidimensionale Morphologie und Topographie sowie die relative Weichheit/Härte von Materialien. Die Nanokugeln maßen 8,7 ± 1,7 nm, basierend auf dem Durchschnitt von 75 zufällig ausgewählten diskreten Nanopartikeln in HR-TEM-Bildern (Abb. 4). Die am häufigsten vorkommende Größe war 8~9 nm (29,3 %), gefolgt von 9~10 nm (12,0 %). Beim Chitosan-Capping blieb die Form der Nanokügelchen ohne Formänderung erhalten (Abb. 4c, d). Die kristalline Natur der Partikel wurde durch die in Abb. 4d gezeigten Gitterstrukturen deutlich angezeigt. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde mit 0,24 nm gemessen (Abb. 4d). Darüber hinaus wurde auch die Chitosanschicht visualisiert, wie durch die roten Pfeile in Abb. 4d angedeutet. Nanosterne wurden durch HR-TEM visualisiert, wie in Abb. 5 gezeigt. Die Nanosterne maßen 99,0 ± 47,0 nm, was dem Durchschnitt von 19 diskreten Nanopartikeln entspricht. Die Gitterstruktur wird in einem vergrößerten Bild angezeigt (Abb. 5c). Wie gezeigt, wurde der Abstand zwischen benachbarten Gittern mit 0,24  nm gemessen (Abb. 5c). Die roten Pfeile in Abb. 5c zeigen die Chitosanschicht an. Nanostäbchen wurden wie in Fig. 6 gezeigt visualisiert. Die durchschnittliche Partikellänge und -breite betrugen 60,4 nm bzw. 16,4 nm gemäß den Messungen an 28 Partikeln. Das Aspektverhältnis, definiert als Partikellänge geteilt durch Partikelbreite, betrug 3,7. Die Gitterstruktur ist in Abb. 6c gezeigt und bestätigt die kristalline Struktur der Nanostäbchen. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde mit 0,23 nm gemessen (Abb. 6c). Die roten Pfeile zeigen die Chitosanschicht an (Abb. 6c).

HR-TEM-Bilder von Gold-Nanosphären. Die Maßstabsbalken repräsentieren a 5 nm, b 20 nm, c 20 nm und d 5 nm. Bilder a und b wurden ohne Chitosan-Capping erhalten und c und d wurden mit Chitosan-Capping erhalten. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde mit 0,24 nm gemessen. Rote Pfeile zeigen die Chitosanschicht nach dem Abdecken an

HR-TEM-Bilder von Gold-Nanosternen. Die Maßstabsbalken repräsentieren a 200 nm, b 50 nm und c 5 nm. d Eine schematische Darstellung von Nanosternen mit einer durchschnittlichen Größe von 99,0 ± 47,0 nm. Bild a ohne Chitosan-Capping erhalten wurde und b und c wurden mit Chitosan-Capping erhalten. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde mit 0,24 nm gemessen. Rote Pfeile zeigen die Chitosanschicht nach dem Abdecken an

HR-TEM-Bilder von Goldnanostäbchen. Die Maßstabsbalken repräsentieren a 100 nm, b 200 nm und c 5 nm. d Eine schematische Darstellung von Nanostäbchen mit einer durchschnittlichen Länge und Breite von 60,4 nm bzw. 16,4 nm. Bild a ohne Chitosan-Capping erhalten wurde und b und c wurden mit Chitosan-Capping erhalten. Der Abstand zwischen benachbarten Gittern wurde mit 0,23 nm gemessen. Rote Pfeile zeigen die Chitosanschicht nach dem Abdecken an

FT-IR-Spektren

Grüner Tee enthält diverse Primär- und Sekundärmetaboliten. Die Hauptbestandteile von grünem Tee sind insbesondere Polyphenole, darunter Epigallocatechin-3-Gallat, (-)-Epicatechin-3-Gallat, (-)-Epigallocatechin und (-)-Epicatechin [28]. FT-IR-Spektren wurden aufgenommen, um Informationen über funktionelle Gruppen zu erhalten, die zur Synthese von AuNPs beigetragen haben. Wir haben das FT-IR-Spektrum von Nanosphären mit dem Spektrum des Extrakts verglichen (Abb. 7). Die wichtigste funktionelle Gruppe, die höchstwahrscheinlich an der Reduktionsreaktion von Au-Salzen beteiligt war, war –OH. Im Extrakt erschienen –OH-funktionelle Gruppen bei 3255 cm ⁻¹ (Abb. 7a). Bei der Synthese wurde dieser Peak bei 3300~3341 cm ⁻¹ . zu einer höheren Wellenzahl verschoben . Dieses Ergebnis zeigte, dass –OH-funktionelle Gruppen von Polyphenolen stammen, die zu C=O oxidiert wurden, während Au-Salze zu AuNPs reduziert wurden. Bemerkenswert ist das Auftreten von C=O-funktionellen Gruppen bei 1716 cm ⁻¹ in Nanokügelchen unterstützte eindeutig die Oxidation von –OH-funktionellen Gruppen während der Synthese (Abb. 7b).

FT-IR-Spektren von a Grüntee-Extrakt zur Synthese und b goldene Nanokugeln

Bewertung der kolloidalen Stabilität unter verschiedenen Lösungen

Die kolloidale Stabilität von Nanopartikeln ist ein wichtiges Anliegen für diagnostische und therapeutische Anwendungen. Sechs verschiedene Lösungen wurden auf kolloidale Stabilität getestet:(i) entionisiertes Wasser, (ii) NaCl (5 %), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5 %), (v) DMEM und (vi ) Vollmedium (DMEM mit 10 % FBS). Nach dem Mischen jeder Art von AuNPs mit der Testlösung wurden UV-sichtbare Spektren aufgenommen; die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und Abb. 8 dargestellt. In den UV-sichtbaren Spektren wurde für alle drei Arten von AuNPs eine hypochrome Verschiebung zusammen mit einer leichten Rot- oder Blauverschiebung beobachtet (Abb. 8a, c und e). Die Form der Spektren wurde beibehalten und es wurde keine Aggregation der kolloidalen Lösung beobachtet (Abb. 8b, d und f). Dieses Ergebnis zeigte, dass die kolloidale Stabilität in den oben genannten Testlösungen recht gut erhalten blieb.

Bewertung der kolloidalen Stabilität. a und b Nanosphären mit Chitosan-Überkappung, c und d Nanosterne mit Chitosan-Überkappung, e und f Nanostäbchen mit Chitosan-Überkappung, g und h Nanosphären ohne Chitosan-Überkappung. DW steht für deionisiertes Wasser

In Tabelle 2 wird die hypochrome Verschiebung als Prozentsatz der zurückgehaltenen Extinktion ausgedrückt, wobei die Extinktion der ursprünglichen Lösung auf 100 % eingestellt ist. Bei allen drei AuNPs blieb die kolloidale Stabilität am besten im Vollmedium erhalten, das für die nachfolgenden Zytotoxizitätsexperimente verwendet wurde:Nanokügelchen (65,3 %), Nanosterne (93,4 %) und Nanostäbchen (80,2 %). Die Proteinlösung BSA (5 %) bot ebenfalls eine angemessene kolloidale Stabilität:Nanokügelchen (61,8 %), Nanosterne (70,2 %) und Nanostäbchen (72,0 %). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Proteine, die die Nanopartikel bedecken, zusammen mit dem Chitosan-Capping weitere positive Auswirkungen auf die kolloidale Stabilität der AuNPs haben. Die kolloidale Stabilität der Nanokügelchen ohne Chitosan-Überkappung wurde ebenfalls bewertet (Abb. 8g, h). Alle Lösungen induzierten eine hypochrome Verschiebung. Von den getesteten Lösungen zeigte nur die NaCl-Lösung (5 %) eine große Rotverschiebung zusammen mit einer hypochromen Verschiebung.

Zytotoxizität

Ein MTT-Assay wurde durchgeführt, um die Zytotoxizität gegen vier Krebszelltypen zu messen (Abb. 9):AGS, HeLa, HepG2 und HT29. Die Zytotoxizität aller drei Arten von AuNPs war von der Au-Konzentration abhängig. Among the four cell types, the highest cytotoxicity was observed for HepG2 cells. Furthermore, nanorods showed the highest toxicity against the four cell types, followed by nanostars and finally by nanospheres. Specifically, nanorods showed a very high toxicity; thus, the cytotoxicity of nanorods containing a low range of Au concentrations was also evaluated (Fig. 9e). At concentrations as low as 8 μM Au, nanorods showed concentration-dependent cytotoxicity. Against HepG2 cells, the IC₅₀ value was 127.1 μM Au for nanospheres, 81.8 μM Au for nanostars, and 22.7 μM Au for nanorods. Thus, nanorods were the most cytotoxic, followed by nanostars, and nanospheres were the least cytotoxic against HepG2 cells.

Cytotoxicity assessed by MTT assay (31.25~500 μM Au concentration). a AGS, b HeLa, c HepG2, and d HT29. e Low Au concentrations (8~125 μM) were evaluated on HepG2 cells

It has been reported that the cytotoxicity of AuNPs is affected by size, shape, and surface charge [29, 30]. Favi and co-workers investigated the cytotoxicity of Au nanospheres (61 nm) and Au nanostars (34 nm) against two types of cells (human skin fibroblasts and rat fat pad endothelial cells) [31]. In both cell types, a lethal concentration was observed at 40 μg/mL for nanospheres and at 400 μg/mL for nanostars. Their results suggested that nanospheres were more cytotoxic than nanostars, suggesting that size, shape, and surface chemistry are most likely influential to the cytotoxicity of AuNPs. Woźniak and co-workers reported the cytotoxicity of AuNPs with diverse shapes against both HeLa and HEK293T (human embryonic kidney cells), namely, nanospheres (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanorods (~ 41 nm), nanoprisms (~ 160 nm), and nanostars (~ 240 nm) [30]. Interestingly, nanospheres and nanorods were more cytotoxic than nanoflowers, nanoprisms, and nanostars. The authors explained that the small size of the nanoparticles and the aggregation process were the main driving forces for the cytotoxicity of nanospheres and nanorods in their work. Indeed, many studies have addressed the size effect of AuNPs on cytotoxicity [32, 33]. As AuNPs become smaller, their uptake by cells increases. This higher uptake results in a higher concentration of AuNPs in the cell, which leads to higher cytotoxicity against cells. However, a low concentration of AuNPs in the cell also shows high cytotoxicity [34]. The concentration of AuNPs in the cell affects cytotoxicity; however, it is vital to consider and understand the characteristics of AuNPs. The cytotoxicity of AuNPs of two different shapes (nanospheres 43 nm, nanorods 38 × 17 nm) was evaluated in epithelial cells by Tarantola and co-workers [35]. Nanospheres were determined to be more cytotoxic than nanorods. Furthermore, nanospheres induced a dysfunction in epithelial cell membranes, which was measured by electric-cell substrate impedance sensing [35]. As previously discussed, many studies are currently investigating the cytotoxicity of different shapes of AuNPs in various cells. Although the shapes of AuNPs may remain the same, many factors still affect the cytotoxicity of AuNPs. When assessing cytotoxicity, factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type should also be considered [34, 36,37,38]. In addition to the characteristics of AuNPs, cytotoxic mechanisms including disruption of the cell membrane, oxidative stress, destruction of the cytoskeleton, and loss of mitochondrial function are also important [38, 39]. Currently, autophagy and lysosomal dysfunction are emerging as explanations of the cytotoxicity of nanomaterials [40]. In lysosomes, nanomaterials induce cytotoxicity by lysosomal-iron-mediated oxidative stress and the release of cathepsins and other associated lysosomal hydrolases, which causes mitochondrial dysfunction and cell death. In the current report, nanorods were the most cytotoxic against the four types of cancer cells tested. Thus, our future work will examine the detailed mechanisms of cytotoxicity.

Cellular uptake on HepG2 cells

HepG2 cells showed the highest cytotoxicity among the four types of cancer cells; accordingly, we selected this cell type for evaluating cellular uptake. Two instruments, ICP-OES and LA-ICP-MS, were used to quantitatively analyze the concentration of Au in cells, and the results are shown in Fig. 10. A Au concentration of 5 μM was used for evaluating cellular uptake because no toxicity was observed at this concentration among the four types of cancer cells. The uptake was the highest for nanospheres (58.0 %), followed by nanorods (52.7 %) and nanostars (41.5 %). As indicated in the previous section, the cytotoxicity was dependent on particle shape (nanorods> nanostars> nanospheres). However, the order of cellular uptake (nanospheres> nanorods> nanostars) did not match the order of cytotoxicity. The cellular uptake of nanospheres was the highest; however, the cytotoxicity of these particles was the lowest. These results suggest that high cellular uptake does not always induce high cytotoxicity. As mentioned previously, diverse factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type are important in influencing cytotoxicity.

Cellular uptake by HepG2 cells

The different degrees of uptake of the three types of AuNPs (41.5~58.0 %) possibly depend on the competition between wrapping (i.e., how a membrane encloses a nanoparticle) under a thermodynamic driving force and receptor diffusion kinetics [41, 42]. Chithrani and Chan compared the cellular uptake of transferrin-coated Au nanospheres and Au nanorods by HeLa cells [42]. At the same size (i.e., the same value for the nanosphere diameter and nanorod width), nanospheres showed higher uptake than did nanorods. This result is consistent with our observations in the current report of higher uptake of nanospheres compared with nanorods. For nanorod uptake, width is more important than length, and an increasing aspect ratio decreases the uptake rate [42]. The size of the nanostars was 99.0 ± 47.0 nm, making them the largest particles among the three types of AuNPs. For large nanoparticles (> 50 nm), slow receptor diffusion kinetics lead to short wrapping times [42]. Thus, the cellular uptake of large nanoparticles is low, i.e., nanostars in the current report. Chitosan was used for capping the AuNPs to increase their colloidal stability and biocompatibility. Chitosan capping can also play a role in the cellular uptake of AuNPs by interacting with receptors on the cell surface. A detailed mechanistic study is necessary to elucidate this issue.

Conclusion

The continued development of nanotechnology requires elaborate shape and size designs of nanoparticles for successful applications, including as drug delivery carriers or vehicles for biologically active compounds such as anticancer agents. Green tea extract was used as a green reducing agent for the synthesis of Au nanospheres and nanostars. Interestingly, the cytotoxicity of nanorods was higher than that of nanospheres and nanostars, while nanospheres showed the lowest cytotoxicity against four types of cancer cells. Cellular uptake by HepG2 cells was most likely dependent on shape and size; nanospheres showed the highest uptake by the cells, whereas nanostars showed the lowest uptake. The optimization of size and shape together with surface modification and functionalization will lead to the development of nanoparticles for future use in nanomedicine.

Abkürzungen

AFM:

Rasterkraftmikroskopie

AgNPs:

Silver nanoparticles

AGS:

Human gastric adenocarcinoma cells

AuNPs:

Goldnanopartikel

CTAB:

Cetyltrimethylammoniumbromid

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

FBS:

Fötales Rinderserum

FT-IR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

HeLa:

Human epithelial cervix adenocarcinoma cells

HepG2:

Human hepatocyte carcinoma cells

HR-TEM:

Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie

HT29:

Human colorectal adenocarcinoma cells

ICP-OES:

Optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma

LA-ICP-MS:

Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

SPR:

Oberflächenplasmonenresonanz