Herstellung, Charakterisierung und Zytotoxizität von kugelförmigen, konjugierten Gold-Cockle-Shell-abgeleiteten Calciumcarbonat-Nanopartikeln für biomedizinische Anwendungen

Hintergrund

Die Herstellung monodisperser Nanopartikel hat sich in elektronischen, optischen, biomedizinischen und magnetischen Anwendungen als bedeutend erwiesen [1,2,3,4]. Ihre Entwicklung und die von Biomaterialien hat Pharmazeutika [5], biomedizinische Systeme [6], Wirkstoffabgabesysteme [7], Kosmetika und Wasseraufbereitung [7,8,9] positiv verbessert. In gleicher Hinsicht könnte die Entwicklung konjugierter Materialien, die biokompatibel, biogen und nicht toxisch sind, wertvolle Beiträge zu den Bereichen Biowissenschaften und Biomedizin leisten [10]. Darüber hinaus könnten biokompatible metallisch konjugierte Bio- und Nanomaterialien zu weiteren wissenschaftlichen Fortschritten für biomedizinische Anwendungen wie Tissue Engineering [5], Therapeutika [11] und Wirkstoffabgabe [12] beitragen. Dies wurde in neueren Arbeiten ausführlich gezeigt, wie der Verwendung von injizierbaren selbstorganisierenden Kollagen-Gold-Hybrid-Hydrogelen [13], kolloidalen Gold-Kollagen-Kern-Schale-Nanokonjugaten [14] und gemeinsam assemblierten trägerfreien Nanowirkstoffen für die Antitumortherapie [fünfzehn]. Eine Reihe von Studien hat auch dokumentiert, dass metallische Nanopartikel Enzymelektroden in elektrochemischen Biosensoren mit anorganischen porösen Materialien, die nicht aus Siliziumdioxid bestehen, herstellen können [16]. Darüber hinaus haben die synthetisierten Graphenoxid-Albumin-Nanohybride auch ihren potenziellen Nutzen für eine verbesserte photodynamische Therapie gezeigt [17]. Insgesamt hat dies bei anderen möglichen Anwendungen wie der biomedizinischen Bildgebung und biosensorischen Systemen nur noch mehr Interesse geweckt [16, 18].

Calciumcarbonat als roher, natürlicher Mineralstoff wurde in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet, einschließlich biomedizinischer, industrieller und Nanotechnologie [10, 19, 20, 21]. Aragonit als Calciumcarbonat-Polymorph kommt in Herzmuschelschalen (Anadara granosa ), eine im Volksmund auch in Malaysia vorkommende Molluske [22]. Aragonit ist im Gegensatz zu den anderen Calciumcarbonat-Polymorphen von Calcit und Vaterit biogen und macht 95–98 % der Herzmuschelschale aus. Calciumcarbonat, ein anorganisches Material von Aragonit-Polymorphen, kommt natürlich und häufig in den Muschelschalen vor [23]. Aragonit-Polymorph hat aufgrund seiner Biokompatibilitätseigenschaften und seines vielversprechenden Potenzials bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen gegen Krebs [24] und der biomedizinischen Bildgebung [25, 26] zunehmend Aufmerksamkeit im Forschungsbereich auf sich gezogen. Derzeit haben die meisten früheren Forschungsstudien hauptsächlich zwei Methoden zur Herstellung von Calciumcarbonat offenbart [26]. Dazu gehören die gemeinsame Ausfällung oder doppelte Zersetzung und Karbonisierung von CO₂ Gas durch Calciumhydroxid unter kontrollierten Einstellungen, die leider keines biogenes Calciumcarbonat produziert [26,27,28]. Daher enthalten die Produkte eine Mischung aus Calcit und Vaterit in hohen Mengen, die aufgrund ihrer Nicht-Biokompatibilität und hohen Toxizitätsberichte für die biomedizinische Anwendung ungeeignet sind [26].

Mit dem zunehmenden Einsatz der Nanotechnologie in biomedizinischen Anwendungen konzentriert sich die vorliegende Studie jedoch auf die Synthese von Calciumcarbonat-Nanopartikeln aus kontrollierter Herzmuschelschale (CSCaCO₃ NPs) mit einzigartiger Größe und Form unter Verwendung von Dodecyldimethylbetain (BS-12) [29]. Dies ist inspiriert von früheren Arbeiten, die BS-12 als Biomineralisierungskatalysator bei der Synthese von CSCaCO₃ . verwenden Nanopartikel, die leicht für Bioanwendungen manipuliert werden können, kosteneffizient und relativ reine Nanopartikel sind [30]. Die Morphologie und Größe synthetisierter Nanopartikel sind entscheidend für die Bestimmung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften, wobei der Schwerpunkt auf Metallnanopartikeln angesichts ihres enormen biomedizinischen Anwendungspotenzials liegt [31]. Goldnanopartikel (AuNPs) werden aufgrund ihrer optischen Eigenschaften, ihres unterschiedlichen Größenbereichs und ihrer Farbe, die von Variationen der Absorptionsmaxima oder der verwendeten Synthesemethode abhängig sind, kontinuierlich verwendet [32]. Größe und Form von AuNPs beeinflussen ihre Absorptions- und Emissionseigenschaften im sichtbaren Lichtspektrum, wodurch sie vom sichtbaren bis zum nahen Infrarotbereich variieren. Daher können sie aufgrund ihrer Synthese [33], physikalisch-chemischen Eigenschaften [34], Biokompatibilität [35] und Oberflächenfunktionalisierung [36] für unterschiedliche und spezielle Anwendungen manipuliert werden [37]. Darüber hinaus wurde auch festgestellt, dass sie in der medizinischen Diagnostik nicht vollständig genutzt werden und ihr Wert möglicherweise in Vergessenheit gerät [37].

Nach entsprechender Funktionalisierung könnten sie also vielleicht für die Krebsbildgebung [38], die Krebsbehandlung [39], die Wirkstoffabgabe [40] und sensorische Geräte [41] umgestaltet werden. Eine Beschichtung ist für die Herstellung von Nano-Hybrid-Biomaterial mit funktionalisierten Eigenschaften wie Gold-Nanopartikeln (AuNPs) in Konjugation mit porösen Calciumcarbonat-Nanokügelchen unerlässlich [16, 42]. Das resultierende konjugierte Gold-Calciumcarbonat-Nanomaterial oder Nanokomposit-Hybrid, das die vorteilhaften Elternmerkmale wie Biokompatibilität, gute Löslichkeit und Dispergierbarkeit in Lösung beibehalten könnte [16]. Konjugierte Goldnanopartikel, die eine starke Farbänderung und lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) aufweisen, könnten ausgezeichnete Kandidaten für potenzielle multiple Rezeptorsysteme wie Aptamere, Peptide und Antikörper sein [35, 43, 44, 45]. Die Herstellung wasserlöslicher konjugierter Polymere und ihre Anwendungen in Biosensoren, Fluoreszenzbildgebung und Wirkstoffabgabe wurden erfolgreich realisiert [46,47,48]. Die konjugierten Nanopartikel oder das Nanomaterial haben jedoch im Laufe der Jahre zunehmend verbesserte Vorteile wie Photostabilität [48, 49] und geringe Zytotoxizität [50], mit Ausnahme der freundlicheren Herstellung [51] und Trenneigenschaften [48].

Hiermit die AuNPs und CSCaCO₃ NPs werden kontrollierbar synthetisiert und verwendet, um biogene konjugierte, aus Gold-Herzmuschelschalen gewonnene Calciumcarbonat-Nanopartikel (Au-CSCaCO₃ .) herzustellen und zu charakterisieren NPs), deren Durchmesser von 19–51 nm reicht. Anfänglich ist die AuNP-Präparation von der klassischen Turkevich-Methode [52] und den von Herzmuscheln abgeleiteten Nanopartikeln unter Verwendung des Dodecyldimethylbetain-Syntheseansatzes [26] inspiriert. Die Modifikationen in den Syntheseparametern wie der Konzentration könnten ihre Größe fachmännisch verringern oder vergrößern. Folglich wurde das synthetisierte Nanomaterial charakterisiert und auf Zytotoxizität untersucht. Das Au-CSCaCO₃ Weitere Vorteile der NP-Vorbereitung sind; einfache Synthese und Kosteneffizienz.

Methoden/Experimental

Materialien und chemische Reagenzien

Das Goldsalz (Tetrachlorgoldsäure mit 49%iger Goldlösung) und das Trinatriumcitrat wurden von prima nexus Sdn Bhd (Malaysia) bezogen. Frische Herzmuschelschalen wurden vom lokalen Markt (Pasar Borong, Seri Kembangan, Selangor, Malaysia) bezogen. Dodecyldimethylbetain (BS-12) und Indocyaningrün-Farbstoff (ICG) wurden von Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland) bezogen. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), fetales Rinderserum (FBS), Antibiotika-Kombination (Glutamin 100 mmol/l, Penicillin 100 U/ml und Streptomycin 100 μg/ml), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Dimethylsulfoxid (DMSO .) ) und MTT (3-Dimethylthiazo-2,5-diphynyltetrazoliumbromid-Farbstoff) wurden von Naclai tesque, Inc., Kyoto, Japan, bezogen. Alle anderen verwendeten Reagenzien waren von analytischer Qualität.

Synthese von Goldnanopartikeln

Die Synthese wurde unter Verwendung eines früher von Verma et al. [53] mit leichten Konzentrationsänderungen 1% Tetrachlorgoldsäure mit 49%iger Goldlösung. Ungefähr 0,1 % der Goldlösung wurden hergestellt und in einer Reihe von Konzentrationen von 15, 25 bzw. 20 mM in verschiedenen Erlenmeyerkolben verdünnt. Die Lösungen wurden dann auf 100 °C auf einer Heizplatte erhitzt, die mit dem Magnetrührer (6 Positionen, WiseStir ® Korea) gekoppelt war. Dann wurde der kochenden Lösung unter kontinuierlichem magnetischem Rühren etwa 1% Trinatriumcitrat zugesetzt, bis ein Farbübergang (gelblich-goldene Lösung wurde farblos, dann schwarz und schließlich leuchtend rot) beobachtet wurde. Die Heizung wurde nach 15 Minuten ausgeschaltet und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die synthetisierten Goldnanopartikel wurden dann zur weiteren Verwendung bei – 4 °C gelagert. Die Reaktion wurde in der folgenden Gleichung gezeigt:

Herstellung und Synthese von aus Herzmuscheln stammenden Calciumcarbonat-Nanopartikeln (CSCaCO₃ NPs)

Drei Kilogramm frisch gewonnene Herzmuschelschalen wurden gründlich gereinigt, geschrubbt und gewaschen. Das Herzmuschelschalenpulver wurde nach dem von Islam et al. [54]. Die gereinigte Herzmuschelschale wurde in einem Ofen (Memmert UM500, GmbH Co, Deutschland) 7 Tage bei 50 °C getrocknet. Die Herzmuschelschalen wurden unter Verwendung eines Mischers (Blender HCB, 550, USA) zu Pulver gemahlen und mit einem rostfreien Labortestsieb (Endecott Ltd., hergestellt in London, England) mit einer Öffnung von 90 &mgr;m gesiebt, um ein Pulver in Mikrometergröße zu erhalten. Das Pulver wurde 7 Tage bei 74 °C im Ofen getrocknet. Das Pulver wurde zur späteren Verwendung weiter in einen luftdichten Plastikbeutel aus Polyethylen verpackt. Die von der Herzmuschelschale abgeleiteten Calciumcarbonat-Nanopartikel wurden gemäß dem von Islam et al. [55], mit leichten Modifikationen der Methode und der Syntheseparameter. Zwei Gramm Herzmuschelschalenpulver wurden in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben gegeben, gefolgt von 50 ml doppelt entionisiertem Wasser, und eine Konzentration von 0,5 ml BS-12 wurde in den Erlenmeyerkolben gegeben. Die Mischung im Erlenmeyerkolben wurde bei 1000 U/min bei einer Temperatur von 50 °C für 135 min unter Verwendung einer systematischen Multi-Heizplatte und eines Magnetrührers mit kleinem Magnetstab kräftig gerührt. Die vorbereitete Probe wurde unter Verwendung von Doppelringfilterpapier der Größe 125 mm (Filtres Fioroni, China) von der Mutterflüssigkeit getrennt. Der Rückstand wurde dann gründlich gewaschen, um das überschüssige BS-12 zu entfernen. Die Endprodukte, CSCaCO₃ NP-Pulver, wurden in einen chemisch sauberen Behälter verpackt und 3 Tage lang (Oven Memmert UM500, GmbH Co, Deutschland) bei 74 °C getrocknet. Der Behälter wurde richtig eingewickelt und mit Para-Folie versiegelt, nachdem mehrere kleine Marmorkugeln hineingegeben wurden. Der Behälter wurde 5 Tage lang bei einer Geschwindigkeit von 200 U/min auf eine programmierbare Rollenkugelmühle (BML-6, Wisemix ® Korea) gestellt. Die Probe wurde zur weiteren Verwendung in einem luftdichten Polyethylen im Ofen aufbewahrt.

Synthese konjugierter, von Gold-Herzmuschelschalen abgeleiteter Calciumcarbonat-Nanopartikel (Au-CSCaCO₃ NPs) und Inkooperation von Nahinfrarot(NIR)-Farbstoff

Bei diesem Verfahren 0,2 g CSCaCO₃ NPs und 5 mg Nahinfrarot(NIR)-Indocyaningrün-Farbstoff (ICG) wurden in 20 ml Goldkolloidlösung (pH 7) (AuNPs-Lösung) dispergiert, wie ähnlich von Cai et al. [16], in einem sauberen, leeren Erlenmeyerkolben. Weitere Synthesemodifikationen wurden vorgenommen, wobei die Probe 20 Minuten lang beschallt und auf einem Magnetrührer mit einem kleinen Magnetstab bei 200 U/min 3 Tage lang inkubiert wurde. Die Probe wurde 10 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 10.000 U/min ultrazentrifugiert, um hellgrün-violettes Au-CSCaCO₃ . zu erhalten NP-Komposit. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet mit einer Reihe von entionisiertem Wasser gewaschen. Das vorbereitete Verbundmaterial wurde 4 Tage lang im Ofen getrocknet und zur weiteren Analyse in luftdichtem Polyethylen im Ofen aufbewahrt.

Charakterisierung von aus konjugierten Gold-Herzmuschelschalen abgeleiteten Calciumcarbonat-Nanopartikeln (Au-CSCaCO₃ NPs)

Die Partikelgröße und Morphologie des Nanomaterials wurde mittels Transmissionselektronenmikroskop (TEM) analysiert. Das Nanomaterial wurde in absolutem Alkohol dispergiert und 40 Minuten lang beschallt. Ungefähr 5 μl der suspendierten Probenlösung wurden auf eine Probenhalterung aus Kupfer mit Spannzange pipettiert. Die Probe wurde unter TEM (Hitachi H-7100) betrachtet. Das Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FESEM) (Modell JOEL 7600F) wurde bei einer Spannung von 5 KV betrieben und war mit einer energiedispersiven Röntgenspektroskopieeinheit (EDX) ausgestattet. Dies wurde verwendet, um die Oberflächenmerkmale von Au-CSCaCO₃ . zu charakterisieren NPs. Das Material wurde in absolutem Alkohol dispergiert und 1 h lang beschallt. Etwa 50 μl der suspendierten Probenlösung wurden auf eine Kupfer-Griffprobenhalterung pipettiert, über Nacht getrocknet und mit den Elektronenstrahlen gescannt. Darüber hinaus wurde das Fourier-Transform-Infrarotspektrometer (FTIR) auch für die Funktionsanalyse des synthetisierten konjugierten Nanomaterials verwendet; das Nanomaterial wurde in 1 Gew.-% in Ker (FTIR Model 100, Perkin Elmer) im Bereich von 400–4000 cm ⁻¹ . kalibriert . Darüber hinaus wurde die Analyse der synthetisierten Nanokonjugatgröße und des Zetapotentials unter Verwendung eines Zetasizers (Nano ZS, Malvern Instruments) durchgeführt. Das Material wurde in entionisiertem Wasser suspendiert und 50 Minuten lang beschallt; die homogene Suspension wurde in die Zetasizer-Küvette gegeben und auf Partikelgröße und Zetapotential untersucht. Das Vorhandensein verschiedener Analyten des konjugierten Nanokomposits wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UV – 2600) bei verschiedenen Wellenlängen im Bereich von 300 bis 800 nm überwacht.

Zellkultur- und Zytotoxizitätsstudien

Humane Brust-Adenokarzinom-Zelllinie (JCRB:MCF-7) und die Maus-Fibroblasten-Zelllinie (JCRB:NIH3T3) wurden in DMEM (hoher Glukose) kultiviert, das mit 10 % FBS und einer Antibiotika-Kombination (Glutamin 100 mmol/l, Penicillin 100 E/ ml und Streptomycin 100 μg/ml). Die Kulturflaschen (Eppendorf-Kultur T-25 und T-75) wurden in 5 % Kohlendioxid bei 37 °C inkubiert und Zellen mit 80–90 % Konfluenz wurden für die Aussaat und den Behandlungsprozess verwendet.

Aussaat und Behandlung von Zellen

Die Zellen wurden in sterilen 96-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 ³ . ausgesät Zellen pro Vertiefung und über Nacht für 24 Stunden inkubiert. Die Medien in jeder Vertiefung wurden entfernt und die Zellen wurden behandelt und in Replikaten mit konjugierter Nano-Komposit-Suspension (Au-CSCaCO₃ NP) für einen Zeitraum von 24, 48 und 72 Stunden. Nach Abschluss der Behandlung wurden die Medien in den Wells abgesaugt und mit PBS gewaschen, bevor sie vor den experimentellen Behandlungen durch andere frische Medien ersetzt wurden.

Vorbereitung von Au-CSCaCO₃ NPs zur Behandlung

Stammlösung von Au-CSCaCO₃ NPs in einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 % serumfreiem DMEM-Medium wurden hergestellt. Nach der Zellaussaat von MCF-7-Zellen und NIH3T3-Zellen in 96-Well-Platten wurden die Platten mit verschiedenen Konzentrationen in Mikrogramm (100–1,56) des Au-CSCaCO₃ . behandelt und inkubiert NPs-Lösungen.

(MTT) 3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazoliumbromid Reagenzvorbereitung und Protokoll

Typischerweise wurden 5 mg MTT-Reagenspulver in 1 ml PBS gelöst, was durch Beschallungswirbel für eine einheitliche Mischung erleichtert wurde. Nach der Zellaussaat und -behandlung wurden die Well-Platten geleert und 20 μl MTT-Reagens wurden zu jedem Well hinzugefügt. Unmittelbar danach durften die Platten 3–4 h inkubieren, um die Bindung des MTT an die Mitochondrien der Zellen zu ermöglichen. Nach der Inkubation wurde 1 ml DMSO in jede der Vertiefungen gegeben, wodurch das Farbprodukt in die Lösung freigesetzt wurde. Die Platten wurden 30 min in einem dunklen Raum aufbewahrt und die optische Dichte (OD) der Lösung wurde mit einem Mikroplattenlesegerät bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen [56]. Die Experimente wurden dreifach für jede Zelllinie durchgeführt und die Mittelwerte wurden aufgezeichnet. Der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit der folgenden Formel bestimmt.

wo A _Beispiel war der durchschnittliche OD-Wert von verschiedenen inkubierten behandelten Zellen beider Zelllinien und A _Kontrolle war der durchschnittliche OD-Wert der verschiedenen inkubierten Zellen nur in vollständigen Kulturmedien. Die Zytotoxizität der Zellen wurde dann anhand der durchschnittlichen Dreifachwerte bewertet und als Mittelwert ± ± Standardabweichung (SD) dargestellt.

Statistische Analyse

Die statistische Datenanalyse erfolgte mit der Software SPSS (Version 10, Chicago, USA). Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und als mittlere ± ± Standardabweichung (M ± ± SD) ausgedrückt. Die Signifikanzschwelle war p < 0.01.

Ergebnisse und Diskussion

Physikochemische Eigenschaften des konjugierten Au-CSCaCO₃ NPs

Transmissionselektronenmikroskop

Der Zweck der TEM-Aufnahmen bestand darin, die Größe des synthetisierten konjugierten Au-CSCaCO₃ . zu bestimmen Nanopartikel, die gut dispergierte Nanopartikel mit einer durchschnittlichen Durchmessergröße von 35 ± 16 nm im Bereich von (19–51 nm) aufweisen. Die den Synthesebedingungen zugeschriebenen Größenunterschiede waren in Abb. 1 dargestellt.

TEM (a , b ) Bilder von Au-CSCaCO₃ NPs, die ihre unterschiedliche Größe der Nanopartikel charakterisieren

TEM-Aufnahmen des Nanokonjugats zeigten einen Durchmesserbereich von 19–51 nm und dispergierte Nanopartikel. Die einzigartige Nanogröße konnte den kontrollierten Synthesebedingungen zugeschrieben werden. Eine andere mögliche Erklärung für die Nanopartikel-Dispersität könnte auf die negativ geladene Schicht aus Citrationen zurückzuführen sein, die die Abstoßung der Nanopartikel voneinander unterstützt, sowie auf die elektrostatische Abstoßung und die konjugierte Hydratationsoberflächenschicht, die die Aggregation verhindert und die Konjugatstabilität erhöht, wie ähnlich berichtet von Jazayeri et al. [56]. Darüber hinaus spielt das Citrat-Capping-Reagenz eine Rolle bei der Synthese, was eine größere Dispersität und Stabilität des Nanopartikel-Konjugats ermöglicht, wie von Rawat et al. [57]. Die einzigartige Partikelgröße zeigte die unterschiedlichen absorbierten Gold-Nanopartikel innerhalb der Calciumcarbonat-Nanokugel-Matrix, ähnlich der Arbeit von Cai et al. [16], was zu der beobachteten resultierenden Partikelgröße beiträgt. Dieses Ergebnis bestätigt jedoch auch Berichte, dass Calcit eine schlechte Fähigkeit hat, Goldnanopartikel aufzunehmen [16].

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FESEM) und energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX)

Die FESEM-Aufnahme bewertete die Morphologie und Form der synthetisierten Nanopartikel, die kugelförmiges und kettenartiges Au-CSCaCO₃ . zeigen NPs-Nanopartikel mit einem geringen Aggregationsgrad, wie in Abb. 2 dargestellt. Die Elementarspektren (Abb. 2b) analysierten die elementare Zusammensetzung der konjugierten Nanopartikel, die 64,98 % Kohlenstoff, 13,53 % Sauerstoff, 0,02 % Calcium, 17,63 % Kupfer und 3,85% Gold, wie in Tabelle 1 dargestellt.

FESEM a FESEM-Aufnahme des Au-CSCaCO₃ NPs, die die Morphologie beschreiben. b EDX-Spektren des Au-CSCaCO₃ NPs

FESEM-Aufnahmen beschrieben die einzigartige Morphologie als Kugelform, geglättete Oberfläche und kettenartig strukturierte konjugierte Nanopartikel, deren physikalische oder chemische Eigenschaften durch die Herstellungsbedingungen und Synthesemethoden erklärt werden können [58]. In ähnlicher Weise war die sphärische Struktur der konjugierten Nanopartikel ähnlich der von Verma et al. [53], jedoch im Gegensatz zu dem vorgestellten geringen Aggregationsgrad. Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis könnten die hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Gold-Nanopartikeln und den von Herzmuscheln abgeleiteten Calciumcarbonat-Nanopartikeln sein, die zu einer starken Bindung führen [48]. Darüber hinaus spiegelte sich die Rolle von BS-12, das bei der Synthese eingesetzt wurde, im Abbau der Nanopartikel in kugelförmige Gestalt analog zu den von Islam et al. dokumentierten Arbeiten wider. [55]. Das Elementarprofil (Tabelle 1) zeigte entgegen dem erwarteten Ergebnis keine signifikanten Veränderungen. In ähnlicher Weise sind beobachtete Befunde zur chemischen Zusammensetzung der konjugierten Nanopartikel dokumentiert, wie bereits in früheren Arbeiten gezeigt [26, 54].

Oberflächenladung und Größenverteilung nach Intensität

Das Zeta-Potential der konjugierten Nanopartikel wurde durchgeführt, um ihre Oberflächenladung, Stabilität und Größenverteilung nach Intensität zu bewerten, was eine negative Ladung von − 16,4 ± 3,81 mV und eine durchschnittliche Größe der konjugierten Nanopartikel von 57,97 nm zeigt, wie in Abb. 3 und . gezeigt Tabelle 2.

a Partikelgrößenverteilung nach Intensität des Au-CSCaCO₃ NPs. b Zetapotential von Au-CSCaCO₃ NPs mit Oberflächenladung

Das Zeta-Potential ist ein wichtiger Assay bei der Bewertung der elektrostatischen Ladung der Nanopartikeloberfläche, die mit einem Zeta-Sizer bestimmt wurde. Dies erklärte weiter die Dispersität des Nanomaterials in Lösung und ermöglichte es uns, die Gesamtstabilität, die Haltbarkeit der Nanopartikel, die Partikelwechselwirkungen zwischen den geladenen Partikeln und ihre Auswirkungen zu verstehen [59]. Die Bewertung des Zetapotenzials des konjugierten Nanomaterials zeigte eine Stabilität der Nanopartikel bei – 16,4 mV und einen Polydispersitätsindex (PdI) von weniger als 0,5. Eine mögliche Erklärung könnte auf das Vorhandensein einer stärkeren Elektroabstoßung zwischen den Partikeln in Suspension während der Messung zurückgeführt werden. Darüber hinaus können die Agglomerationstendenzen auch die Größenverteilung beeinflusst haben, was aufgrund der synthetischen Verfahren zu einer größeren Größe führt. Vorherige Studie von Hoque et al. hat in ähnlicher Weise dokumentiert [60], dass stark positives oder negatives Zetapotential die Aggregation verringert und die Stabilität erhöht. Darüber hinaus könnten die physikalisch-chemischen Unterschiede der synthetisierten Nanopartikel auf die verwendeten Synthesemethoden zurückgeführt werden. Kanaujia und Mitarbeiter [61] haben auch betont, dass höhere negative oder positive Werte des Zetapotentials Stabilität anzeigen und eine Aggregation von Partikeln verhindern, da die elektrische Abstoßung die Nanopartikeldispersion elektrisch stabilisiert, die auch von Isa et al. [62].

Fourier-Transform-Infrarotspektrometer (FTIR)

Das FTIR-Spektrum von Au-CSCaCO₃ NPs zeigt, dass der herausragendste Peak bei 1455,09 cm ⁻¹ . auftrat gefolgt von Peaks bei 1059,12 cm ⁻¹ , 854,80 cm ⁻¹ , und 464,16 cm ⁻¹ , bzw. Außerdem wurden schwache Peaks bei 706,40 cm ⁻¹ . beobachtet und 1785,68 cm ⁻¹ wie in Abb. 4 dargestellt.

Fourier-Transformations-Infrarotspektrometer-Spektrum der charakteristischen Hauptpeaks von Au-CSCaCO₃ NPs. Alle Markierungen entsprechen den im Text besprochenen Frequenzen

Das FTIR-Spektrum von Au-CSCaCO₃ Die vorgestellten NPs zeigten, dass der herausragendste Peak bei 1455,09 cm ⁻¹ . auftrat , was die Sauerstoff-Wasserstoff-(O-H)-Bindungen in Carboxylgruppen von Gold-Nanopartikeln [14] und Herzmuschel-Nanopartikeln belegt, gefolgt von Peaks, die am besten das Vorhandensein von Aragonit-Polymorph-Marker zeigten, beobachtet bei 1059,12 cm ⁻¹ , 854,80 cm ⁻¹ , und 706,40 cm ⁻¹ , von denen bekannt ist, dass sie über Alkylgruppen berichten, die in den von der Herzmuschelschale abgeleiteten Nanopartikeln vorkommen, die mit den Spektrumpeaks übereinstimmen [55]. Ebenso wurde der schwache Peak bei 1785,68 cm ⁻¹ . beobachtet aufgrund des Vorhandenseins der Carboxylgruppe [54], und ein zusätzlicher Peak wurde bei 464,16 cm ⁻¹ . beobachtet . Alle Peaks zeigten signifikante Merkmale des Vorhandenseins kovalenter Bindungen, Kohlenstoff-Kohlenstoff- (C-C), Kohlenstoff-Sauerstoff- (C-O) und Kohlenstoff-Stickstoff-(C-N)-Bindungen, deren entsprechende funktionelle Gruppen in unseren konjugierten Nanopartikel. Das FTIR identifizierte im Wesentlichen die vorhandenen funktionellen Gruppen, indem es die Infrarotspektrumspeaks des konjugierten Nanomaterials erfasste und gleichzeitig Daten mit hoher Spektralauflösung über einen weiten Spektralbereich (400–4000 cm ⁻¹ .) sammelte ) [63]. Es wird jedoch berichtet, dass Calcit-Polymorphe von Calciumcarbonat Peaks im Bereich von 2000 bis 2900 cm ⁻¹ . aufweisen mit den Nanopartikeln hergestellt durch die Karbonisierungsmethode [64].

UV-Vis-Spektrophotometer

Die synthetisierten konjugierten Nanopartikel zeigen einen starken Absorptionspeak bei 530 nm, wie in Abb. 5 gezeigt.

UV-Vis-Spektrophotometer-Absorptionsspektrum von Au-CSCaCO₃ NPs wie im Text besprochen

Goldnanostrukturen haben aufgrund des lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanzeffekts von AuNPs eine breite Lichtabsorption [65, 66]. Eine Reihe von Berichten hat gezeigt, dass Goldpartikel oft einen scharfen Absorptionspeak aufweisen, der zwischen 500–520 nm beobachtet wird [66,67,68,69]. Diese Technik ermöglichte eine weitere Bewertung des konjugierten Au-CSCaCO₃ Größe, Konzentration und Aggregationsniveau der NPs [65]. Es ist auch bekannt, dass sich die Absorptionsbande zu den kleineren Wellenlängen verschiebt, was die Verringerung der Partikelgröße anzeigt, und die symmetrische Form der Absorptionsspektren weist auf eine enge Partikelgrößenverteilung hin [70], was unser konjugiertes Au-CSCaCO_{3 NPs mit einem breiteren Absorptionspeak zwischen 500–550 nm und dem höchsten Punkt bei 530 nm Wellenlänge. Akzeptabel im nahen Infrarot-sichtbaren Spektrenbereich, in dem Licht durch das Gewebe leicht abgeschwächt wird und sich der Absorptionspeak signifikant zu längeren Wellenlängen verschiebt [71]. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte in der Synthese und Konjugation des Nanomaterials liegen. Auch im Einklang mit Srinath et al., die zeigten, dass die Position der Absorptionsbande hauptsächlich von der Farbvariation, Aggregation und oberflächenadsorbierten Spezies abhängt [72]. Darüber hinaus könnte sich das Absorptionsspektrum von Nanopartikeln aufgrund der Goldplasmonenresonanzeigenschaft in Abhängigkeit von Farbe, Morphologie und Größe verschieben [73]. Nanostrukturen mit photothermischen NIR-Eigenschaften haben die Fähigkeit, Licht stark zu streuen, was bedeutende Anwendungen in der biomedizinischen Bildgebung hat [74, 75].}

Zytotoxizitätsstudien

MTT (3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazoliumbromid)

Zytotoxizitätsstudien an menschlichen Brustkarzinomzellen (MCF-7) und embryonalen Fibroblastenzellen der Maus (NIH3T3) zeigen, dass das Au-CSCaCO₃ NPs hemmten über 70 % der Zellproliferation, was zum Absterben von Krebszellen führte, und fast 40 % der Fibroblastenzellen bei einer Dosierung von 100 μg. Der IC₅₀ und niedrigere Konzentrationsdosen wie 25 μg erwiesen sich auch als toxisch für die Krebszellen, was eine geringe Zelllebensfähigkeit offenbarte und auch die Zellproliferation der Krebszellen für die Nanopartikel um mehr als 50 % hemmte. Andererseits zeigten identische Konzentrationsdosierungen für die Fibroblastenzellen eine erhöhte und konsistente Zelllebensfähigkeit der Fibroblastenzellen. Der IC₅₀ zeigte eine Zelllebensfähigkeit von bis zu 80 % der Fibroblastenzellen, wie in Abb. 6 dargestellt.

Zytotoxizitätsbewertung des mit MCF-7 und NIH3T3 behandelten Au-CSCaCO₃ NPs-Zellen mit MTT-Assay, die die Lebensfähigkeit der Zellen in Prozent angeben

3-Dimethylthiazo-2,5-diphynyltetrazoliumbromid (MTT) ist ein kolorimetrischer Assay, der akzeptabel zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen verwendet wird [76]. Utilizing mitochondrial enzymes in the electron transport chain [77], viable cells with active metabolism converted MTT into purple-colored formazon crystals in the cellular cytosol [78]. The crystals were dissolved after cell lysis on adding an organic solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) which is proportional to live cell number, unlike dead cells, due to cytotoxicity that are unable to carry out the reaction [79]. The conjugated nanoparticles displayed consistent cell death against the cancer cells and reliable cell viability of the fibroblast cells with concentration doses ranging from 25–100 μg. Furthermore, attesting low cytotoxicity and highlighting the biocompatibility of Au-CSCaCO₃ NPs and potential usefulness for biomedical applications, the cytotoxicity could be due to the internalization of the nanoparticles which possibly triggered intracellular responses and thus induced cellular damage because of interaction with cell organelles. Despite contrary cytotoxicity findings with works done on HeLa cells (human cervical cancer cell line) due to nanoparticles inducing oxidative damage [35, 80], Zhang et al. demonstrated the biocompatibility of the nanoparticles and its likely use for drug delivery systems [80]. Similarly, reports of gold nanoparticles confirmed nontoxic dependent on their size [81] and concentration [39]. Studies strongly confirmed that biogenic gold conjugates are stable and nontoxic nanocarrier used in biomedical application [35, 39] suggesting use for biomedical applications such as drug delivery and cancer therapy [82].

Schlussfolgerungen

Spherical-shaped conjugated gold-cockle shell-derived calcium carbonate nanoparticles (Au-CSCaCO₃ NPs) were obtained. The conjugated nanoparticles were synthesized using a simpler, environmental friendly, and cost-efficient synthetic approach. Furthermore, based on the results, the obtained conjugated nanoparticles were relatively pure and stable. The source of material used for the cockle shell-derived nanoparticles is biogenic, readily available, and naturally occurring as seawater mollusca cockle shell. Based on the presented evidences, the conjugated Au-CSCaCO₃ NPs could be a good biomaterial for biomedical applications.

Abkürzungen

Au-CSCaCO₃ NPs :

Synthesized Conjugated Gold-Cockle Shell Derived Calcium Carbonate Nanoparticles

AuNPs:

Gold nanoparticles

BS-12:

Dodecyl dimethyl betaine

C–C:

Carbon-carbon bond

C–N:

Carbon-nitrogen bond

C–O :

Carbon-oxygen bond

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

EDX:

Energy dispersive X-ray

FBS:

Fetal bovine serum

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FRGS:

Fundamental Research Grant Scheme

FTIR:

Fourier transform infrared spectroscopy

HeLa cells:

Human cervical cancer cell line

IC₅₀ :

50% inhibition concentration

ICG:

Indocyanine green dye

JCRB:

Japanese Collection Research Bioresource

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

MTT:

3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazolium Bromide Dye

NIH-3T3:

Mouse embryonic fibroblast cell line

NIR:

Nahes Infrarot

O–H:

Oxygen-hydrogen bond

OD:

Optical density

PBS:

Phosphate-buffered saline

TEM:

Transmission electron microscope