Effiziente Ein-Schritt-Grünsynthese multifunktionaler Goldnanopartikel für gezielte Tumor-Bildgebung und -Therapie

Zusammenfassung

Goldnanopartikel (GNPs) wurden stets als Doxorubicin (DOX)-Transportvektoren für Tumordiagnose und -therapie eingesetzt; jedoch umfasst der Syntheseprozess dieser Vektoren zunächst die Herstellung von GNPs via chemischer Reduktionsmethode, gefolgt von Konjugation mit DOX oder spezifischen Peptiden, sodass diese Methoden gemeinsame Probleme wie Mehrschrittigkeit, hohe Kosten, Zeitaufwand, komplizierte Präparation und Nachbearbeitung aufwiesen. Hier präsentieren wir erstmals eine Ein-Schritt-Strategie zur Herstellung DOX-konjugierter GNPs auf Basis der chemischen Konstitution von DOX. Zudem stellen wir multifunktionale GNPs (DRN-GNPs) mit einer Ein-Schritt-Methode mithilfe der reduktiven Funktionsgruppen von DOX, RGD-Peptiden und nuklearen Lokalisationspeptiden (NLS) her, was nur 30 min benötigt. Streubild- und Zell-TEM-Studien zeigten, dass DRN-GNPs den Zellkern von HeLa-Zellen gezielt ansprechen können. Die Tumorinhibitionsraten von DRN-GNPs durch Tumor- und Schwanzveneninjektion bei nackten Mäusen betrugen 66,7 % bzw. 57,7 %, was signifikant erhöht war im Vergleich zu Kontrollgruppen. Die Ein-Schritt-Synthese multifunktionaler GNPs spart nicht nur Zeit und Material, sondern entspricht auch der Entwicklungsrichtung der Grünen Chemie und würde die Grundlage für großskalige Anwendungen in naher Zukunft legen. Unsere Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Fertigungsstrategie effizient ist und unsere hergestellten DRN-GNPs gute kolloidale Stabilität im physiologischen System besitzen; sie sind ein potenzielles Kontrastmittel und ein effizienter DOX-Transportvektor für Zervixkrebs-Diagnose und -Therapie.

Einleitung

Doxorubicin (DOX) ist ein häufig verwendetes Antikrebsmedikament, das breit in verschiedenen Krebschemotherapien eingesetzt wird, wie blutige bösartige Tumoren [1], verschiedene Adenokarzinome [2–5], Weichteilsarkome [6] usw. Allerdings führen langfristige und hohe DOX-Dosen zu Medikamentenresistenz [7], Übelkeit [8], Haarausfall [9] und akuter und chronischer Toxizität [10], was zu kongestiver Herzinsuffizienz führen kann [11]. Daher ist es sehr notwendig, einen Drug-Carrier mit guter Biokompatibilität und hoher Arzneimittelladekapazität zu entwickeln. In den letzten Jahren wurden viele Nanomaterialien wie Quantenpunkte [12, 13], Chitosan [14, 15], Silicium-Nanomaterialien [16, 17], polymerische Nanomaterialien [18–20], fluoreszierende Nanopartikel [21–24] und metallische Nanomaterialien [25–30] als DOX-Transportvektoren für Tumordiagnose und -therapie entwickelt. Goldnanomaterialien wurden aufgrund ihrer einzigartigen chemischen und optischen Eigenschaften, niedrigen Toxizität, guter Biokompatibilität und kontrollierbarer Oberflächenmodifikation [31, 32] breit eingesetzt. Bisher gibt es drei Ansätze für die Konjugation von DOX an GNPs: Erstens Konjugation von DOX auf die GNP-Oberfläche mit Hilfe von Hydrazin [25], EDC [26], pH-sensitivem Agens [27], DCC/NHS-System [28]. Zweitens Inkubation von GNPs mit DOX für mindestens 24 h [29]. Drittens Austausch von Citrat auf der GNP-Oberfläche durch DOX [30]. Obwohl diese DOX-konjugierten GNPs in Tumortherapie eingesetzt wurden, ist die Anwendung aufgrund mangelnder Spezifität noch begrenzt. Kürzlich funktionalisierte El-Sayeds Gruppe [27] GNPs mit DOX, RGD-Peptiden und nukleären Lokalisationssignalen (NLS). Der Höhepunkt ihrer Arbeit ist, dass GNPs über rezeptorvermittelte Endozytose von RGD-Peptiden in Tumorzellen eindringen und dann durch NLS-Peptide in den Zellkern gelangen, wodurch DOX effektiv die DNA-Synthese stört. Leider benötigte dies mindestens 120 h durch schichtweises Koppeln von Peptiden oder Medikamenten auf den GNPs, wobei jeder Prozess mindestens 24 h dauerte. Ähnlich litten alle oben genannten Methoden unter gemeinsamen Problemen wie Mehrschrittigkeit, hohen Kosten, komplizierter Präparation und Nachbearbeitung. Daher ist es notwendig, eine einfache und schnelle Methode zur Synthese multifunktionaler Goldnanomaterialien zu entwickeln.

In dieser Arbeit präsentieren wir erstmals eine Ein-Schritt-Strategie zur Herstellung DOX-konjugierter GNPs auf Basis der chemischen Konstitution von DOX. Zudem präsentieren wir eine praktische Synthesemethode für einen multifunktionalen DOX-Transportvektor, um DOX besser wirken zu lassen, der in Tumordiagnose und -therapie eingesetzt werden kann. Der Schlüsselunterschied unserer Arbeit zu anderen ist, dass wir DOX, RGD-Peptide und NLS-Peptide als Reduktions- und Stabilisierungsreagenzien verwenden, um GNPs herzustellen und alle drei Substanzen gleichzeitig auf der GNP-Oberfläche zu konjugieren, um DRN-GNPs zu bilden. Unsere früheren Arbeiten [33–35] hatten bewiesen, dass RGD und andere Peptide verwendet werden können, um Goldionen zu reduzieren und Goldnanomaterialien herzustellen. Der N-Terminus des NLS kann durch Cystein-Cystein-Tyrosin (CCY)-Sequenz modifiziert werden, um CCYNLS zu konstruieren, das Goldionen reduzieren kann, während es den Targeting-Effekt von NLS beibehält [36]. Wir fanden auch, dass DOX zwei phenolische Hydroxylgruppen mit starker Reduzierbarkeit unter basischen Bedingungen besitzt [37, 38], sodass es ebenfalls Goldionen reduzieren kann, um GNPs zu bilden. Zudem könnte die antitumorale Wirkung von DOX nicht beeinträchtigt werden, da es durch die Aminogruppe von Kohlenstoff 7 und die Hydroxylgruppe von Kohlenstoff 9 in DNA eingebaut wird [39]. Gleichzeitig können Schwefel, Sauerstoff und Stickstoff auf den Peptiden und DOX mit den GNPs kombiniert werden, um die kolloidale Stabilität zu erhalten [33]. Die Ergebnisse zeigen, dass DRN-GNPs erfolgreich hergestellt wurden und gut in Tumor-Bildgebung, Diagnose und Therapie funktionierten (Schema 1). Meines Wissens ist dies der erste Bericht zur Synthese von DOX, RGD- und NLS-Peptid-konjugierten multifunktionalen GNPs mit einer Ein-Schritt-Methode und deren Anwendung in Tumordiagnose und -therapie.

Schematische Illustration der Synthese von DRN-GNPs, der Aufnahme durch HeLa-Zellen und der Tumordiagnose von DRN-GNPs

Materialien und Methoden

Materialien

HAuCl₄·4H₂O wurde von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. bezogen. Zyklische RGD-Peptide (Aminosäuresequenz: Arginin-Glycin-Aspartat-Tyrosin-Glutaminsäure (c(RGDyE))) und Natriumhydroxid waren identisch mit Ref. [35]. Doxorubicin wurde von Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. gekauft. CCYNLS-Peptide (Aminosäuresequenz: Cystein-Cystein-Tyrosin-Prolin-Prolin-Lysin-Lysin-Lysin-Arginin-Lysin-Valin, CCYPPKKKRKV) wurden von China Peptides Co., Ltd. (Shanghai, China) geliefert. Die HeLa- und MCF-7-Zelllinien wurden von Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. bereitgestellt. Fötales Kälberserum (FBS) und Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) wurden von GibcoBRL Life Technologies bezogen. Das Proliferations- und Zytotoxizitäts-Assay-Kit (MTT) wurde von Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd. gekauft.

Synthese von DOX-GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs, DRN-GNPs

Zur Herstellung der DOX-GNPs wurde DOX-Lösung (0,2 mg/mL, 1,0 mL) in Chlorgoldsaure-Lösung (0,86 mM, 1,0 mL) unter magnetischem Rühren gegeben, dann NaOH (2 M, 5 µL) zum pH-Einstellen zugegeben. Für NLS-GNPs wurde CCYNLS-Peptid-Lösung (0,5 mM, 1,0 mL) in Chlorgoldsaure-Lösung (3,44 mM, 1,0 mL) unter Rühren gegeben, dann NaOH (2 M, 20 µL) zum pH-Einstellen. Für DR-GNPs wurden DOX-Lösung (0,2 mg/mL, 1,0 mL) und RGD-Peptid-Lösung (1,0 mM, 1,0 mL) in Chlorgoldsaure-Lösung (1,72 mM, 2,0 mL) unter Rühren gegeben, dann NaOH (2 M, 15 µL). Für DN-GNPs wurden DOX-Lösung (0,2 mg/mL, 1,0 mL) und CCYNLS-Peptid-Lösung (0,5 mM, 1,0 mL) in Chlorgoldsaure-Lösung (1,72 mM, 2,0 mL) unter Rühren gegeben, dann NaOH (2 M, 20 µL). Für DRN-GNPs wurden Lösungen von DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL), CCYNLS-Peptiden (0,5 mM, 1,0 mL) und RGD-Peptiden (1,0 mM, 1,0 mL) in Chlorgoldsaure-Lösung (1,72 mM, 3,0 mL) unter Rühren gegeben, dann NaOH (2 M, 35 µL). Alle Reaktionen dauerten 30 min bei 100 °C in einem Refluxsystem, der pH-Wert lag bei 10–12. Alle GNPs wurden durch Zentrifugation bei 55.000 rpm für 30 min (Optima MAX-TL, Beckman Coulter) gereinigt. Nach Entfernen des Überstands wurden die GNPs in ultrareinem Wasser redispergiert.

Charakterisierung

Die Charakterisierung der GNP-Spektren wurde mit einem UV-3150-Spektrophotometer (Shimadzu, Japan), einem Nicolet Avatar FTIR Modell 330 Spektrometer (Thermo, USA) und einer ESCALab250 Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) unter denselben analytischen Bedingungen wie Ref. [35] durchgeführt. TEM-Bilder der GNPs wurden mit einem TEM (JEM-2100F, JEOL, Japan) bei 200 kV Beschleunigungsspannung aufgenommen.

Dynamische Lichtstreuung und Zeta-Potenzial-Messungen

Ein Zeta PALS Zeta-Potenzial-Analysator (Brookhaven Instrument Corporation) wurde verwendet, um die dynamische Lichtstreuung (DLS) der DOX-GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs zu messen, der bei 90° Winkel mit einem Festkörperlaser (λ = 670 nm) bei Raumtemperatur arbeitete. Ausgestattet mit einer AQ-827-Elektrode wurde der Analysator zur Messung der Zeta-Potenziale der GNPs verwendet.

ICP-Analyse

Die quantitative Analyse von Au in den GNPs entsprach Ref. [35].

Stabilität von DR-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs dispersiert in PBS, HCl, NaOH, NaCl-Lösung

Wir mischten 100 µL der gefällten GNPs und 500 µL hochkonzentrierter 0,2 M PBS, 0,5 M HCl, 0,5 M NaOH und 1,0 M NaCl-Lösung jeweils. Zwölf Stunden später machten wir Fotos und testeten ihre UV-Absorptionsspektren.

Zellkultur

HeLa- und MCF-7-Zellen wurden in einem Inkubator (befeuchtet mit 5 % CO₂-ausgeglichener Luft) bei 37 °C für 24 h kultiviert. Das Kultivierungsmedium war DMEM mit 10 % FBS. Die Anzahl lebender Zellen wurde mit einer Zählkammer bestimmt.

Zytotoxizitäts-Assay von freiem DOX und DRN-GNPs

HeLa- und MCF-7-Zellen in exponentieller Phase wurden in 96-Well-Platten (ca. 5 × 10³ Zellen/Well) gegeben und 24 h inkubiert. Dann wurden DRN-GNPs mit Konzentrationen 0, 20, 40, 60, 80 und 100 µg/mL (entsprechende DOX-Konzentrationen 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2 und 39,0 µg/mL) in jeden Well gegeben und 24 h bei 37 °C inkubiert. Die Kontrollgruppe erhielt nur PBS-Pufferlösung, ihre Lebensfähigkeit wurde als 100 % gesetzt. MTT (20 µL, 5 mg/mL) wurde in jeden Well gegeben und 37 °C ca. 4 h inkubiert. Dann wurde das Kultivierungsmedium vorsichtig abgesaugt und 150 µL Dimethylsulfoxid pro Well zugegeben für 10 min bis zur vollständigen Kristallauflösung. Ein Mikroplattenleser (Thermo Multiskan Mk3) wurde verwendet, um den OD-Wert jedes Wells bei 490 nm zu messen. Drei Wells pro Gruppe wurden vorbereitet und die berechneten Werte als Mittelwert ± S.D. ausgedrückt.

Durchflusszytometrie-Experiment

HeLa- und MCF-7-Zellen in exponentieller Phase wurden in je zwei 12-Well-Platten (ca. 5 × 10⁴ Zellen/Well) gegeben und 24 h inkubiert. Dann wurde DRN-GNPs-Lösung in jeden Well gegeben (Endkonzentrationen 0, 20, 40, 60, 80, 100 µg/mL) und 24 h bei 37 °C inkubiert. Entfernen des Kultivierungsmediums und Zugabe von Trypsin (mit EDTA) Lösung in die Wells zur Zellverdauung. Dann Trypsin-Lösung entfernen, Kultivierungsmedium zugeben und Zellen in Zentrifugenröhrchen überführen. Nach Zentrifugation bei 1000 g für 5 min wurde der Überstand entfernt und die Zellen in jedem Röhrchen in PBS-Lösung gesammelt und gezählt. Etwa 5–10 × 10⁴ Zellen in weitere Zentrifugenröhrchen geben und erneut bei 1000 g für 5 min zentrifugieren. Überstand entfernen und 100 µL AnnexinV-Pufferlösung zugeben. 5 µL AnnexinV-FITC und 5 µL Propidiumiodid zugeben und vorsichtig mit Zellen mischen. Die Röhrchen wurden 15 min bei Raumtemperatur (20–25 °C) im Dunkeln inkubiert und dann per Durchflusszytometer (BD Accuri C6) getestet.

Optische Dunkelfeld-Streuungsbildgebung und Transmissionselektronenmikroskopie an Zellkulturen

HeLa- und MCF-7-Zellen wurden auf 8-Loch-Zellkultur-Slides mit ca. 7 × 10³ Zellen pro Well implantiert. DRN-GNPs wurden mit Endkonzentration 35 µg/mL in jeden Well gegeben. Nach 24 h Inkubation entfernten wir physisch adsorbierte und freie GNPs durch dreimaliges Spülen mit PBS. Dann fixierten wir mit 4 % Paraformaldehyd für 20 min, gaben wenige Tropfen Glycerin hinzu und versiegelten die Slides mit Deckgläsern. Ein Dunkelfeldmikroskop (Zeiss Imager Z1) wurde verwendet, um Zellen bei 200-facher Vergrößerung im Reflexionsmodus zu beurteilen. Belichtungszeit für Hellfeld- und Dunkelfeldbilder bei 5 V betrug 1 ms bzw. 400 ms.

Für TEM-Studien wurden HeLa- und MCF-7-Zellen 24 h in Zellkulturflaschen mit DRN-GNPs (35 µg/mL) inkubiert. Nach Inkubation und Absaugen der Mischlösung aus Medium und DRN-GNPs spülten wir die Zellen dreimal mit PBS und verdauten sie mit Trypsin. Die Zellen wurden in ein Zentrifugenröhrchen mit wenig DMEM-Medium überführt. Die Zellen wurden zentrifugiert (1500 rpm) für 10 min, das DMEM-Medium vorsichtig abgesaugt und 3 % Glutaraldehyd-Lösung (üblicherweise 40-faches Volumen des Materials) vorsichtig zugegeben, um Zellen am Boden des Röhrchens für >1 h zu fixieren. Die Zellen wurden weiter durch Zugabe von 1 % Osmiumtetroxid für 1 h fixiert, mit Ethanol dehydriert und in Spurr (Sigma-Aldrich Co., USA) eingebettet. Die Zellen wurden aus dem Röhrchen entnommen, in Schnitte geschnitten, mit wässrigem Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und auf Kupfergitter (300 Mesh) montiert. Die Proben wurden mit einem FEI TECNAI-12 Transmissionselektronenmikroskop (Arbeitsspannung 120 kV) vermessen.

Tiereinversuche

Versuchstiere

Athymische weibliche Nacktmäuse wurden vom Tierversuchszentrum der Southern Medical University (Guangzhou, China) für in vivo Tumortherapie-Tests bezogen. Alle Tierexperimente wurden in Übereinstimmung mit den Tierschutzregeln des chinesischen Gesundheitsministeriums (Dokument Nr. 55, 2001) und den Richtlinien für Pflege und Verwendung von Labortieren der China Pharmaceutical University durchgeführt.

Therapeutische Wirksamkeit von freiem DOX und seinen Konjugaten in tumortragenden Mäusen

Kurz: 36 Nacktmäuse (5–6 Wochen, 16–18 g) wurden zufällig in sechs Gruppen aufgeteilt. Sie wurden subkutan mit HeLa-Zellen (5 × 10⁶ Zellen in PBS) in die rechte Achselhöhle injiziert. Fünf Tage später erhielten Mäuse der Kontrollgruppe Kochsalzlösung (0,154 mol/L, 0,2 mL) per Schwanzveneninjektion. Mäuse der Gruppen freies DOX, DR-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs erhielten ebenfalls Schwanzveneninjektionen. Um die antitumorale Wirksamkeit von DRN-GNPs zwischen intravenöser Injektion und Tumorinjektion zu vergleichen, wurde eine Gruppe mit gleicher Menge DRN-GNPs direkt in den Tumor injiziert. Diese fünf Gruppen erhielten eine Dosis von 0,3 mg/kg äquivalentem freiem oder konjugiertem DOX pro Maus. Jede Maus erhielt täglich eine Schwanzvenen- oder Tumorinjektion. Körpergewicht und Tumorvolumen jeder Maus wurden 14 Tage lang täglich überwacht. Um die therapeutischen Effekte von DOX, DR-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs weiter zu untersuchen, wurden die Tumoren der sechs Gruppen nach 14 Tagen Behandlung für pathologische Analyse entnommen. Tumoren und innere Organe (Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere) wurden isoliert, mit 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die geschnittenen Tumorgewebe wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt und per Olympus-Optikmikroskop untersucht.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von DOX-GNPs, NLS-GNPs, DN-GNPs, DR-GNPs, DRN-GNPs

Bei der Synthese der DOX-GNPs änderte sich die Farbe der Lösung beim Zusatz von NaOH-Lösung in die Mischung aus DOX und Chlorgoldsaure-Lösung sofort von orange zu blasslila, wurde dann bei 100 °C im Refluxsystem unter magnetischem Rühren innerhalb einer Minute weinrot, was die Bildung der DOX-GNPs anzeigte. Das Ergebnis zeigte, dass die Reduktionsfähigkeit von DOX sehr stark ist, da DOX zwei phenolische Hydroxylgruppen (Kohlenstoff Nr. 6 und Nr. 11) mit starker Reduzierbarkeit unter basischen Bedingungen besitzt. Die Reaktion dauerte 30 min, bis sich die Farbe nicht mehr änderte.

Um die orange-rote Farbe von DOX und die weinrote Farbe der GNPs nicht zu verwechseln, lieferten wir weitere Beweise durch Charakterisierung ihrer UV-Absorptionsspektren (Abb. 1a). DOX hat einen charakteristischen Absorptionspeak nahe 485 nm und einen Peak bei 530 nm; jedoch verschwand der Peak bei 480 nm im Spektrum der Produktlösung, und ein charakteristischer Peak bei 520 nm, der charakteristische Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Absorptionspeak der GNPs, trat auf. Dennoch ist die Bildung der GNPs noch nicht vollständig zwischen dem 520 nm der GNPs und dem 530 nm Peak von DOX bestimmt. Da GNPs bei Hochgeschwindigkeitszentrifugation ausfallen, DOX-Moleküle jedoch nicht, können wir lila Niederschlag am Boden der Zentrifugenröhre im Produkt sehen (Inset Abb. 1a(3-4)), während DOX keines hat (Inset Abb. 1a(1-2)).

a UV-Vis-Absorptionsspektren von DOX und den hergestellten DOX-GNPs, Inset von (a) zeigt Bilder von DOX (1, 2) und DOX-GNPs (3, 4) vor (1, 3) und nach Zentrifugation (2, 4). b TEM-Bild von DOX-GNPs. c FTIR-Spektren von DOX und den hergestellten DOX-GNPs. d XPS-Spektrum von DOX-GNPs

DOX zeigt rote Fluoreszenz unter 365 nm UV-Bestrahlung; die Fluoreszenz von DOX verschwand jedoch nach der GNP-Synthese. Es gibt zwei mögliche Gründe: Erstens ist der Extinktionskoeffizient der GNPs sehr stark, sie neigen dazu, die Fluoreszenz von Molekülen zu löschen, wenn sie sich in geringer Entfernung zur GNP-Oberfläche befinden (< 5 nm) [40]. Wenn die Distanz auf 20 nm oder mehr ansteigt, ist das Plasmonenfeld der Nanopartikel zu weit, um ihr Fluoreszenzsignal zu löschen [41]. Der andere Grund ist, dass die fluoreszierende Gruppe von DOX nach ihrer Rolle als Reduktionsmittel zerstört wurde. Wie in Abb. 1c gezeigt, obwohl die Anzahl der Infrarot-Absorptionspeaks der DOX-GNPs signifikant geringer ist als die von DOX, wurden viele DOX-Charakteristika beibehalten, wie charakteristische IR-Absorptionspeaks bei 2910 cm⁻¹ (C-H, Streckschwingung) [42], 1631 cm⁻¹ (Carbonyl-Streckschwingung) [43], 1114 cm⁻¹ (C-O, C-N Streckschwingung) [44] und 867 cm⁻¹ (N-H, C-H, out-of-plane Biegungsschwingung) [45]. Diese repräsentativen Peaks von DOX wurden auch in den Spektren der DOX-GNPs angezeigt, was anzeigte, dass DOX erfolgreich an DOX-GNPs gebunden war. Interessanterweise verschwand der Peak bei 1214 cm⁻¹, charakteristischer Peak für C-O Streckschwingung der phenolischen Hydroxylgruppe [46], in den Spektren der DOX-GNPs. Die phenolische Gruppe kann Au-Ionen zu GNPs reduzieren und wurde dann in Carbonylgruppe umgewandelt. Wir spekulieren, dass die Wirkung von DOX nicht beeinträchtigt wird, da es durch die Aminogruppe von Kohlenstoff 7 und die Hydroxylgruppe von Kohlenstoff 9 in DNA eingebaut wird [39].

Aus den TEM-Ergebnissen (Abb. 1b) ist die Partikelgröße der DOX-GNPs ca. 6 nm. Der berechnete Anteil von Au(I) betrug 31,93 % aus dem XPS-Spektrum der DOX-GNPs (Abb. 1d), was hoch genug ist, um die kolloidale Stabilität aufrechtzuerhalten. Allerdings wurde der Niederschlag von DOX-GNPs in 0,2 M PBS-Pufferlösung mit Hochgeschwindigkeitszentrifugation nach Entfernen des Überstands dispersiert, wurde die Farbe dieser Lösung lila-schwarz, und es war sichtbarer unlöslicher Flock. Dies zeigte, dass die Stabilität der DOX-GNPs in Umgebung hoher Salzkonzentration nicht sehr gut war. Dies kann erklärt werden: DOX besitzt nur eine Aminogruppe, aber keine Sulfhydrylgruppe, was nicht ausreicht, damit DOX über Au-S- und Au-N-Bindungen an der GNP-Oberfläche bindet. Daher sind weitere Anstrengungen nötig, wenn DOX-GNPs als Kontrastmittel und Antitumor-Material für Tumor-Bildgebung und -Therapie verwendet werden sollen.

Wir synthetisierten DRN-GNPs mit DOX, RGD-Peptiden und NLS-Peptiden als Reduktions- und Stabilisierungsmittel. RGD-Peptide können spezifisch Tumorzellen ansprechen, die das α_vβ₃-Integrin überexprimieren, und NLS-Peptide können spezifisch den Zellkern ansprechen. Abb. 2a zeigt die UV-Vis-Spektren der hergestellten DOX-GNPs, NLS-GNPs, DRN-GNPs; die Charakteristika ihrer Oberflächenplasmonen-Absorptionspeaks lagen bei 520–530 nm [33]. Aus dem Inset ist ersichtlich, dass die GNPs eine helle weinrote Farbe zeigten. TEM-Bilder (Zusatzdatei 1: Abb. S1) zeigen, dass die Partikelgröße von NLS-GNPs und DRN-GNPs ca. 10 nm bzw. 5 nm betrug und die GNPs gleichmäßig verteilt waren, ohne offensichtliche Koagulation.

a UV-Vis-Absorptionsspektren und Foto-Bilder von DOX-GNPs (a), NLS-GNPs (b) und DRN-GNPs (c). b UV-Vis-Absorptionsspektren von basischem DOX, RGD-Peptiden, NLS-Peptiden und Überstand von DRN-GNPs. c FTIR-Spektren von NLS-Peptiden, NLS-GNPs und DRN-GNPs. Der Abstand zwischen GNP-Spektrum und NLS-Peptid-Spektrum wurde für deutlichen Kontrast vergrößert

Zur Validierung der Synthese von NLS-GNPs und DRN-GNPs charakterisierten wir die FTIR-Spektren von NLS-Peptiden und GNPs in Abb. 2c. Einige FTIR-Peaks von NLS-Peptiden fanden sich in den Spektren von NLS-GNPs und DRN-GNPs, wie C-H-Streckschwingungs-Absorptionspeak (2840–2972 cm⁻¹) [47], C=O-Streckschwingungs-Absorptionspeak (1630–1700 cm⁻¹) [48] und =C-H-in-plane-Biegungsschwingungspeak (1300–1475 cm⁻¹) [49]; dies zeigte, dass CCYNLS-Peptide erfolgreich auf der GNP-Oberfläche konjugiert waren. Wir fanden auch, dass der Benzolgerüst-Vibrationspeak des Tyrosin-Terminals im NLS-Peptid bei 1529 cm⁻¹ und der phenolische Hydroxyl-C-O-Streckschwingungspeak bei 1193 cm⁻¹ [49] in den Infrarotspektren von NLS-GNPs und DRN-GNPs verschwanden, was bedeutet, dass das Benzolgerüst des Tyrosin-Terminals nach seiner Rolle als Reduktionsmittel in eine Chinon-Struktur überführt wurde.

Wir zentrifugierten DRN-GNPs mit hoher Geschwindigkeit, sammelten den Überstand, der fast farblos war, und testeten, ob Reaktanten übrig blieben, via UV-Vis-Spektren in Abb. 2b. Die UV-Absorptionspeaks von RGD- und NLS-Peptiden stammen von Tyrosin-Resten, der Absorptionspeak lag bei 275 nm. Unter alkalischen Bedingungen wurde die phenolische Hydroxylgruppe zu negativen Sauerstoffionen, was die Elektronendichte des Benzolrings erhöht, der Peak wurde rotverschoben auf 292 nm. Wir sahen den charakteristischen Peak nicht im UV-Vis-Spektrum des DRN-GNPs-Überstands, was bedeutet, dass beide Peptide an der Reaktion teilnahmen. DOX besitzt drei Absorptionspeaks im Bereich 450–600 nm, aber der DRN-GNPs-Überstand hat diese Peaks nicht. Außerdem wurde kein DOX im DRN-GNPs-Überstand gefunden, da seine Farbe hellbraun war, während die Farbe von DOX unter basischen Bedingungen transparent helllila war. Es kann geschlossen werden, dass die drei Materialien fast vollständig reagierten. Ebenso werden DR-GNPs und DN-GNPs auf diese Weise erklärt, siehe Zusatzdatei 1: Abb. S2.

Wir nutzten XPS-Spektroskopie, um die Valenz von Au für NLS-GNPs und DRN-GNPs zu untersuchen. Wie in Abb. 3a, b gezeigt, sind zwei Peaks mit Bindungsenergien um 83,6 eV und 87,0 eV konsistent mit der Emission von Au 4f_7/2 und 4f_5/2 Photoelektronen [33]. Ihre Au 4f_7/2 Bindungsenergieposition beider GNPs liegt nahe 84,0 eV. Für NLS-GNPs kann es in Au(0) (83,5 eV) und Au(I) (84,1 eV) dekonvolutiert werden, ihre Peakflächenverhältnisse betragen 57 % und 43 %. Ähnlich für DRN-GNPs kann es in Au(0) (83,6 eV) und Au(I) (84,4 eV) dekonvolutiert werden, die Peakflächenverhältnisse betragen 62 % und 38 %, somit haben sie einen höheren Anteil an Au(I). Die Ladung kann Au(I)-S-Komplexe bilden, die helfen, die kolloidale Stabilität der GNPs aufrechtzuerhalten. Interessanterweise identifizierten wir drei Schwefelarten in den XPS-Spektren von NLS-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs in Zusatzdatei 1: Abb. S3. Die blauen und schwarzen Kurven repräsentieren die Oxidationszustände von Schwefel, lila Kurven die S-H-Bindung, und die grüne Kurve die Au-S-Bindung. Die Bildung der Au-S-Bindung illustrierte, dass NLS-Peptide erfolgreich auf der Oberfläche dieser drei GNPs konjugiert waren.

XPS-Spektrum des Au 4f von (a) NLS-GNPs, (b) DRN-GNPs. Die Au 4f_7/2 Bindungsenergie der Originalspektren (schwarz) und angepassten Ergebnisse (rot) konnte in zwei Komponenten dekonvolutiert werden, Au(0)-blaue Kurve und Au(I)-lila Kurve. UV-Vis-Absorptionsspektren und Bilder von DRN-GNPs dispersiert in PBS, NaCl, NaOH und HCl (c).

Zudem zeigten die Peaks von N 1s, C 1s und O 1s der XPS-Spektren, dass Peptide und DOX an GNPs gebunden waren (Zusatzdatei 1: Abb. S4).

Die XRD-Spektren (Zusatzdatei 1: Abb. S5) zeigten, dass die Kristallstruktur dieser GNPs flächenzentriert-kubisch ist, da alle ihre XRD-Spektren vier Peaks bei 38,2°, 44,5°, 64,7° und 77,8° enthielten, die den (111), (200), (220) und (311) Ebenen entsprechen [33].

Stabilität von DRN-GNPs

Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zeta-Potenzial-Daten dieser fünf GNPs sind in Tabelle 1 dargestellt; ihre hydrodynamische Größe ist größer als die durch TEM charakterisierte, was auf eine gewisse Menge an hydratisierten Molekülen um den Kern der wasserlöslichen GNPs zurückgeführt werden kann. Ihre Zeta-Potenziale waren negativ aufgrund der auf der GNP-Oberfläche konjugierten Carboxylgruppen. Die GNP-Lösung zeigt gute kolloidale Stabilität, wenn der Absolutwert des Zeta-Potenzials größer als 30 mV ist; je größer der Absolutwert, desto besser die Stabilität. Man sieht, dass sie alle gute kolloidale Stabilität aus Tabelle 1 besitzen. Im Vergleich war der Zeta-Potenzial-Wert der NLS-GNPs am höchsten, was vielleicht daran liegt, dass ihre Oberfläche voll von NLS-Peptiden ist, die starke Au-S-Bindungen über die Thiolgruppe bilden können. Der Absolutwert des Zeta-Potenzials von DOX-GNPs lag nahe 30 mV; dies war konsistent mit der zuvor erwähnten geringen Stabilität von DOX-GNPs in PBS-Pufferlösung. Die Spektraldaten sind in Zusatzdatei 1: Abb. S6 dargestellt.

Die Änderungen der charakteristischen Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Bänder der GNPs können verwendet werden, um die Aggregation der GNPs mittels UV-Vis-Spektrometrie zu bestimmen [49]. Wir maßen ihre UV-Vis-Spektren und machten Fotos der DRN-GNPs (Abb. 3c), wenn sie in Hochsalzlösungen (1 M NaCl und 0,2 M PBS), starker Säure (0,5 M HCl) und starker Base (0,5 M NaOH) dispersiert waren. Weder Lösungsfarbänderung noch UV-Vis-Spektralverschiebung wurde unter verschiedenen harten Bedingungen beobachtet, außer in der HCl-Lösung, in der sich ihre Farbe leicht lila verfärbte und der UV-Absorptionspeak um ca. 20 nm rotverschob, was bedeutet, dass GNPs unter stark sauren Bedingungen leicht koagulierten. Der Grund könnte sein, dass die negativ geladene kolloidale Stabilität der GNPs unter stark sauren Bedingungen beeinträchtigt wurde, aber nicht in neutraler PBS-Puffer- und alkalischer Umgebung. Wir können schließen, dass DRN-GNPs unter Hochsalz- und alkalischen Bedingungen hochstabil sind, was anzeigt, dass unsere synthetisierten DRN-GNPs für in vitro Zellbildgebung und in vivo Antitumor-Therapie erwartet werden können.

Plasmonische Dunkelfeld-Streuungsbildgebung von Tumorzellen und Zell-TEM-Mikroskopie

Für die spezifische gezielte Bildgebung von Tumorzellen mit DRN-GNPs wählten wir HeLa-Zellen als Testgruppe und MCF-7-Zellen als Kontrollgruppe. Der Grund ist, dass HeLa-Zellen das Integrin α_vβ₃ überexprimieren [50], MCF-7-Zellen jedoch nicht, sodass keine spezifische Bindung von RGD erfolgt; es ist eine gute Kontrollgruppe [51]. Die Aufnahme von DRN-GNPs durch diese beiden Zelllinien nach 24 h Inkubation mit Endkonzentration 35 µg/mL wurde mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop im Dunkelfeldmodus bewertet. Zellen, die ohne GNPs behandelt wurden, zeigten keine plasmonische Lichtstreuung (Abb. 4 A-HeLa-Zellen, 5C-MCF-7-Zellen). Bilder von HeLa-Zellen, die mit DRN-GNPs behandelt wurden, zeigen, dass Streusignale von den GNPs stark im Zellkern lokalisiert sind (Abb. 4b und 5e). Allerdings konnten wir kaum Streulicht von MCF-7-Zellen nach Inkubation mit DRN-GNPs sehen, obwohl geringe Mengen an GNPs möglicherweise durch den passiven Enhanced Permeation and Retention (EPR)-Effekt in die Tumorzellen eingedrungen sein könnten (Abb. 4d und 5f). Der EPR-Effekt ist ein einzigartiges Phänomen solider Tumoren, bedingt durch ihre anatomischen und pathophysiologischen Unterschiede zu normalen Geweben. Beispielsweise führt Angiogenese zu hoher Gefäßdichte in soliden Tumoren, große Lücken bestehen zwischen Endothelzellen in Tumorblutgefäßen, und Tumorgewebe zeigen selektive Extravasation und Retention makromolekularer Medikamente [52]. So könnten sie unter gleichen experimentellen Bedingungen nicht klar detektiert werden. Die Ergebnisse demonstrierten, dass die Endozytose von HeLa-Zellen über rezeptorvermittelte Endozytose durch RGD-Peptide auf der GNP-Oberfläche erleichtert wurde. NLS-Peptide konnten auch ihre Aktivität beibehalten, um spezifisch den Zellkern anzusprechen. So könnten unsere synthetisierten DRN-GNPs ein sehr potenzielles Kontrastmittel für tumorzielgerichtete Bildgebung sein.

Inhalt der Zeilen: „PBS-Puffer“ repräsentiert Zellen inkubiert mit PBS-Puffer, „DRN-GNPs“ repräsentiert Zellen inkubiert mit DRN-GNPs. Der Index „1“ repräsentiert Hellfeldbilder der Zellen, „2“ Dunkelfeldbilder der Zellen, und „3“ Überlagerungsbilder (Hellfeld und Dunkelfeld) der Zellen. Alle Skalenbalken sind 20 µm. Bild E ist ein kleiner Bereich gewählt aus B₃ in Abb. 4, Bild F ist ein kleiner Bereich gewählt aus D₃ in Abb. 4, Skalenbalken sind 10 µm

TEM-Bilder von DRN-GNPs inkubiert in HeLa- und MCF-7-Zellen für 24 h. A₁, A₂ und A₃ entsprechen HeLa-Zellen, während B₁ und B₂ MCF-7-Zellen entsprechen

Tabelle 2 zeigt die Verhältniswerte zwischen dem mittleren Grauwert der Zellen und dem Hintergrund im gleichen Bild, was positiv mit den aufgenommenen Mengen an DRN-GNPs durch diese beiden Zelllinien korreliert. Die Verhältnisse der mit PBS-Puffer inkubierten Zellen und der MCF-7-Zellen lagen nahe 1,0, die Helligkeit der Zellen war fast nahe dem Hintergrund. Das Verhältnis von HeLa-Zellen, inkubiert mit DRN-GNPs, betrug 4,80, was bedeutet, dass die synthetisierten DRN-GNPs spezifisch zielgerichtet in Tumorzellen eindringen konnten, die das Integrin α_vβ₃ überexprimieren.

Zur Bestätigung der rezeptorspezifischen Internalisierung der DRN-GNPs untersuchten wir die zelluläre Aufnahme der DRN-GNPs durch HeLa- und MCF-7-Zellen mittels TEM-Technik (siehe Abb. 5). Es wurde eine große Menge DRN-GNPs im Kern- und Zytoplasmabereich von α_vβ₃-positiven HeLa-Zellen lokalisiert (Abb. 5(A₁–A₃)). Andererseits wurde nur eine vernachlässigbare Menge an Partikeln im Zytoplasmabereich von α_vβ₃-negativen MCF-7-Zellen gefunden (Abb. 5(B₁–B₂)), sie könnten durch den passiven Targeting-EPR-Effekt in MCF-7-Zellen akkumuliert sein. Wir fanden hochkontrastige schwarze kontinuierliche Bereiche im Kern der MCF-7-Zellen; es handelte sich um Uranylacetat, das den Kern färbte, und sie unterschieden sich von den granulären Partikeln im Kern der HeLa-Zellen. Die TEM-Bilder sind konsistent mit den Dunkelfeld-Bildgebungsergebnissen, was anzeigt, dass RGD- und NLS-Peptide auf der GNP-Oberfläche die DRN-GNPs zum Targeting des HeLa-Zellkerns erleichterten. So könnten unsere synthetisierten DRN-GNPs als perfektes Kontrastmittel für tumorzielgerichtete Bildgebung und Diagnose verwendet werden.

Zelluläre Therapeutische Wirksamkeitsbewertung

Zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit von DOX und DRN-GNPs auf Zellebene wurde zunächst ein MTT-Assay durchgeführt, um die Zelllebensfähigkeit von HeLa- und MCF-7-Zellen unter Behandlung mit diesen beiden Proben für 24 h zu untersuchen. DRN-GNPs zeigten fast denselben Inhibitions-Effekt, indem sie nahezu 70 % der Zellen bei gleicher DOX-Konzentration (39,0 µg/mL, Abb. 6(A, B)) abtöteten. Entsprechend den MTT-Ergebnissen, als die DRN-GNPs-Konzentration 40 µg/mL betrug, waren Anzahl und Zustand der HeLa- und MCF-7-Zellen relativ gut, sodass 35 µg/mL die geeignete Konzentration für Bildgebung war. Wir beobachteten, dass bei DRN-GNPs-Konzentration von 60 µg/mL (Abb. 6(C₃)) HeLa-Zellen offensichtlich nekrotisch wurden. Bei 100 µg/mL DRN-GNPs war eine deutliche Reduktion der Zellzahl und klare zelluläre morphologische Veränderung als Nekrose-Charakteristik beobachtbar. Die gleiche Konzentration an konjugiertem DOX zeigte fast dieselbe antitumorale Wirksamkeit wie freies DOX. Diese Ergebnisse zeigten, dass unsere synthetisierten DRN-GNPs nicht nur als Kontrastmittel, sondern auch als gutes Drug-Delivery-System verwendet werden können.

MTT-Assay wurde verwendet, um in vitro anti-tumorale Aktivität von DOX und DRN-GNPs auf HeLa (a) und MCF-7-Zellen (b) für 24 h qualitativ darzustellen (100 %). Die Konzentrationen C₀–C₅ sind 0, 20, 40, 60, 80, 100 µg/mL für DRN-GNPs; entsprechende DOX-Konzentrationen sind 0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2, 39,0 µg/mL. Daten als Mittelwert ± Standardabweichung von Triplikaten (n = 3). Bilder von HeLa-Zellen inkubiert mit verschiedenen DRN-GNPs-Konzentrationen (c)

Das per Durchflusszytometrie detektierte Ergebnis in Abb. 7 demonstriert ebenfalls die antikrebs Wirksamkeit von DRN-GNPs. Die Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen bei Exposition gegenüber DRN-GNPs verschiedener Konzentrationen wurde mittels Durchflusszytometrie-basierten Assays gemessen. Zwei Zelltodmodi, Apoptose und Nekrose, wurden mit AnnexinV-FITC- und Propidiumiodid-(PI)-Farbstoffen gemessen (Abb. 7). Ähnlich den MTT-Ergebnissen zeigten die Daten, dass DRN-GNPs dosisabhängig Zellnekrose induzierten. Der Anteil nekrotischer Zellen betrug 8 % ohne Inkubation mit DRN-GNPs; bei 100 µg/mL Konzentration betrug der Anteil nekrotischer Zellen 23,84 %; das bedeutet, unsere synthetisierten DRN-GNPs können HeLa-Zellen effizient abtöten. Der Unterschied zwischen MTT- und Durchflusszytometrie-Ergebnissen kann durch den Unterschied in Zellzahl und Methoden erklärt werden.

Repäsentative zweidimensionale Kontur-Dichteplots zur Bestimmung der Anteile lebender, apoptotischer und nekrotischer Zellen bei Exposition gegenüber DRN-GNPs bei verschiedenen Konzentrationen (0–100 µg/mL) für 24 h. Zellnekrose und Apoptose wurden mit PI und AnnexinV-FITC-Farbstoffen gemessen

Therapiebewertung von DRN-GNPs an tumortragenden Mäusen

Um weiter zu bestimmen, ob DRN-GNPs einen kombinierten therapeutischen Effekt auf Tumorzellen in vivo induzierten, evaluierten wir den Antitumor-Effekt von DRN-GNPs an tumortragenden Mäusen für langfristige intravenöse Injektion von Medikamenten. Die Kochsalzgruppe und die Gruppen mit intravenöser Injektion von freiem DOX, DR-GNPs und DN-GNPs wurden als Kontrollgruppen gesetzt, in denen die Konzentration konjugierten DOX der von freiem DOX entsprach. Wir beobachteten, dass die Tumorgrößen der DRN-GNPs-behandelten Gruppen offensichtlich kleiner waren als die der Kochsalz-, DOX-, DN-GNPs- und DR-GNPs-behandelten Gruppen (Abb. 8a). Tumorvolumen und Körpergewicht der Mäuse wurden alle 2 Tage überwacht. Signifikante Variation von Tumorvolumen und Tumorgewicht aller Behandlungsgruppen ist in Abb. 8d, f dargestellt; Tumorvolumen und -gewicht der DN-GNPs- und DR-GNPs-behandelten Gruppen waren kleiner als die der freies-DOX-behandelten Gruppe, aber noch größer als die der DRN-GNPs-behandelten Gruppen aufgrund geringerer gezielter Aktivität. Das könnte daran liegen, dass DOX-Moleküle klein sind, Targeting fehlt und sie eine kurze Halbwertszeit in vivo haben; daher könnten sie schnell abgebaut werden. DRN-GNPs hingegen besitzen starke Stabilität im Blutsystem, lange Halbwertszeit und hohe gezielte Fähigkeit, sodass sie an den Tumorort zielgerichtet werden können und dann die antitumorale Wirkung von DOX entfalten. Zwischen intravenöser DRN-GNPs-Injektion und Tumorinjektion ist die antitumorale Wirksamkeit der letzteren Gruppe besser, da die Medikamente kein komplexes Blutzirkulationssystem zum Fokus durchlaufen müssen. Die Tumorinhibitionsrate von DOX liegt unter 50 %, und die Raten aller DOX-konjugierten GNPs liegen über 50 %; sie können 66,7 % bzw. 57,7 % erreichen. Die H&E-Färbung zeigte, dass in der intravenös injizierten DRN-GNPs-Gruppe ein gewisser Grad an Leberschädigung vorlag (Abb. 9). Darüber hinaus wurde die Bio-Toxizität von DOX, DR-GNPs und DN-GNPs an tumortragenden Mäusen durch histologische Analyse bewertet. Wie in Abb. 8b gezeigt, ist das Tumorzellvolumen der Kochsalzgruppe vergleichsweise größer als das der Behandlungsgruppen, und Tumorzellen zeigen mehr Mitosefiguren. Alle Ergebnisse zeigten, dass der Tumorinhibitionseffekt von DRN-GNPs der beste unter den GNPs war. Somit könnten unsere synthetisierten DRN-GNPs als perfektes DOX-Delivery-System für Tumortherapie verwendet werden.

a Tumor-Bilder isoliert von tumortragenden Mäusen nach Behandlung mit Kochsalz, freiem DOX, DN-GNPs, DR-GNPs und DRN-GNPs (Tumorinjektion und intravenöse Injektion). b Histologische Bilder der Tumoren der Mäuse nach Behandlung mit Kochsalz, freiem DOX, DN-GNPs, DR-GNPs und DRN-GNPs (Tumorinjektion und intravenöse Injektion). c Körpergewicht, Tumorvolumen (d), Tumorinhibitionsrate (e) und Tumorgewicht (f) tumortragender Mäuse während 14 Tage Behandlung; Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6)

Histologische Bilder der Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere) der Mäuse nach Behandlung mit Kochsalz, freiem DOX, DR-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs (Tumorinjektion und intravenöse Injektion)

Fazit

In dieser Studie haben wir erfolgreich eine Ein-Schritt-Methode zur Herstellung multifunktionaler DRN-GNPs in etwa einer halben Stunde entwickelt. Die GNPs wurden auch erfolgreich auf tumorzielgerichtete Bildgebung und Tumortherapie sowohl in vitro als auch in vivo angewendet. Der Erfolg zeigt, dass es möglich ist, die reduzierende und stabilisierende Fähigkeit von DOX, RGD-Peptiden und CCYNLS-Peptiden voll auszunutzen, was den GNP-Syntheseprozess einfach und effizient macht. Noch wichtiger: Die einstufig synthetisierten DRN-GNPs besitzen immer noch gute kolloidale Stabilität im physiologischen System, und die auf der Oberfläche konjugierten Peptide behielten die Targeting-Fähigkeit, und DOX behält seine antitumorale Fähigkeit. Meines Wissens ist dies der erste Bericht zur Synthese von DOX, RGD- und CCYNLS-Peptid-konjugierten multifunktionalen GNPs mit einer Ein-Schritt-Methode und deren Anwendung in Tumor-Bildgebung, Diagnose und Therapie. Diese Strategie entspricht der Entwicklungsrichtung der Grünen Chemie und würde die Grundlage für großskalige Anwendungen in naher Zukunft legen. Wir erwarten, dass unser Bericht einen neuen Weg für die Ein-Schritt-Synthese multifunktionaler Nanomaterialien für Tumor-Bildgebung und -Therapie aufzeigen wird.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Datensätze sind im Hauptartikel oder in den zusätzlichen unterstützenden Dateien präsentiert.

Abkürzungen

CCYNLS-Peptide:

Aminosäuresequenz: Cystein-Cystein-Tyrosin-Prolin-Prolin-Lysin-Lysin-Lysin-Arginin-Lysin-Valin

Zyklische RGD-Peptide:

Aminosäuresequenz: Arginin-Glycin-Aspartat-Tyrosin-Glutaminsäure

DOX:

Doxorubicin

DR-GNPs:

DOX-RGD-GNPs, DN-GNPs: DOX-NLS-GNPs, DRN-GNPs: DOX-RGD-NLS GNPs

GNPs:

Goldnanopartikel