Grüne Synthese von Silbernanopartikeln mit Hefeextrakt: Kontrollierte Morphologie und verstärkte antibakterielle Aktivität

Zusammenfassung

Die Biosynthese zur Herstellung antimikrobieller Silbernanopartikel (Ag NPs) ist eine grüne Methode ohne zytotoxische Reduktions- und Tensidmittel. Hierbei wurden formkontrollierte, gut dispersierte Ag NPs mittels Hefeextrakt als Reduktions- und Kappmittel biosynthetisiert. Die synthetisierten Ag NPs wiesen eine gleichmäßige kugelförmige Form und feine Größe mit durchschnittlich 13,8 nm auf. Biomoleküle reduktiver Aminosäuren, α-Linolensäure und Kohlenhydrate im Hefeextrakt spielen eine bedeutende Rolle bei der Ag NP-Bildung, belegt durch Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie. Zudem tragen Aminosäuren auf der Ag NP-Oberfläche in alkalischer Lösung netto negative Ladungen, was elektrostatische Abstoßung maximiert und günstige Stabilität für über ein Jahr ohne Ausfällung bietet. Ag NPs in Kombinationsbehandlung mit Ampicillin kehrten die Resistenz in ampicillin-resistenten E. coli-Zellen um. Diese monodispersen Ag NPs könnten eine vielversprechende Alternative zur Desinfektion multiresistenter Bakterienstämme sein und zeigten vernachlässigbare Zytotoxizität und gute Biokompatibilität gegenüber Cos-7-Zellen.

Einleitung

Medikamentenresistente Infektionen sind eine Haupttodesursache und stellen ein ernsthaftes Risiko für die öffentliche Gesundheit dar. Zunehmende Resistenz gegen antimikrobielle Medikamente entwickelt sich zu einem dringenden Problem in der Medizin. Zahlreiche Stämme von Staphylococcus aureus sind gegen Methicillin resistent und Hauptursache nosokomialer Infektionen. Weitere antibiotikaresistente Bakterien umfassen penicillin-resistente Neisseria gonorrhoeae und multiresistente Escherichia coli. Hauptwiderstandsmechanismen sind verstärkter Efflux und reduzierte Antibiotikaaufnahme. Ein weiterer Mechanismus ist die Expression von Enzymen, die die molekulare Struktur von Antibiotika modifizieren. Obwohl viel Aufwand in die Entwicklung nächster Generation antimikrobieller Wirkstoffe fließt, besteht erhöhter Bedarf an überlegenen Desinfektionsmethoden.

Silbernanopartikel (Ag NPs) finden in vielen Anwendungen Verwendung: Proteinträger, Radiosensitisatoren, Steigerung der Solarbrennstoffzelleneffizienz, antibakterielle Mittel. Unter Nanopartikeln, einschließlich metallhaltiger Nanopartikel, sind Ag NPs die am weitesten verbreiteten antimikrobiellen Mittel. Tatsächlich zeigen Ag NPs signifikante antimikrobielle Aktivität gegen Bakterienstämme, aber vernachlässigbare Zytotoxizität gegenüber Tierzellen. Zudem weisen Ag NPs antimikrobielle Aktivität gegen Pilze, bestimmte Viren und antibiotikaresistente Bakterienstämme auf. Wirkmechanismen: Unterdrückung der DNA-Replikation, Blockade des elektrischen Potenzialunterschieds in Zytoplasmamembranen, Unterdrückung der Atmungskette. Daher spielen Größe, Oberflächenstruktur und kontrollierte Formen der Ag NPs entscheidende Rollen für ihre antimikrobielle Aktivität und andere Anwendungen. Die generelle Herstellungsmethode umfasst Reduktion von Silberionen in Gegenwart geeigneter Tenside für kontrolliertes Wachstum. Die meisten Reduktions- und Tensidmittel zeigen jedoch Zytotoxizität gegenüber menschlichen Gewebezellen und potenziell Umweltkontamination. Daher ist die Entwicklung grüner Methoden für formkontrollierte Ag NPs essenziell.

In dieser Arbeit präsentieren wir einen neuartigen Weg zur Biosynthese von Ag NPs durch Nutzung von Hefeextrakt. Während des Prozesses liefert Hefeextrakt Reduktions- und Kappmittel einschließlich Aminosäuren, Vitamine und Kohlenhydrate, während Silberionen als Elektronenakzeptoren dienen. Resultat: Die durch organische Kappmittel auf der Oberfläche bereitgestellte günstige Stabilität bewahrt monodisperse Ag NPs für über ein Jahr ohne Ausfällung. Ag NPs zeigten überlegene antibakterielle Aktivität im Vergleich zu Ampicillin gegen ampicillin-resistente E. coli-Zellen. Im Vergleich zu konventionellen Synthesemethoden ist der hier vorgestellte Biosyntheseansatz biokompatibel, kosteneffizient und umweltfreundlich. Zudem zeigten die formkontrollierten, gut dispersen Ag NPs gute antibakterielle Effekte gegen E. coli.

Methoden

Materialien

Silbernitrat (AgNO₃), Saccharose (C₁₂H₂₂O₁₁), Natriumchlorid (NaCl), Natriumhydroxid (NaOH) von Sinopharm Co., Ltd. Getrockneter Backhefe von AB/MAURI Co., Ltd. E. coli von TransGen Biotech Co., Ltd. CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (MTS) von Promega Biotech Co., Ltd. pcDNA3.4-Plasmid, 1×NuPAGE® LDS Sample Buffer, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und fötales Kälberserum (FBS) von Thermo Fisher Scientific Inc. Ampicillin und Luria-Bertani (LB)-Medium von Sangon Biotech Co., Ltd. Alle Chemikalien analytischer Grad, ohne weitere Reinigung verwendet. Deionisiertes ultrareines Wasser (18,2 MΩ·cm) durchgängig verwendet.

Synthese von Ag NPs

Die vorrätigen Hefezellen wurden in LB-Medium inokuliert und über Nacht bei ~150 rpm, 25 °C zur Aktivierung geschüttelt. Anschließend wurden die aktivierten Hefezellen mit 0,9 % Kochsalzlösung gewaschen und in 2 % Saccharoselösung bei ~150 rpm für 6 h bei 25 °C dispersiert. Schließlich wurde der zellfreie Hefeextrakt durch Zentrifugation bei 2000 rpm für 5 min für die Biosynthese von Ag NPs gewonnen. Während des biosynthetischen Prozesses wurde der pH-Wert des Hefeextrakts mit NaOH-Lösung auf 10 eingestellt, dann wurde die AgNO₃-Lösung unter kräftigem Magnetrühren nach und nach zugegeben. Die erhaltenen Ag NPs wurden 5 Tage mit 1 kDa Dialysemembranen dialysiert und gefriertrocknet zur weiteren Charakterisierung.

Charakterisierung

TEM-Bilder von Ag NPs an JEM-2100 (200 kV, JEOL, Japan). SEM-Bilder an Carl Zeiss ULTRA plus (Carl Zeiss, Deutschland) mit EDS bei 20 kV. UV-Vis-Absorptionsspektren an Lambda 950 UV/Vis/NIR-Spektrophotometer (Perkin-Elmer, USA). XRD-Muster an D8 Advance (Bruker, Deutschland). FTIR von 4000–500 cm⁻¹ mit KBr-Pellets an Vertex 70 FTIR-Spektrometer (Bruker, Deutschland). Zeta-Potenzial an Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, UK) bei 25 °C. Oberflächenelemente per XPS an Kratos AXIS Ultra DLD (monochromatische Al-Kα-Quelle, 1486,6 eV, Shimadzu, Japan). Aminosäurekomponenten an L-8900 Hochgeschwindigkeits-Aminosäureanalysator (Hitachi, Japan).

Zellzytotoxizitätsassay

Zur Untersuchung der Biokompatibilität der präparierten Ag NPs wurde ein MTS-Assay zur Evaluierung der Zytotoxizität eingesetzt. Cos-7-Zellen wurden in DMEM mit 10 % FBS in feuchter Atmosphäre (5 % CO₂, 37 °C) kultiviert. Zellen in 96-Well-Platten (Flachboden) bei 10.000 Zellen/Well für 24 h. Dann Wachstumsmedium ersetzt durch frisches DMEM mit verschiedenen Ag NP-Konzentrationen. Nach weiterer 24 h Inkubation wurden relativ lebensfähige Zellen per MTS bestimmt. Absorption bei 490 nm an SpectraMax® M5 Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA). Unbehandelte Zellen in DMEM als Kontrolle.

SDS-PAGE-Assay

Standard-SDS-PAGE mit 10 % (w/v) Trenngel und 4 % Stapelgel. Proben 5 min mit 1×NuPAGE® LDS Sample Buffer gekocht, 12000 rpm 5 min zentrifugiert vor Applikation. Standard-Proteinmarker als Referenzkontrolle. Gele mit 0,5 % Coomassie Blau gefärbt. Bilder mit GelDoc XR⁺ Gel-Imaging-System (Bio-Rad, USA) aufgenommen.

Antimikrobielle Aktivitätsstudien

Zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität wurden synthetisierte Ag NPs auf bakterizide Aktivität gegen E. coli getestet. Einzelkolonie E. coli über Nacht bei 37 °C in LB-Medium auf Orbital-Shaker (150 rpm). Kolonien auf OD 0,01–0,02 bei 600 nm mit frischem LB-Medium eingestellt. 100 µl serieller Verdünnungen von Ag NPs in 96-Well-Mikrotiterplatten. Mikrotiterplatten mit 100 µl verdünnter E. coli-Lösung inokuliert, 16 h bei 37 °C inkubiert. Vitalität von E. coli per Absorption bei 600 nm (SpectraMax® M5). Zeitverlaufsanalyse zur Evaluierung antibakterieller Empfindlichkeit über Zeit. Schließlich 100 µl E. coli-Lösung in sterile Röhrchen mit 10 und 20 µg/ml Ag NPs. Absorption bei 600 nm nach 1, 2, 4, 6 h.

Koloniebildende-Einheiten-Assay (CFU) zur Untersuchung von Ag NPs gegen antibiotikaresistente Bakterienzellen. E. coli exprimiert stabil pcDNA3.4-Plasmid mit β-Laktamase-Gen, das Ampicillin-Resistenz verleiht, als Modell. Im Log-Phasen-Wachstum wurden E. coli-Amp⁺-Zellen auf LB-Agarplatten in Behandlung mit Ampicillin allein oder in Kombinationsbehandlung mit Ag NPs inkubiert (18 h, 37 °C). Anzahl E. coli-Amp⁺-Kolonien auf LB-Platten bestimmt. Alle Assays mindestens dreimal durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese von Ag NPs

Wie schematisch in Schema 1 dargestellt, begann die Ag NP-Präparation mit Selbstassembly von Biomolekülen im Hefeextrakt zu Hefe-Mizellen. Dann wurde Ag⁺ in situ durch Reduktionsmittel im Hefeextrakt (Aminosäuren, Vitamine, Kohlenhydrate) reduziert. Die gebildeten Ag-Nanopartikel wurden durch Biomoleküle stabilisiert. Die Oberflächenbeschichtung auf Ag NPs erhöhte die Affinität zur bakteriellen Membran, steigerte die Zellwandpermeabilität. Die Wechselwirkung zwischen Ag NPs und Peptidoglykan veränderte die Peptidoglykan-Konfiguration, führte schließlich zum Apoptoseprozess und schädigte die Bakterien.

Strukturelle Charakterisierung von Ag NPs

Abb. 1a: Typisches SEM-Bild zeigt kugelförmige Form und feine Größe der synthetisierten Ag NPs. EDX bestätigt Ag NP-Bildung (Abb. 1b). Starker optischer Absorptionspeak bei ~3 keV – typisch für Silber-Nanokristallite (Oberflächenplasmonenresonanz). Geringe Mengen O und C auf dünne organische Kappenschicht zurückführbar. Reaktion AgNO₃ mit NaOH bildet geringe Ag₂O-Mengen → O auch von Ag₂O möglich. Morphologie und Größe per HRTEM weiter charakterisiert. Ag NPs: Durchmesser 10,3–18,9 nm (Abb. 1c), Durchschnitt 13,8 nm (Abb. 1d). Größe, Form, Oberflächenchemie wichtig für antimikrobielle Aktivität. Kleinere Größe und größere Oberfläche ermöglichen bessere Interaktion mit bakterieller Membran für verstärkte Aktivität. Klare Gitterstreifen im HRTEM: Streifenabstand 0,15 nm (Abb. 2a) → (220)-Ebenen von Silber. Kristalline Natur per SAED (Abb. 2b): helle Kreisringe entsprechen (311), (220), (200), (111)-Ebenen.

UV-Vis-Spektrum (Abb. 3a): starker Peak bei 418 nm → Oberflächenplasmonenresonanz. Gelbe Lösung synthetisierter Ag NPs (Abb. 3b) bestätigt Bildung. XRD-Muster (Abb. 3c): vier intensive Peaks bei 77,36°, 64,30°, 43,52°, 38,16° → (311), (220), (200), (111) für Silber (JCPDS 04-0783). Kristalline Natur bestätigt, konsistent mit Literatur. FTIR (Abb. 3d) charakterisiert potenzielle Biomoleküle auf synthetisierten Ag NPs. Breites Band 3405 cm⁻¹ → –OH-Streckung. Schwächerer Peak 2915 cm⁻¹ → –CH₂-Streckschwingung. Band 1655 cm⁻¹ in Hefeextrakt (C=O-Streckung Carboxyl) verschiebt auf 1573 cm⁻¹ in Ag NPs → Interaktion Carboxyl/Ag NPs. Scharfer Peak 1375 cm⁻¹ → C–N-Streckung. Bänder 1048, 1083 cm⁻¹ → C–O–C- und C–OH-Streckschwingungen. Ergebnisse belegen: Biomoleküle des Hefeextrakts verantwortlich für Biosynthese. Oberflächenbeschichtung beeinflusst Affinität zur bakteriellen Membran. XPS (Abb. 4): Vollspektrum (Abb. 4a) mit klaren Peaks für C 1s, Ag 3d, Ag 3p, Ag 3s, O 1s. Ag 3d (5/2) und 3d (3/2) bei ~368,5 eV bzw. ~374,5 eV (Abb. 4b). Energiespaltung 6,0 eV bestätigt Ag NP-Bildung.

Oberflächenladung per Malvern Zeta Nano ZS-90 – wichtiger Parameter für Stabilität und Dispersion kolloidaler Lösungen. Zeta-Potenzial = elektrostatisches Potenzial an Grenze Diffus-/Kompaktschicht, Indikator für biomedizinische Polymeranwendungen. Zusatzdatei 1: Abb. S1: bei pH 3 leicht negative Ladung (−3,2 mV). Zeta-Potenzial fällt monoton von −12,1 mV (pH 7,0) auf −24,4 mV (pH 11,0) → negativ geladene Gruppen auf Ag NP-Oberfläche bestätigt. Gao et al. berichteten, Dispersion und Stabilität von Ag NPs hauptsächlich auf Oberflächenladung zurückzuführen. Negative Gruppen verbessern Stabilität und Dispersion in wässrigen Lösungen.

Zytotoxizität von Ag NPs und Biomolekülanalyse

Biokompatibilität synthetisierter Ag NPs wichtig für biomedizinische Anwendung. Zytotoxizität per MTS-Assay an Cos-7-Zellen. Inkubation mit Ag NPs bei verschiedenen Konzentrationen 24 h. Abb. 5a: Keine signifikante Zytotoxizität bis 200 µg/ml Ag NPs. Schluss: Ag NPs zeigen vernachlässigbare Zytotoxizität und gute Biokompatibilität gegenüber Cos-7-Zellen.

Zur Erkundung der Synthesemechanismen wurden Biomoleküle auf Ag NP-Oberfläche und im Hefeextrakt analysiert. SDS-PAGE (Abb. 5b): keine nachweisbaren oder marginale Proteine auf Ag NP-Oberfläche oder in Hefeextrakt. Hochgeschwindigkeits-Aminosäureanalysator bestimmte Biomoleküle im Hefeextrakt (Zusatzdatei 1: Tabelle S1): ~22 Aminosäuren, reich an Glutaminsäure, γ-Aminobuttersäure, Ornithin, α-Linolensäure. Isoelektrischer Punkt ~6, außer Lysin, Arginin (~10–11). Zusätzlich diverse –NH₂-haltige Komponenten (Harnstoff, Ammoniak, Asparagin, Glutamin). Biomoleküle reduktiver Aminosäuren, α-Linolensäure, Kohlenhydrate im Hefeextrakt spielen signifikante Rolle bei Ag NP-Bildung. Literatur: NADH-abhängige Reduktase oder Nitratreduktase-Enzym beteiligt an Reduktion bei Biosynthese via Mikroorganismusextrakt.

Biomoleküle des Hefeextrakts spielen entscheidende Rolle bei Ag NP-Bildung durch Schutz vor Aggregation. Stabilisatoren verhindern redundante Reaktionen zwischen Ag NPs. Amphotere Aminosäuren enthalten basische und saure Gruppen. Nettoladung kann negativ oder positiv sein je nach pH-Änderungen der Hefeextraktlösung, was Bindungsfähigkeit während Ag NP-Synthese weiter beeinflusst. In alkalischer Lösung tragen Aminosäuren auf Ag NP-Oberfläche netto negative Ladungen → maximieren elektrostatische Abstoßung. Biomoleküle aus Hefeextrakt wirken als Kappmittel, Schlüsselrolle bei Kontrolle von Größenverteilung, Form, Morphologie. pH-Wert wichtiger Faktor für kontrollierte Synthese: pH < 7 → Nukleation bei niedriger Rate; höherer pH → Ag NPs in Minuten, Partikelgröße nimmt mit steigendem pH ab. Optimales Gleichgewicht zwischen Wachstum und Nukleation demonstriert. Instabile, agglomerierte Ag NPs bei extremen pH-Werten (> 11).

Antibakterielle Aktivität

E. coli ausführlich für antimikrobielle Aktivität von Ag NPs evaluiert. Wachstum von E. coli mit/ohne Ag NPs beweist antimikrobielle Fähigkeit. Abb. 6a: synthetisierte Ag NPs zeigen signifikante antibakterielle Aktivität konzentrationsabhängig gegen E. coli. Wachstumshemmung: vollständige Reduktion bei > 20,0 µg/ml Ag NPs vs. Negativkontrolle. Halbmaximale Inhibitions-Konzentration (EC₅₀) = 13,4 µg/ml. 20,0 µg/ml signifikant antibakteriell über gesamten Testzeitraum, 10,0 µg/ml partiell inhibitorisch (Abb. 6b).

Untersuchung ob Ag NPs antibiotikaresistente Bakterienzellen beeinflussen: CFU-Assay gegen ampicillin-resistente E. coli. E. coli-Amp⁺ exprimiert stabil hochkopien pcDNA3.4-Plasmid mit β-Laktamase-Gen → Ampicillin-Resistenz. E. coli-Amp⁺ auf LB-Agar in Behandlung mit Ampicillin allein oder Kombinationsbehandlung mit Ag NPs. Inhibitorische Aktivität in Abb. 7. Ag NPs in Kombinationsbehandlung mit Ampicillin zeigten überlegene antibakterielle Aktivität vs. Ampicillin allein. Im Gegensatz: Ampicillin allein keine inhibitorische Aktivität auf E. coli-Amp⁺. Kombinationsbehandlung Antibiotika + Ag NPs bietet komplementäre Strategie zur Überwindung antibiotikaresistenter Bakterien, verbessert aktuelle Therapieansätze. Gesamtergebnisse tragen zu Entwicklung alternativer antibakterieller Inhibitoren für Infektionen durch multiresistente Bakterienstämme bei.

Großer Bedarf an neuartigen Medikamenten mit unterschiedlichen Mechanismen zur Bekämpfung bakterieller Resistenz. Aufgrund potenter antimikrobieller Aktivität werden Ag NPs in Medizinprodukten, Körperpflegeprodukten, Textilien verwendet. Mehrere Mechanismen, wie Ag NPs mikrobielle Resistenz bekämpfen: Anlagerung an bakterielle Membranoberfläche → erhöhte Zellwandpermeabilität. Wechselwirkung Ag NPs/Peptidoglykan → Konfigurationsänderung Peptidoglykan → Schädigung bakterieller Membran. Eigenschaften Form, Oberflächenstruktur, Morphologie, Dispergierbarkeit, Biokompatibilität von Ag NPs spielen signifikante Rolle für antimikrobielle Aktivität.

Fazit

Hier berichten wir über eine neuartige biosynthetische Methode zur Herstellung von Ag NPs mit Hefeextrakt. Hefe-Mizellen bilden sich beim Mischen von Ag⁺-Lösung mit Hefeextrakt. Bioreduzierende Biomoleküle spielen Hauptrolle bei Ag⁺-Reduktion. Zudem liefern Biomoleküle günstige Stabilität, Monodispersität, kontrollierbare Größenverteilung für synthetisierte Ag NPs – gute Stabilität > 1 Jahr ohne Ausfällung. Hochgeschwindigkeits-Aminosäureanalyse zeigte: Hefeextrakt reich an Biomolekülen inkl. Aminosäuren, α-Linolensäure, Aminobuttersäure. Ag NPs zeigten signifikante antibakterielle Aktivität konzentrationsabhängig gegen E. coli. Wachstumshemmung: vollständige Reduktion bei > 20,0 µg/ml Ag NPs. Ag NPs in Kombinationsbehandlung mit Ampicillin zeigen überlegene antibakterielle Aktivität vs. Ampicillin allein gegen ampicillin-resistente E. coli (E. coli-Amp⁺). Oberflächenbeschichtungen auf Ag NPs erhöhen Affinität zur bakteriellen Membran und Zellwandpermeabilität. Wechselwirkung Ag NPs/Peptidoglykan ändert Peptidoglykan-Konfiguration → schließlich Bakterienapoptose. Zudem zeigten diese biomolekülstabilisierten Ag NPs niedrige Zytotoxizität und gute Biokompatibilität gegenüber Cos-7-Zellen.