Die orale Verabreichung von Resveratrol-beladenen festen Lipid-Nanopartikeln verbessert die Insulinresistenz durch gezielte Expression von SNARE-Proteinen in Fett- und Muskelgewebe bei Ratten mit Typ-2-Diabetes

Präsentation der Hypothese

Die Einkapselung von Resveratrol (RES) in Lipidkern-Nanopartikel verstärkte seine Vorteile durch die Verbesserung der Stabilität und der oralen Aufnahme im Darm bei oraler Einnahme. SLN-RES verbessert die Insulinresistenz stärker als RES. Die antioxidative Wirkung von RES nimmt zu, wenn es in SLNs eingebaut wird.

Testen der Hypothese

Eine spektroskopische Analyse von SLN-RES wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit der Einkapselung zu bestimmen. Die zweite Hypothese bestand darin, die Wirkung der SLN-RES-Behandlung auf die Parameter des oxidativen Stresses und ihre hypoglykämische Wirkung gegen Typ-2-Diabetes in Tiermodellen zu bewerten.

Implikationen der Hypothese

Erhöhte Stabilität und intestinale Resorption führen bei oraler Verabreichung zur Bioverfügbarkeit von RES. Eine erhöhte Bioverfügbarkeit von RES beim Einbau in SLNs führt zu einer erhöhten Konzentration von RES in Zielgeweben. Eine erhöhte Konzentration von RES in Zielgeweben führt zu einer stärkeren hypoglykämischen Wirkung von RES, wenn es in SLNs eingebaut wird als RES.

Hintergrund

Diabetes mellitus Typ 2 ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Insulinresistenz gekennzeichnet ist. Insulinresistenz entsteht hauptsächlich durch die Störung des Glukosetransportsystems (GLUT 2 und 4) im Muskel- und Fettgewebe [1]. Die SNARE-Proteine ​​immobilisierten das GLUT 4-System an der Zellmembran und spielen eine wichtige Rolle beim Membrantransport, beim Andocken und bei der Vesikelfusion. Als Hauptbestandteile des SNARE-Proteinkomplexes sind das synaptosomal-assoziierte Protein 23 (SNAP-23), Syntaxin-4 (STX4) und das Vesikel-assoziierte Membranprotein 2 (VAMP-2) bekannt [2]. Frühere Berichte haben gezeigt, dass die Herunterregulierung von SNARE-Proteinen die Insulinresistenz beschleunigt [3]. In den letzten Jahren hat eine große Datenmenge gezeigt, dass pflanzliche Komponenten viele positive Wirkungen haben, die viele Stoffwechselstörungen verbessern können [4,5,6]. Forschungsversuch von Côté et al. zeigten die akute intraduodenale Infusion von RES-kompensierter Insulinresistenz über eine Verringerung des duodenalen SIRT1-Proteins und eine Verringerung der hepatischen Glukoseproduktion im Rattenmodell [4]. Gencoglu et al. berichteten, dass die intraperitoneale Verabreichung von RES die Insulinresistenz bei diabetischen Ratten durch die Normalisierung der Visfatin-Expression und die Hochregulierung der SIRT1-Expression in der Skelettmuskulatur linderte. RES-Fütterung führt zu einer erhöhten GLUT4- und GLUT2-Expression bei Streptozotocin-induziertem Diabetes bei Ratten. Insgesamt lieferten diese Ergebnisse neue Einblicke in die positiven Auswirkungen einer RES-Supplementierung auf die Insulinresistenz. Trotz seiner vielversprechenden therapeutischen Anwendung führen die geringe intestinale Resorption und der gastrointestinale Abbau bei oraler Verabreichung hauptsächlich zu einer geringen Bioverfügbarkeit von RES [7].

In den letzten Jahren bietet die Nanomedizin einen intelligenten Ansatz für die Wirkstoffabgabe vieler Medikamente, um ihre geringe Bioverfügbarkeit, geringe Stabilität und Verbesserung der Targeting-Strategien zu überwinden [8]. Als solche sind Micellen, Liposomen, polymere Nanopartikel und feste Lipid-Nanopartikel (SLNs) die bekanntesten Systeme zur Wirkstoffabgabe [9, 10]. Jüngste Studien zeigten, dass der Einbau von RES in nanoskalige Abgabesysteme eine bequeme Methode ist, um seine Beschränkung zu umgehen und in klinischen Versuchen wirksamer sein könnte als die reine Arzneimittelsuspension [11]. Jüngste Beweise zeigten, dass der Einbau von Medikamenten in feste Lipid-Nanopartikel (SLNs) die Bioverfügbarkeit von RES bei oraler Verabreichung erhöhen könnte [11, 12]. Frozzaet al. zeigten, dass die Nanoverkapselung von RES seine neuroprotektive Wirkung gegen Alzheimer-Krankheiten durch eine Erhöhung der Wirkstoffkonzentration im Hirngewebe verbesserte [13]. Gemäß den oben erwähnten früheren Berichten wurde vorgeschlagen, dass die Einkapselung von RES in Lipidkern-Nanopartikel die Insulinresistenz besser verbessern kann als RES durch die Erhöhung seiner oralen Bioverfügbarkeit.

Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich auf die Entwicklung, Optimierung und Charakterisierung von RES-beladenem SLN (SLN-RES) mit dem Ziel, seine orale Bioverfügbarkeit zu verbessern. Daher haben wir in der aktuellen Studie SLN-RES vorbereitet und versucht, seine Eigenschaften zu bestimmen. Anschließend wurde die Wirkung der oralen Behandlung von SLN-RES auf die Parameter Nüchternblutzucker (FBS), Insulin und oxidativen Stress bei Ratten mit Typ-2-Diabetes untersucht. Darüber hinaus haben wir die Wirkung der oralen Verabreichung von SLN-RES auf die Genexpression von Snap23, Stx4 und Vamp2 in Fett- und Muskelgewebe untersucht.

Materialien und Methoden

Materialien

Trans-Resveratrol (> 99 %) wurde von Mega Resveratrol (USA) bereitgestellt, Streptozotocin (STZ) und Nicotinamid (NA) wurden von Sigma-Aldrich (Deutschland) bezogen und das hydrierte Sojabohnenlecithin (S100) wurde geschenkt von Lipoid KG (Ludwigshafen, Deutschland). Hydriertes Palmöl (S154) wurde von Condea (Witten, Deutschland) geschenkt, und das TRIzol-Reagens und der cDNA-Synthese-Kit wurden von Invitrogen (USA) geliefert. Das Insulin-Ratten-ELISA-Kit wurde von Bio-Equip (China) bezogen. Andere Produkte und Lösungsmittel wurden in analytischer Qualität verwendet.

Vorbereitung von SLN-RES

SLN-RES wurde gemäß der vorherigen Studie mit geringfügigen Modifikationen hergestellt [14]. Kurz gesagt wurden 40 mg S100 und 1 g Sorbitol zu 15 ml destilliertem Wasser gegeben und als wässrige Phase auf 70 °C erhitzt. Die organische Phase mit 100 mg S154, 70 mg S100 und RES wurde bei 70 °C geschmolzen und dann wurden 5 ml Chloroform als organisches Lösungsmittel zugegeben. Anschließend wurde die organische Phase unter Rühren bei 1000 U/min/min schnell mit der vorgewärmten wässrigen Phase vermischt, bis das organische Lösungsmittel entfernt war. Die resultierende Suspension wurde 2 Minuten lang beschallt und dann in kaltes Wasser (2 °C) unter kontinuierlichem Rühren mit 1000 Upm/min für 2 Stunden injiziert, um die Lipidmatrix schnell zu verfestigen. Dann wurde die Probe bis zum Trocknen im Dunkeln gehalten. Die resultierende Probe wurde zweimal mit destilliertem Wasser durch Zentrifugieren gewaschen, um den Überstand zu entfernen, der das freie Arzneimittel enthielt. Die Überstände wurden einer Messung der Einfangeffizienz ( EE). Eine Reihe von SLN wurde hergestellt, indem eine unterschiedliche Menge an reinem RES (30, 50 und 70 mg) in die geschmolzene Lipidphase gegeben wurde, um einen hohen EE zu erreichen. Die Wirkung der RES-Beladung auf die mittlere Partikelgröße, den Polydispersitätsindex (PDI), die Oberflächenladung (Zetapotential) und den EE von SLNs wurde bewertet (Tabelle 1).

Charakterisierung von SLN-RES

Der mittlere Nanopartikeldurchmesser, das Zetapotential und der PDI von SLN-RES wurden durch Laserbeugung (Zetasizer Nano-ZS; Malvern Instrument, UK) gemessen. Die Charakterisierung wurde nach SLN-RES-Verdünnung in destilliertem Wasser (1/30) durchgeführt.

Einfangeffizienz

Der EE-Wert ist definiert als der Prozentsatz des im SLN eingeschlossenen RES relativ zum gesamten RES unter Verwendung der folgenden Gleichung. Die Menge an eingefangenem RES wurde durch Abtrennen von freiem RES von eingekapseltem RES bestimmt. Freies RES wurde mit einem UV-Spektrophotometer bei 310 nm quantifiziert.

In-vitro-Studie zur Wirkstofffreisetzung

Das in vitro-Arzneimittelfreisetzungsmuster von RES wurde wie folgt analysiert. Das hergestellte SLN-RES wurde in Plasmamedium unter Rühren bei pH 7,4 und 1,2 gelöst. Zu den definierten Zeitpunkten (0,5, 1, 2, 4, 6 und 8 h) wurde die definierte Mediummenge entnommen und anschließend zur Quantifizierung der freien Form von RES durch einen 0,24-μm-Spritzenfilter filtriert. Das gefilterte RES repräsentiert die Menge an RES, die in das Medium freigesetzt wurde.

Transmissionselektronenmikroskopie

Die morphologische Charakterisierung wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bewertet. Kurz gesagt, SLN-RES wurde auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter ausgebreitet und unter TEM ZEISS betrachtet. Oberflächenmorphologie, Aggregation und Unregelmäßigkeit von SLN-RES wurden charakterisiert.

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

Die S100, RES und getrocknete Probe von SLN und SLN-RES wurden analysiert, um ihre intermolekularen Wechselwirkungen und die oberflächenchemische Charakterisierung von Nanopartikeln durch Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) unter Verwendung eines Infrarotspektrometers (FTIR PerkinElmer, USA) zu bestätigen. Die Spektren wurden im Bereich von 400 und 4000 cm ⁻¹ . aufgenommen . Die getrockneten Proben wurden unter Verwendung von KBr hergestellt, um Pellets zu bilden.

Tierstudiendesign

Zwanzig männliche Wistar-Ratten (200–250 µg) wurden vom Animal House of Razi Institute (Iran) bereitgestellt. Die Tiere wurden gemäß den von der Ethikkommission der Hamadan University of Medical Sciences genehmigten Protokollen behandelt. Die Ratten wurden mit frischem Wasser und einem Standardfutter gefüttert und unter kontrollierten Bedingungen gehalten (25 ± 2 °C und Beleuchtung 12-h-Hell/Dunkel-Zyklen). Typ-2-Diabetes wurde durch intraperitoneale Injektion von STZ 65 µmg/kg (0,1 µM in Natriumcitrat; pH 4,5) und Nicotinamid 110 µmg/kg als Einzeldosis induziert [15]. Der FBS-Spiegel wurde nach 3 Tagen gemessen. Ratten mit Glukosespiegeln über 150 wurden als diabetische Modelle betrachtet. Nach einer Woche wurden RES und pulverisiertes SLN-RES in destilliertem Wasser gelöst und 1 Monat lang täglich per Schlundsonde oral verabreicht. Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen von 5 Ratten in jeder Gruppe eingeteilt:HC, gesunde Kontrolle; DC, diabetische Kontrolle; RES, diabetische Ratte, die mit 10 mg/kg Resveratrol oral behandelt wurde; und SLN-RES, diabetische Ratte, die oral mit Resveratrol-beladenen festen Lipid-Nanopartikeln behandelt wurde (pulverisierte SLN-RES-Probe mit 10 mg/kg RES). Am Ende der Studie wurden die Tiere gewogen und dann mit Ketamin und Xylazin intraperitoneal (100 mg/kg bzw. 10 mg/kg) anästhesiert. Danach wurde Blut aus einer Herzpunktion entnommen und das Serum abgetrennt und bei – 20 °C gelagert. Anschließend wurden Skelettmuskel und viszerales Fettgewebe entnommen und sofort eingefroren und zur weiteren Analyse bei – 80°C aufbewahrt.

Messung des Nüchternblutzuckers

Der FBS wurde mit einem kolorimetrischen Assay-Kit (Pars Azmun, Iran) gemessen.

Die Messung von Seruminsulin

Der Insulin-Serumspiegel wurde mit einem kommerziellen ELISA-Kit (Bio-Equip, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Insulinresistenz wurde anhand der Homöostase-Modellbewertungsformel (HOMA) berechnet.

Gesamte antioxidative Kapazität

Die Fähigkeit der Probe, Eisen(III) zu reduzieren (Fe ⁺³ ) zu Eisen (Fe ⁺² .) ) wurde als die totale antioxidative Kapazität (TAC) bestimmt. Die Reaktion zwischen Fe ²⁺ und 2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazin (TPTZ) führt zu einem blau gefärbten Komplex [16].

Thiol-Gruppe insgesamt

Die Gesamt-Thiolgruppen (-SH) wurden unter Verwendung von 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB)-Reagens gemessen. Dieses Reagens reagiert mit Thiolgruppen unter Bildung eines gelb gefärbten Komplexes [17].

Lipidperoxidationsassay

Malondialdehyd (MDA) als Endprodukt des Lipidperoxidationsprozesses wurde unter Verwendung der kolorimetrischen Methode gemessen. Die peroxidierten Lipide reagieren mit Thiobarbitursäure (TBA) und bilden einen rosafarbenen Komplex. Als Standard wurde 1,1,3,3-Tetraethoxypropan verwendet [18].

Gesamter Oxidationsmittelstatus

Das Oxidationspotential der Probe wurde nach der Methode des Gesamtoxidationsmittelstatus (TOS) gemessen. Kurz gesagt, Fe ⁺³ und Xylenolorange erzeugen im sauren Zustand einen farbigen Komplex. Der Assay wurde mit H₂ . kalibriert O₂ , und die Ergebnisse wurden in μM H₂ . ausgedrückt O₂ Äquivalent/L [19].

Quantitative Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion

Um die Genexpression von Snap23, Stx4 und Vamp2 zu bestimmen, wurde eine quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) durchgeführt. Gesamt-mRNA wurde aus schnell gefrorenem Fett- und Muskelgewebe unter Verwendung von TRIzol-Reagenz extrahiert. Die mRNA-Quantität und -Qualität wurde mit einem NanoDrop UV-Spektrophotometer (BioTek Laboratories, Inc., USA) bestimmt. Die mRNA wurde unter Verwendung des RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit revers in cDNA transkribiert. Die quantitative Amplifikation wurde mit spezifischen Primersequenzen unter Verwendung des CFX96-Echtzeit-PCR-Detektionssystems durchgeführt. Die Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer wurden für die Genamplifikation verwendet:5'-dTTCCGTTTCTGTGTCCAATAG und 5'-dTTGTGCTTTCCAGAGACTCAT für Snap23, 5'-dTCAGCAGACTATGTGGAAC und 5'-dCCAAGATGAGAACAGTGACAGA für Stx4 und 5'-dCTACTTGAG 5TCCTAAGAAGAG und 5'-dCTACTTGAG 5TCCTAAGAAGAG und TA Die relative Änderung der Genexpression wurde gemäß 2 ^-ΔΔCt . berechnet Formel. Als Housekeeping-Gen wurde 18s rRNA verwendet. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde unter Verwendung der Software SPSS 16 und GraphPad Prism 6.00, LaJolla, CA (USA) durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu vergleichen. p < 0,05 wurde als signifikantes Niveau angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Physikochemische Charakterisierung von SLN-RES

Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, waren die Partikelgröße und der PDI-Wert mit zunehmendem Verhältnis von Wirkstoff zu Lipid fast konstant, was auf die Bildung mehrerer Phospholipidschichten in SLN zurückzuführen sein könnte [11]. Der Größenbereich der vorliegenden Nanopartikel lag bei etwa 250  nm, was für die intestinale Absorption und das Bypass-Leber- und Milz-Filtrationssystem geeignet sein könnte [20]. Außerdem kann dieser Größenbereich zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit von RES durch eine verlängerte Zirkulationszeit von SLN-RES und eine verlängerte Wirkstofffreisetzung führen. Die Entwicklung von Nanopartikeln mit geringerer Größe und geringerem PDI-Wert kann deren Aufnahme im Darm erleichtern. Als Vorschlag könnte die Modifikation von SLN mit Polyethylenglycol (PEG) unsere Formulierung verbessern, um ihre Permeabilität und systemische Zirkulationszeit zu verbessern [21].

Wie in Tabelle 1 gezeigt, wird davon ausgegangen, dass der PDI-Wert von 0,4 eine heterogene Verteilung aufweist, die das Vorhandensein von Agglomeraten ausdrückt. In SLN-RES-30 trägt die Erhöhung des RES-Gehalts dazu bei, die Wahrscheinlichkeit einer Aufnahme in das SLN zu erhöhen, obwohl der EE-Prozentsatz offensichtlich aufgebraucht war, gefolgt von einem Anstieg des Wirkstoffgehalts in der SLN-RES-70-Formulierung. Es wurde der Schluss gezogen, dass ein erhöhter Lipidgehalt in SLN-RES-70 nicht ausreicht, um die gesamte RES-Menge in die SLN-Matrix aufzunehmen [22]. Daher wurde SLN-50 als optimierte Formulierung für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Die Ergebnisse des Zetapotentials zeigten eine negative Oberflächenladung (− 16,5 ± 17,7 mV) für die aktuellen Formulierungen. Hinsichtlich der morphologischen Beobachtung wurde die Oberflächenladung von SLN-RES als ausreichend angesehen, um Partikelaggregationsphänomene und eine feine SLN-Stabilität zu verhindern [21]. Das Zeta-Potential aller Formulierungen mit oder ohne Wirkstoff war einander nahezu ähnlich, was bedeutet, dass die Einkapselung des Wirkstoffs in SLN keinen signifikanten Einfluss auf die Oberflächenladung des Trägers hatte. Als Ergebnis wurde das Medikament aufgrund der lipophilen Natur von RES an der Innenseite des SLN platziert [23].

Der In-vitro-Release-Assay

Wie die Ergebnisse in Abb. 1 dargestellt sind, wurden bei pH = 7,4 und pH = 1,2 unterschiedliche Freisetzungsverhalten festgestellt. Nach 6 h und 1 h wurden bei neutralen bzw. sauren pH-Bedingungen etwa 70 % des RES aus den Nanopartikeln freigesetzt. Die anfängliche Burst-Freisetzung war auf die Freisetzung von Wirkstoffen zurückzuführen, die in der Anfangsphase an der Oberfläche von Nanopartikeln adsorbiert waren [24]. Danach konnte eine verzögerte Freisetzung der Wirkstoff-Lipid-Wechselwirkung, dem Konzentrationsgradienten und dem Einbau des Wirkstoffs in den öligen Trägerkern zugeschrieben werden. Das Profil der anhaltenden Freisetzung führt zu einer erhöhten Wirkstoffserumkonzentration und hilft folglich, die Bioverfügbarkeit und gezielte Abgabe von RES zu erhöhen. Als Vorschlag kann die intravenöse Verabreichung von RES den sauren Zustand des Magens umgehen [22].

In-vitro-Freisetzungsprofile von RES aus SLN-RES unter sauren und natürlichen Bedingungen

Morphologiebewertung

Wie in Abb. 2 zu sehen ist, führte die TEM-Analyse zu guten Ergebnissen, wobei die meisten Partikel eine regelmäßige Kugelform und Größe im Bereich von 20–30 nm erreichten. Außerdem wurden die stäbchenförmigen und amorphen Nanopartikel mit geringerer Aggregation beobachtet. Die Partikelgröße von SLN wurde zwischen 20 und 30 nm geschätzt, was mit den DLS-Ergebnissen nicht übereinstimmt (Tabelle 1). Diese Diskrepanz kann auf die Hydratation von Nanopartikeln durch Probenverdünnung bei der DLS-Analyse zurückzuführen sein. Außerdem gab es einen stäbchenförmigen Nanopartikel, der auf das ständige Einspritzen einer Emulsion in das kalte Wasser durch eine Spritzennadel zurückzuführen sein könnte. Wir haben bei der TEM-Beobachtung keine SLN-Aggregationen beobachtet, was eine ausreichende Oberflächenladung und Stabilität für unsere Formulierung darstellt [23].

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von SLN-RES. Balken=100 nm

Validierung der Ladeeffizienz von RES durch Infrarotspektroskopie

Wie in Abb. 3 gezeigt, zeigten die FTIR-Ergebnisse des Lecithinspektrums einen breiten Peak bei 3370–3390 cm ⁻¹ das bezieht sich auf die symmetrische N-H-Streckung von der funktionellen Cholingruppe. Ein Peak bei 1735 cm ⁻¹ repräsentiert die C=O-Streckung von der Esterverbindung in Lecithin. Auch die charakteristischen Peaks bei 2922, 2853 und 3010 cm ⁻¹ sind auf die Streckung der C–H-Gruppen zurückzuführen. Das SLN-Spektrum zeigte mehrere charakteristische Peaks, die dem Lecithin-Spektrum ohne Verschiebung ähnlich waren, aber die Intensität der zu Lecithin gehörenden Peaks war stark verringert, wenn sie in SLN platziert wurden. Dies kann an der hydrophilen Umgebung und der abschirmenden Wirkung des Tensids liegen. In der vorliegenden Studie zeigte das RES-Spektrum funktionelle Gruppen einschließlich Absorptionsbanden bei 3290 cm ⁻¹ aufgrund der OH-Streckung, die zur Alkoholgruppe gehört, 965 cm ⁻¹ für trans-C=C-Bindung, 1154 cm ⁻¹ für C-O-Streckung, 1445 cm ⁻¹ und 1587 cm ⁻¹ für C=C-Streckung im aromatischen (AR) Ring und 1606 cm ⁻¹ für die C-C-Streckung der Alkengruppe. Außerdem zeigte das RES charakteristische Peaks mit starker Intensität der monosubstituierten C-H-Biegung bei 770 cm ⁻¹ und Ar-C-H-Streckung bei 3020 cm ^–1 . Es gab Peaks mit einer Intensität bei 1175–1263, die die ArO-H-Gruppe von RES repräsentierten. Unsere Ergebnisse bestätigten den Einbau von RES in SLN, während der RES-Fingerabdruck in SLN-RES wiederholt wurde, aber das SLN-Spektrum war nicht mit diesem Fingerabdruck assoziiert. Außerdem ein Peak von etwa 1735–1740 cm ⁻¹ wurde der C=O-Streckung (R-C(O)-O-R) zugeschrieben, die sich auf Ester in Lecithinphospholipid in allen Spektren auf RES bezieht.

FTIR-Spektrum von SLN (feste Lipid-Nanopartikel), SLN-RES (Resveratrol-beladene feste Lipid-Nanopartikel), S100 (Lecithin) und RES (reines Resveratrol-Pulver)

FTIR-Daten bestätigten das Vorhandensein von Arzneimitteln im Träger. Es gab einen breiten Peak bei 3040–3670 cm ⁻¹ in Lecithin, SLN und SLN-RES war dies auf die OH-Streckung zurückzuführen, die zu der stark hydrophoben Natur der Proben beiträgt. Die breite Peakverschiebung zwischen SLN und SLN-RES kann auf die Bildung von Wasserstoffbrücken zurückgeführt werden, wenn RES in SLN platziert wird. Wir kamen zu dem Schluss, dass die Partikeloberfläche aufgrund der Verstärkung der C-H-Streckung in SLN-RES von Lecithin bedeckt war. Andererseits bezieht sich die verringerte Intensität des RES-Fingerabdrucks im SLN-RES-Spektrum auf die Lipidbedeckung von RES in der SLN-Struktur. Der Unterschied zwischen den charakteristischen Peaks von RES und SLN-RES bestätigte, dass eine potenzielle chemische Wechselwirkung zwischen RES und anderen Formulierungskomponenten besteht. Ein neuer Peak, der bei 1000 cm ⁻¹ . sichtbar wurde in SLN-RES wurde Ar-O-R zugeschrieben, das sich auf die Wechselwirkung zwischen RES und Lecithin bezog. Andererseits ist im RES-Spektrum die Absorptionsbande bei 1106 cm ⁻¹ war mit der Ar-O-H-Gruppe verwandt, die in SLN-RES verschwand. Diese Änderung liefert einen weiteren Beweis für die Interaktion zwischen RES und SLN. Darüber hinaus wurde eine erhöhte Intensität bei 2850–2900 cm ⁻¹ . sichtbar in SLN-RES als in SLN, was auf eine Verstärkung der C-H-Streckung hinweist, die auf die zunehmende Oberflächenlokalisierung des Tensids und die Platzierung von RES im Kern-Nanopartikel zurückzuführen sein kann. Insgesamt bestätigten unsere Ergebnisse den Einbau von RES in Lipidkern-SLN, die von Lecithin gebildet werden [11, 22].

Die Wirkung der RES- und SLN-RES-Behandlung auf die Körpergewichtszunahme, den Nüchternblutzucker, das Insulin und den HOMA-Index

Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigten, dass in der DC-Gruppe die STZ-Injektion das Körpergewicht signifikant verringerte als in der HC-Gruppe. Die RES-Verabreichung verhinderte einen Gewichtsverlust im Vergleich zur DC-Gruppe. SLN-RES dient einem normalen Körpergewicht signifikanter als die RES-Behandlung, während auf die HC-Gruppe zurückgegriffen wird. Basierend auf früheren Berichten hatte die orale Verabreichung von SLN-RES bei intraperitonealer Verabreichung eine ähnliche Wirkung wie freies RES. Gencogluet al. berichteten, dass die intraperitoneale Behandlung von RES dem Körpergewicht nach der Diabetesinduktion diente, während das endgültige Körpergewicht von diabetischen Modellen, die RES erhielten, 10 % niedriger war als das der gesunden Ratten [25].

Wie in Tabelle 2 gezeigt, war FBS in der DC-Gruppe im Vergleich zur HC-Gruppe signifikant erhöht. Am Ende der Studie war der Serum-FBS-Wert sowohl durch die RES- als auch die RES-SLN-Behandlung im Vergleich zur DC-Gruppe verringert. Die Diabetesinduktion verringerte den Serumspiegel von Insulin im Vergleich zur HC-Gruppe. Interessanterweise wurde der Serumspiegel von Insulin bei diabetischen Ratten durch eine RES-SLN-Behandlung ausgeglichen. Die Verabreichung von RES und SLN-RES verbesserte die HOMA als die DC-Gruppe bemerkenswert. In der SLN-RES-Gruppe war HOMA besser als die RES-Behandlung, die der HC-Gruppe nahe kommt.

Die mit SLN-RES erzielte hypoglykämische Wirkung war signifikant besser als mit RES, was auf die verbesserte intestinale Absorption und die verlängerte Zirkulationszeit von nanoverkapseltem RES im Blut zurückzuführen sein könnte. In Übereinstimmung mit unserem Vorschlag haben Sadi et al. zeigten, dass die intraperitoneale Behandlung von RES mit einer starken hypoglykämischen Wirkung und einer verbesserten Insulinresistenz bei STZ-induziertem Diabetes einhergeht [26].

Die Wirkung der RES- und SLN-RES-Behandlung auf den Serumspiegel der oxidativen Stressparameter

Wie in Tabelle 3 erwähnt, führt die Diabetesinduktion in der aktuellen Studie zu reduzierten antioxidativen Indikatoren und signifikant erhöhten Oxidationsindikatoren im Vergleich zur HC-Gruppe. Die RES-Behandlung verhinderte die Erschöpfung des Serum-TAC-Spiegels und hemmte die Erhöhung von MDA. Überraschenderweise konnte die SLN-RES-Behandlung die Serum-TAC- und MDA-Spiegel vollständig wiederherstellen. Wahrscheinlich führte die verlängerte Zirkulationszeit von RES zu einer besseren modulatorischen Wirkung von RES-SLN [27]. In Übereinstimmung mit dem vorliegenden Ergebnis haben Gokce et al. berichteten, dass SLN und nanostrukturierte Lipidträger (NLC), die RES enthalten, intrazelluläre ROS in Zellkulturfibroblasten reduzierten [28]. Coradini und Co-Autoren berichteten auch, dass die gemeinsame Verkapselung von RES und Curcumin in Lipidträgern das Hydroxylradikal in vitro bemerkenswert verringerte [29]. Darüber hinaus führte die Verabreichung von RES-SLN zu einem verringerten TOS-Wert und einem signifikant erhöhten -SH-Spiegel im Vergleich zur DC-Gruppe. Die RES-Behandlung verbesserte jedoch nicht den TOS- und -SH-Spiegel, was die schwache antioxidative Wirkung von RES zeigte, die auf die geringe Bioverfügbarkeit von RES bei oraler Verabreichung zurückgeführt werden könnte.

Die Wirkung der RES- und SLN-RES-Behandlung auf die Genexpression von Snap23, Stx4 und Vamp2 im Fettgewebe

Frühere Versuche zeigten, dass die Erhöhung der Genexpression von Snap23, Stx4 und Vamp2 zu einer Verbesserung der Insulinresistenz führte. Oh et al. berichteten, dass die Überexpression von Stx4 in den Pankreaszellen des transgenen Modells die Insulinresistenz verbessert [30]. Hier induzierte die RES-Behandlung offensichtlich die Genexpression von Snap23, Stx4 und Vamp2 im Fettgewebe (Abb. 4a–c). Farimaniet al. zeigten, dass die RES-Behandlung die Genexpression von Stx4 und Vamp2 im Fettgewebe des diabetischen Rattenmodells signifikant herunterreguliert [31]. Zwischen RES- und SLN-RES-Behandlung wurden keine signifikanten Veränderungen in Fettgewebe beobachtet, in denen wahrscheinlich die Halbwertszeit der Serumelimination von RES für eine Arzneimittelexposition im Fettgewebe nicht ausreicht. Die Genexpression von Snap23 hatte keinen Einfluss auf RES und SLN-RES, was auf die Überproduktion des SNAP23-Proteins in den Adipozyten zurückzuführen sein könnte, die über einen Feedback-Mechanismus zu einer transkriptionellen Repression führen kann. Um diese Frage zu beantworten, könnte die Messung des Proteingehalts von SNAP23 die vorliegenden Daten genauer erklären. Auch die Messung der hepatischen Snap23-Expression mit der Zeitverlaufsmethode würde unsere Beobachtung klar erklären.

Die Wirkung der RES- und SLN-RES-Behandlung auf den mRNA-Spiegel von Snap23, Stx4 und Vamp2 in Fettleibigkeit (a –c ) und Muskelgewebe (d –f ). α , im Vergleich zur DC-Gruppe; δ , gab es einen signifikanten Unterschied zwischen der RES- und der SLN-RES-Gruppe (p <0,05); π , wieder in die HC-Gruppe aufgenommen (es gab keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur HC-Gruppe (p> 0,05)). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.*p < 0,05, ⁺ p < 0.01, ^# p <0,001

Die Wirkung der RES- und SLN-RES-Behandlung auf die Genexpression von Snap23, Stx4 und Vamp2 im Muskelgewebe

Wie in Abb. 4d–f dargestellt, war die STZ-Injektion in der DC-Gruppe im Vergleich zur HC-Gruppe mit einer Herunterregulierung von Snap23, Stx4 und Vamp2 im Muskelgewebe verbunden. SLN-RES induzierte die Expression von Snap23 und Stx4 im Muskelgewebe besser als die freie Form von RES. Wir haben das beste Ergebnis bezüglich der Genexpression von Vamp2 beobachtet. Die orale Gabe von SLN-RES kompensierte die Herunterregulation von Vamp2 nahezu auf das normale Niveau. Ähnlich unseren Ergebnissen haben Mullainadhan et al. zeigten, dass die Gabe von Bisphenol-A bei erwachsenen männlichen Albino-Ratten die Proteinexpression von Snap23, Stx4 und Vamp2 im Gastrocnemius-Muskel erhöht [32]. Eine wahrscheinlich erhöhte Absorption von RES durch die Verabreichung von RES-SLN kann die Chance von RES-SLN erhöhen, das Muskelgewebe zu erreichen, was zu einer besseren regulatorischen Wirkung auf die Genexpression von Snap23, Stx4 und Vamp2 führte. Basierend auf den bisherigen Erkenntnissen beeinflusst die potenzielle Penetrationsfähigkeit und Zellaufnahmekapazität von SLN-RES die Gewebeakkumulation von RES, die für die unterschiedlichen Wirkungen von SLN-RES auf die Genexpression von SNARE-Proteinen in Fett- und Muskelgewebe verantwortlich sein kann. In other words, our results supported differently in vivo biodistribution pattern of RES in intact form within the SLN.

Conclusion

We prepared suitable nanocarrier in terms of physicochemical and morphological properties for oral delivery of RES. In light of our result, we concluded that SLNs could serve as a promising delivery system to enhance the therapeutic effect of oral treatment of RES against insulin resistance through improving the hypoglycemic effect and elevating the expression of Snap23, Stx4, and Vamp2 in adipose and muscle tissue. However, subsequent studies will be necessary to identify the in vivo biodistribution and pharmacokinetic properties of SLN-RES.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Abkürzungen

RES:

Resveratrol

SLN:

Solid lipid nanoparticle

SLN-RES:

Resveratrol-loaded solid lipid nanoparticle

SNAP-23:

Synaptosomal-associated protein 23

STX4:

Syntaxin-4

VAMP-2:

Vesicle-associated membrane protein 2

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

-SH:

Total thiol group

TAC:

Total antioxidant capacity

MDA:

Malondialdehyde

TOS:

Total oxidant status