HDAC1-vermittelte MicroRNA-124-5p reguliert NPY, um die Lern- und Gedächtnisfähigkeit von Ratten mit Depressionen zu beeinflussen

Einführung

Depression bezeichnet eine schwere behindernde Psychose, die weltweit schwere wirtschaftliche Belastungen und soziale Folgen mit sich bringt [1]. Depression ist durch physiologische, kognitive und Verhaltensänderungen gekennzeichnet, die die allgemeine Gesundheit der Patienten gefährden [2]. Die für Depressionen zugänglichen Behandlungen haben sich mit der Anwendung von Ketamin als schnell wirkendem Antidepressivum und der Weiterentwicklung von Geräten entwickelt, die selektiv auf die Aktivität von Populationen neuronaler Subtypen eingehen können [3]. Darüber hinaus sind vielseitige Nanoarchitekturen wie Carbon Dots bei neurologischen Erkrankungen anwendbar [4]. Eine unzureichende Behandlung von Depressionen kann jedoch zu Leistungsschwäche, Verhaltensstörungen, körperlichen Erkrankungen, Drogenmissbrauch und sogar Selbstmord führen [5]. Daher besteht ein dringender Bedarf, innovative Wirkstoffe zur Behandlung von Depressionen zu entdecken.

Es wurde bereits dokumentiert, dass der microRNA (miR)-124-Spiegel im Plasma bei Depressionen und Antidepressiva ansteigt [6]. Während einer durch chronischen unvorhersehbaren leichten Stress (CUMS) induzierten Depression zeigt die miR-124-Expression im Hippocampus dynamische Variationen, was auf verschiedene pathologische Veränderungen in verschiedenen Stadien der Depression hinweist [7]. Darüber hinaus ist miR-124 der Kandidat, um depressivähnliches Verhalten bei schweren depressiven Störungen zu verbessern [8]. Außerdem dient die miR-124-Suppression als Antidepressivum im präfrontalen Kortex, was sich in abgeschwächten depressionsähnlichen Verhaltensweisen bei Mäusen widerspiegelt [9]. Histon-Deacetylase 1 (HDAC1) ist ein Mediator von miR-124 [10], der einen Multiproteinkomplex zur transkriptionellen Regulation und epigenetischen Modifikation bildet [11]. Nach unserem besten Wissen fördert eine Beeinträchtigung der HDAC1-Aktivität die Resilienz bei Major Depression [12]. Darüber hinaus kann die Unterdrückung von HDAC1 im Gehirn Stimmungsstörungen und andere neuroplastisch veränderte Hirnerkrankungen verbessern [13]. HDAC-Inhibitoren könnten angstähnliches und alkoholtrinkendes Verhalten abschwächen und die Expression von Neuropeptid Y (NPY) erhöhen [14]. Außerdem kann eine Beeinträchtigung der HDAC-Aktivität zu einer Erhöhung der NPY-Expression im zentralen Kern der Amygdala und im medialen Kern der Amygdala führen [15]. NPY ist ein hypothalamisches orexigenes Neuropeptid, das ausreichend ist, um Angstzuständen, sozialen Störungen und depressiven Symptomen vorzubeugen [16]. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass NPY und seine Rezeptoren entzündungshemmende und antidepressive Wirkungen auf Rattenmodelle mit einer durch Lipopolysaccharide induzierten Depression haben [17]. Zusammenfassend ist das kombinierte Zusammenspiel der HDAC1/miR-124-5p/NPY-Achse bei Depressionen unklar. Daher beabsichtigt diese Studie, den Mechanismus dieser Achse aufzudecken, um einen kurativen Kandidaten für die Depressionstherapie zu untersuchen.

Materialien und Methoden

Ethikerklärung

Die an dieser Studie beteiligten Tierversuche entsprachen den Anforderungen der Versuchstierethik des The First Affiliated Hospital der Harbin Medical University. Die Versuche wurden optimiert, um die Fütterungsbedingungen der Versuchstiere zu verbessern, die Anzahl der verwendeten Tiere zu reduzieren und das Leiden der Tiere zu lindern.

Versuchstiere

Männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten mit einem spezifischen pathogenfreien (SPF)-Grad, die 200–220 g wiegen, wurden vom Animal Research Center, First Affiliated Hospital der Harbin Medical University (Harbin, China) zur Verfügung gestellt. Die Ratten wurden in einer Umgebung mit Lichtschutzfaktor (22–24 °C, 60–64 % Luftfeuchtigkeit, 12-stündige Licht- und Dunkelzyklen) gehalten. Abgesehen von der Zeit während der Modellierung und anderen bestimmten Zeitpunkten konnten die Ratten Wasser und Nahrung erhalten.

Rattengruppierung und Modellbildung

Die modellierten Ratten wurden zufällig in 8 Gruppen (n = 10):normale Gruppe (Ratten ohne jegliche Behandlung), CUMS-Gruppe (CUMS-induzierte Depressionsratten), Sh-Negativkontrollgruppe (NC) (CUMS-induzierte Depressionsratten, denen sh-HDAC1 Lentivirus NC injiziert wurde), sh-HDAC1-Gruppe (CUMS-induzierte Depressionsratten, denen sh-HDAC1-Lentivirus injiziert wurde), Anti-miR-NC-Gruppe (CUMS-induzierte Depressionsratten, denen Anti-miR-124-5p-Lentivirus NC injiziert wurde), Anti-miR-124-5p-Gruppe (CUMS- Ratten mit induzierter Depression, denen Anti-miR-124-5p-Lentivirus injiziert wurde), Anti-miR-124-5p + sh-NC-Gruppe (CUMS-induzierte Depressionsratten, denen Anti-miR-124-5p-Lentivirus und sh-NPY-Lentivirus NC injiziert wurden) und Anti-miR-124-5p + sh-NPY-Gruppe (CUMS-induzierte Depressionsratten, denen anti-miR-124-5p-Lentivirus und sh-NPY-Lentivirus injiziert wurden).

CUMS-induzierte Depressions-Rattenmodelle wurden nach Willners Methode [18] etabliert. Die Ratten in der normalen Gruppe wurden ohne Stimuli mit Futter und Wasser gefüttert, während die Ratten in den anderen 7 Gruppen 35 Tage lang CUMS in unabhängigen Käfigen erhielten. Diese Ratten wurden durch Eiswasserschwimmen bei 4 °C für 5 min in einem Behälter (30 cm Wassertiefe) stimuliert, Tag- und Nachtumkehr (Ratten blieben tagsüber 12 h im Dunkeln und in einem hellen Raum, der von Glühlampen für 12 h in der Nacht), Schwanzklemmen durch eine Schwalbenschwanzklemme für 30 s, 1 min Schütteln, 24 h Fasten und Wasserentzug, 30 min Ultraschallstimulation (50 Hz), Nasspolsterung und Klimaanlage bei 17℃. Die Ratten wurden täglich zufällig mit einem dieser Stimuli stimuliert, und der gleiche Stimulus wurde insgesamt nicht mehr als 5 Mal angewendet.

Ratten wurden mit 2% Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg) anästhesiert und bilateraler Hippocampus (anteroposteriorer Durchmesser =  4,8 mm, mediolateraler Abstand =   ±   2,5 mm, Abstand zwischen Rückenhöhle und vorderer Fontanelle =  − 3,5 mm) wurde Lentivir bei 1 injiziert μL/min mit einer Hamilton-Mikrospritze mit einer 26-G-Nadel. Die Nadel wurde 5 min an der Injektionsstelle belassen, um Reflux zu verhindern. Die Schädel wurden mit Knochenwachs versiegelt und die Schnitte wurden vernäht und die Ratten wurden 7 Tage lang geborgen [19]. sh-HDAC1-Lentivirus und seine NC, Anti-miR-124-5p-Lentivirus und seine NC sowie sh-NPY und seine NC (Titer:10 ⁸ TU/ml) wurden von GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China) gekauft.

Verhaltensfunktionstests

Die Ratten wurden am Tag vor der CUMS-Modellierung (am Tag 0), nach der CUMS-Modellierung (am 36. Tag) und nach der Lentivirus-Interferenz (am 52. Tag) gewogen.

Ein Open-Field-Test (OFT) konnte das autonome und explorative Verhalten von Ratten in einer neuen Umgebung erkennen, die häufig verwendet wurde, um depressives Verhalten zu bewerten. Dieser Test wurde in einer schwarzen Holzkiste mit offenem Feld (100 cm × 100 cm ×   50 cm) mit einem Video-Tracking-System durchgeführt, das über der offenen Feldkiste angebracht war, um Rattenaktivitäten aufzuzeichnen. Der Boden der offenen Schachtel wurde in 25 Raster (20 cm ×   20 cm) mit weißen Linien unterteilt. Die Ratten wurden in einer vordefinierten zufälligen Reihenfolge in das zentrale Gitter platziert und die Häufigkeit des Überquerens des Gitters (Ratten betreten ein Gitter mit Gliedmaßen oder doppelten Vordergliedmaßen mit einem Hinterglied) und Häufigkeit der Aufzucht (Ratten heben Vordergliedmaßen und stehen aufrecht mit einem der Gliedmaßen) Hintergliedmaßen) wurden vom Video-Tracking-System aufgezeichnet. Dieser Test wurde in einer ruhigen und abgedunkelten Innenumgebung durchgeführt. Nach jedem Test wurde die Freifeldbox mit 75 % Alkohol gereinigt, um Gerüche zu entfernen.

Anhedonie war eines der entscheidenden Symptome einer Depression. Der Saccharose-Präferenztest (SPT) könnte das depressivähnliche Verhalten von Ratten bewerten. Vor der SPT erhielt jede Ratte 24 Stunden lang 2 Flaschen Zuckerwasser (1% Saccharose, w/w) und weitere 24 Stunden lang 1 Flasche steriles Wasser und 1 Flasche Zuckerwasser. Danach wurde der Saccharose-Präferenzprozentsatz (SPP) der Ratten wie folgt ermittelt:Nach 23-stündigem Fasten und Wasserentzug wurde den Ratten 30 Minuten lang 1 Flasche steriles Wasser und 1 Flasche Zuckerwasser (1% Saccharose) gegeben. Nach 1 h wurde die Position der beiden Flaschen umgekehrt und die Ratten waren für weitere 30 min frei von diesen beiden Flaschen. Während dieser 1 h wurde der Verbrauch (ml) dieser beiden Flaschen steriles Wasser und Zuckerwasser (1% Saccharose) gemessen und SPP berechnet. SPP = Zuckerwasserverbrauch/(Zuckerwasserverbrauch + steriler Wasserverbrauch) × 100%.

Der Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM) wurde in großem Umfang angewendet, um das räumliche Lernen und die Gedächtnisfähigkeit von Ratten zu bewerten. Der MWM-Test wurde in einem runden Wassertank (150 cm Durchmesser und 60 cm Höhe) mit einer Wassertiefe von 40 cm durchgeführt. Die Wassertemperatur wurde bei 22 ± 1 °C gehalten und das Wasser wurde mit ungiftigem und leicht zu reinigendem Farbstoff schwarz gefärbt. Der Tank und die Wasseroberfläche wurden in 4 Quadranten (SE-, SW-, NW- und NE-Quadranten) unterteilt, wobei jeder Quadrant mit seinem entsprechenden Symbol mit heller Farbe und besonderer Form an der Innenwand verziert war. Die Zielplattform war eine kreisförmige transparente Plattform (11 cm Durchmesser), die sich in der Mitte des NE-Quadranten befand und 1,5 cm unter der Wasseroberfläche lag. Über der Mitte des Tanks wurde ein Video-Tracking-System installiert, um die Schwimmgeschwindigkeit, den Weg und die Zeit aufzuzeichnen, die die Ratten damit verbracht haben, in die Zielplattform zu gelangen und in Quadranten zu schwimmen. Ratten wurden in zufälliger Reihenfolge aus 4 Quadranten ins Wasser gesetzt und sie durften die Zielplattform innerhalb von 60 s erkunden und an Bord gehen. Die Zeit, die Ratten brauchten, um die Plattform zu besteigen, wurde als Fluchtlatenz aufgezeichnet. Wenn Ratten die Zielplattform nicht innerhalb von 60 s betreten konnten, wurden sie geführt und die Fluchtlatenz wurde mit 60 s aufgezeichnet. Nach jedem Test durften die Ratten 15 s auf der Zielplattform bleiben, und die Ratten wurden 5 Tage lang 4-mal täglich trainiert. Die endgültige Escape-Latenz war der Durchschnitt der Escape-Latenz am 3.-5. Am 6. Tag des MWM-Tests wurde ein Weltraumforschungstest durchgeführt. Die Zielplattform wurde aus dem Wassertank entfernt und die Ratten betraten das Wasser aus dem SW-Quadranten. Die Zeit, in der Ratten innerhalb von 60 s im NE-Quadranten schwimmen, wurde als Weltraumerkundungszeit aufgezeichnet.

Die Zeitleiste dieses Experiments ist in Abb. 1 dargestellt.

Chronologie der vorliegenden Studie

Probensammlung

Einen Tag nach dem letzten MWM-Test wurden die Ratten euthanasiert und ihnen wurde 2% Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg) intraperitoneal injiziert. Die Brusthöhle wurde geöffnet, um Herzblut mit einer Spritze zu gewinnen, die 3 mal bei 3500 U/min für 15 min zentrifugiert wurde, und der Überstand wurde bei -20 °C gelagert. Nach der Blutentnahme wurde ein Katheter vom linken Ventrikel zur Aorta eingeführt und 500 ml normale Kochsalzlösung wurden perfundiert, um das Vollblut zu spülen. Hippocampus-Gewebe wurden abgetrennt und in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, gewogen und bei –80 °C gelagert. Ein Teil des Hippocampus wurde mit 4% Paraformaldehyd für 2 h fixiert, mit Gradient Saccharose dehydratisiert und in Paraffin eingebettet.

Erkennung von oxidativem Stress und Entzündungsindex

Das Serum wurde zum Nachweis von Superoxiddismutase (SOD), Malondialchehyche (MDA), Glutathion (GSH), Interleukin (IL)-β, Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Stickoxid (NO)-Konzentration erneut erwärmt. Kits zum Nachweis von SOD, MDA und GSH wurden vom Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China) bereitgestellt, während Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kits zum Nachweis von IL-β, TNF-α und NO vom NanJing JianCheng Bioengineering Institute ( Nanjing, China).

Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung

Die Paraffinschnitte wurden entwachst, mit Ethanol hydratisiert, mit destilliertem Wasser gespült und mit Hämatoxylin-Färbelösung 20 min gefärbt. Danach wurden die Schnitte mit Leitungswasser gespült, bis die Schnitte blau wurden. Anschließend wurden die Schnitte für 10 s in 1%ige ethanolische Salzsäurelösung gelegt, mit Leitungswasser gespült und mit Ethanol entwässert, gefolgt von 2 min Eosinfärbung, Dehydratisierung mit hochkonzentriertem Alkohol und Permeabilisierung in Xylol. Schließlich wurden die Schnitte versiegelt und unter einem biologischen Mikroskop betrachtet.

Neurotransmitter-Ausdruckserkennung

Die Hippocampusgewebe wurden gewogen und durch Ultraschall in normaler Kochsalzlösung (100 &mgr;l/10 mg) homogenisiert. Das Homogenisat wurde 30 min bei 4 °C gehalten, 3 min bei 12.000 U/min (4 °C) zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Die Proteinkonzentration des Überstands wurde mit dem Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinnachweis-Kit (CWBIO, Peking, China) und die Expressionsniveaus von Noradrenalin (NE), Serotonin (5-HT) und Dopamin (DA) mit ELISA-Kits nachgewiesen. NE-, 5-HT- und DA-ELISA-Kits wurden von Liweiping Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China) bereitgestellt.

Reverse Transkription Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

RNA wurde mit einem RNA-Extraktionskit (Promega, Madison, WI, USA) aus Hippocampus-Geweben extrahiert, und die Konzentration und Reinheit der RNA wurden mit einem Ultraviolett-Spektrophotometer nachgewiesen. Gefolgt von den Anweisungen des Reverse-Transkriptions-Kits (DRR047S, Takara, Dalian, China), wurde die RNA-Reverse-Transkription in komplementäre DNA (cDNA) durchgeführt. mRNA wurde mit dem GoldScript One-Step RT-PCR Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) revers in cDNA transkribiert, während miRNA mit dem Hairpin-it™ miRNA quantitativen Nachweiskit (GenePharma) revers transkribiert wurde. Das RT-qPCR-Nachweiskit (Promega) wurde verwendet, um die HDAC1-, miR-124-5p- und NPY-Expression in Geweben nachzuweisen. U6 wurde als interne Kontrolle für miR-124-5p angegeben, während β-Aktin für HDAC1 und NPY angegeben wurde. PCR-Primer wurden von Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) erhalten (Tabelle 1). Die relative Expression der Zielgene wurde mit 2 ^−△△ . berechnet Ct-Methode.

Western Blot-Analyse

Die Hippocampus-Gewebe wurden auf Eis in Stücke geschnitten und durch Radioimmunpräzipitationsassay-Lysat (Beijing Solarbio Science &Technology Co. Ltd., Peking, China) lysiert, um Protein zu extrahieren. Die Proteinkonzentration wurde durch die BCA-Methode bestimmt. Gesamtprotein (50 &mgr;g) wurde mit 5 × Natriumdodecylsulfat (SDS)-Ladepuffer im Verhältnis 1:4 versetzt und in einem siedenden Wasserbad 5 min erhitzt. Dann wurde das Protein einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, auf eine Membran elektrogeblottet und 1 h mit 5% Milch blockiert. Danach wurde das Protein mit den primären Antikörpern gegen HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), NPY (1:800, NeoMakers, Fremont, Kalifornien, USA) und β-Aktin (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, UK) über Nacht und erneut mit Meerrettichperoxidase-markiertem Sekundärantikörper sondiert. Die Membran wurde durch verstärkte Chemilumineszenz entwickelt und die optische Dichte wurde mit der Grauanalyse-Software Quantität One berechnet. Die Proteinexpression des Zielgens wurde als Verhältnis des Grauwerts zum β-Aktin-Grauwert ausgedrückt.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Assay

Der ChIP-Assay wurde gemäß den Anweisungen des EZ-ChIP-Kits (Millipore, Bedford, MA, USA) durchgeführt. HEK293T-Zellen wurden mit 1% Formaldehyd für 10 min inkubiert und durch Glycin terminiert. Dann wurden die Zellen bei 2000 Upm für 5 min zentrifugiert und mit SDS Lysis Buffer zur Ultraschallbehandlung versetzt. Zentrifugiert bei 10.000 g bei 4℃ für 10 min, wurden die Zellen (100 μL) mit 900 μL ChIP Dilution Buffer, 20 μL 50 × PIC und 60 μL ProteinA Agarose/Lachssperma DNA bei 4℃ für 1 h umgesetzt und wurden 10 min stehen lassen. Die Präzipitate wurden 1 min bei 700 U/min mit 20 &mgr;l als Input zentrifugiert. Ein Röhrchen wurde mit HDAC1-Antikörper (1 &mgr;l) und Immunglobulin-G-Antikörper hinzugefügt und das andere Röhrchen wurde ohne Antikörper hinzugefügt. Die Proben in den beiden Röhrchen wurden über Nacht inkubiert, eluiert und ent-quervernetzt. Nach der DNA-Wiederherstellung wurde die Probe durch RT-qPCR getestet.

Dualer Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Die Bioinformatik-Website (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) analysierte die Bindungsstellen von miR-124-5p und NPY. NPY-Wildtyp-(WT)- und NPY-Mutanten-(MUT)-Plasmide wurden von Huayueyang Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China) erzeugt. Kombiniert mit mimic NC oder miR-124-5p mimic wurden die Plasmide in HEK293T-Zellen transfiziert. Die Zell-Luciferase-Aktivität wurde mit dem Luciferase-Nachweiskit (BioVision) und dem Glomax20/20-Luminometer (Promega) bestimmt.

Statistische Analyse

Zur Datenanalyse wurde die Statistiksoftware SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) verwendet. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden von t . getestet Prüfung. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) ausgewertet, danach paarweise Vergleiche durch Tukeys Post-hoc-Test. P repräsentierte zweiseitige Tests und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant erachtet.

Ergebnisse

Hemmung von HDAC1 oder miR-124-5p erhöht das Gewicht depressiver Ratten

Die Ratten wurden 1 Tag vor der CUMS-Modellierung (Tag 0) gewogen, 1 Tag nach Beendigung der Modellierung (Tag 36) und 7 Tage nach der Lentiviren-Interferenz (Tag 52). Vor der Modellierung wurde kein Unterschied im Körpergewicht der Ratten in jeder Gruppe festgestellt (alle P> 0,05). Nach der Modellierung nahm das Rattengewicht in der CUMS-Gruppe, sh-NC-Gruppe, sh-HDAC1-Gruppe, Anti-miR-NC-Gruppe und Anti-miR-124-5p-Gruppe im Vergleich zur normalen Gruppe ab (alle P < 0,05). In der CUMS-Gruppe, der sh-NC-Gruppe, der sh-HDAC1-Gruppe, der Anti-miR-NC-Gruppe und der Anti-miR-124-5p-Gruppe (alle P> 0,05). Nach der Interferenz nahm das Gewicht der Ratten in der CUMS-Gruppe gegenüber der normalen Gruppe ab (alle P < 0,05). Es wurde keine Diskrepanz bezüglich des Rattengewichts in der CUMS-Gruppe, der sh-NC-Gruppe und der Anti-miR-NC-Gruppe festgestellt (alle P> 0,05). Das Rattengewicht erhöhte sich in der sh-HDAC1-Gruppe und der Anti-miR-124-5p-Gruppe im Vergleich zu ihren NC-Gruppen (beide P < 0,05), was darauf hindeutet, dass die Hemmung von HDAC1 oder miR-124-5p das Gewicht depressiver Ratten erhöhte (Abb. 2a).

Die Hemmung von entweder HDAC1 oder miR-124-5p erhöht das Gewicht und verbessert die Lern- und Gedächtnisfähigkeiten depressiver Ratten. a Auswirkungen der Hemmung mit HDAC1 oder miR-124-5p auf das Körpergewicht depressiver Ratten; b SPP vor und nach Hemmung mit HDAC1 oder miR-124-5p; c Häufigkeit des Überquerens des Gitters bei OFT vor und nach der Hemmung mit HDAC1 oder miR-124-5p; d Aufzuchthäufigkeit bei OFT vor und nach Hemmung mit HDAC1 oder miR-124-5p; e Escape-Latenz im MWM-Test vor und nach der Hemmung mit HDAC1 oder miR-124-5p; f Weltraumerkundungszeit im MWM-Test vor und nach Hemmung mit HDAC1 oder miR-124-5p; n = 10; ein P < 0,05 im Vergleich zur Normalgruppe; b P <0,05 im Vergleich zur sh-NC-Gruppe; c P < 0,05 im Vergleich zur Anti-miR-NC-Gruppe. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch Einweg-ANOVA ausgewertet, und paarweise Vergleiche durch Tukeys Post-hoc-Test

Hemmung von HDAC1 oder miR-124-5p verbessert die Lern- und Gedächtnisfähigkeiten bei depressiven Ratten

SPT-, OFT- und MWM-Tests wurden angewendet, um SPP, Häufigkeit des Überquerens des Gitters und Häufigkeit von Aufzuchten sowie Fluchtlatenz und Weltraumerkundungszeit zu erkennen. Es wurde skizziert, dass (Abb. 2b–f) vor der Interferenz im Vergleich zur Normalgruppe, SPP, die Häufigkeit des Überquerens des Gitters, die Häufigkeit der Aufzucht und die Weltraumerkundungszeit reduziert wurden, während die Fluchtlatenz in der CUMS-Gruppe verlängert wurde, sh-NC Gruppe, sh-HDAC1-Gruppe, Anti-miR-NC-Gruppe und Anti-miR-124-5p-Gruppe (alle P < 0,05), was auf die Entwicklung von depressionsähnlichen Verhaltensweisen bei Ratten hindeutet. Es gab keine Diskrepanz bei SPP, Häufigkeit des Überquerens des Gitters, Häufigkeit von Aufzucht, Weltraumerkundungszeit und Fluchtlatenz zwischen der CUMS-Gruppe, der sh-NC-Gruppe, der sh-HDAC1-Gruppe, der Anti-miR-NC-Gruppe und der Anti-miR-124 -5p Gruppe (alle P> 0,05). Nach der Interferenz erhöhte sich gegenüber der sh-NC-Gruppe und der Anti-miR-NC-Gruppe, SPP, die Häufigkeit des Überquerens des Gitters, die Häufigkeit der Aufzucht und die Zeit zur Erforschung des Weltraums, während die Fluchtlatenz in der sh-HDAC1-Gruppe und Anti-miR-124- verkürzt wurde. 5p-Gruppe (alle P < 0,05). Zwischen der CUMS-Gruppe, der sh-NC-Gruppe und der Anti-miR-NC-Gruppe (alle P> 0,05), was darauf hindeutet, dass das Stummschalten von HDAC1 oder die Unterdrückung von miR-124-5p depressionsähnliches Verhalten abschwächen und die Lern- und Gedächtnisfähigkeiten bei Ratten verbessern könnten.

Hemmung von HDAC1 oder miR-124-5p schwächt pathologische Neuronenschäden bei depressiven Ratten ab

Die Beobachtung von Hippocampus-Läsionen durch HE-Färbung (Fig. 3a) zeigte, dass die ordentlich angeordneten Neuronen im Hippocampus von Ratten in der normalen Gruppe eine klare Morphologie, normale Struktur, dichte Schichten, klare Zellkerne und offensichtliche Nukleolen zeigten. Die Neuronen der Ratten in der CUMS-Gruppe waren geschrumpft, zahlenmäßig verringert und locker angeordnet mit ungleichmäßig verteiltem Chromatin und verdünnter Schicht. Die Ratten in den Sh-NC- und Anti-miR-NC-Gruppen zeigten die gleiche Situation wie die CUMS-Gruppe. Die Ratten in den sh-HDAC1- und Anti-miR-124-5p-Gruppen zeigten im Vergleich zu ihren NC-Gruppen erhöhte Neuronen und eine abgeschwächte Schädigung. Es wurde darauf hingewiesen, dass der Knockdown von HDAC1 oder die Hemmung von miR-124-5p Hippocampus-Läsionen bei depressiven Ratten linderten.

Die Hemmung von entweder HDAC1 oder miR-124-5p schwächt pathologische Hippocampus-Schäden ab und reguliert die Neurotransmitter-Expression bei depressiven Ratten hoch. a HE-Färbung von Hippocampus-Läsionen depressiver Ratten; b ELISA der NE-Expression in Hippocampus-Geweben; c ELISA der 5-HT-Expression in Hippocampus-Geweben; d ELISA der DA-Expression in Hippocampus-Geweben; n = 6; ein P < 0,05 im Vergleich zur Normalgruppe; b P <0,05 im Vergleich zur sh-NC-Gruppe; c P < 0,05 im Vergleich zur Anti-miR-NC-Gruppe. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch Einweg-ANOVA ausgewertet, und paarweise Vergleiche durch Tukeys Post-hoc-Test

Hemmung von entweder HDAC1 oder miR-124-5p reguliert die Neurotransmitter-Expression bei depressiven Ratten

Depression war mit Neurotransmitter-Störungen des Gehirns verbunden. Daher wurden die Spiegel von DA-, NE- und 5-HT-Neurotransmittern im Hippocampus der Ratte durch ELISA gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass (Abb. 3b–d) bei der normalen Gruppe im Gegensatz dazu bei Ratten der CUMS-Gruppe, sh-NC-Gruppe, sh-HDAC1-Gruppe, anti-miR . reduzierte Spiegel von DA, NE und 5-HT gefunden wurden -NC-Gruppe und Anti-miR-124-5p-Gruppe (alle P < 0,05). Es wurde kein Unterschied in der Neurotransmitter-Expression in der CUMS-Gruppe, der sh-NC-Gruppe und der Anti-miR-NC-Gruppe beobachtet (alle P> 0,05). Im Vergleich zu den sh-NC- und anti-miR-NC-Gruppen stiegen die DA-, NE- und 5-HT-Spiegel bei Ratten der sh-HDAC1- und anti-miR-124-5p-Gruppen (alle P < 0,05), was impliziert, dass eine Herunterregulierung von HDAC1 oder eine Reduzierung von miR-124-5p die Spiegel von DA, NE und 5-HT im Hippocampus depressiver Ratten hochregulieren könnte.

Hemmung von HDAC1 oder miR-124-5p unterdrückt oxidativen Stress und Entzündungen bei depressiven Ratten

Die Expression von oxidativem Stress und Entzündungsfaktoren im Serum wurde gemessen. In Bezug auf die normale Gruppe waren die SOD- und GSH-Aktivitäten beeinträchtigt, während die MDA-, IL-1β-, TNF-α- und NO-Spiegel in den anderen Depressionsmodellgruppen (alle P < 0,05). SOD- und GSH-Aktivitäten und Spiegel von MDA, IL-1β, TNF-α und NO zwischen der CUMS-Gruppe, der sh-NC-Gruppe und der Anti-miR-NC-Gruppe zeigten keinen Unterschied (alle P> 0,05). In Bezug auf die sh-NC-Gruppe und die Anti-miR-NC-Gruppe wurde eine Zunahme der SOD- und GSH-Aktivitäten und eine Abnahme der MDA-, IL-1β-, TNF-α- und NO-Spiegel in der sh- HDAC1-Gruppe und Anti-miR-124-5p-Gruppe (alle P < 0,05) (Abb. 4a–f), was darauf hindeutet, dass eine Erschöpfung von HDAC1 oder eine Herunterregulierung von miR-124-5p oxidativen Stress und Entzündungen bei depressiven Ratten lindern könnte.

Die Hemmung von entweder HDAC1 oder miR-124-5p unterdrückt oxidativen Stress und Entzündungen bei depressiven Ratten. a –c Wirkung der Hemmung von entweder HDAC1 oder miR-124-5p auf die SOD-, MDA- und GSH-Konzentration im Serum depressiver Ratten; d –f Wirkung der Hemmung von entweder HDAC1 oder miR-124-5p auf die IL-1β-, TNF-α- und NO-Konzentration im Serum depressiver Ratten; n = 10; ein P < 0,05 im Vergleich zur Normalgruppe; b P <0,05 im Vergleich zur sh-NC-Gruppe; c P < 0,05 im Vergleich zur Anti-miR-NC-Gruppe. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch Einweg-ANOVA ausgewertet, und paarweise Vergleiche durch Tukeys Post-hoc-Test

HDAC1 vermittelt miR-124-5p zur Regulierung des NPY

RT-qPCR und Western-Blot-Analyse wurden zum Nachweis von HDAC1, miR-124-5p und NPY im Hippocampus verwendet. Es wurde dargestellt, dass (Abb. 5a, b) im Vergleich zur normalen Gruppe HDAC1 und miR-124-5p anstiegen und NPY in der CUMS-Gruppe (alle P < 0,05). HDAC1-, miR-124-5p- und NPY-Expression zeigten keine Variationen in der CUMS-Gruppe und der sh-NC-Gruppe (alle P> 0,05). Im Vergleich zur sh-NC-Gruppe zeigte sich die sh-HDAC1-Gruppe in verringerten HDAC1 und miR-124-5p und erhöhten NPY-Expressionswerten (alle P < 0,05). Die obigen Ergebnisse legten die erfolgreiche Lentivirus-Interferenz und die positive Beziehung zwischen miR-124-5p und HDAC1-Expression nahe.

HDAC1 vermittelt miR-124-5p, um NPY zu regulieren. a HDAC1-, miR-124-5p- und NPY-mRNA-Expression in Hippocampus-Geweben nach Hemmung von HDAC1 durch RT-qPCR (n = 6); b HDAC1- und NPY-Proteinexpression in Hippocampusgeweben nach Hemmung von HDAC1 durch Western-Blot-Analyse (n = 6); c MiR-124-5p- und NPY-mRNA-Expression in Hippocampus-Geweben nach Hemmung von miR-124-5p durch RT-qPCR (n = 6); d NPY-Proteinexpression in Hippocampus-Geweben nach Hemmung von miR-124-5p durch Western-Blot-Analyse (n = 6); ein P < 0,05 im Vergleich zur Normalgruppe; c P < 0,05 im Vergleich zur sh-NC-Gruppe. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch Einweg-ANOVA ausgewertet, und paarweise Vergleiche durch Tukeys Post-hoc-Test

Außerdem wurden miR-124-5p- und NPY-Expression nach miR-124-5p-Suppression nachgewiesen, wobei die Ergebnisse (Abb. 5c, d) zeigten, dass in Bezug auf die normale Gruppe erhöhtes miR-124-5p und reduziertes NPY in vorlagen die CUMS-Gruppe (beide P < 0,05). Im Gegensatz dazu tendierte die Anti-miR-124-5p-Gruppe zu verringertem miR-124-5p und erhöhtem NPY im Vergleich zur Anti-miR-NC-Gruppe (beide P < 0,05). Es wurde keine Diskrepanz in der miR-124-5p- und NPY-Expression in der CUMS-Gruppe und der Anti-miR-NC-Gruppe festgestellt (beide P> 0,05). Die Ergebnisse waren ein Hinweis auf die erfolgreiche Lentivirus-Interferenz und den negativen Zusammenhang zwischen NPY und miR-124-5p.

Der ChIP-Assay sollte testen, ob HDAC1 an den miR-124-5p-Promotor binden konnte, und die Ergebnisse zeigten, dass (Abb. 6a, b) HDAD1 nur mit dem miR-124-5p-Promotor (P < 0,001), was darauf hinweist, dass HDAC1 miR-124-5p direkt regulieren könnte.

HDAC1 bindet an den Promotor von miR-124-5p. a Bindungshäufigkeit von HDAC1 und miR-124-5p-Promotorregion in HEK293T-Zellen durch ChIP-Assay (n = 3); b Bindungshäufigkeit von HDAC1 und nicht verwandten intergenischen Regionen in HEK293T-Zellen durch ChIP-Assay (n = 3); c MiR-124-5p und NPY-Bindungsstelle von der Website für biologische Informationssoftware; d Targeting-Beziehung zwischen miR-124-5p und NPY durch dualen Luciferase-Reportergen-Assay (n = 3); Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden von t . getestet testen

Die Targeting-Beziehung zwischen miR-124-5p und NPY wurde vorhergesagt und durch das RNA22-Tool und den dualen Luciferase-Reportergen-Assay verifiziert ( 6c , d). With respect to the cells co-transfection with NPY-3′UTR-WT and mimic NC, the cells with co-transfection of NPY-3′UTR-WT and miR-124-5p mimic showed impaired luciferase activity (P < 0,05). No difference was recognized in the luciferase activity in the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and mimic NC, and the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and miR-124-5p mimic (P  > 0.05).

Knockdown of NPY Abolishes the Protective Effects of Inhibited miR-124-5p on Depressed Rats

Spontaneous depletion of NPY and miR-124-5p was programmed to explore their interplay in depressed rats. It was exhibited that (Fig. 7a, b) lower NPY expression level was noticed in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (P < 0,05). Body weight and behavioral function tests illustrated that (Fig. 7c–f) by comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group presented reduced weight, SPP, frequency of crossing the grid, incidence of rearing and space exploration time with increased escape latency (all P < 0,05). HE staining of the hippocampal lesions pictured that (Fig. 8a) in comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the number of hippocampal neurons was reduced, and hippocampal neurons were darkly stained, sparsely and disorderly arranged in an irregular shape with reduced cell layers in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group. Moreover, versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group was accompanied by reduced DA, NE and 5-HT (all P  < 0.05) (Fig. 8b). Besides, impaired SOD and GSH activities, and increased MDA, IL-1β, TNF-α and NO levels existed in the rats of the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (all P  < 0.05) (Fig. 8c, d). Collectively, knockdown of NPY abolished the protective effects of repressed miR-124-5p on depressed rat.

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on body weight and behavioral function of depressed rats. a MiR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by RT-qPCR (n = 6); b NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by western blot analysis (n = 6); c Body weight of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); d SPP of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); e Frequency of crossing the grid and incidence of rearing after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); f Escape latency and space exploration time after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); Comparisons between two groups were tested by t testen

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on hippocampal damages of depressed rats. a HE staining of hippocampal lesions of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); b ELISA of NE, 5-HT and DA expression in hippocampal tissues of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 6); C. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on SOD, MDA and GSH concentration in serum (n  = 10); D. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on IL-1β, TNF-α and NO concentration in serum (n = 10). Comparisons between two groups were tested by t testen

Discussion

Depression is a type of psychiatric disorder comprising a variety of conditions with diverse symptoms [20]. Though emerging studies have implied the role of miRNAs in depression, the precise action of miR-124-5p has been rarely investigated. Hence, the present study is projected for better comprehension of the mechanism of miR-124-5p/HDAC1/NPY axis in depression with the major outcome elaborating that silencing of either HDAC1 or miR-124-5p up-regulated NPY to improve memory and learning abilities of depressed rats.

To begin with, this study discovered HDAC1 expression in hippocampal tissues with the findings suggesting the elevation in the HDAC1 expression. Subsequently, with the purpose to decipher the functional roles of HDAC1 in depressed rats, loss-of-function assays were performed and it was disclosed that knockdown of HDAC1 increased the body weight, improved learning and memory abilities, attenuated pathological damage, up-regulated neurotransmitter expression, and suppressed oxidative stress and inflammation in depressed rats. Currently, a study has implied an increment in the expression of HDAC1 in depressive-like and anxiety-like phenotypes resulted by stress-offspring [21]. Moreover, the expression of HDAC1 is documented to up-regulate in penumbra in photothrombotic stroke [22]. Besides that, the incremental HDAC1 mRNA expression is found in granule and pyramidal cells in temporal lobe epilepsy [23]. As to the functional role of HDAC1, it has been reported that virus-mediated overexpression of neuronal HDAC1 in the hippocampus of mice imposes influences on loss of contextual fear memory in particular [24]. Mechanically, HDAC inhibitors reverse cognitive deficits found in neurodegenerative diseases and age-related memory loss [25]. Actually, it is accepted that the HDAC1 suppression by tianeptinaline has advanced neuroplasticity and reinforced memory [26]. As mentioned in a prior study, it is concluded that repression of HDAC1 inhibits the pathogenic processes that lead to motor neuron degeneration in mitochondrial diseases [27]. Experimentally, the silencing of HDAC1 by 5-thienyl-substituted 2-aminobenzamide-type is partially involved in the prevention of neuronal cell death in Parkinson's disease models [28]. Further supported by those researches, the protective effects of silenced HDAC1 have been witnessed in brain diseases, including but not limited to depression.

Then, our study discovered a targeting relationship between HDAC1 and miR-124-5p, which was supported by a prior study which suggests miR-124 transcription is in the charge of EVI1, acting by connection with the deacetylase HDAC1 [29]. miR-124-5p was the overexpressed gene in depressed rats and knockdown of miR-124-5p had the similar functions of silenced HDAC1 in depressed rats. In fact, there is a study indicating that the expression of miR-124 in the hippocampus is up-regulated from 5 to 6 weeks in depression-like behavior phenotypes [7]. Another study has identified the increase in the miR-124 expression in female with cocaine use disorder [30]. Also, it is previously described that miR-124-3p is highly expressed in stressed rodents in major depressive disorder [31]. Regarding to the effects, knockdown of miR-124 in the prefrontal cortex is reported to attenuate depression-like behavior of mice [9]. Besides that, miR-124 knockdown is believed to serve as an antidepressant agent of chronic corticosterone-induced gypenosides in mice [32]. Drawn from a prior study, knockdown of miR-124 can result in improved behavioral susceptibility to a milder stress paradigm [33]. It is reported that suppression of miR-124 by lentivirus transfection in the hippocampus can protect ketamine-induced neurodegeneration in vivo and in vitro [34]. Anyway, miR-124-5p suppression is an active actor to attenuate depression.

Furthermore, NPY expression was verified to be regulated by HDAC1 and miR-124-5p. The deteriorated deficits associated with HDAC2 in histone acetylation may be related to the decreased expression of NPY and can used to control anxiety-like and drinking behaviors [14]. NPY was down-regulated in depressed rats and up-regulation of NPY promoted learning and memory ability recovery in depressed rats. In the development of depressive-like behaviors, the rat models are manifested with reduced NPY expression [17]. Academically, the expression of NPY is evidenced to decline in mice with depression [35]. Consistently, the above-mentioned study findings are as same as the previous literature to some extent.

The novel findings of study suggested that inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities and increased body weight of depressed rats. In addition, knockdown of miR-124-5p or inhibition of HDAC1 suppressed oxidative stress and inflammation and promoted neurotransmitter expression of depressed rats. Moreover, HDAC1 mediated miR-124-5p to regulate NPY. In the rescue experiments, knockdown of NPY abolished the protective effects of inhibited miR-124-5p on depressed rats.

Conclusion

In summary, this study highlighted the effect of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression with the major findings suggesting inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities, increased body weight, suppressed oxidative stress and inflammation, as well as promoted neurotransmitter expression in depressed rats. HDAC1/miR-124-5p/NPY axis may provide a reference to treat neurological disorder, which may also update the existed knowledge of depression. However, further studies are still required for thorough comprehension of the complex mechanism of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Not applicable.

Abkürzungen

miR-124-5p:

MicroRNA-124-5p

HDAC1:

Histone deacetylase 1

NPY:

Neuropeptide Y

CUMS:

Chronic unpredictable mild stress

SD:

Sprague–Dawley

SPF:

Specific pathogen-free

NC:

Negative control

OFT:

Open field test

SPT:

Sucrose preference test

SPP:

Sucrose preference percentage

MWM:

Morris water maze test

SOD:

Superoxide dismutase

MDA:

Malondialchehyche

GSH:

Glutathion

IL-β:

Interleukin-β

TNF-α:

Tumor necrosis factor-α

NO:

Nitric oxide

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

HE:

Hematoxylin–eosin

BCA:

Bicinchoninic acid

NE:

Norepinephrine

5-HT:

Serotonin

DA:

Dopamin

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

cDNA:

Complementary DNA

SDS:

Natriumdodecylsulfat

ChIP:

Chromatin immunoprecipitation

UTR:

Untranslated region

MUT:

Mutant type

WT:

Wild type

ANOVA:

One-way analysis of variance