Resveratrol-beladene Albumin-Nanopartikel mit verlängerter Durchblutung und verbesserter Biokompatibilität für eine hochwirksame gezielte Pankreastumortherapie

Hintergrund

Bauchspeicheldrüsenkrebs stellt eine verheerende Krankheit mit einer medianen Überlebenszeit von weniger als 6 Monaten und einer 5-Jahres-Überlebensrate von nur 6 % dar [1]. Die traditionelle klinische Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist die chirurgische Exzision, Strahlentherapie und Chemotherapie [2, 3]. Diese Methoden können jedoch durch schwerwiegende Nebenwirkungen wie die Ausbreitung von Krebszellen nach unvollständiger Exzision, schwere Toxizität für normale Zellen während der Strahlentherapie und schlechte Überlebensraten eingeschränkt sein [4]. Obwohl auch geringe Zielwirkungen und hohe Nebenwirkungen den Nutzen von Krebsmedikamenten in der Chemotherapie eingeschränkt haben, werden zunehmend neue Chemotherapeutika entwickelt. Abgesehen von synthetischen Medikamenten haben sich viele chinesische Kräuterextrakte als wirksam gegen bestimmte Krebsarten erwiesen. Resveratrol (RV), ein natürliches Extrakt aus Pflanzen wie Weintrauben und Sojabohnen [5], hat eine breite Wirkung bei der Thrombozytenaggregation und der Hemmung der Vasodilatation und der Verringerung der Blutviskosität [6, 7]. In den letzten Jahrzehnten wurde auch festgestellt, dass es bei einigen Krebsarten wie Leber-, Brust- und Eierstockkrebs große krebshemmende Wirkungen hat [8, 9]. Die Verwendung von RV als potenzielles Krebsmedikament hat jedoch einige Nachteile für die weitere klinische Anwendung, wie z. B. schlechte Löslichkeit, geringe Durchblutung und mangelnde Selektivität [4, 10].

Unter der Prämisse, die strukturelle Integrität des Arzneimittels zu schützen, hat die Verkapselungsstrategie das Interesse vieler Forscher geweckt, die nachweislich einige der oben genannten Nachteile im Vergleich zu herkömmlichen „freien“ Arzneimitteln effektiv überwindet [11]. Zum Beispiel kann es die schlechte Löslichkeit und geringe Bioverfügbarkeit verbessern, die schnelle renale Clearance verringern und die Zellselektivität erhöhen [12]. Derzeit werden viele Verkapselungsmethoden wie Liposomen, polymerbasierte Nanopartikel, Hydrogele und Serumalbumin verwendet [13,14,15,16]. Unter diesen Methoden hat sich die Verwendung von Serumalbumin zu einem der aufregendsten Träger entwickelt, um unlösliche Anti-Krebs-Medikamente zu verabreichen. Humanes Serumalbumin (HSA), ein körpereigenes Protein, ist nicht toxisch, zeigt keine Immunogenität und weist eine hohe Biokompatibilität auf [17]. Es wird häufig als makromolekularer Proteinträger für die Wirkstoffabgabe verwendet [18]. Somit ist HSA in der Lage, die Löslichkeit von lipophilen Arzneimitteln zu verbessern. Darüber hinaus erleichtert das Vorhandensein funktioneller Carboxyl- und Aminogruppen auf der Oberfläche die Oberflächenfunktionalisierung für Albumin-Nanopartikel [19, 20]. Über kovalente Bindung kann beispielsweise die Oberfläche von Albumin-Nanopartikeln mit Fluoreszenzfarbstoffen, Zielmolekülen und funktioneller RNA dekoriert werden [21, 22]. Außerdem kann es leicht mit hydrophilen Polymeren wie PEG funktionalisiert werden, um die Blutzirkulation zu verlängern [23].

In dieser Studie wird HSA verwendet, um lipophiles RV als Nanowirkstoff zu verkapseln, der mit einem auf Tumor gerichteten Molekül Arginin-Glycin-Aspartat (RGD) über eine PEG-„Brücke“ (HRP-RGD-NPs) oberflächenfunktionalisiert ist. Die präparierten HRP-RGD-NPs zeigen eine hervorragende In-vitro- und In-vivo-Biokompatibilität und eine verlängerte Blutzirkulation. Die Zellaufnahme und die In-vivo-Bioverteilung von Tumoren wurden ebenfalls evaluiert, um ihr Targeting-Potenzial in PANC-1-Zellen zu validieren. Darüber hinaus wurde die gezielte Anti-Krebs-Wirksamkeit von HRP-RGD-NPs in vitro und in vivo untersucht. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass HRP-RGD-NPs eine vielseitige Nanoplattform für potenzielle Tumortherapeutika zur gezielten Chemotherapie-Anwendung sein könnten.

Methoden

Materialien

Humanserumalbumin (HSA, lyophilisiertes Pulver, ≥96%), Resveratrol (RV, ≥99%), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Arg-Gly-Asp (RGD, ≥97%), 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure N -Hydroxysuccinimidester (SPDP), Hoechst 33258 Farbstoff und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) erhalten. NH₂ –PEG₂₀₀₀ –COOH wurde von Seebio Biotech Inc. (Shanghai, China) gekauft. N -Succinimidyl S -Acetylthioacetat (SATA) wurde von Pierce Biotech Inc. (Rockford, IL, USA) bezogen. DMSO, Trypsin-EDTA-Lösung, Phosphatpuffer (PBS), fötales Rinderserum (FBS), Penicillin-Streptomycin-Lösung und DMEM-Medien wurden von Sigma bezogen.

Synthese von HSA-RV-Nanopartikeln

HSA-RV-Nanopartikel wurden durch eine einfache Desolvatationsmethode synthetisiert [24]. Im Detail wurden 6 mg RV in DMSO zu 1 mg/ml gelöst und mit 10 mg HSA in 1 ml Wasser unter leichtem Rühren vermischt, wobei nach 6 h Rühren bei Raumtemperatur gehärtete Koazervate gebildet wurden, und dann im Kreuzverfahren verarbeitet -Verknüpfung mit 0,5 % Glutaraldehyd (100 μL). Anschließend wurden die organischen Lösungsmittel durch eine eintägige Dialyse in Wasser entfernt, was zu den HSA-RV-Nanopartikeln führte. Leere HSA-Nanopartikel wurden wie oben erwähnt hergestellt, außer dass DMSO ohne RV 6 h lang mit HSA-Lösung gemischt wurde.

Synthese und Charakterisierung von HRP-RGD-NPs

HSA-RV-Nanopartikel wurden mit HS-PEG-RGD durch den traditionellen Crosslinker SPDP konjugiert, wie in der Literatur beschrieben [25]. Kurz gesagt, 20 mg NH₂ –PEG₂₀₀₀ –COOH wurde 3 h mit 2 mg SATA behandelt und durch Entsalzen gereinigt. Das resultierende SATA-PEG wurde 3 h lang zu 10 mg RGD-Peptid und 8 mg EDC gegeben. Das SATA-geschützte PEG-RGD wurde dann 3 h lang mit 1 ml Hydroxylamin in Natriumphosphat umgesetzt. Nach der Reinigung durch Entsalzung erhielt es das HS-PEG-RGD. Als nächstes wurde das erhaltene HS-PEG-RGD über Disulfidbrücken mit HSA-RV-Nanopartikeln konjugiert. Kurz gesagt, die Aminogruppen der HSA-RV-Nanopartikel wurden zuerst durch SPDP aktiviert und dann in 10 mL PBS resuspendiert und mit überschüssigem HS-PEG-RGD oder HS-PEG für 24 h umgesetzt. Die resultierende Lösung wurde wiederholt mit PBS gewaschen und durch einen Millipore-Filter (100 kDa) filtriert, um verbleibendes PEG-RGD und andere organische Lösungsmittel zu entfernen, was zu HRP-RGD-NPs führte. Die Morphologie und Größe der Nanopartikel wurden durch Rasterelektronenmikroskopie (REM, Philips XL-30 FEG, Eindhoven, Niederlande) bzw. ein Zetasizer Nano ZS-System (Malvern Instruments, Malvern, UK) nachgewiesen. Absorptionsspektren wurden mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UV1800, Shimadzu, Japan) aufgenommen. Fluoreszenzspektren wurden mit einem Fluoreszenzspektrometer (F-4500, Hitachi, Japan) aufgenommen.

Laden und Freigeben von Medikamenten

Sechs Milligramm RV wurden in DMSO zu 1 mg/ml gelöst und mit 10 mg HSA in 1 ml Wasser unter leichtem Rühren gemischt, wodurch nach 6 h Rühren bei Raumtemperatur gehärtete Koazervate gebildet wurden, die dann durch Vernetzung verarbeitet wurden mit 0,5 % Glutaraldehyd (100 μl). Danach wurden die organischen Lösungsmittel und das freie RV durch 1 Tage Dialyse in Wasser entfernt. Das Dialysat wurde verwendet, um den freien RV mit einem UV-Vis-Spektrometer bei 306 nm gemäß einer Kalibrierungskurve zu quantifizieren. Die Arzneimittelmenge in HRP-RGD-NPs war das gesamte hinzugefügte RV minus der Menge an freiem RV.

Die RV-Freisetzung aus HRP-RGD-NPs wurde über eine dynamische Dialysetechnik (Dialysebeutel mit einem Cutoff-Mw von 8–12 kDa) bei pH 5,0, 7,4 bzw. 9,0 PBS bei 37 °C nachgewiesen. Die Arzneimittelkonzentration wurde unter Verwendung einer Standardkalibrierungskurve berechnet. Die Verkapselungseffizienz = W ₁ /W ₂ × 100 %, wobei W ₁ stellt das Gewicht von RV in HRP-RGD-NPs dar und W ₂ ist das Gewicht des RV hinzugefügt. Kumulative Veröffentlichung = W _a /W _b × 100 %, wobei W _a stellt die Menge an freigesetztem RV dar und W _b ist das gesamte RV, das in HRP-RGD-NPs vorhanden ist.

In-vitro-Hämolyse-Assay

Der In-vitro-Hämolyse-Assay wurde wie in früheren Arbeiten beschrieben durchgeführt [26]. Im Detail wurden 0,2 ml rote Blutkörperchen (RBCs, in PBS) mit 0,8 ml HRP-RGD-NPs (in PBS) in vorbestimmten Konzentrationen (10, 50, 100 und 200 μg/ml) gemischt. Mit entionisiertem Wasser oder PBS inkubierte Erythrozyten wurden als positive bzw. negative Kontrolle eingesetzt. Nach der Inkubation bei 37 °C für 3 Stunden wurde der obige Satz von Suspensionen bei 10.000 U/min 1 Minute lang zentrifugiert und die Absorption der Überstände bei 541 nm wurde mit einem UV-Vis-Spektrometer überwacht. Hämolytisches Verhältnis = (OD_t − OD_nc )/(OD_Stk − OD_nc ) × 100 %, wobei OD_t , OD_pc , und OD_nc sind die Extinktion des Überstands der Testprobe bzw. der Positiv- und Negativkontrollen.

Zellkultur

Humane Pankreastumor-PANC-1-Zellen wurden von der Cell Bank of Type Culture Collection der Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) erworben und in DMEM-Medien, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, in einem befeuchteten Inkubator (5 % CO₂ ) bei 37 °C.

Mobilfunkaufnahme

Für die zelluläre Aufnahme wurde FITC verwendet, um die HRP-RGD-NPs zu markieren. PANC-1-Zellen hafteten an Glasobjektträgern in 6-Well-Platten und wurden mit HRP-NPs, HRP-RGD-NPs + freie RGD-Blockierung und HRP-RGD-NPs bei derselben Konzentration an markiertem FITC jeweils 5 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit 0,2 ml Glutaraldehyd fixiert, gefolgt von einer 10 Minuten langen Färbung mit DAPI. Die Fluoreszenzbilder der Zellen wurden mit dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop (Leica TCS SP8 CARS, Wetzlar, Deutschland) aufgenommen.

Darüber hinaus wurden die Aufnahmeverhältnisse von HRP-NPs, HRP-RGD-NPs + freie RGD-Blockierung und HRP-RGD-NPs bei gleicher Konzentration an markiertem FITC durch PNAC-1-Zellen mittels Durchflusszytometrie (FCM, FACSCalibur, FACSCanto II) analysiert. durch Messung der FITC-Fluoreszenz. Zehntausende Zellen wurden für jede FCM-Analyse aufgezeichnet. Die FITC-Fluoreszenz wurde mit einem 488-nm-Laser angeregt.

In-vitro-Zytotoxizität

Die Zytotoxizität von HP-RGD-NPs, den Trägern von RV, wurde unter Verwendung eines Standard-Zellzähl-Kit-8 (CCK-8)-Assays (Bestbio, China) bestimmt. PNAC-1-Zellen (1 × 10 ⁵ Zellen/ml, 0,5 ml) wurden in 96-Well-Platten ausgesät und für 24 h kultiviert. Nach dem Verwerfen der alten Medien wurden frische Medien mit 10, 50, 100 und 200 μg/ml HRP-RGD-NPs 24 h mit PNAC-1-Zellen inkubiert. PBS wurde verwendet, um die Zellen dreimal mild zu waschen. Eine 100 μl CCK-8-Arbeitslösung (10 % CCK-8 + 90 % DMEM) wurde dann in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 0,5 h. Der Absorptionswert bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Infinite 200 Pro, Tecan, Österreich) erfasst. Darüber hinaus wurde die In-vitro-Krebswirksamkeit von RV (gelöst in DMSO), HRP-NPs und HRP-RGD-NPs mit derselben RV-Konzentration gegen PNAC-1-Zellen durch den oben erwähnten CCK-8-Assay bewertet. Alle Experimente wurden viermal durchgeführt. Zusätzlich wurde die morphologische Untersuchung auf Apoptose durch Hoechst 33258-Färbung nachgewiesen. Die Fluoreszenz von Hoechst 33258 in Zellen wurde beobachtet und mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop aufgezeichnet.

Tiermodell

Balb/c-Nacktmäuse, 4–5 Wochen, wurden von Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Verwaltungsbüro für Labortiere der Medizinischen Universität Taishan genehmigt. Subkutane Tumor-Xenotransplantat-Modelle wurden in der rechten Rückenregion von Mäusen durch Injektion von 1 × 10 ⁶ . etabliert PNAC-1-Zellen pro Maus und wenn die Tumoren ein Volumen von etwa 80 mm ³ . aufwiesen , wurden diese Mäuse zufällig in verschiedene Gruppen (n = 5) zur weiteren Verwendung.

Blutzirkulation und Tumorbioverteilung

Den normalen Mäusen wurden RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs intravenös injiziert. Anschließend wurden Blutproben zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus dem Orbitalplexus entnommen. Jede Blutprobe wurde in 900 μl Lysepuffer gelöst. Die Konzentration von RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs im Blut wurde durch RV-Absorptionsspektren jeder solubilisierten Blutprobe mit einem UV-Vis-Spektrometer bestimmt. Die Probenkonzentrationen sind als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (ID%/g) definiert.

Die Bioverteilung im Tumor wurde in tumortragenden Mäusen durchgeführt. Die Tumorgewebe wurden gewogen und über Nacht 24 h nach der intravenösen Injektion von RV-, HRP-NPs bzw. HRP-RGD-NPs mit Königswasserlösung verdaut. Die Konzentration von RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs im Tumor wurde durch RV-Absorptionsspektren jedes solubilisierten Tumorgewebes mit einem UV-Vis-Spektrometer bestimmt. Die Probenkonzentrationen sind als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (ID%/g) definiert.

In-vivo-Wirksamkeit gegen Krebs

Den Mäusen verschiedener Gruppen wurden intravenös Kochsalzlösung, RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs injiziert (die Dosis entspricht RV, n = 5, 10 mg/kg). Während der Behandlung wurden die Tumorgröße und das Körpergewicht der tumortragenden Mäuse alle 3 Tage überwacht. Das Tumorvolumen wurde nach folgender Formel berechnet:V = (Länge × Breite ² )/2. Relatives Tumorvolumen = V /V ₀ , wobei V ₀ war das Tumorvolumen vor der Erstbehandlung.

Histologische Untersuchung

Gesunden Balb/c-Nacktmäusen verschiedener Gruppen wurde intravenös Kochsalzlösung (Kontrolle), RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs (die Dosis entspricht RV, n = 5,5 mg/kg). Nach 35 Tagen wurden die Mäuse getötet und Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere wurden entnommen. Die erhaltenen Hauptorgane wurden über Nacht mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden diese Organe in 25 % Saccharose dehydriert, in 5 μm-Scheiben geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop abgebildet.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von HRP-RGD-NPs

Nach einer einfachen Desolvatationsmethode [24] wurde RV von HSA verkapselt, was zu HSA-RV-Nanopartikeln führte. Danach wurde die Oberfläche von HSA-RV-Nanopartikeln kovalent mit HS-PEG-RGD durch den traditionellen Vernetzer SPDP [25] funktionalisiert, wodurch HRP-RGD-Nanokomposit-NPs gebildet wurden. Die HRP-NPs und HRP-RGD-NPs zeigten eine unimodale und enge Partikelgrößenverteilung (Abb. 1a, b). Nach der Konjugation von RGD auf der Oberfläche von HRP-NPs erhöhte sich die durchschnittliche Größe der Nanopartikel von 113 ± 3,1 nm auf 120 ± 2,6 nm. Darüber hinaus wiesen HRP-NPs und HRP-RGD-NPs eine homodisperse kugelförmige Morphologie auf (Abb. 1c, d).

Partikelgrößenverteilung von HRP-NPs (a ) und HRP-RGD-NPs (b ). REM-Bilder von HRP-NPs (c ) und HRP-RGD-NPs (d )

UV-Vis- und Fluoreszenzspektren wurden aufgenommen, um das Vorhandensein von RV in HRP-RGD-NPs zu bestätigen. Wie in Abb. 2a gezeigt, wiesen HRP-NPs und HRP-RGD-NPs Absorptionspeaks für RV bei 304 nm auf, was auf das Vorhandensein von RV in beiden Nanopartikeln hinweist. Darüber hinaus zeigten HRP-NPs und HRP-RGD-NPs RV-Fluoreszenzsignale bei einer Anregungswellenlänge von 325 nm, was mit den Fluoreszenzspektren von RV übereinstimmt (Abb. 2b). Diese Ergebnisse zeigen, dass RV seine optischen Eigenschaften nach Konjugation an HRP-NPs und HRP-RGD-NPs behält.

a Die Absorptionsspektren von freien RV-, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs. b Die Fluoreszenzspektren von freien RV-, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs

RV Laden und Freigeben

Abbildung 3a zeigt die Änderungskurve der Einkapselungseffizienz von RV in HRP-RGD-NPs bei steigender RV-Konzentration. Die maximale RV EE der erhaltenen HRP-RGD-NPs betrug 62,5 ± ± 4,21 %. Darüber hinaus zeigten HRP-RGD-NPs, wie in Abb. 3b zu sehen, die höchste RV-Freisetzungsrate von 58,4,2 ± 2,8 % nach 60 h bei 37 °C und pH 5,0 im Vergleich zur Freisetzungsrate bei pH 6,5, pH 7,4. und pH 9,0 bei 37 °C. Es wurde berichtet, dass der normale pH-Wert des Blutes 7,4 beträgt, während Tumorgewebe leicht sauer ist [27]. Dies erweist sich als vorteilhaftes Merkmal der Verwendung von HRP-RGD-NPs in der Tumortherapie.

a RV-Einkapselungseffizienz als Funktion der zugesetzten RV-Konzentrationen. b In-vitro-Freisetzungsprofil von RV aus HRP-RGD-NPs bei pH 5,0, 6,5, 7,4 und 9,0 bei 37 °C

In-vitro-Biokompatibilität

Abbildung 4a, b zeigt Bilder von in DMSO gelösten RV- und HRP-RGD-NPs in PBS bei 4 °C nach 7 Tagen. Ersteres zeigt feste Materie wie nadelförmige Kristalle, während letzteres viele mikro- und homodisperse kugelförmige Partikel aufweist, was auf die verbesserte Stabilität von RV nach Verkapselung durch HSA-Nanopartikel hinweist. Darüber hinaus zeigte die durchschnittliche Größe von HRP-RGD-NPs in Wasser, DMEM, PBS und FBS über 4 Wochen fast keine Variation (Abb. 4c), was die hohe kolloidale Stabilität von HRP-RGD-NPs demonstriert, die höchstwahrscheinlich auf PEG und zurückgeführt wird HSA-Kapselung.

Das Mikroskopbild von a freies RV (gelöst in DMSO) in PBS und b HRP-RGD-NPs in PBS nach 7 Tagen. c Kolloidstabilitätstest von HRP-RGD-NPs in verschiedenen Medien (Wasser, DMEM, PBS und FBS). d Die RV-Fluoreszenzstabilität in HRP-RGD-NPs nach 4 Wochen. e Hämolyseverhältnis von Erythrozyten nach 1 h Inkubation mit HRP-RGD-NPs in verschiedenen Konzentrationen. Der Einschub zeigt das Foto von Erythrozyten, die destilliertem Wasser, PBS und HRP-RGD-NPs mit unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt waren, gefolgt von Zentrifugation

Abbildung 4d zeigt die Fluoreszenzstabilität von RV- und HRP-RGD-NPs in wässriger Lösung bei 4 °C. Nach 4 Wochen Lagerung blieb die RV-Fluoreszenzintensität von HRP-RGD-NPs bei mehr als 96,8 % ihrer ursprünglichen Intensitäten; die Fluoreszenz von RV fiel jedoch schnell auf 12,1 % der ursprünglichen Intensität ab, wahrscheinlich aufgrund der RV-Präzipitation aus der Lösung [10], was weiter auf die Stabilität von HRP-RGD-NPs im Vergleich zu freiem RV hinweist. Darüber hinaus wurde, wie in Abb. 4e gezeigt, kein signifikantes Hämolysephänomen für mit HRP-RGD-NPs behandelte Erythrozyten unter 200 μg/ml festgestellt, ähnlich wie bei der mit PBS behandelten Negativkontrollgruppe, was die ausgezeichnete Hämokompatibilität von HRP-RGD-NPs veranschaulicht. . Diese Ergebnisse legen nahe, dass die HSA-Verkapselung die Stabilität und In-vitro-Biokompatibilität von RV verbessert, was für biomedizinische Anwendungen von Vorteil ist.

Mobilfunkaufnahme

HRP-NPs und HRP-RGD-NPs wurden von FITC markiert. Wie in Abb. 5a gezeigt, zeigten die Kerne blaue Fluoreszenz, die durch DAPI gefärbt wurden. In der perinukleären Region von PANC-1-Zellen, die mit HRP-RGD-NPs behandelt wurden, wurde eine intensive grüne Fluoreszenz (FITC-Signal) beobachtet, die zeigt, dass eine ausreichende Menge an HRP-RGD-NPs in das Zytoplasma gelangt ist. Im Gegensatz dazu wurde in HRP-NPs-behandelten PANC-1-Zellen sehr wenig grüne Fluoreszenz gezeigt. Darüber hinaus zeigten mit freiem RGD vorbehandelte PANC-1-Zellen auch eine schwache grüne Fluoreszenz, die wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass der RGD-Rezeptor auf der PANC-1-Oberfläche durch freies RGD blockiert wird. Das zelluläre Aufnahmeverhältnis der Nanopartikel wurde durch FCM nachgewiesen und betrug 16,2 ± 4,9 %, 7,1 ± 5,1 % und 58,5 ± ± 3,5 % für HRP-NPs, HRP-RGD-NPs mit RGD-Blockierung und HRP-RGD-NPs-behandelte PANC- 1 Zellen (Abb. 5b). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Zielmolekül RGD die hocheffiziente Aufnahme von HRP-RGD-NPs durch PANC-1-Zellen erleichtern kann [28, 29].

a Konfokale Fluoreszenzbilder von PANC-1-Zellen nach Inkubation mit HRP-NPs, HRP-RGD-NPs mit RGD-Blockierung und HRP-RGD-NPs, die mit FITC markiert wurden. Grün und blaue Farben repräsentieren FITC-Fluoreszenz bzw. DAPI-gefärbte Zellkerne. Skalierungsleiste = 20 μm. b Die quantitative zelluläre Aufnahme von PANC-1-Zellen in Richtung von HRP-NPs, HRP-RGD-NPs mit RGD-Blockierung und HRP-RGD-NPs durch Durchflusszytometrie

In-vitro-Zytotoxizität

Abbildung 6a zeigt die Zytotoxizität von HP-RGD-NPs mit einem Konzentrationsbereich von 0–200 μg/ml im CCK-8-Assay, bei dem die Lebensfähigkeit der PANC-1-Zellen über 90 % gehalten wurde. Es wurde vermutet, dass Spiegel von RV-Träger-HP-RGD-NPs unter 200 μg/ml keine signifikante Zytotoxizität aufwiesen. Darüber hinaus wurde auch die krebshemmende Wirkung von HRP-RGD-NPs in vitro untersucht. Abbildung 6b zeigt, dass freie RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs bei RV-Konzentrationen zwischen 0 und 50 μg/ml dosisabhängig eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit induzierten. Im Vergleich zu freien RV- und HRP-NPs können HRP-RGD-NPs unter allen Testkonzentrationen zu einem stärksten Rückgang der Zelllebensfähigkeit führen, wahrscheinlich aufgrund der Stabilität und der RGD-Targeting-Effekte von HRP-RGD-NPs auf PANC-1-Zellen [30, 31] . Darüber hinaus wurden die Kerne von PANC-1-Zellen, die mit freiem RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs (alle mit 30 μg/ml RV) behandelt wurden, mit Hoechst 33258 gefärbt und unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die mit HRP NPs und HRP-RGD NPs behandelten Zellen zeigten das Vorhandensein von pyknotischen Kernen, was mit RV-behandelten Zellen übereinstimmt (Abb. 6c–f), was darauf hindeutet, dass der Zelltodtyp höchstwahrscheinlich Apoptose ist [32].

a Zelllebensfähigkeit von PANC-1-Zellen nach Behandlung mit HP-RGD-NPs für 24 Stunden. b Zelllebensfähigkeit von PANC-1-Zellen nach Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen von RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs. Der Kern von PANC-1-Zellen, die mit PBS behandelt wurden (c ), Wohnmobil (d ), HRP-NPs (e ), HRP-RGD-NPs (f ) gefärbt mit Hoechst 33258 nach 24 h Behandlung. Die Bilder wurden mit einer Digitalkamera aufgenommen. Skalierungsleiste = 20 μm. Rote Pfeile repräsentieren die Kerne pyknotische Zellen

Blutzirkulation und Tumorbioverteilung

Abbildung 7a zeigt die Blutzirkulationszeit von freien RV-, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs nach intravenöser Injektion in Mäuse. Es ist ersichtlich, dass HRP-NPs und HRP-RGD-NPs nahezu die gleiche Halbwertszeit haben (t _1/2 ) von 7,5 ± 0,5 h und t _1/2 = 6,57 ± 0,9 h. Während freies RV schnell aus dem Blutkreislauf entfernt wurde und t _1/2 = 1,21 ± 0,09 h. HRP-RGD-NPs verlängerten die Blutzirkulationszeit von RV, etwa um das 5,43-fache (t _1/2 ). Darüber hinaus war 24 h nach Injektion der Nanopartikel der RV-Gehalt im Tumorgewebe der mit HRP-RGD-NPs behandelten Gruppe etwa 3,01- und 8,1-fach höher als der der mit HRP-NPs und freien RVs behandelten Gruppen , bzw. (Abb. 7b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verkapselung von HSA und PEG die Zirkulationszeit verlängern könnte, um die Elimination von RV zu verringern und eine signifikante selektive Akkumulationsleistung im Tumorgewebe zu zeigen [33, 34], wahrscheinlich aufgrund der verbesserten Permeabilität und Retention (EPR) und des RGD-Targetings Wirkung [35].

a Blutzirkulationskurven von freien RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs bei Mäusen nach intravenöser Injektion, bestimmt durch die RV-Absorption aus verdünntem Gewebelysat. b RV-Gehalt im Tumor 24 h nach der Behandlung mit RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs. c Das relative Tumorvolumen tumortragender Mäuse nach intravenöser Injektion mit Kochsalzlösung (Kontrolle), RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs. d Körpergewicht tumortragender Mäuse nach intravenöser Injektion von Kochsalzlösung (Kontrolle), RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs

In Vivo Anti-Krebs-Wirksamkeit

Abbildung 7c zeigt die Antikrebseffizienz von freien RV, HRP-NPs und HRP-RGD-NPs bei derselben RV-Konzentration nach intravenöser Schwanzinjektion. Als Kontrolle wurden Mäuse mit Kochsalzlösung behandelt. Mit HRP-RGD-NPs behandelte Mäuse zeigten nach 35-tägiger Behandlung ein signifikant unterdrücktes Tumorwachstum und keinen Rückfall. Während die mit RV und HRP NPs behandelten Gruppen, ähnlich der Kontrollgruppe, ein ständig zunehmendes Tumorwachstum zeigten. Wie erwartet nahm das Körpergewicht der Mäuse in allen Gruppen während der 35-tägigen Behandlung nicht signifikant ab (Abb. 7d). Darüber hinaus wurde die systemische In-vivo-Toxizität durch H&E-Färbung der Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere) nach 35-tägiger Behandlung weiter bewertet (Abb. 8). In den entsprechenden Gewebe-H&E-Färbungsbildern aller getesteten Gruppen wurde keine merkliche Gewebetoxizität oder -anomalie gefunden, was die In-vivo-Sicherheit von HRP-RGD-NPs für biomedizinische Anwendungen weiter garantiert.

Die repräsentativen HE-Färbungsbilder von Herz, Leber, Milz, Niere und Lunge. Skalierungsleiste = 100 μm

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir gezeigt, wie HRP-RGD-NPs als hochwirksames Therapeutikum für den Pankreastumor verwendet werden können. Es wurde gezeigt, dass HRP-RGD-NPs eine verbesserte kolloidale Stabilität und Biokompatibilität in vitro im Vergleich zu freiem RV aufweisen. RGD als Zielmolekül förderte die hocheffiziente Zellaufnahme von HRP-RGD-NPs. Bei Anwesenheit von PEG und HSA zeigten HRP-RGD-NPs eine signifikant verlängerte Zirkulationszeit, die die kurze Blutzirkulation des freien RV überwinden kann. Basierend auf dem RGD-Targeting war der Gehalt an HRP-RGD-NPs im Tumorgewebe höher als der von freien RV- und HRP-NPs. Darüber hinaus zeigten In-vitro- und In-vivo-Studien, dass HRP-RGD-NPs im Vergleich zu freien RV- und HRP-NPs eine ausgezeichnete Anti-Krebs-Wirkung aufweisen, die wahrscheinlich durch Apoptose induziert wird. Schließlich zeigten HRP-RGD-NPs eine hohe Biokompatibilität und keine signifikante systemische Toxizität in vivo über eine 35-tägige Behandlung. Diese Ergebnisse zeigen, dass HRP-RGD-NPs vielversprechende Tumorchemotherapeutika für zukünftige biomedizinische Anwendungen sein können.

Abkürzungen

CCK-8:

Zellzähl-Kit-8

FBS:

Fötales Rinderserum

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

HSA:

Humanserumalbumin

PBS:

Phosphatpuffer

PEG:

Polyethylenglykol

RGD:

Arginin-Glycin-Aspartat

RV:

Resveratrol