Krebszellmembrandekorierte Silica-Nanopartikel, beladen mit miR495 und Doxorubicin zur Überwindung von Medikamentenresistenz für eine effektive Lungenkrebstherapie

Einführung

Aktuelle Studien belegen immer häufiger positive Korrelationen zwischen Multidrug Resistance (MDR) und dem Scheitern einer Chemotherapie [1, 2]. Einer der am weitesten verbreiteten Mechanismen für MDR ist der Transporter der ATP-Bindungskassette (ABC), von dem P-Glykoprotein (P-gp) der am meisten untersuchte ist [1, 3]. Es wurde festgestellt, dass P-gp intrazelluläre Chemotherapeutika effektiv aus Zellen herauspumpen kann, was zu einer verringerten intrazellulären Arzneistoffakkumulation, gefolgt von einer verringerten Wirksamkeit, führt [4, 5]. Die Hemmung von P-gp hat positive Auswirkungen auf die Überwindung von MDR gezeigt, die ein potenzielles Ziel zur Bekämpfung von MDR sein könnte.

MicroRNAs (miRNA) sind eine natürlich vorkommende Art von nicht-kodierender RNA. miRNA spielt jedoch eine wichtige Rolle bei der Regulierung der zellulären Transfektion und der Proteinexpression [6]. Als Ergebnis wurde berichtet, dass die Expression von P-gp durch verschiedene miRNAs beeinflusst wird, was von den Tumortypen abhängt [7]. Frühere Studien haben gezeigt, dass miR495 die P-gp-Expression sowohl in MDR-Ovarial- als auch in Magenkrebszellen effektiv herunterregulieren könnte [8]. Hier, in dieser Studie, wurde miR495 eingesetzt, um seine Rolle bei der Regulierung von P-gp in MDR-Lungenkrebszellen weiter zu untersuchen.

Aufgrund der unvergleichlichen Vorteile, wie stark reduzierte Nebenwirkungen bei gleichzeitig erhöhter Bioverfügbarkeit, sind Drug-Delivery-Systeme (DDS) in den letzten Jahrzehnten gewachsen und als Alternative zu freien Medikamenten in der Wirkstofffreisetzung, insbesondere in der Krebstherapie, anerkannt [9,10 ,11,12]. Infolgedessen rückt die Entwicklung multifunktionaler DDS in den Fokus der Forschung, die die komplizierten extra- und intrazellulären Barrieren der Krebstherapie überwinden und gleichzeitig für die Beladung verschiedenster Medikamente geeignet sind [13,14,15,16]. Silica (SLI)-Nanopartikel als einer der am weitesten verbreiteten Kandidaten haben vielseitige Tugenden wie einfache Herstellung, hohe Wirkstoffbeladungskapazität und gute Biokompatibilität und sind bevorzugte Nanoträger. Natürlich wurde SLI von vielen DDS als Nanoträger verwendet, um eine zufriedenstellende Wirksamkeit zu erzielen [17, 18].

Präklinische Studien haben jedoch gezeigt, dass die gezielte Abgabe von DDS auch für eine erfolgreiche Krebstherapie von entscheidender Bedeutung ist. Um einen besseren Targeting-Effekt zu erzielen, ist der am häufigsten gewählte Ansatz die Modifikation von Targeting-Liganden auf der Oberfläche von DDS, die an entsprechende Rezeptoren auf der Oberfläche von Krebszellen binden können [16, 19, 20]. Von kleinen Molekülen (Molekulargewicht unter 1000 Da) bis hin zu monoklonalen Antikörpern (Molekulargewicht über 10 kDa) wurden diese Targeting-Liganden erfolgreich auf DDS angewendet [21,22,23]. Aufgrund der ektogenen Natur einiger Liganden oder aus anderen Gründen traten jedoch Nebenwirkungen wie Immunreaktion und Zytotoxizität auf. In den letzten Jahren haben sich zelluläre Plasmamembranen zu einem weiteren vielversprechenden Material entwickelt, um nicht nur die Oberfläche von Nanopartikeln zu modifizieren, sondern auch als biokompatible Targeting-Komponente zu dienen. Auf der Grundlage der Interaktion zwischen der homologen Krebszellmembran (CCM) mit Krebszellen wurde gezeigt, dass die CCM die Tumor-Homing-Fähigkeit von DDS stark erhöht [24, 25].

Um die Tumor-Homing-Eigenschaft von CCM und P-gp, die auf miR495 abzielen, in einem DDS für die Cocktailtherapie von Lungenkrebs (in unserer Studie als Modellkrebs ausgewählt) zu kombinieren, wurde zunächst positiv geladenes Amin SLI hergestellt und mit Doxorubicin (DOX ). Das DOX-beladene Amin-SLI wurde anschließend mit miR495 beladen, um den Co-Delivery-Kern (SLI/R-D) zu bilden. Schließlich wurde das SLI/R-D mit negativ geladenem CCM (erworben aus A549/DOX-Zellen) dekoriert, um eine gemeinsame Abgabe und tumorzielendes DDS (CCM/SLI/R-D) herzustellen. Es wurde erwartet, dass CCM das CCM/SLI/R-D spezifisch zu der homogenen A549/DOX-Zelle lenken kann, um seine Tumor-Targeting-Wirkung zu verstärken und die intrazelluläre Aufnahme zu erhöhen. In der Zwischenzeit kann das veröffentlichte miR495 die MDR von A549/DOX überwinden und mit DOX einen synergetischen Antikrebseffekt erzielen.

Materialien und Methoden

Materialien

Methylthiazolyltetrazolium (MTT), N -(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan (AEAPS), Tetraethylorthosilicat (TEOS), Doxorubicin (DOX) und Triton X-100 wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Der miR495 wurde von Cell Biolabs Inc. (San Diego, CA, USA) bereitgestellt. Andere Chemikalien und Reagenzien wurden von Aladdin Co., Ltd (Shanghai, China) bezogen und waren analysenrein.

Zellkultur und Tiermodell

A549 (humanes Lungenkarzinom), A549/DOX (DOX-resistente Zelllinie) und NIH3T3 (Mausembryonalfibroblast) Zelllinien wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 .) kultiviert U/ml) und Streptomycin (100 U/ml) in einem Inkubator mit konstanter Temperatur von 37 °C, der 5 % CO₂ . enthält . Die A549/DOX (DOX-resistente Zelllinie) wurde durch Inkubation von A549-Zellen mit allmählich erhöhter DOX-Konzentration etabliert, wie berichtet [26]. Alle Zelllinien wurden wie zuvor berichtet nach einem Standardprotokoll kultiviert [27]. Männliche Balb/c-Nacktmäuse (~20 µg) wurden vom Institute of Model Animal, Wuhan University (Wuhan, China) erhalten und mit Standardprotokollen aufgezogen. Das A549/DOX-Tumor-Xenograft-Modell wurde basierend auf einem früheren Artikel etabliert [28]. Alle tierexperimentellen Experimente wurden von der institutionellen Ethikkommission des Third Affiliated Hospital der Sun Yet-sen University genehmigt.

Multizelluläres Tumor-Sphäroid-Modell

Das multizelluläre Tumorsphäroid (MCTS) wurde basierend auf einem früheren Bericht etabliert [29]. Kurz gesagt wurde eine 96-Well-Platte (Corning, USA) mit autoklavierter Agaroselösung bedeckt, um ein Gelkissen zu erzeugen. Danach wurden gemischte A549/DOX- und NIH3T3-Zellen (1:1) in die Platte ausgesät und inkubiert, um MCTS zu bilden. Die Bildung von MCTS wurde durch ein optisches Mikroskop (CX 23, Olympus, Japan) überwacht.

Vorbereitung von CCM/SLI/R-D

Die Herstellung von Amin-SLI erfolgte in einer Wasser-in-Öl-Mikroemulsion basierend auf einem früheren Bericht [30]. Kurz gesagt wurde eine DOX-haltige Wasser-in-Öl-Mikroemulsion bei Raumtemperatur hergestellt. Danach AEAPS, TEOS und NH₄ OH wurden nacheinander zugegeben, um die Reaktion auszulösen. Nach 24 Stunden Reaktion wurde das DOX-beladene Amin-SLI unter Verwendung einer überschüssigen Menge an Ethanol ausgefällt und mittels Zentrifugation (3000 U/min, 10 Minuten) gesammelt.

Das miR495 wurde in HEPES-Puffer gelöst und tropfenweise zu der wässrigen Lösung von DOX-beladenem Amin-SLI in verschiedenen Gewichts/Gewichts-Verhältnissen (w/w) mit Vortex zugegeben, um binäre SLI/R-D-Komplexe zu erhalten [31].

Die Isolierung von CCM aus A549/DOX-Zellen erfolgte in Anlehnung an einen früheren Bericht [32]. Zusammenfassend wurden die A549/DOX-Zellen gesammelt und unter Verwendung von Zentrifugation konzentriert. Danach wurden die Zellen in Extraktionspuffer dispergiert und weiter zentrifugiert (10.000g , 10 min), gefolgt von einer zweiten Ultrazentrifugation (100.000g , 60 min), um schließlich die CCM zu erhalten. Alle Verfahren wurden bei 4°C durchgeführt. Die Proteinkonzentration von CCM wurde mit einem BCA-Kit (Beyotime, Shanghai, China) quantifiziert.

Die Beschichtung von CCM auf SLI/R-D verwendet ein ähnliches Protokoll wie die miR495-Bindung. Zusammenfassend wurden unterschiedliche Volumina der CCM-Lösung zu SLI/R-D (1 µmg/ml) unter Vortex gegeben. Schließlich wurde die Mischung mit Sondenbeschallung (100 W, 5 min) behandelt und dann zentrifugiert (10.000g , 10 min), um CCM/SLI/R-D zu erhalten.

Charakterisierung

Die Größenverteilung und das Zetapotential von CCM/SLI/R-D wurden mit einem Zetasizer (ZS90, Malvern, UK) bewertet. Darüber hinaus wurde das Transmissionselektronenmikroskop (TEM, JEM1230, JEOL, Japan) verwendet, um die Morphologie von Nanoträgern zu beobachten.

Die Bindungsfähigkeit von SLI an miR495 wurde durch einen Gel-Retardations-Assay mit nacktem miR495 als Kontrolle untersucht. Das in verschiedenen w/w-Verhältnissen formulierte SLI/RD (0,2–25, SLI zu miR495) wurde auf ein 2% Agarosegel mit Goldview (Solarbio Science &Technology Co., Ltd., Peking) geladen und in 0,5 × Tris-Borate . elektrophoretisiert -EDTA-Puffer (90 V, 60 min). Die Visualisierung von miR495 wurde mit dem Gel-Pro-Analysegerät (Genegenius, Syngene, UK) durchgeführt.

Der Lysepuffer (Beyotime, Shanghai) wurde verwendet, um das Gesamtprotein aus CCM zu bestimmen, wonach der BCA-Kit zur Konzentrationsquantifizierung verwendet wurde. Dann wurden die Proben auf eine Poly(vinylidenfluorid) (PVDF)-Membran übertragen. Schließlich wurde die Membran mit entsprechenden ersten Antikörpern (Abcam, USA) und zweiten Antikörpern (Abcam, USA) angefärbt. Zur Visualisierung wurde das Densitometer (E-Gel Imager, Thermo-Fisher, USA) verwendet.

Der Wirkstoffbeladungsgehalt (DLC) von CCM/SLI/R-D wurde bestimmt, indem die so hergestellten Nanoträger 48 h lang in Methanol aufgetaucht wurden. Die Proben wurden zentrifugiert (10.000 U/min, 30 Min) und die Überstände wurden für die Bestimmung von DOX mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gesammelt [33]. Die miR495-Beladung wurde durch UV-Absorption bei 260 nm (UV5Nano, METTLER TOLEDO, Schweiz) bestimmt.

Die Veränderungen der Partikelgröße von CCM/SLI/R-D in PBS und Mausplasma wurden zu jedem Zeitpunkt innerhalb von 48 h aufgezeichnet. Das Freisetzungsprofil von DOX aus CCM/SLI/R-D wurde gemäß einem früheren Bericht untersucht [34].

Intrazelluläre Transfektion

A549/DOX-Zellen wurden 24 h in 6-Well-Platten ausgesät und dann 48 h mit CCM/SLI/miR495 (miR495-Konzentrationen 1–25 ng/ml) kultiviert. Danach wurden die Zellen abgelöst, geerntet und einer Western-Blot-Analyse der P-gp-Expression unterzogen.

Die intrazelluläre Konzentration des Arzneimittels wurde gemäß einem früheren Bericht bestimmt [23]. Kurz gesagt, nach Behandlung mit CCM/SLI/miR495 für verschiedene Zeitintervalle wurden die A549/DOX-Zellen mit DOX inkubiert. In vorbestimmten Zeitintervallen (4 und 8 h) wurden die Zellen abgelöst, gesammelt und in 5 ml DOX-Extraktionslösung (Ethanol 0,6 M HCl, 1:1, v/v) dispergiert, gefolgt von Ultraschall bei 400 W in einem Eisbad 40 mal. Die Mischung wurde 24 h bei 4 °C belassen und 10 min bei 12.000 U/min (4 °C) zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und der DOX-Gehaltsmessung wie oben beschrieben unterzogen.

Zelllebensfähigkeit

Die Zytotoxizitätswirkung von wirkstofffreien Nanocarriern (10–200 µg/ml) und CCM/SLI/RD (DOX-Konzentration 2-50 µM; die miR495-Konzentration 10–250 µmM; das Molverhältnis zwischen DOX und miR495 wurde auf . festgelegt 200) auf A549/DOX-Zellen für 48 h wurde durch 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bestimmt. Die Level-Variationen von Apoptose-bezogenen Proteinen wurden auch mit Western-Blot-Assays bestimmt.

MCTS mit Durchmessern von 300–400 µm wurde mit dem Medium mit verschiedenen Formulierungen (DOX-Konzentration, 25 µM) 5 Tage bei 37 °C inkubiert. Ein optisches Mikroskop wurde verwendet, um die Durchmesseränderungen von MCTS aufzuzeichnen.

In-vitro- und In-vivo-Targeting von CCM/SLI/R-D

Die FAM-markierte siRNA wurde verwendet, um das DDS zu konstruieren. A549/DOX-Zellen wurden 24 h lang in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät. Dann wurden die Zellen 2 h lang mit überschüssigem CCM inkubiert und SLC/siRNA und CCM/SLC/siRNA wurden zugegeben. In den festgelegten Zeitintervallen wurden die Zellen gesammelt und mit einem Durchflusszytometer (FCM, FC500MCL, Beckman Coulter) zur Quantifizierung bestimmt.

Das mit Cy5 markierte miR495 wurde verwendet, um das DDS zu konstruieren. Mäuse, die einen A549/DOX-Tumor trugen, wurden i.v. mit SLI/miR495 und CCM/SLI/miR495 injiziert, und die Verteilung von miR495 wurde in vorbestimmten Zeitintervallen unter Verwendung eines Echtzeit-Bildgebungssystems (ZEWTON 7.0, Vilber, Frankreich) überwacht. Nach 12-stündiger Verabreichung wurden Tumoren und Hauptorgane von den getöteten Mäusen entnommen und unter Verwendung desselben Systems für die analytische Analyse abgebildet.

In-vivo-Antikrebs-Assay

Der In-vivo-Antikrebs-Assay von CCM/SLI/R-D wurde unter Verwendung von A549/DOX-Tumor-tragenden Mäusen bewertet. Im Detail wurden Mäuse nach dem Zufallsprinzip in 5 Gruppen (n = 6):(1) Kochsalzlösung (als Kontrolle), (2) freies DOX, (3) CCM/SLI/DOX, (4) CCM/SLI/miR495 und (5) CCM/SLI/R-D. Danach wurden den Mäusen die Formulierungen in einer Dosierung von 5 mg/kg DOX und 0,25 mg/kg miR495 7-mal innerhalb von 14 Tagen intratumoral verabreicht. Die Tumorvolumina und das Körpergewicht der Mäuse in jeder Gruppe wurden alle 2 Tage bestimmt.

Ergebnisse und Diskussion

Vorbereitung von CCM/SLI/R-D

Um eine gute Wirkstoffbeladungskapazität und Biokompatibilität in einem DDS zu erreichen, wurde für die Herstellung von SLI eine synchrone Hydrolyse von TEOS und AEAPS in der Wasser-in-Öl-Mikroemulsion verwendet. DOX wurde während der Herstellung in die Matrix von SLI voreingeschlossen. Wie in 1a gezeigt, zeigte das Ergebnis der dynamischen Lichtstreuung (DLS), dass der DOX-beladene Amin-SLI einen Durchmesser von ~ 100 nm hatte. Eine TEM-Aufnahme zeigte außerdem, dass die Nanopartikel eine kugelförmige Form mit einer engen Verteilung hatten, was mit den Ergebnissen von DLS übereinstimmte.

a Größen- und Zetapotentialänderungen von SLI/R-D bei verschiedenen w/w-Verhältnissen. b Der miRNA-Bindungsassay von binären SLI/R-D-Komplexen in verschiedenen w/w-Verhältnissen. Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD (n = 3)

Der DOX-beladene Amin-SLI hatte ein Oberflächenpotential von 26,83 mV, was als Träger von miR495 von Vorteil war. Laut einem früheren Bericht [31] wurde der Zusammenbau von miR495 und SLI zu binären Komplexen durch elektrostatische Wechselwirkung angetrieben. Der w/w-SLI zu miR495 in den binären Komplexen übt einen signifikanten Einfluss auf die endgültige Transfektionseffizienz aus. Wie in Abb. 1a gezeigt, haben die binären Komplexe aufgrund der Tatsache, dass miR495 ein negativ geladenes Makromolekül ist, bei einem niedrigen w/w-Verhältnis von SLI zu miR495 eine negative Oberflächenladung mit signifikant erhöhter Partikelgröße gezeigt, was möglicherweise auf die Adhäsion benachbarter Nanopartikel. Mit zunehmendem w/w-Verhältnis wurde die Oberflächenladung binärer Komplexe jedoch allmählich positiv, wobei eine stabile Partikelgröße bei etwa 100 nm beobachtet wurde. Es wurde gezeigt, dass, wenn das w/w-Verhältnis 20 erreichte, sowohl die Partikelgröße als auch das Oberflächenpotential der binären Komplexe stabil blieben, ohne sich mit der Zunahme des w/w-Verhältnisses signifikant zu ändern.

Die Bindungs- und Schutzkapazitäten der Nanocarrier an miR495 sind für die Genübertragung von entscheidender Bedeutung. Die miR495-Bindungsfähigkeit von SLI wurde durch Gel-Retardations-Assay bewertet. Wie in Abb. 1b gezeigt, zeigte nacktes miR495 keine Retardation, während die Zugabe von SLI das Verhalten von miR495 signifikant veränderte. Es wurde beobachtet, dass SLI mit zunehmendem W/W-Verhältnis eine wachsende miR495-Bindungskapazität zeigte, was eine vollständige Retardierung von miR495 bei einem W/W-Verhältnis von 5 erreichte.

Zusammenfassend wurde gefolgert, dass binäre Komplexe mit einem w/w-Verhältnis von 20 mit der richtigen Partikelgröße und der gewünschten Oberflächenladung sowie einer effektiven miR495-Bindungs- und Schutzeigenschaft die optimale Formulierung waren, die als Modell für die Durchführung ausgewählt wurde die folgenden Experimente.

Dann untersuchten wir das optimale Verhältnis von CCM-Protein zu den binären Komplexen, indem wir CCM mit binären Komplexen in unterschiedlichen Massenverhältnissen (SLI zu CCM-Protein, w/w) mischten. Das optimale Verhältnis wurde durch die resultierende Partikelgröße und Oberflächenladung unter verschiedenen Bedingungen bestimmt. Wie in Fig. 2a gezeigt, führte die Zugabe von CCM (negative Ladung) zu einer signifikanten Fluktuation der Produktgröße, jedoch zu einer kontinuierlichen Abnahme der Oberflächenladung. Die Ergebnisse zeigten, dass CCM erfolgreich auf der Oberfläche binärer Komplexe verankert wurde. Am wichtigsten wurde beobachtet, dass sowohl die Partikelgröße als auch die Oberflächenladung von CCM/SLI/R-D bei einem Massenverhältnis von 7,5 ein Plateau erreichten und dass das zusätzliche CCM einen unbedeutenden Einfluss auf die Oberflächenladungen und nur eine leichte Zunahme der Größe zeigte. Genauer gesagt erreichte der Durchmesser des Nanopartikels 121,28 ± 3,36 nm und das Zetapotential änderte sich auf −28,04 ± 2,64 µmV, was der Oberflächenladung von freiem CCM (−27,95 ± ±3,06 µmV) ähnlich war, was darauf hindeutet, dass die Dekoration von CCM unter dieser Bedingung eine Sättigung erreicht. Als Ergebnis wurde CCM/SLI/R-D bei einem Massenverhältnis von 7,5 als Modellformulierung ausgewählt, um die folgenden Experimente durchzuführen.

a Größen- und Zetapotentialänderungen von CCM SLC/R-D bei unterschiedlichen w/w-Verhältnissen. Das eingefügte Bild war eine Western-Bolzen-Analyse der drei repräsentativen Proteine ​​in CCM und CCM/SLI/R-D. b Die Größenverteilung und TEM von CCM/SLI/R-D. Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD (n = 3). Maßstabsbalken 100 nm

Charakterisierung von CCM/SLI/R-D

Frühere Berichte haben gezeigt, dass Proteine ​​in CCM in der Lage sind, die homologen Tumorzellen zu finden, wenn sie zur Modifikation von Nanopartikeln verwendet werden [35, 36]. Daher wurden drei Membranproteine ​​(Na-K ATPase, AT1R und CXCR4) ausgewählt und ihre Expressionsniveaus in CCM wurden mit CCM/SLI/R-D verglichen. Wie im eingefügten Bild von Fig. 2a gezeigt, zeigte die Menge aller drei Proteine ​​in CCM eine ähnliche Intensität wie die von CCM/SLI/RD, was zeigte, dass integrierte Proteine ​​in CCM nach der Beschichtung an CCM/SLI/RD vererbt wurden und die der Verlust oder die Verschlechterung war während dieses Prozesses vernachlässigbar. Dieses Ergebnis lieferte auch solide Beweise für die erfolgreiche Konstruktion von CCM/SLI/R-D, die für ein verbessertes Tumor-Homing von CCM/SLI/R-D von Vorteil war.

Die Größenverteilung und Morphologie von CCM/SLI/R-D wurden auch mit DLS und TEM untersucht. Wie in Abb. 2b gezeigt, zeigte DLS, dass CCM/SLI/RD eng bei etwa 120 nm verteilt war, während TEM zeigte, dass CCM/SLI/RD als kugelförmige Kern-Schale-Struktur charakterisiert war und eine Lipiddoppelschicht auf der Oberfläche deutlich beobachtet werden konnte Schicht.

Der DLC von DOX in CM/SLI/R-D (bestimmt durch HPLC) könnte bis zu 17,96 % betragen und die miR495-Beladung (bestimmt durch UV-Spektrophotometer) könnte bis zu 1,64% betragen.

Frühere Studien haben mehrere vorläufige Anforderungen für eine sichere Verabreichung von Wirkstoffmolekülen ergeben. Zuallererst sollte das verwendete DDS ohne dramatische Größenschwankungen unter physiologischen Umgebungen stabil gehalten werden, da die Partikelgröße eine entscheidende Bedeutung für das in-vivo-Schicksal des Systems beitrug [10, 37]. Als Ergebnis wurde die zeitabhängige Stabilität von CCM/SLI/R-D untersucht. Um die kolloidale Stabilität von CCM/SLI/R-D in physiologischen Umgebungen zu bestimmen, wurden die Größenänderungen von DDS in PBS (pH 7,4) und Mausplasma bis zu 48 h aufgezeichnet. Wie in Abb. 3a dargestellt, konnte CM/SLN/Ce6 seine Größe während des gesamten Testbereichs ohne signifikante Schwankungen effektiv beibehalten. Daher wurde gefolgert, dass CCM/SLI/R-D in der Lage ist, einen physiologischen Zustand stabil zu halten. Wie in Abb. 3b gezeigt, konnte das CCM/SLI/RD die Stabilität im extrazellulären Zustand bewahren (32,76 % der Wirkstoffe werden nach 120 h Inkubation freigesetzt), was darauf hindeutet, dass das CCM/SLI/RD während des Abgabeprozesses die beladenes Wirkstoffmolekül, ohne potenzielle Nebenwirkungen hervorzurufen. Am wichtigsten ist, dass die Medikamente beim Eindringen in die Zellen und beim Kontakt mit der sauren Umgebung von Krebszellen leicht freigesetzt wurden (75,93%), was auf die hohe Wasserstoffkonzentration zurückzuführen sein könnte, die die Kombination von Medikament und Trägern schwächt [6, 38].

a Kolloidale Stabilität von LCC/R-A in PBS (pH 7,4) und Mausplasma bei 37 °C für bis zu 48 h. b Wirkstofffreisetzungsprofile von DOX aus dem LCC/R-A in Freisetzungsmedien unter extrazellulären und intrazellulären pH-Werten (7,4 und 5,5). Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD (n = 3)

Intrazelluläre Transfektion

Um den Zusammenhang zwischen der Transfektion von miR495 und der Expression von P-gp aufzudecken, wurden die A549/DOX-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von miR495 transfiziert. Anschließend wurde das P-gp-Expressionsniveau in diesen Zellen unter Verwendung eines Western-Blot-Assays bestimmt. Wie in Abb. 4a gezeigt, zeigte die Expression von P-gp eine negative Beziehung zur miR495-Konzentration, was darauf hindeutet, dass CCM/SLI als nützliches Werkzeug für die Abgabe von miR495 verwendet werden könnte, was für CCM/SLI/RD von Vorteil ist, um die MDR in A549/DOX-Zellen. Als Machbarkeitsstudie wurde die Wirkung der miR495-Transfektion auf die Variation der intrazellulären DOX-Akkumulation weiter untersucht. Nach Behandlung mit CCM/SLC/siRNA für 48 oder 72 h (Fig. 4b) wurden die A549/DOX-Zellen für unterschiedliche Zeitintervalle mit DOX behandelt. Wie in Abb. 5d gezeigt, stieg die zelluläre Fluoreszenz von DOX in A549/DOX-Zellen mit CCM/SLC/siRNA-Vorbehandlung für 48 h um das 1,49-fache (4 h nach Inkubation) und 1,47-fach (8 h nach der Inkubation) , bzw. Mit CCM/SLC/siRNA-Vorbehandlung für 72 h stieg die intrazelluläre DOX-Fluoreszenz in A549/DOX-Zellen um das 1,63-fache (4 h nach Inkubation) und das 1,85-Fache (8 h nach der Inkubation). Daraus wurde geschlossen, dass CCM/SLC/siRNA die MDR in A549/DOX überwinden könnte, indem sie die intrazelluläre DOX-Akkumulation im Vergleich zu unbehandelten Zellen erhöht.

a Die Beziehung zwischen der miR495-Konzentration und der Expression von P-gp-Proteinen in A549/DOX-Zellen nach Behandlung mit CCM/SLI/miR495 für 48 Stunden. b Die intrazelluläre DOX-Akkumulation in A549/DOX-Zellen nach Behandlung mit LCC/miR495 für verschiedene Zeitintervalle. Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD (n = 3)

Lebensfähigkeit von A549/DOX-Zellen, die mit einem arzneimittelfreien Träger behandelt wurden (a ) oder arzneimittelhaltige (b ) verschiedene Formulierungen bei unterschiedlichen Nanopartikel-/Arzneistoffkonzentrationen für 48 h. c Western-Blot-Assays der Expression von Caspase-3-, Cytochrom-C- und bcl-2-Proteinen nach verschiedenen Behandlungen. Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD (n = 3). ^** P < 0.01

In-vitro-Antikrebs-Assay

Die Zytotoxizität von wirkstofffreien Trägern (CCM/SLI) wurde untersucht, um die Biokompatibilität des DDS weiter aufzuzeigen. Wie in Abb. 5a gezeigt, zeigte A549/DOX nach 48 Stunden Inkubation mit CCM/SLI bei der höchsten Konzentration von 200 µg/ml immer noch mehr als 90 % Lebensfähigkeit, was darauf hindeutet, dass CCM/SLI mit unbedeutenden toxischen Substanzen biokompatibel ist zu Zellen.

Anschließend wurde der In-vitro-Antikrebs-Assay ausgewertet. Wie in Fig. 5b gezeigt, standen die Antikrebswirkungen aller Formulierungen in positivem Zusammenhang mit den Arzneimittelkonzentrationen. Im Detail betrug die Lebensfähigkeit von A549/DOX-Zellen bei der höchsten DOX-Konzentration (50 µM) immer noch 72,6%. CCM/SLI/DOX und CCM/SLI/miR495 erreichten unter den gleichen Bedingungen eine ähnliche Zelllebensfähigkeit, die mit 59,4% bzw. 63,3% höher war als die von DOX. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Zelllebensfähigkeit für die CCM/SLI/R-D-Behandlung signifikant auf 38,5% verringert war. Darüber hinaus wurde der CI-Index in CCM/SLI/R-D mit 0,84 bestimmt, was auf eine starke synergistische Wirkung von miR495 und DOX auf die Abtötung von A549/DOX-Zellen hinweist.

Um die Schlussfolgerung erneut zu verifizieren, wurden die gängigen Apoptose-Regulationsproteine ​​(Caspase-3, bcl-2 und Cytochrom-3) in verschiedenen Formulierungen untersucht. Wie in Fig. 5c gezeigt, war die Menge an gespaltener Caspase-3 in CCM/SLI/RD-behandelten Zellen am höchsten und der bcl-2-(Apoptose-Suppressor)-Spiegel war der niedrigste unter allen Testgruppen, was die bevorzugte Krebsbehandlung weiter bestätigt Wirksamkeit von CCM/SLI/RD. Darüber hinaus zeigte das CCM/SLI/R-D eine stark erhöhte Expression von Cytochrom-3, was darauf hindeutet, dass die Apoptose in dieser Gruppe mit einer Schädigung der Mitochondrien zusammenhängt.

Das MCTS wurde eingeführt, um solide Tumore nachzuahmen und die Antikrebswirkung verschiedener Formulierungen zu beurteilen. Wie in Fig. 6a gezeigt, wächst das MCTS-Volumen in der freien DOX-Gruppe während der gesamten Versuchsperiode anhaltend, was darauf hindeutet, dass die MDR in A549/DOX die Zytotoxizität von DOX signifikant verringern könnte. Einzelabgabesysteme (SLI/DOX und SLI/miR495) zeigten eine gewisse Unterdrückungswirkung mit leicht vermindertem Wachstum. Am wichtigsten ist, dass die Kombination von miR495 und DOX in CCM/SLI/R-D eine stark erhöhte Wirksamkeit mit einem negativen Volumenwachstum am Ende des Tests zeigte. Auch das optische Bild in Abb. 6b kam zu ähnlichen Schlussfolgerungen.

Die Lautstärke ändert sich (a ) und entsprechende optische Bilder (b ) von MCTS nach verschiedenen Behandlungen. Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD (n = 3). ^** P < 0.01

In-vitro- und In-vivo-Targeting

Um die möglichen Gründe für die diskriminierende Antitumorwirkung verschiedener Formulierungen aufzudecken, wurde die zelluläre Aufnahme untersucht, um zu untersuchen, ob die CCM-Modifikation die Internalisierungskapazität von Nanopartikeln in A549/DOX-Zellen positiv erhöhen könnte, da viele Studien gezeigt haben, dass die Oberflächenmodifikation von CCM den Tumor verstärken kann -Targeting-Kapazität von Nanocarriern [39, 40]. Wie in Abb. 7a dargestellt, nahm die intrazelluläre Fluoreszenzintensität in der CCM/SLI/miR49- und SLI/miR495-Gruppe als Funktion der Zeit zu, was auf die positive Beziehung zwischen Zeit und zellulärer Aufnahme in beiden Nanopartikeln hindeutet. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass in der CCM/SLI/miR495-Gruppe höhere Fluoreszenzsignale beobachtet wurden, die zum Zeitpunkt 6 h 1,58-mal so hoch waren wie in der SLI/miR495-Gruppe. Um zu überprüfen, ob die Aufnahme von CCM/SLI/miR495 über die CCM-vermittelte Endozytose erfolgte, wurden die Zellen vor der Zugabe von Nanocarriern mit überschüssigem CCM inkubiert. Es wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität in der CCM/SLI/miR495-Gruppe weiter abnahm, während die Fluoreszenzintensität in der SLI/miR495-Gruppe nahezu gleich blieb. Diese Ergebnisse zeigten, dass CCM/SLI/miR495 von Zellen durch CCM-bedingte Endocytose aufgenommen wurde.

a Quantitative Analyse der intrazellulären zeitabhängigen Aufnahme verschiedener Formulierungen in A549/DOX-Zellen (vorbehandelt mit/ohne CCM). b Mittlere Fluoreszenzintensität von sezierten Tumoren und Hauptorganen von Mäusen, die mit SLI/R-A und CCM/SLI/R-A behandelt wurden, 48 h nach der Injektion. Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD (n = 3). ^** P < 0.01

Es wurde erwartet, dass das CCM von A549/DOX die Tumor-Targeting-Kapazität von CCM/SLI/R-D auf isogene A549/DOX-Zellen verbessert, um die Akkumulation von Nanocarriern im Tumor zu erhöhen. Um unser Konzept zu verifizieren, wurde die Verteilung von SLI/R-D und CCM/SLI/R-D durch ein Echtzeit-Bildgebungssystem überwacht. Wie in 7b gezeigt, zeigte CCM/SLI/R-D wie erwartet im Vergleich zu SLI/R-D eine stärkere Akkumulation innerhalb des Tumors. Darüber hinaus wurde geschlussfolgert, dass SLI/R-D in fast allen Organen (außer dem Herzen) mit Fokus auf Leber und Milz verteilt war, was möglicherweise auf ihre schlechte Fähigkeit zur Tumorsuche zurückzuführen ist. Im Gegenteil, die CCM-Modifikation könnte das Einfangen der Leber erheblich erleichtern, um das verbesserte Zielen der geladenen Ladung in das Tumorgewebe zu unterstützen.

In-vivo-Antitumor-Wirksamkeit

Die In-vivo-Antitumorwirkung von CCM/SLI/R-D wurde untersucht. Nach Behandlung mit DOX oder SLI/DOX wurde das Tumorwachstum von Mäusen verlangsamt. CCM/SLI/R-D hatte jedoch die beste Antitumorwirksamkeit und führte zu einem offensichtlich reduzierten Tumorvolumen von 303 ± ± 25 mm ³ . Darüber hinaus zeigten auch die Ergebnisse der Körpergewichtsvariation von Mäusen in verschiedenen Gruppen interessante Ergebnisse ( 8 ). Es zeigte sich, dass bei Mäusen, die mit CCM/SLI/R-D behandelt wurden, keine offensichtliche Abnahme des Körpergewichts auftrat, was darauf hindeutet, dass die Fähigkeit von CCM/SLI/R-D zur Tumor-Targeting die Antitumor-Wirksamkeit mit reduzierten Nebenwirkungen erhöhen könnte. Im Gegensatz dazu verursachte die ungezielte Verteilung von freiem DOX bei Mäusen eine systematische Toxizität, die sich in einem allmählich abnehmenden Körpergewicht als Funktion der Zeit widerspiegelte. Zusammenfassend war das CCM/SLI/R-D ein überlegenes Tumor-Homing-DDS für die Lungentumortherapie.

The tumor volume (a ) and body weight (b ) of tumor tissue analysis of A549/DOX tumor-bearing Balb/c nude mice after intratumoral administration of different formulations. Data were expressed as mean ± SD (n = 6). ^** P < 0.01

Conclusion

In summary, we successfully constructed a CCM-coated SLI nanoparticle as a DDS to co-delivery miR495 and DOX (CCM/SLI/R-D). The characterization demonstrated that CCM/SLI/R-D showed well distribution with a diameter of 120 nm, which showed high stability as well as pH-responsive drug release. Cellular experiments revealed that CCM/SLI/R-D could realize preferable miR495 delivery which achieved the significant downregulation of P-gp, which finally overcome the MDR in A549/DOX by increasing the intracellular DOX accumulation compared to untreated cells. The CCM/SLI/R-D showed promising tumor-homing capability. Most importantly, the synergetic effect of miR495 and DOX achieved much more potent anticancer effect to mono-delivery DDS or free DOX both in vitro and in vivo.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Abkürzungen

AEAPS:

N -(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane

CCM:

Cancer cell membrane

DDS:

Drug delivery systems

DLC:

Drug loading content

DOX:

Doxorubicin

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

MCTS:

Multicellular tumor spheroid

MDR:

Multidrug resistance

miRNA:

MicroRNAs

MTT:

Methyl thiazolyl tetrazolium

P-gp:

P-glycoprotein

SLI:

Silica

TEOS:

Tetraethyl orthosilicate