5-Aminolävulinsäure-Squalen-Nanoanordnungen für die Tumorphotodetektion und -therapie:In-vitro-Studien

Hintergrund

Die medizinische Nanotechnologie hat vielversprechende neue Plattformen zur Wirkstoffabgabe eingeführt. Sie bestehen aus biokompatiblen und biologisch abbaubaren Nanomaterialien, die zur Verbesserung der chemischen Stabilität und des pharmakokinetischen Profils pharmakologisch aktiver Verbindungen beitragen und gleichzeitig eine kontrollierte Abgabe am Wirkort bieten [1,2,3]. Allerdings haben bisher nur wenige Nanopartikelsysteme den Markt erreicht. Die Hauptstricke existierender Nanopartikel (NPs) sind hauptsächlich ihre schlechte Wirkstoffbeladung (normalerweise weniger als 5%) und der „Burst-Release-Effekt“, der eine vorzeitige Freisetzung eines erheblichen Teils des Wirkstoffs bewirkt, bevor er den Zielort erreicht. Dies verursacht nachteilige Nebenwirkungen und kann zu Toxizität und Verlust der pharmakologischen Aktivität führen [4].

Squalen (SQ) ist ein lineares Triterpen mit der chemischen Formel C₃₀ H₅₀ und eine Vorstufe von Cholesterin und anderen Steroiden [5]. Im menschlichen Körper wird Squalen in der Leber und in der Haut synthetisiert und durch Lipoproteine ​​niedriger Dichte (LDL) und Lipoproteine ​​sehr niedriger Dichte (VLDL) im Blut transportiert [6]. Im Rahmen der Tumortherapie zeigte Squalen eine starke Potenzierungswirkung auf bestimmte Chemotherapeutika [7]. Da es in der Natur weit verbreitet und sicher ist, hat Squalen seine Anwendung in der pharmazeutischen Technologie als Hilfsstoff bei der Herstellung von Lipidemulsionen für die Verabreichung von Impfstoffen, verschiedenen Wirkstoffen und Genen gefunden [6, 8, 9]. Squalen hat sich für die kovalente Konjugation an verschiedene Arzneimittel als geeignet erwiesen. Auf diese Weise geschaffene fortschrittliche Nanosysteme beinhalten Squalen, das an Chemotherapeutika wie Gemcitabin [10,11,12], Paclitaxel [13], Cisplatin [14] oder Doxorubicin [15] konjugiert ist. Dieser Ansatz wird „Squalenoylierung“ genannt und beinhaltet eine Prodrug-Strategie mit der Bildung der nanokolloidalen Systeme, in denen der Wirkstoff kovalent gebunden ist [16, 17]. Squalen-basierte Nanoanordnungen (NAs) werden durch Selbstorganisation funktioneller Komponenten in wässrigen Medien gebildet und zeichnen sich durch eine inhärente hohe Wirkstoffbeladung aus [18]. Es wurde festgestellt, dass Squalenoylierung die Arzneimittelstabilität und die Löslichkeit von schlecht wasserlöslichen Arzneimitteln erhöht, wodurch die Bioverfügbarkeit verbessert und die Halbwertszeit des Arzneimittels im systemischen Kreislauf verlängert wird [14, 16]. In den meisten Fällen zeigen solche selbstorganisierten NAs eine bessere pharmakologische Aktivität als die Muttersubstanz [16, 19]. Darüber hinaus bietet die Squalenoylierung ein Mittel zur Konstruktion von NAs, die sowohl eine therapeutische als auch eine bildgebende Modalität enthalten [20]. Couvreur und Mitarbeiter haben über ähnliche theranostische NAs berichtet, indem sie ein MRT-Agens in Squalenoyl-Gemcitabin (SQgem)-Nanoanordnungen eingebaut haben [14]. Diese Arten von multifunktionalen Systemen können bei der Entwicklung neuer theranostischer Wirkstoffe für die personalisierte Medizin von großer Bedeutung sein.

Im Rahmen der Krebstheranostik hat die Verabreichung eines niedermolekularen 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) (Abb. 1) zur klinischen Anwendung von 5-ALA für die photodynamische Therapie (PDT) geführt [21,22,23] , Photodiagnostik (PD) [24] und fluoreszenzgesteuerte Tumorresektion bei Gliompatienten mit Hirntumor [25,26,27]. Die Theranostik wird durch den Metabolismus von 5-ALA und die selektive Akkumulation von Protoporphyrin IX (PpIX) im Krebsgewebe als Folge der umgangenen Rückkopplungshemmung des Hämzyklus erreicht [22]. Die Wirksamkeit von 5-ALA PD und PDT wird jedoch durch ihre zwitterionische Natur bei neutralem pH-Wert im Blutkreislauf ernsthaft behindert. Es wurden verschiedene Versuche unternommen, um die Stabilität und das pharmakokinetische Profil von 5-ALA zu verbessern. Sowohl das Amino- als auch das Carboxylende von 5-ALA wurden durch verschiedene Ansätze modifiziert [28]. Die Veresterung der Carboxylgruppe von 5-ALA führte zu 5-ALA-Methylester (Metvix®) [29] und wird zur topischen Behandlung von aktinischer Keratose, Basalzellkarzinom und akuter Akne eingesetzt. Hexylester von 5-ALA (5-ALA-Hex) (Hexvix®) hat die Marktzulassung für die Photodiagnostik (PD) von Blasenkrebs erhalten [30, 31] und wird experimentell zur Behandlung von Gebärmutterhalskrebs und schwerer Akne eingesetzt [32 ,33,34].

Chemische Strukturen von NA-Bausteinelementen. 5-ALA (a ), 5-ALA-Hex (b ), Squalen (c ) und 5-ALA-SQ (d )

Mit Ausnahme von Gliolan™ ist die klinische Anwendung von 5-ALA und seinen Derivaten jedoch meist auf die topische Anwendung beschränkt. Dies schränkt ihren Einsatz bei wichtigeren Krebsarten wie Brust-, Dickdarm-, Lungen- und Prostatakrebs ein. Versuche, die Verwendung von 5-ALA auszuweiten, haben Aminoend-modifizierte Phosphatase-sensitive Derivate von 5-ALA, die in letzter Zeit eine sehr vielversprechende Aktivität gezeigt haben [35, 36]. Darüber hinaus wurden Versuche unternommen, 5-ALA in verschiedene Nanosysteme einzukapseln, darunter polymere NAs [37,38,39] oder Liposomen [40,41,42,43] und seine Konjugation in Dendrimere [44, 45] oder Gold-NPs [46 , 47]. Obwohl einige dieser Lösungen dazu beigetragen haben, die Stabilität von 5-ALA und sein pharmakokinetisches Profil zu verbessern, hat keiner der oben genannten Versuche zu einem erfolgreichen klinischen Kandidaten im Bereich der Krebs-Nanomedizin geführt.

Das Ziel dieser Arbeit war das Design und die Synthese eines 5-ALA-Squalen (5-ALA-SQ)-Konjugat-Bausteins (Abb. 1d), der sich in wässrigen Medien selbst anordnet und eine hohe Wirkstoffbeladung von 5-ALA enthält, eine Voraussetzung für pharmakologische Aktivität bei Krebs. Die NAs wurden an zwei verschiedenen Krebszelllinien auf ihre Fluoreszenz-PD-Fähigkeiten getestet. In Kombination mit den jüngsten Berichten über Squalen-basierte NAs, die Plasmalipoproteine ​​nutzen, um eine indirekte Krebsbekämpfung zu erreichen [48], erweitert dieser 5-ALA-Nanotechnologie-Ansatz die Verwendung von 5-ALA für PD und PDT bei verschiedenen Krebsarten, wie zum Beispiel Prostatakrebs, der in dieser Studie verwendet wurde .

Ergebnisse und Diskussion

5-ALA-SQ-Bausteinsynthese

Eine effiziente konvergierende chemische Strategie wurde verwendet, um den 5-ALA-SQ-Baustein aus Squalen und 5-ALA zu synthetisieren (Abb. 2). 5-ALA wurde zuerst am Aminoende mit N . geschützt -Boc-Schutzgruppe unter Verwendung von Standardbedingungen. Squalenalkohol, der die Nanoanordnung induziert (3 ) wurde aus Squalen in vier Syntheseschritten nach in der Literatur beschriebenen Verfahren synthetisiert [49]. Boc-5-ALA (2 ) und Squalenalkohol (3 ) wurden dann in Gegenwart von EDC und DMAP gekuppelt, um das geschützte Esterderivat (4 ) in guter Ausbeute. Die abschließende Boc-Entschützung musste unter milden sauren Bedingungen durchgeführt werden, um eine elektrophile Addition an das Squalengerüst zu vermeiden. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, um den NA-Baustein in guter Ausbeute zu erhalten.

Synthese von 5-ALA-SQ-Bausteinen. 5-ALA-SQ wurde in vier Syntheseschritten unter Verwendung der konvergenten Synthese aus 5-ALA und SQ synthetisiert

5-ALA-SQ-Nanobaugruppen

Um eine effiziente Abgabe eines Wirkstoffs durch Nanopartikel (NPs) an seinen Wirkort zu erreichen, spielen Parameter wie Nanopartikelgröße, Form und Oberflächenladung eine wichtige Rolle und bestimmen die Pharmakokinetik von Nanoabgabesystemen im Körper [ 50]. Insbesondere bestimmt die Partikelgröße mehrere pharmakokinetische Phänomene wie die NP-Halbwertszeit im systemischen Kreislauf, die Sequestrierung durch Makrophagen und die Extravasation durch undichte Gefäße in den Wirkort [51]. Form und Größe von Nanopartikeln regulieren ihre Fähigkeit zur Extravasation durch die im Gefäßsystem gefundenen Fensterungen [50, 51]. Größe und Form sind auch für das aktive Targeting und die Aufnahme in Zellen sehr wichtig, da kleinere Nanopartikel und kugelförmige Formen eine kleinere Oberfläche haben und daher im Vergleich zu größeren nicht-sphärischen nanopartikulären Systemen stark begrenzte Kontaktpunkte haben [51].

Die Selbstorganisation des 5-ALA-SQ-Bausteins erfolgte spontan in wässrigen Medien. Die NAs wurden durch Nanopräzipitation gebildet. 5-ALA-SQ-Konjugat wurde in organischen Lösungsmitteln gelöst und tropfenweise in Wasser gegeben. Die vollständige Verdampfung der organischen Lösungsmittel ergab eine wässrige Lösung von NAs. 5-ALA-SQ-NAs waren monodispers mit einem niedrigen Polydispersitätsindex von 0,12. Elektrophoretische Mobilitätsmessungen ergaben ein ζ-Potential von 36 mV und dynamische Lichtstreuung (DLS) ergab eine monodisperse Verteilung von NAs mit einer durchschnittlichen Größe von 70 nm (Abb. 3). Der Größenbereich der NA bietet ein gutes Potenzial für eine verlängerte Zirkulation im Blutkreislauf [50]. Trotzdem sind 5-ALA-SQ-NAs deutlich kleiner als zuvor berichtete SQ-Komposite, die zwischen 100 und 300 nm liegen, was auf eine andere supramolekulare Anordnung hinweist [19].

Charakterisierung von 5-ALA-SQ-NAs. Niedrig (a ) und hoch (b ) Kryo-TEM-Bilder mit Vergrößerung, DLS-Analyse (c ) und Stabilität bei 4 °C (d )

Die geringere Größe könnte auf positiv geladene Aminogruppen und ein relativ kleines 5-ALA-Molekül im Vergleich zur SQ-Einheit zurückzuführen sein. Es wurde gezeigt, dass die Variation kleiner Moleküle, die an Squalen gebunden sind, Veränderungen in der Selbstorganisation und Packung von Verbindung-Squalen-Konjugaten einführt und folglich die Form und Größe von NAs verändert [16]. Es ist möglich, dass sich die stark positiv geladene Aminogruppe von 5-ALA zum Hauptwasser hin orientiert, während die lipophilen Ketten das Innere dieser NAs besetzen; die genaue supramolekulare Struktur muss jedoch noch aufgeklärt werden. Trotz der deutlich geringeren Größe im Vergleich zu anderen Squalen-Nanokompositen weisen die NAs eine ausgezeichnete Lagerstabilität auf, wobei Größe und PDI über mehrere Wochen konstant bleiben.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der neuen 5-ALA-SQ-NAs ist, dass sie eine Wirkstoffbeladung von 26% erreichen, was im Vergleich zu anderen berichteten 5-ALA-Nanopartikelsystemen, bei denen die Beladung viel weniger effizient war, hoch ist [37, 38, 41]. Die Wirkstoffbeladung ist bei der NP-Verabreichung sehr wichtig, da bei schwach mit Wirkstoff beladenen NPs die verabreichte Dosis möglicherweise nicht ausreicht, um eine pharmakologisch aktive Konzentration im Zielgewebe zu erreichen [4]. Die Beladung konnte durch einfache Berechnung unter Berücksichtigung der Molekulargewichte von 5-ALA und 5-ALA-SQ bestimmt werden, da 5-ALA kovalent im Molverhältnis 1:1 an das Squalengerüst gebunden ist.

PpIX-Fluoreszenzkinetische Messungen in Krebszellen

Die zeitabhängige Bildung von PpIX wurde in menschlichen PC3-Prostatakrebszellen und U87MG-Glioblastomen, die mit 5-ALA-SQ-NAs und 5-ALA-Hex als Referenz inkubiert wurden, untersucht. Abbildung 4 zeigt die PpIX-Bildung in menschlichen PC3-Prostatakrebszellen, die über 24 Stunden steigenden Konzentrationen von 5-ALA-SQ-NAs oder 5-ALA-Hex ausgesetzt waren.

Kinetische Fluoreszenzmessungen der PpIX-Akkumulation in PC3-Zellen. Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von 5-ALA-SQ-NAs inkubiert (a ) oder 5-ALA-Hex (b )

Konzentrationsabhängige PpIX-Fluoreszenzprofile wurden für 5-ALA-SQ-NAs beobachtet. Bei 1,0 und 2,0 mM nahm die PpIX-Fluoreszenz über 24 Stunden stetig zu, während sie nach 8 Stunden Inkubation für niedrigere Konzentrationen ein Plateau erreichte. Andererseits induzierte 5-ALA-Hex die höchste Akkumulation von PpIX im unteren Konzentrationsbereich zwischen 0,10 und 0,30 mM, wie zuvor berichtet [35, 52]. Es wurde jedoch festgestellt, dass 5-ALA-Hex in Konzentrationen über 1 mM für Zellen toxisch ist, was die beobachtete Gesamtfluoreszenz reduziert und ihre Verwendung behindert [36].

Als nächstes wurde eine dosisabhängige PpIX-Akkumulation in PC3- und U87MG-humanen Glioblastom-Krebszellen mit dem Ziel durchgeführt, die optimale NA-Dosierung abzuschätzen. Die Fluoreszenzintensität nach 4 und 24 h Inkubation mit 5-ALA-SQ-NAs und 5-ALA-Hex ist in Abb. 5 gezeigt. Sehr wichtig ist, dass 5-ALA-SQ-NAs die PpIX-Produktion in beiden Zelllinien induzierten. Darüber hinaus sind die maximalen Fluoreszenzwerte in beiden Zelllinien mit denen der ALA-Hex-Kontrolle vergleichbar. Es kann auch festgestellt werden, dass in PC3-Zellen 1,0 und 2,0 mM Konzentrationen von 5-ALA-SQ-NAs optimal waren, um die höchste Akkumulation von PpIX zu induzieren. In U87MG-Zellen gab es bei kurzen Inkubationszeiten keine signifikanten Unterschiede zwischen verschiedenen Konzentrationen von 5-ALA-SQ-NAs (Fig. 5c). Nach 24 h wurde festgestellt, dass die PpIX-Akkumulation von der Konzentration von 5-ALA-SQ-NAs oder 5-ALA-Hex abhängig war, ähnlich wie bei PC3-Zellen. Nach längerer Inkubationszeit bei höheren Konzentrationen von 5-ALA-SQ-NAs, die empfindlicher auf die Anwesenheit von NAs reagierten, wurde eine Abnahme der PpIX-Induktion festgestellt, die der von ALA-Hex ähnlich war.

Dosis-Wirkungs-Kurven. Konzentrationsabhängige PpIX-Akkumulation mit 5-ALA-SQ-NAs (blau) und 5-ALA-Hex (rot) in PC3 (a , b ) und U87MG (c , d ) Zellen nach 4 h (links) und 24 h (rechts) Inkubation

Abbildung 5 zeigt, dass die PpIX-Produktionskurven nach 24 Stunden sowohl in PC3- als auch in U87MG-Zellen glockenförmig sind. Während eine 1 mM-Konzentration von 5-ALA-SQ-NAs die höchste PpIX-Akkumulation in PC3-Zellen induzierte, tolerierten U87MG-Zellen höhere Konzentrationen und eine Zunahme der PpIX-Fluoreszenz wurde bis zu 2 mM 5-ALA-SQ-NAs beobachtet. Im Allgemeinen waren höhere Konzentrationen von 5-ALA-SQ-NAs erforderlich, um die Biosynthese von PpIX im Vergleich zu 5-ALA-Hex effizient zu induzieren, vermutlich aufgrund der unterschiedlichen Spaltungsraten der Esterbindung innerhalb der Krebszellen. Aufgrund der unspezifischen Toxizität von 5-ALA-Hex wurde eine Abnahme der PpIX-Produktion beobachtet, wenn Konzentrationen von mehr als 1 mM von 5-ALA-Hex verwendet wurden. Dieser Effekt war bei 5-ALA-SQ viel weniger ausgeprägt, wo die Fluoreszenz die Spiegel begannen erst bei der höchsten getesteten Konzentration (3,3 mM) und verlängerten Inkubationszeiten abzufallen (Abb. 5b, d). Die Fluoreszenzwerte waren jedoch für beide Verbindungen ähnlich, ohne dass für die NAs eine Fluoreszenzverzögerung beobachtet wurde.

Die NAs wurden auch im U87MG-Glioblastom gegen die 5-ALA-Kontrolle getestet, die für PD von Glioblastom während der chirurgischen Resektion vermarktet wird. Abbildung 6 zeigt die Fluoreszenz der U87MG-Zelle nach 4 und 24 Stunden. 5-ALA-SQ-NAs induzierten nach 4 h eine signifikant höhere Fluoreszenz im Vergleich zu 5-ALA, was in einem klinischen Umfeld von hoher Relevanz ist. Nach 24 h verschiebt sich das Fluoreszenzprofil bei niedrigeren Konzentrationen zugunsten von 5-ALA, da die langsame, aktive Aufnahme von 5-ALA ausreichende 5-ALA-Mengen in den Zellen liefert. NAs zeigen immer noch ähnliche Fluoreszenzniveaus wie 5-ALA bei optimalen 1,0 und 2,0 mM Konzentrationen von NAs (Abb. 6b).

Dosis-Wirkungs-Kurven. Konzentrationsabhängige PpIX-Akkumulation in U87MG-Zellen nach 4 h (a ) und 24 Stunden (b ) Inkubation mit 5-ALA-SQ NAs (blau) und 5-ALA (grün)

In der klinischen Praxis wird 5-ALA entweder topisch oder oral verabreicht, aber aufgrund seiner geladenen Natur gelangt je nach Zelltyp nur ein kleiner Teil der Anfangsdosis über endogene Peptidtransporter wie PEPT1, PEPT2 oder BETA-Transporter in die Zielzellen [40, 53]. Neuere Studien an NAs aus einem SQgem-Derivat weisen darauf hin, dass der Zelleintritt durch Albumin-verstärkte Diffusion einzelner Molekülbausteine ​​gesteuert wird und stark von der Anwesenheit extrazellulärer Proteine ​​abhängt [54, 55]. Darüber hinaus zeigten dunkelrot fluoreszierende NAs, über die wir kürzlich berichtet haben, auch eine schnelle Internalisierung, und 5-ALA-SQ-Fluoreszenzkinetikexperimente und die Dosis-Wirkungs-Kurven bestätigen die Internalisierung von Einzelmolekül-Bausteinen und einen effizienten nachfolgenden Metabolismus, um fluoreszierendes PpIX zu ergeben.

Schlussfolgerungen

In dieser in vitro Machbarkeitsstudie wurde eine konvergierende chemische Strategie verwendet, um den 5-ALA-SQ-Baustein aus Squalen und 5-ALA zu synthetisieren. Die 5-ALA-SQ-NAs wurden durch spontane Nanopräzipitation in Wasser hergestellt. NAs waren monodispers und stabil mit einem Größenmittel von 70 nm, einem Polydispersitätsindex von 0,12, einem positiven ζ-Potential von 36 mV und einer hohen 5-ALA-Beladung von 26 %. Die PpIX-Produktion wurde in vitro in zwei Krebszelllinien durch Messung des Fluoreszenzanstiegs im Laufe der Zeit bewertet und mit 5-ALA und 5-ALA-Hex verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass SQ-ALA-NAs sehr effizient die PpIX-Produktion in PC3- und U87MG-Krebszelltypen induzieren. Sie übertreffen 5-ALA-Hex bei der Fluoreszenzinduktion bei höheren Konzentrationen bei Inkubationszeiten von 4 und 24 Stunden in vitro; im Vergleich zu 5-ALA zeigen sie jedoch eine überlegene Fluoreszenzinduktion bei kürzeren Inkubationszeiten. Im Rahmen dieser Ergebnisse können wir den Schluss ziehen, dass 5-ALA-SQ-NAs eine attraktive nanotechnologische Lösung zur Überwindung der pharmakokinetischen Nachteile von 5-ALA darstellen. Darüber hinaus werden In-vivo-Experimente ihr Potenzial für die systemische Abgabe von 5-ALA für die Fluoreszenz-PD- und PDT-Therapie von Tumoren evaluieren.

Methoden/Experimental

Reagenzien wurden von den kommerziellen Lieferanten Sigma-Aldrich (Bucks, Schweiz) und Acros Organics (Basel, Schweiz) gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet. Deuterierte NMR-Lösungsmittel wurden von Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, USA) erhalten. Tetrahydrofuran (THF) und Dichlormethan (CH₂ .) Kl₂ ) wurden aus einem Trocknungssystem auf Aluminiumoxidsäulenbasis von Anhydrous Engineering erhalten. Alle anderen verwendeten Lösungsmittel waren von HPLC-Qualität. N,N-Dimethylformamid (DMF), Methanol (CH₃ OH), Diethylether (Et₂ O) und Aceton wurden von Sigma-Aldrich (Buchs, Schweiz) bezogen. Ethylacetat (AcOEt) wurde von Biosolve (Dieuze, Frankreich) bezogen; Acetonitril (CH₃ CN) wurde von Carlo Erba Reagents (Balerna, Schweiz) geliefert. Hexan ~95% n-Hexan wurde von Fisher Chemical (Basel, Schweiz) bezogen. Das für die Zubereitungen verwendete Wasser wurde mit einem Milli-Q-Laborwassersystem (Millipore, Molsheim, Frankreich) entionisiert. Chemische Reaktionen wurden unter Verwendung von Standard-Spritzensepten mit positivem Argondruck durchgeführt, um wasserfreie Bedingungen zu gewährleisten.

Dünnschichtchromatographie (DC) wurde mit aluminiumbeschichteten Silicaplatten (Merck-Keiselgel 60 F254) mit einer geeigneten mobilen Phase durchgeführt und mit einer UV-Fluoreszenzlampe (254 und 366 nm) visualisiert und/oder mit Ninhydrin, 20 % Schwefelsäure entwickelt Säure oder Phosphomolybdänsäure (PMA). Flash-Chromatographie wurde auf einem automatisierten PuriFlash® 4100-Gerät von Interchim (Montlucon, Frankreich) unter Verwendung von Interchim-Kieselgelsäulen puriFlash® HP 30 μm, ausgestattet mit einem PDA-Detektor (200–800 nm) und einem automatisierten Fraktionssammler, durchgeführt. Das Elutionsprofil wurde mit der Flash-Interchim-Softwareversion 5.0x überwacht. Eine semipräparative HPLC-Säule wurde auf einer Waters Symmetry 300TM – 5 μm (19  ×  150 mm), C8-Säule (Baden-Dättwil, Schweiz) durchgeführt. Die analytische UPLC wurde unter Verwendung einer Macherey-Nagel EC50/2 Nucleodur Gravity 1,8 μm-Säule (50 ×   2,1 mm) durchgeführt, die auf einem Wassersystem montiert war, das mit einem Waters PDA-Detektor (Baden-Dättwil, Schweiz) ausgestattet war. Puffer A = CH₃ CN + 0,1% Ameisensäure) und Puffer B = H₂ O + 0,1% Ameisensäure. Flussrate =400,0 μl/min bei 25 °C. ¹ H und ¹³ C-NMR-Spektren wurden auf Varian Gemini 300 MHz-, Varian Innova 500 MHz- oder Bruker Avance III Cryo 600 MHz-Spektrometern bei 298 K aufgenommen. Chemische Verschiebungen (δ) sind in Teilen pro Million (ppm) angegeben und Kopplungskonstanten (J) sind in Hertz (Hz). s für Singulett, d für Dublett, dd für Dublett von Dubletts, t für Triplett, q für Quartett und m für Multiplett. Als interne Referenz für die chemischen Verschiebungen des Protons und des Kohlenstoffs wurden Restlösungsmittelpeaks verwendet. NMR-Spektren wurden mit dem Softwarepaket Mnova Version 10.0.2 verarbeitet. Massenspektrometrie mit niedriger Auflösung (LRMS) wurde auf einem HTS PAL-LC10A – API 150Ex Instrument im ESI (positiver Modus) durchgeführt. Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) wurde auf einem QSTAR Pulsar (AB/MDS Sciex) Instrument im ESI (positiver Modus) durchgeführt. Chemische Strukturen wurden gezeichnet und gemäß der IUPAC-Nomenklatur unter Verwendung des Softwarepakets ChemBioDraw Ultra Version 14.0.0.117 benannt. Der pH-Wert wurde auf einem Metrohm 691 pH-Meter unter Verwendung einer Spearhead-Elektrode (Zofingue, Schweiz), kalibriert mit Metrohm-Puffer, gemessen. Statistische Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 6, 2016 (GraphPad Software) durchgeführt. P Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Synthese des SQ-ALA-Bausteins

5-(tert-Butoxycarbonylamino)-4-oxopentansäure (2)

Boc-5-ALA wurde gemäß dem veröffentlichten Verfahren synthetisiert. Die spektroskopischen Daten sind identisch mit der Literatur [56]. ¹ H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) 12,12 (s, 1H), 7,06 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 3,76 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 2,61 (t, J = 6,6 Hz , 2H), 2,40 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 1,38 (s, 9H). ¹³ C-NMR (151 MHz, DMSO) 206,62, 174,07, 156,21, 78,54, 49,97, 40,38, 40,24, 40,11, 39,97, 39,83, 39,69, 39,55, 34,22, 28,64. [M+H] ⁺ 232.1, gefunden 232.7.

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-pentaen-1-ol (3)

Squalenalkohol 3 wurde aus Squalen in vier Syntheseschritten in 23,7% Ausbeute als farbloses Öl nach den beschriebenen Verfahren synthetisiert [49]. ¹ H-NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ 5.17-5.06 (m, 5H, CH), 3.62 (q, J =6,3 Hz, 2H, CH₂ -OH), 2,17 – 1,92 (m, 18H, CH₂ ), 1,67 (s, 3H, CH₃ ), 1,59 (m, 17 H, CH₃ und CH₂ ). ¹³ C-NMR (75 MHz, CDCl₃ ) 135,35, 135,17, 135,14, 134,81, 131,49, 125,05, 124,64, 124,60, 124,47, 63,07, 39,98, 39,95, 39,89, 36,24, 30,92, 28,48, 26,98, 26,88, 26,78, 25,94, 17,92, 16,28, 16,23, 16.08. LRMS (ESI):m/z berechnet für [M+NH₄ ] ⁺ 404.4, gefunden 404.8.

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-Pentaen-1-yl 5-((tert-Butoxycarbonyl)amino)-4-oxopentanoat (4)

Squalenalkohol (3 ) (100 mg, 0,26 mmol), EDC (74 mg, 0,38 mmol) und DMAP (94 mg, 0,78 mmol) und 5-(tert-Butoxycarbonylamino)-4-oxopentansäure (2) (77 mg, 0,34 mmol) wurden in DCM (15 ml) gelöst. Nach Rühren über Nacht bei Umgebungstemperatur wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft und das Rohprodukt durch Flash-Chromatographie unter Verwendung eines DCM/Ethylacetat (EA)-Gradienten gereinigt, was ein farbloses Öl (108 mg, 0,18 mmol, 70 %) ergab. ¹ H-NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ 5,31 – 5,20 (br s, 1H), 5,13 – 5,07 (m, 5H), 4,09 – 3,95 (m, 4H), 2,75 – 2,53 (m, 4H), 2,02 – 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63 – 1,50 (m, 19H), 1,41 (s, 9H). ¹³ C-NMR (75 MHz, CDCl3) 204,46, 172,65, 135,30, 135,16, 135,09, 133,75, 131,43, 125,34, 124,60, 124,57, 124,48, 124,45, 64,81, 50,53, 39,96, 39,93, 39,87, 35,92, 34,56, 28,52 , 28.43, 28.24, 28.02, 26.97, 26.86, 25.92, 23.11, 17.90, 16.25, 16.21, 16.06. LRMS (ESI):m/z berechnet für [M+NH₄ ] ⁺ 617.5, gefunden 617.8.

Trifluoressigsäuresalz von 5-Amino-(((4E,8E,12E,16E)-4,8,13 ,17,21-Pentamethyldocosa-4,8,12,16,20-pentaen-1-yl)oxy)-4-oxopentanoat (5)

Verbindung 4 (34 mg, 57 mmol) wurde in DCM (2,0 ml) gelöst. Trifluoressigsäure (TFA) (200 μl) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach 10 Minuten wurden die Lösungsmittel im Vakuum bei niedriger Temperatur verdampft und Spuren von TFA wurden durch gemeinsames Verdampfen mit EA (3 × 10 ml) entfernt. Das Rohprodukt wurde durch RP-HPLC unter Verwendung von vollem H₂ . gereinigt O/AcN (0,025 % TFA)-Gradient, der ein farbloses Öl ergibt (25 mg, 74 %). %). ¹ H-NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ 5,31 – 5,20 (br s, 1H), 5,13 – 5,07 (m, 5H), 4,09 – 3,95 (m, 4H), 2,75 – 2,53 (m, 4H), 2,02 – 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63 – 1,50 (m, 19H). LRMS (ESI):m/z berechnet für [M+H] ⁺ 500.4, gefunden 500.6.

Vorbereitung von Nanobaugruppen

NAs wurden durch Nanopräzipitation hergestellt, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben wurde [20]. Kurz gesagt, Baustein 5 (1,2 mg, 2,0 μmol) wurde in einem 50/50 V . gelöst /V Mischung Aceton/Ethanol (500 μl). Die organische Phase wurde dann tropfenweise unter Verwendung einer Mikrospritze in MilliQ-Wasser (1,25 ml) mit 100 μl/min unter magnetischem Rühren zugegeben. Nach 5 Minuten unter Rühren wurde der Magnetrührstab entfernt und die organischen Lösungsmittel und der Wasserüberschuss unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 30 °C entfernt. Die Endkonzentration der Nanoanordnungen betrug 2,00 mM.

Charakterisierung von 5-ALA-SQ-NAs

Die 5-ALA-Beladung von 5-ALA.SQ NA wurde aus den jeweiligen Beiträgen der Molekulargewichte von 5-ALA und des 5-ALA-SQ-Konjugats wie folgt berechnet [19]:

Der hydrodynamische Durchmesser von NAs wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) unter Verwendung eines NANO ZS-Instruments von Malvern (Worcestershire, UK) mit der Software ZetaSizer 7.01 gemessen. Die Analysen wurden mit 4 mW He-Ne-Laser (633 nm) bei einem Streuwinkel von 173° bei 25°C in einer Mikroküvette aus Polystyrol (PS) der Firma Brand (Wertheim, Deutschland) durchgeführt. Das Zetapotential (ZP) wurde mit dem gleichen Nano ZS Instrument von Malvern in gefalteten Kapillarzellen DTS 1070 von Malvern bestimmt. Die Größenverteilung und der größenmittlere Durchmesser wurden aus den Daten berechnet. Die Stabilität von NAs, die bei 4 °C gelagert wurden, wurde über einen Zeitraum von 1 Monat zu regelmäßigen Zeitpunkten mit DLS getestet.

Die Morphologie der NAs wurde mit einem kryogenen Transmissionselektronenmikroskop (Kryo-TEM) mit TECNAI® G ² . bewertet Sphera-Mikroskop (FEI, Thermo Fisher Scientific), ausgestattet mit einer 2000 x 2000 Pixel hochauflösenden Digitalkamera TCL (Gräfelfing, Deutschland). Die verglasten Eisproben wurden mit dem Virtobot Kryo-Plunger (FEI, Thermo Fisher Scientific) hergestellt. NAs (2,0 μl, 2,0 mM) wurden auf Quantifoil Cu/Rh 200 mesh R3,5/1-Gitter (SPI, West Chester, USA) aufgetragen und mit flüssigem Ethan verglast.

Zellkultur

Humane Prostatakrebszellen PC3 (ATTC® CRL-1435™) und humane Glioblastomzellen U87MG (ATTC® HTB-14™) wurden gezüchtet und durch serielle Passage in F-12K-Nährstoffmischung (21127-022, Thermo Fisher Scientific) oder mindestens . gehalten Essential Media (31095-029, Thermo Fisher Scientific). Die Zellmedien wurden mit fötalem Kälberserum (10%, CVFSVF00-01, Eurobio), Streptomycin (100 μl/ml) und Penicillin (100 IE/ml, 15140-122, Thermo Fisher Scientific) ergänzt. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO_{2 kultiviert.}

In-vitro-PpIX-Fluoreszenzkinetikmessungen

Humane Prostatakrebszellen PC3 (12.000 Zellen/Vertiefung) und Glioblastomzellen U87MG (10.000 Zellen/Vertiefung) wurden in 96-Well-Platten (durchsichtige schwarze Platte, 3603, Corning) ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen steigenden Konzentrationen von 5-ALA-SQ-NAs, 5-ALA-Hex und 5-ALA in serumfreien Medien ausgesetzt. Die PpIX-Fluoreszenz wurde mit einem Plattenlesegerät (Safire, Tecan, Schweiz) zu verschiedenen Zeitpunkten aufgezeichnet. Die Anregungswellenlänge wurde auf 405 nm und die Emissionswellenlänge auf 630 nm eingestellt. Mittelwerte und s.d. für jede Konzentration zu jedem Zeitpunkt pro Platte wurden mit dem Referenzwert (keine Behandlung) subtrahiert und für jede Zelllinie aufgetragen.