Biokompatible FePO4-Nanopartikel:Wirkstofftransport, RNA-Stabilisierung und funktionelle Aktivität

Einführung

Unter verschiedenen anorganischen Nanopartikeln wie Gold, Siliziumdioxid und Quantenpunkten werden eisenbasierte Nanopartikel (Fe-NPs) für biomedizinische Anwendungen wie Kontrastmittel, Wirkstofftransportvehikel und thermisch basierte Therapeutika umfassend erforscht [1,2,3]. Aufgrund der magnetischen Eigenschaft, der hohen Bioanpassungsfähigkeit und des bekannten endogenen Eisenstoffwechsels sind Fe-NPs wünschenswerte Kandidaten für biomedizinische Anwendungen. Als solche machen Fe-NPs den Großteil der von der FDA zugelassenen anorganischen Nanomedizin aus [1, 2]. Dazu gehören INFeD, DexFerrum, Ferrlecit, Venofer, Feraheme und Injectafer, die für ihre Anwendung bei Eisenmangelanämie und Eisenmangel bei chronischer Nierenerkrankung im Handel erhältlich sind [1]. Ebenso ist die intravenöse Gabe des Chelat-Eisengluconats eine gut verträgliche Intervention bei Anämie [4]. Anämie ist einer der häufigsten Nährstoffmangel der Welt und Fe-basierte Nanopartikel wie FePO₄ und FeSO₄ wurde zur Anreicherung von Lebensmitteln verwendet, um Anämie zu verhindern. Lebensmittelanreicherung ist der Prozess der Zugabe von Mikronährstoffen zu Lebensmitteln mit dem Ziel, den Nährstoffmangel in einer Bevölkerung zu überwinden [5]. FePO₄ NPs sind aufgrund ihrer Biokompatibilität, hohen Bioverfügbarkeit und überlegenen sensorischen Leistung, die keine nachteiligen organoleptischen Wirkungen haben, von besonderem Interesse für die Nahrungsmittelanreicherung [6,7,8,9]. Perfectoet al. haben das FePO₄ . nachgewiesen Die Internalisierung von NPs in menschliche Darmzellen erfolgt hauptsächlich über den divalenten Metalltransporter-1 (DMT-1) und kann daher leicht resorbiert werden [9, 10]. Feridex® und Revosit® auf Eisenbasis sind weit verbreitete Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRT) für die kontrastverstärkte MRT [11,12,13,14,15,16]. Angesichts dieser herausragenden Berichte hat FePO₄ NPs präsentieren sich als gutes Lieferfahrzeug. Hier haben wir FePO₄ . untersucht als Vehikel für die Arzneimittelabgabe durch Beladen mit einem Krebsmedikament, Doxorubicin (DOX). Eisen(III)-Ionen (Fe ³⁺ .) ) kann einen Komplex mit dem DOX-Molekül bilden, was durch die elektrostatische Wechselwirkung zwischen elektronenarmem Fe in FePO₄ . erleichtert wird und elektronenreiche –OH-Gruppe in DOX, um DOX-beladenes FePO₄ . zu bilden NPs:FePO₄ -DOX-NPs. Wir haben die physikalisch-chemischen Eigenschaften von FePO₄ . bewertet und FePO₄ -DOX-NPs und bewerteten ihr Biokompatibilitäts- bzw. Zytotoxizitätsprofil in Maus-Osteosarkom K7M2 und Fibroblasten-NIH/3T3-Zelllinie.

Darüber hinaus hat der anorganische Nanopartikel vielversprechende Möglichkeiten zur Stabilisierung und Abgabe von Nukleinsäuren gezeigt [17,18,19]. In dieser Hinsicht wurden die Goldnanopartikel aufgrund ihrer Fähigkeit, Oligonukleotide in ihrer Oberfläche zu immobilisieren, umfassend untersucht, was zur Verhinderung der molekularen Aggregation und des Abbaus führt [17, 20]. Gold ist jedoch kein endogenes Element und kann daher seine translationale Anwendung einschränken. Hier Fe-basierte Nanopartikel wie FePO₄ Nanopartikel können aufgrund ihrer endogenen Natur und ihres etablierten Biokompatibilitätsprofils von größtem Interesse für RNA-Stabilisierungsstudien sein. Es gibt zwei vorgeschlagene Wechselwirkungsmechanismen von Nukleinsäure (RNA/DNA) mit Fe-NPs zur Stabilisierung – (1) Bildung von Wasserstoffbrücken und elektrostatische Wechselwirkung zwischen der Phosphatgruppe des Nukleinsäurerückgrats und Fe-NPs, was zur Adsorption von Nukleinsäuren führt Säure in Fe-NPs und (2) Nukleinsäure kann über Nukleotidbasenpaar-Wechselwirkung an die Fe-NPs-Oberfläche adsorbieren [19, 21, 22]. Eine Studie hat das Potenzial von Calciumphosphat-Nanopartikeln für die Stabilisierung und Abgabe von DNA-Impfstoffen gezeigt [23]. In diesem Zusammenhang haben wir hier die RNA-Stabilisierung und funktionelle Aktivität eines anderen phosphatbasierten Nanopartikels, FePO₄ ., untersucht , um das multifunktionale Potenzial von FePO₄ . zu untersuchen Nanopartikel, bei der Lieferung und Stabilisierung von Fracht.

Mit der raschen Zulassung des mRNA-Impfstoffs gegen COVID19 sind mRNA-Impfstoff-Nanopartikel von großem Interesse, da RNA einer schnellen Hydrolyse und einem Verlust der funktionellen Expression unterliegt, es obliegt dem Nanopartikel, diese kritischen Eigenschaften zu verbessern. Hier zeigen wir FePO₄ NPs stabilisieren RNA und unterstützen die funktionelle mRNA-Translation. Angesichts dieser hervorragenden Eigenschaften ist FePO₄ NPs könnten für die Anreicherung von Nahrungsmitteln, die Verabreichung von Medikamenten und die RNA in Betracht gezogen werden, was spannende biomedizinische Anwendungen eröffnet.

Ergebnisse und Diskussion

FePO₄ Nanopartikelsynthese, Charakterisierung und Biokompatibilitätsanalyse

Eine einfache einstufige chemische Reaktion zwischen (NH₄ )₃ PO₄ und Fe(NO₃ )₃ gibt FePO₄ als Niederschlag, der in biokompatiblem Lipid-PEG-Tensid dispergiert ist, das hilft, FePO₄ . zu stabilisieren Nanopartikel und verhindern eine Aggregation. FePO₄ Die NPs wiesen eine hydrodynamische Größe von 175 ± 5 nm mit einem Polydispersitätsindex (PDI) von 0,150 ± 0,01 auf, was auf eine gute Partikelhomogenität und eine enge Größenverteilung schließen lässt. Die Zetapotentialanalyse zeigte eine negative Oberflächenladung von FePO₄ NPs mit − 19,1 ± 8 mV Zetapotential. Die negative Oberflächenladung trägt außerdem dazu bei, Partikel in Kolloiden zu stabilisieren, wodurch die Proteinopsonisierung verhindert wird, ein Mechanismus, der das zelluläre Targeting verhindert und die Pharmakokinetik verändert [24,25,26]. FePO₄ wurde weiter durch FTIR charakterisiert. Abbildung 1c zeigt die Spektralcharakteristik von FePO₄ Nanopartikel und ihr Vorläufer – Fe(NO₃ )₃ und (NH₄ )₃ PO₄ . FePO₄ Spektren zeigen einen deutlichen scharfen Peak auf 1030 cm ⁻¹ was auf das P–O-Streckband zurückgeführt werden kann, ein kleiner Peak bei 520 cm ⁻¹ entspricht der antisymmetrischen O–P–O-Biegung und reicht von 3000 bis 3500 cm ⁻¹ repräsentiert Wasserbiege- und Streckschwingungen von adsorbierten Wassermolekülen [27, 28]. Die FePO₄ Spektren zeigten das Vorhandensein von PO₄ ³⁻ Gruppe und ähneln dem in anderen Studien berichteten FTIR-Peak, was die Bildung von FePO₄ . bestätigt Nanopartikel [27,28,29]. Fe(NO₃ )₃ Spektren zeigten charakteristische Peaks für N–O-Streckbanden bei 1326 und 813 cm ⁻¹ [30]. Peak bei 1625 kann auf –OH-Biegevibrationen und einen breiten Peak um 3000 cm ⁻¹ . zurückgeführt werden kann auf Wasserbiege- und Streckschwingungen zurückgeführt werden [30]. Ebenso (NH₄ )₃ PO₄ zeigte charakteristische Peaks für die Ammoniumgruppe um 1500 cm ⁻¹ und Phosphatgruppe etwa 1000 cm ⁻¹ [31]. Das Fehlen von Nitrat- und Ammoniumpeaks in FePO₄ Nanopartikel deuten darauf hin, dass das Produkt frei von möglichen Nebenprodukten ist und bestätigen die Reinheit der Synthese.

Charakterisierung und Biokompatibilität von FePO₄ Nanopartikel. a Hydrodynamische Größenverteilung von FePO₄ NPs, b Zeta-Potential-Messung von FePO₄ NPs mit Oberflächenladung, c FTIR von FePO₄ NPs und sein Vorläufer-Fe(NO₃ .) )₃ und (NH₄ )₃ PO₄ , und d Biokompatibilität von FePO₄ NPs auf Maus-Osteosarkom K7M2 und Maus-Fibroblasten-NIH/3T3-Zelllinie. NPs wurden 48 h lang in verschiedenen Konzentrationen behandelt (a, b Daten repräsentieren den Mittelwert  ± s.d.; n = 3 Wiederholungen. d repräsentiert den Mittelwert  ± s.d., n = 6 Replikate).

Mit der Gewissheit einer erfolgreichen Synthese, Reinheit, guter Größenhomogenität und stabiler Oberflächenladung von FePO₄ NPs haben wir die Biokompatibilität von FePO₄ . analysiert NPs. Zu diesem Zweck verwendeten wir Krebs- und Nicht-Krebszellen:Maus-Osteosarkom K7M2 und Maus-Fibroblasten NIH/3T3 und analysierten die Biokompatibilität von NPs in unterschiedlicher Konzentration in Bezug auf die Zellviabilität mittels MTT-Assay. FePO₄ NPs zeigten in beiden Zelllinien – K7M2 und NIH/3T3 – eine konzentrationsabhängige Biokompatibilität im Konzentrationsbereich von 20 bis 600 µg/ml (Abb. 1d). FePO₄ NPs zeigten eine gute Biokompatibilität bis zu einer Konzentration von 80 µg/ml mit einer Zelllebensfähigkeit von mehr als 70 %. Die Biokompatibilität war bei Nicht-Krebszellen NIH/3T3 im Vergleich zu Krebszellen K7M2 relativ höher.

Doxorubicin-Beladung in FePO₄ und Zytotoxizität von FePO₄ -DOX

Doxorubicin ist in FePO₄ . geladen durch das Co-Inkubations-Fällungsverfahren, bei dem Doxorubicin-Lösung mit der Vorstufe von FePO₄ . vermischt wird das führt zur Bildung von DOX-beladenem FePO₄ . Drei verschiedene Formulierungen zum Beladen von DOX werden verwendet, wie in den Verfahren diskutiert. Formulierung 1 zeigte die beste Beladungseffizienz von 26,81 % ± 1, während Formulierung 2 eine Beladungseffizienz von 8,83 % ± 2 zeigte und Formulierung 3 keine Beladung zeigte (Abb. 2a). Zum Beladen haben wir dem Vorläufer Fe(NO₃ .) DOX-Lösung zugesetzt )₃ in Formulierung 1 und zu (NH₄ )₃ PO₄ in Formulierung 2, während wir in Formulierung 3 DOX-Lösung zu FePO₄ . hinzugefügt haben NPs direkt. Die Beladungsdaten zeigten deutlich, dass die Zugabe von DOX zum FePO₄ NPs halten das DOX nicht zurück, während DOX zu einem der beiden Vorläufer hinzugefügt wird:Fe(NO₃ )₃ und (NH₄ )₃ PO₄ Lösung hilft beim Laden und Zurückhalten von DOX. Dies lässt sich dadurch erklären, dass Fe ³⁺ aus Fe(NO₃ )₃ können mit der in Doxorubicin enthaltenen elektronenreichen Sauerstoffgruppe einen Komplex bilden [32, 33]. Das Fe ³⁺ -DOX-Komplex wird dann durch Zugabe von (NH₄ )₃ PO₄ was zu FePO₄ . führt -DOX, das durch einen Farbwechsel von schwach gelb zu schwach braun gekennzeichnet ist (Abb. 2b). Trotz der Farbänderung gab es keine Änderung in den Emissionsspektren von FePO₄ -DOX, das Emissionsmaxima bei 590 nm zeigte, ähnlich dem von freiem DOX, wenn es bei 480 nm angeregt wurde (Abb. 2c). FePO₄ -DOX-NPs zeigten eine hydrodynamische Größe von 187 ± 7 nm und einen PDI von 0,143 ± 0,02, ähnlich dem von FePO₄ (Abb. 2d). Es gab jedoch einen signifikanten Unterschied in der Oberflächenladung von FePO₄ -DOX-NPs (-8,89 ± 5 mV), im Vergleich zu FePO₄ NP (-19,1 ± 8 mV) (Abb. 2e). Eine Änderung des Zetapotentials deutet auf funktionelle Veränderungen der Oberflächeneigenschaft von Nanopartikeln hin. Hier kann die Verringerung des Zetapotentials von − 19,1 auf − 8,89 mV der DOX-Komplexierung zugeschrieben werden, die dem Komplex kationische Eigenschaften verleiht.

Doxorubicin (DOX)-Beladung in FePO₄ NPs und Charakterisierung von FePO₄ -DOX. a DOX-Beladungseffizienz in drei verschiedenen Formulierungen von FePO₄ NPs und DOX, b bildliche Darstellung des Farbwechsels von gelb nach braun nach DOX-Beladung in FePO₄ um FePO₄ . zu formulieren -DOX, c Emissionsspektren Charakterisierung von DOX beladenem FePO₄ NPs (FePO₄ -DOX) nach Anregung bei 480 nm, d hydrodynamische Größenverteilung von FePO₄ -DOX NPs und e Zetapotential-Charakterisierung von FePO₄ -DOX-NPs mit Oberflächenladung (Daten repräsentieren den Mittelwert  ± s.d.; n = 3 Replikate)

Nach der physikalisch-chemischen Charakterisierung wurde die Zytotoxizität von FePO₄ -DOX wurde in K7M2- und NIH/3T3-Zellen analysiert und mit freiem DOX verglichen (Abb. 3). FePO₄ -DOX zeigte bei gleicher DOX-Konzentration in beiden Zelllinien eine höhere Zytotoxizität im Vergleich zu freiem DOX. Der IC50-Wert zeigte eine etwa 10-fache Verringerung mit FePO₄ -DOX-Behandlung von 2,61 bis 0,248 µM in NIH/3T3- und 1,01 bis 0,107 µM in K7M2-Zellen. Diese drastische Verringerung des IC50-Werts in beiden Zelllinien deutet auf ein verbessertes Zytotoxizitätsprofil von FePO₄ . hin -DOX-NPs. Das äquivalente FePO₄ Konzentration im IC50-Konzentrationsbereich von FePO₄ -DOX beträgt 40 µg/ml (0,107 µM in K7M2-Zellen) und 100 µg/ml (0,248 µM in NIH/3T3-Zellen), die beide im biokompatiblen Bereich von FePO₄ . liegen Konzentration, mit mehr als 70 % Zelllebensfähigkeit. Daher ist die Erhöhung von FePO₄ -DOX-Zytotoxizität kann dem Fe ³⁺ . zugeschrieben werden -DOX-Komplexbildung und nicht zum individuellen Beitrag von FePO₄ und DOX. Die Literatur hat die erhöhte zytotoxische Wirkung von Anthrazyklin wie Doxorubicin in Gegenwart von Eisen gezeigt [34,35,36,37]. Diese Berichte werden weiter durch die Linderung der Fe-DOX-Zytotoxizität durch die Verwendung von Eisenchelatoren gestützt [35,36,37]. Ein vorgeschlagener Mechanismus ist, dass der Fe-DOX-Komplex die Toxizität von DOX-abgeleiteten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verstärkt und relativ sichere ROS (O ^2· – und H₂ O₂ ) in viel toxischere ROS um, was zu erhöhten DNA-Schäden und Zelltod führt [34, 36]. Ein weiterer vorgeschlagener Mechanismus ist die Wechselwirkung von DOX mit der Funktion von eisenregulierenden Proteinen und Ferritin in Gegenwart von überschüssigem Fe, wodurch die Eisenhomöostase beeinflusst wird, was zu ROS-abhängiger und unabhängiger Schädigung und zum apoptotischen Zelltod führt [36, 38].

Zytotoxizität von FePO₄ -DOX-NPs. a, b Zytotoxizität von freiem Doxorubicin (DOX) und FePO₄ -DOX-NPs in Maus-Fibroblasten-NIH/3T3- und Osteosarkom-K7M2-Zelllinien in verschiedenen DOX-äquivalenten Konzentrationen. Die Zytotoxizität wurde in Prozent der Lebensfähigkeit der Zellen nach einer Partikelbehandlung für 48 Stunden analysiert. c, d Ein Vergleich der prozentualen Lebensfähigkeit der Zellen von FePO₄ -DOX-NPs und freies DOX in NIH/3T3- bzw. K7M2-Zelllinien bei äquivalenter DOX-Konzentration. Der Einschub in der Mitte stellt die IC-50-Werte von freiem DOX und FePO₄ . dar -DOX-NPs in NIH/3T3- und K7M2-Zellen (Daten repräsentieren den Mittelwert  ± s.d.; n = 6 Replikate)

Zusammen mit der erhöhten Zytotoxizität, FePO₄ -DOX zeigte eine Selektivität gegenüber Krebszellen mit einem höheren Zytotoxizitätsverhalten ähnlich dem von freiem DOX. Abbildung 3c zeigt 0,1 µM DOX-Äquivalent FePO₄ -DOX zeigte 53 % Zelllebensfähigkeit für die Krebszelle K7M2 im Vergleich zu 72 % Zelllebensfähigkeit für Nicht-Krebs-NIH/3T3. Ebenso zeigte freies DOX auch ein höheres Zytotoxizitätsverhalten gegenüber Krebszellen, mit 54 % Zelllebensfähigkeit in K7M2-Zellen im Vergleich zu 66 % in NIH/3T3. Im Fall von FePO₄ . haben sich die Unterschiede jedoch vergrößert -DOX, mit 19% Unterschieden in der Zelllebensfähigkeit zwischen Krebs- und Nicht-Krebszellen im Vergleich zu 12% bei freiem DOX. Zytotoxizitätsanalysen haben gezeigt, dass Fe-Komplexierung mit DOX in FePO₄ -DOX NPs hat die Zytotoxizität signifikant erhöht und die Selektivität gegenüber Krebszellen verbessert.

Zelluläre Internalisierung von FePO₄ -DOX-NPs

Das Internalisierungsverhalten von FePO₄ -DOX-NPs wurden nach einer zeitabhängigen Internalisierungsstudie mit konfokaler Mikroskopie analysiert (Abb. 4). Als Positivkontrolle wurde freies DOX verwendet. Sowohl FePO₄ -DOX-NPs und freies DOX zeigten in den anfänglichen Inkubationszeitpunkten von 0,5 und 1 h keine signifikante Internalisierung. Nach 3 h Inkubation zeigten jedoch beide eine Internalisierung, wie durch die rote DOX-Fluoreszenz im konfokalen Bild dargestellt. Die blaue Farbe kommt von der Kernfärbung durch DAPI. Die Analyse zeigt, dass innerhalb von 3 h FePO₄ -DOX-NPs internalisieren in Zellen und folgen einem ähnlichen Internalisierungsverhalten wie dem von freiem DOX. Es ist wichtig zu beachten, dass aufgrund der Farbänderung von FePO₄ -DOX, das im Vergleich zur roten Farbe von freiem DOX bräunlich ist, können wir das relative Internalisierungsprofil von FePO₄ . nicht quantitativ vergleichen -DOX. Dennoch bestätigte der Internalisierungsassay, dass FePO₄ -DOX wird innerhalb von 3 h von den Zellen aufgenommen. Angesichts des gut verstandenen Mechanismus des Umgangs mit Eisen durch unseren Körper könnten die vorgeschlagenen NPs vielversprechend bei der Entwicklung von eisenbasierten Krebstherapeutika mit der Fähigkeit sein, das therapeutische Ansprechen in einer einzigen Therapiesitzung zu überwachen.

Zelluläre Internalisierungsstudie. Zelluläre Internalisierung von FePO₄ -DOX-NPs und freies DOX auf K7M2-Zellen nach 3 h, 1 h und 0,5 h Behandlung. Die Zellen wurden mit 200 µl einer 5 µg/ml DOX-Konzentration behandelt. Die rote Farbe, die in einer mit Nanopartikeln behandelten Zelllinie beobachtet wurde, weist auf eine erfolgreiche Internalisierung der Nanopartikel hin. Die rote Farbe ist auf die Fluoreszenzeigenschaft von DOX zurückzuführen. In der unbehandelten Kontrollzelle wird kein rotes Signal beobachtet

RNA-Stabilisierung und mRNA-Expression

Wie in Abb. 5a zu sehen ist, beschleunigen Kupfer-Nanopartikel (Cu-NP) und Kohlenstoff-Nanoröhrchen (CNTs) den hydrolytischen Abbau der RNA (niedrigere Bandenintensität als die Kontrolle), die FePO₄ und Kontroll-Silber-(Ag)-Nanopartikel stabilisieren die RNA, wie durch eine relativ starke Bandenintensität in der RNA-Agarose-Gelelektrophorese (RAGE) gezeigt wird. Die FePO₄ und Kontroll-Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO NP) verleihen auch eine gewisse Resistenz gegenüber dem Abbau im Serum, wie durch die Bandenintensität dargestellt, die etwas höher ist als die der Kontrollen ( 5b ). Wichtig ist die funktionelle Aktivität, die mRNA-Expression ist höher als die Nicht-Nanopartikel-Kontrollen, während das RNA-abbauende Cu-NP einen Verlust der mRNA-Expression verursacht, gemessen in relativen Lichteinheiten ( 5c ). Diese Ergebnisse zeigen, dass FePO₄ NPs helfen, RNA zu stabilisieren und können als stabilisierendes Verabreichungsmittel für die therapeutische RNA-Verabreichung verwendet werden. Frühere vorläufige Experimente hatten gezeigt, dass ein normaler Arbeitsbereich der Translation gezeigt wurde, sind zwei unabhängige Experimente für die nicht mit Nanopartikeln behandelten Kontrollproben, die 2393 und 2630 RLU/Vertiefung zeigten, was repräsentativ ist. Ein mit den obigen Daten übereinstimmender zweifacher Anstieg deutet darauf hin, dass FePO44 NP die Translation unterstützt, während in Übereinstimmung mit der obigen RNA-Denaturierung/-abbau das Cu-NP die Translation unterdrückt. Eine Vielzahl anorganischer Nanopartikelsysteme wurde zur therapeutischen Stabilisierung und Abgabe von RNA genutzt, einschließlich; Gold, Silber, Kupfer, Eisenoxid, mesoporöse Silica-Nanopartikel (MSN), kohlenstoffbasierte Polymere, Komposite und andere [39–45]. Unsere Gruppe hatte zum Beispiel berichtet, dass die Komplexierung von Nanopartikeln an makromolekularer RNA dazu führen kann, dass sie dem Abbau durch RNase oder Nukleasen, die in Serum und Geweben vorkommen, widersteht. Der COVID-19-mRNA-Impfstoff hat ein erneutes Interesse an solchen makromolekularen RNA-Therapien geweckt, die über Impfstoffe hinausgehen, bei denen es den Nanopartikeln obliegt, nicht nur die RNA vor Hydrolyse und Nuklease-vermitteltem Verdau zu schützen, sondern beispielsweise die Komplexierung an die NP muss die RNA-Funktion erhalten , mRNA-Expression. Zuvor hatten wir gesehen, dass makromolekulare RNA durch Kupfer-Nanopartikel-Komplexierung eine RNA-Denaturierung verursacht [46] Daher untersuchten wir die Auswirkungen der NP-Komplexierung auf makromolekulare RNA mit Torula-Hefe-RNA (TY-RNA) oder einem Reporterkonstrukt, das Luciferase exprimiert.

RNA-Hydrolyse. a Es wurde eine Modell-RNA verwendet, die wir in einer Reihe unserer Veröffentlichungen verwendet haben, die in Größe und Sequenzzusammensetzung den meisten mRNAs aus Torula-Hefe (TY-RNA) ähnlich ist. Die RNA wurde im Laufe der Zeit in doppelt destilliertem Wasser in Gegenwart oder Abwesenheit von Nanopartikeln entweder Kupfer (Cu NP), Eisenphosphat (FePO4), Silber (Ag NP) oder Kohlenstoff-Nanoröhrchen (CNT) bei 37 Grad Celsius inkubiert und die Proben wurden bei zum gleichen Zeitpunkt und untersucht durch RNA-Agarose-Gelelektrophorese (RAGE). Ein Verlust der Bandenfärbungsintensität weist auf einen RNA-Abbau hin, wohingegen die Beibehaltung der RNA-Bandenfärbungsintensität eine Stabilisierung anzeigt. b Ähnlich wie oben wurde RNA in 10 % FBS/DMEM bei Raumtemperatur in Gegenwart von Zinkoxid (ZnO) NP oder FePO₄ . inkubiert NP im Vergleich zur Kontrolle, bei der es sich um RNA allein in Abwesenheit von Nanopartikeln handelte. Wieder wurden im Laufe der Zeit Proben entnommen und durch RAGE untersucht, das Vorhandensein der gefärbten RNA-Bande im Laufe der Zeit zeigt wiederum Stabilität und Resistenz gegenüber Nuklease- oder RNase-Abbau aus dem Serum. c Luciferase kodierende mRNA wurde in vitro aus Standard-Kaninchen-Retikulozyten translatiert und die relative Lumineszenz in Gegenwart oder Abwesenheit von Eisenphosphat (FePO₄ .) auf RNA standardisiert ) oder Kupfer (Cu) Nanopartikel

Schlussfolgerung

FePO₄ Nanopartikel wurden nach einer einfachen Co-Inkubations-Präzipitations-Technik erfolgreich synthetisiert, was zur Bildung homogener Partikel von 175 ± 5 nm führte. Die FTIR-Analyse bestätigte das Vorhandensein einer Phosphatgruppe und das Fehlen von Vorläuferverunreinigungen im Nanopartikel. Die Biokompatibilitätsanalyse ergab eine konzentrationsabhängige Biokompatibilität mit mehr als 70 % Zelllebensfähigkeit von bis zu 80 µg/ml. Darüber hinaus wurde DOX effektiv in FePO₄ . geladen was zu FePO₄ . führt -DOX-NPs, die ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften wie FePO₄ . zeigten . Zytotoxizitätsanalyse ergab, dass Fe-Komplexierung mit DOX in FePO₄ -DOX-NPs erhöhten die Zytotoxizität mit einer etwa 10-fachen Verbesserung der IC50 und verbesserten die Selektivität gegenüber Krebszellen. Darüber hinaus zeigte der Internalisierungsassay FePO₄ -DOX-NPs wurden zu einem Inkubationszeitpunkt von 3 h effizient in Zellen internalisiert. RNA-Stabilisierungsstudie zeigte, dass FePO₄ Nanopartikel stabilisieren effizient RNA, verhindern einen schnellen Abbau und behalten die funktionelle Aktivität bei, was die Versprechungen für die Bereitstellung von therapeutischer RNA zeigt. Angesichts der guten Größenhomogenität, des Biokompatibilitätsbereichs, der Wirkstoffbeladungseffizienz, des verbesserten Zytotoxizitätsprofils, der RNA-stabilisierenden Eigenschaft und der effizienten zellulären Aufnahme ist FePO₄ NPs zeigten wünschenswerte Eigenschaften für Wirkstoff- und RNA-Transportvehikel. Darüber hinaus haben die Ergebnisse vielversprechende Aussichten für die Verwendung von FePO₄ . gezeigt -Arzneimittel-NPs in Lebensmittelanreicherungen für die Entwicklung einer lebensmittelbasierten Arzneimittelplattform.

Methoden

Synthese und Charakterisierung von FePO₄ Nanopartikel

FePO₄ Nanopartikel wurden durch das Optimierungsprotokoll der chemischen Fällungstechnik von Sokolova et al. synthetisiert. [47]. Kurz gesagt, Ammoniumphosphat ((NH₄ )₃ PO_4, 16 mg/ml) und Eisennitrat (Fe(NO₃ .) )_3, 8 mg/ml) Lösung wurde hergestellt. Auf 1 ml Fe(NO₃ )₃ , 1 ml (NH₄ .) )₃ PO₄ unter ständigem Rühren zugetropft, was zur Ausfällung von Eisenphosphaten (FePO₄ ). Überschuss von (NH₄ )₃ PO₄ wurde so verwendet, dass das gesamte Fe aus Fe(NO₃ )₃ fällt als FePO_{4 aus.} Die so gebildete Eisenphosphatlösung wurde dreimal mit Wasser gewaschen, um Nebenprodukte durch Zentrifugieren bei 300 g für 2 Minuten zu entfernen. Schließlich FePO₄ Niederschlag wurde mit DSPE-PEG-COOH-Lösung (10% w/w) in Wasser dispergiert, um FePO₄ . zu formulieren Nanopartikel. FePO₄ NPs wurden hinsichtlich ihrer Größe und Oberflächeneigenschaft mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) und spektraler Eigenschaften mittels Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) charakterisiert.

Doxorubicin (DOX) Laden auf FePO₄ Nanopartikel

Doxorubicin wurde in FePO₄ . geladen Nanopartikel durch die Co-Inkubations-Präzipitation-Methode. Drei verschiedene DOX-FePO₄ NPs-Formulierungen wurden untersucht, um die beste Ladeeffizienz zu optimieren. In der ersten Formulierung ist DOX-FePO₄ NPs wurden durch Zugabe von 100 µg DOX in 1 ml Fe(NO₃ .) formuliert )₃ (8 mg/ml) gefolgt von der Zugabe von 1 ml (NH₄ .) )₃ PO₄ (16 mg/ml) tropfenweise unter ständigem Rühren. In den zweiten Formulierungen wurden zunächst 100 µg DOX zu 1 ml (NH₄ )₃ PO₄ (16 mg/ml) gefolgt von der Zugabe von 1 ml Fe(NO₃ .) )₃ (8 mg/ml) tropfenweise unter ständigem Rühren. In den dritten Formulierungen wurden dem FePO₄ . 100 µg DOX zugesetzt NP-Lösung. So formuliertes FePO₄ -DOX-NPs wurden dreimal mit Wasser gewaschen und die Menge an Doxorubicin in FePO₄ -DOX wurde spektrofluorimetrisch durch Messung der DOX-Anregung und -Emission bei 490 nm und 595 nm quantifiziert.

Die DOX-Beladungseffizienz wurde nach der folgenden Gleichung berechnet:

Biokompatibilität von FePO₄ NPs und Zytotoxizität von FePO₄ -DOX-NPs

Biokompatibilität von FePO₄ NPs und Zytotoxizität von FePO₄ -DOX-NPs wurden in Maus-Osteosarkom K7M2 und Maus-Fibroblasten NIH/3T3 unter Verwendung des MTT-Assays nach einem etablierten Protokoll getestet [48, 49]. Kurz gesagt, 10.000 Zellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät und 24 h lang in einem 37°C heißen 5 % CO₂ . inkubiert Inkubator. Dann wurden die Medien entfernt und frische Medien mit unterschiedlichen Konzentrationen von Nanopartikeln wurden zu Zellen behandelt und für 48 Stunden zur Inkubation belassen. Kontrollzellen wurden nur mit Medium gehalten. FePO₄ Die NPs-Konzentration reicht von 20 bis 600 µg/ml und die DOX-Konzentration von 0,05 bis 5 µM. Nach der NP-Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit MTT-Lösung (0,5 mg/ml) in serumfreiem Medium 2 h lang inkubiert, um die Bildung von Formazan-Kristallen zu ermöglichen. Die MTT-Lösung wurde entfernt und Formazankristalle wurden in DMSO gelöst und zum richtigen Mischen 15 min bei Raumtemperatur belassen. Dann wurde die Absorption der DMSO-Lösung bei 550 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (BioTek, Synergy H1 Hybrid Reader) gemessen und die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen berechnet.

Zelluläre Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Zelluläre Internalisierung von FePO₄ -DOX-NPs wurden in Maus-Osteosarkom-K7M2-Zellen mittels konfokaler Mikroskopie analysiert [49,50,51]. Kurz gesagt, 12.000 Zellen wurden in 8-Well-Platten ausgesät und 24 h lang bei 37 °C 5 % CO₂ . inkubiert Inkubator. Dann wurden 200 µl einer DOX-Konzentration von 5 µg/ml in den Medien 3 h lang behandelt und die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd für die Bildgebung fixiert. Der Kern wurde durch DAPI gefärbt und die Zellen wurden unter einem konfokalen Laserscanningmikroskop (Carl Zeiss, LSM-700) beobachtet. Hier kann das Emissionsmaximum von DOX bei 560 nm genutzt werden, um seine Internalisierung zu verfolgen, die in der konfokalen Mikroskopie eine rote Farbe ergibt. Unter Verwendung des gleichen Protokolls wurde ein zeitabhängiger Internalisierungsassay durch Inkubation von FePO₄ . durchgeführt -DOX-NPs und freies DOX für 0,5, 1 bzw. 3 h.

RNA-Stabilität und -Expression

Torula-Hefe-RNA (Sigma-Aldrich) wurde zu 1 mg/ml in sterilem entionisiertem Wasser gelöst und 2 µg-Aliquote wurden 20 ug/ml Nanopartikel (CNT, Cu, Ag, ZnO NP oder FePO₄ .) ausgesetzt ) bei 37 °C inkubiert und im Laufe der Zeit durch RNA-Agarose-Gelelektrophorese untersucht, wie wir zuvor berichtet haben [42, 52]. Der in Abb. 5 gezeigte Zeitpunkt ist über Nacht. In ähnlicher Weise wurde die RNA mit/ohne Nanopartikeln 10 % FBS/DMEM ausgesetzt und erneut wie oben durch RAGE getestet. mRNA fLuc wurde von Trilink Biotechnologies bezogen, 2 µl wurden in Kaninchen-Retikuloysat, ergänzt mit Methinin, Cystein und Leucin (ProMega Corp) bei 30 Grad für 1,5 Stunden mit oder ohne Nanopartikel bei 20 µg/ml inkubiert, Standard-Luciferin-Reagenz hinzugefügt und Lumineszenzmessung aufgenommen auf einem Biotek Synergy H1-Plattenleser unter Standardbedingungen.

Statistische Analyse

Alle Daten repräsentieren mindestens drei unabhängige Replikate und werden als Mittelwert  ± s.d. ausgedrückt. wenn möglich. Cell viability data includes six replicates.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.