Gezielte NIR-responsive PNIPAM-Pyrrol-Nanokomposite für synergistische Chemo-Photothermale Brustkrebstherapie

Zusammenfassung

Die Kombinationstherapie auf Basis multifunktionaler Nanokomposite gilt als vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der Krebswirksamkeit. Hier berichten wir über gezielte multifunktionale Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM)-basierte Nanokomposite für synergistische Chemo-Photothermale Therapie gegen Brustkrebszellen. Um die Übergangstemperatur zu erhöhen, wurde Acrylsäure (AAc) im Syntheseprozess von PNIPAM hinzugefügt, wodurch die intrinsische untere kritische Lösungstemperatur (LCST) auf 42 °C geändert wurde. Um den photothermischen Effekt unter Bestrahlung mit nahem Infrarot (NIR) Laser (808 nm) zu erzeugen, wurden Polypyrrol (ppy) Nanopartikel gleichmäßig in PNIPAM-AAc dekoriert. Folsäure (FA) als Krebsziel-Ligand wurde erfolgreich an die überschüssigen Carboxylgruppen im PNIPAM-Netzwerk konjugiert. Die Arzneimittelfreisetzung der PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite wurde effizient durch Temperaturänderungen mittels NIR-Laserbestrahlung ausgelöst. Wir bestätigten auch, dass PNIPAM-ppy-FA über folsäurerezeptorvermittelte Endozytose in MDA-MB-231 Brustkrebszellen internalisiert wurde und die Krebswirksamkeit durch die Kombinationstherapie aus Chemo- und Photothermaleffekten signifikant gesteigert wurde. Daher ermutigt unsere Arbeit zur weiteren Erforschung multifunktionaler Nanoträger für synergistische therapeutische Ansätze gegen verschiedene Krebszelltypen.

Einleitung

Arzneimittelverabreichungssysteme (DDS) sind eine der leistungsstarken Methoden zur Verabreichung pharmazeutischer Wirkstoffe zur Erzielung therapeutischer Effekte in der Krebstherapie [1]. Obwohl das Ziel von DDS darin besteht, den Wirkstoff zu liefern und im gewünschten Bereich anzureichern, wird das konventionelle DDS oft von schweren Nebenwirkungen und ineffizienter therapeutischer Wirksamkeit begleitet [2, 3]. Um diese Hindernisse zu überwinden, wurden verschiedene Nanoträger entwickelt, die auf spezifische interne oder externe Reize wie Temperatur, Licht, pH, elektrisches Feld, Oxidation-Reduktion, Enzymaktivität und Antigenkonzentration reagieren können, für fortschrittliche DDS und zur Induktion nachhaltiger und kontrollierter Arzneimittelfreisetzung [4–6].

Einer der verschiedenen Reize ist der thermoresponsive Nanoträger ein leistungsstarker Ansatz zur Verbesserung der Krebsbehandlung, da Arzneimittel in Nanopartikeln bei einer bestimmten Temperatur freigesetzt werden können [7]. Zudem kann der Vorteil thermosensitiver Nanopartikel mit anderen Reizen kombiniert werden, um die vollständige Krebsausrottung zu induzieren [8, 9]. Als thermoresponsives Nanopartikel hat Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM) die meiste Aufmerksamkeit erhalten, da es einen Phasenübergang bei einer unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) von ca. 32 °C aufweist [10, 11]. Unterhalb der LCST existiert das gesamte Polymer-Netzwerk in PNIPAM in einem gequollenen Zustand aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen. Andererseits geht PNIPAM in den hydrophoben Zustand über und Wasserstoffbrückenbindungen werden reduziert, was zu einem Zusammenbruch des Polymer-Netzwerks oberhalb der LCST führt [12, 13]. Im Vergleich zu anderen Nanopartikeln hat der PNIPAM-basierte Nanoträger den Vorteil hoher Arzneimittel-Einkapselungseffizienz, kontrollierter Arzneimittelfreisetzungskapazität und guter Biokompatibilität [14]. Aufgrund der spontanen Arzneimittelfreisetzung bei Körpertemperatur ist der PNIPAM-basierte Nanoträger jedoch nicht ausreichend für fortschrittliche DDS einsetzbar. Um dies zu überwinden, fügten frühere Studien organische Säuren (z. B. Vinylessigsäure, Acrylsäure und Allylessigsäure) in den Syntheseprozess von PNIPAM ein, was zu reduzierten Nebenwirkungen durch kontinuierliche Arzneimittelfreisetzung führte [15].

Kürzlich haben sich zahlreiche Studien auf neue therapeutische Ansätze konzentriert, die die Integration von zwei oder mehr reizausgelösten Nanopartikeln für verbesserte Krebswirksamkeit betreffen [16–18]. Beispielsweise weist die photothermale Therapie (PTT) mehrere Vorteile auf, wie präzise Lichtsteuerung auf Tumoren, nicht-invasive Penetration und geringe Toxizität für normale Zellen [19, 20]. Um Nanopartikel mit PTT zu kombinieren, müssen photothermale Wirkstoffe (z. B. Goldnanostäbe, Kohlenstoffnanoröhren, Polypyrrol (ppy) und Graphenoxid) gleichmäßig in PNIPAM-basierte Nanopartikel eingekapselt werden [21–23]. Eine frühere Studie fertigte mesoporöse Silica-beschichtete Goldnanostäbe mit einer thermo- und pH-responsiven PNIPAM-Hülle an und untersuchte weiter in-vivo-Krebstherapieanwendungen [24]. Diese PNIPAM-basierten Nanokomposite erfordern jedoch einen mehrstufigen Syntheseprozess. Zudem verfügten die Nanokomposite nicht über eine Zielgerichtetheit gegen spezifische Krebszellen, was schwerwiegende Nebenwirkungen auf andere Organe oder normale Gewebe verursachen könnte. In unserem vorherigen Bericht entwickelten wir ein bidirektional kontrolliertes Freisetzungssystem unter Nutzung der thermo- und pH-sensitiven Eigenschaften von PNIPAM [15]. PNIPAM-Nanogele wurden mit Acrylsäure (AAc) Gehalten kopolymerisiert für effiziente LCST-Kontrolle. Um die Krebszielgerichtetheit und therapeutische Wirksamkeit besser zu verbessern, entwickelten wir die zielgerichtete Kombinationstherapie mittels Chemo- und Photothermaleffekt (Schema 1). Durch Temperaturerhöhung durch NIR-Laserbestrahlung wurden Arzneimittel aus thermoresponsiven PNIPAM-Nanokompositen freigesetzt und der photothermale Effekt anschließend aktiviert. Aufgrund der konjugierten Folsäure (FA) zeigten PNIPAM-basierte Nanokomposite signifikant verbesserte therapeutische Wirksamkeit gegen MDA-MB-231 Brustkrebszellen.

Schematische Illustration von (a) Synthese von NIR-Licht- und thermo-ausgelösten Dox@PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen und (b) Anwendung für verbesserte Chemo-Photothermale Kombinationstherapie in Brustkrebszellen.

Materialien und Methoden

Materialien

NIPAM, N,N'-Methylenbisacrylamid (MBA), Kaliumpersulfat (KPS, 99 %), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Pyrrol (98 %) wurden von Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA) bezogen. AAc wurde von Dae Jung Chemicals & Materials Co. Ltd (Korea) gekauft. FA-PEG-Amin (FA-PEG-NH₂, MW: 5 kDa) wurde von Nanocs, Inc. (New York, NY, USA) bereitgestellt. Doxorubicin-Hydrochlorid (Dox) wurde von Tokyo Chemical Industry Co. Ltd (Tokio, Japan) bezogen. Alle Chemikalien und Materialien wurden kommerziell ohne weitere Reinigung verwendet.

Synthese von ppy-dekorierten PNIPAM-AAc Nanopartikeln

Die thermoresponsiven PNIPAM-AAc-Nanopartikel wurden nach vorherigem Bericht [15] durch radikalische Polymerisation synthetisiert. 1,13 g NIPAM-Monomer, 0,077 g MBA und 0,136 g AAc wurden in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst und in einen 250-ml-Dreihals-Rundkolben gegeben. Nach 30 min wurde die Reaktionstemperatur auf 80 °C erhöht und 1 h lang kräftig gerührt. Zur Initiierung der Polymerisation wurde KPS (1,5 mg) dem Gemisch zugesetzt, gefolgt von 4 h Rühren. Das Gemisch wurde 7 Tage lang gegen eine Dialysemembran mit Molekulargewichtcutoff (MWCO) 12–14 kDa in deionisiertem Wasser dialysiert, um unreaktive Monomere, Initiatoren, entbehrliche Ionen zu entfernen, und das PNIPAM-AAc-Nanopartikel wurde durch Gefriertrocknung für 48 h erhalten. Um den photothermischen Effekt zu funktionalisieren, wurde ppy durch Polymerisationsreaktion in die vorbereitete PNIPAM-AAc-Lösung dekoriert [25]. PVP (50 und 100 mg) und Pyrrol-Monomer (50 und 100 μl) wurden schnell in 10 mg/ml PNIPAM-AAc-Lösung gegeben und 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde KPS (3,4 mg) in die PNIPAM-AAc-Lösung gegeben und zusätzlich 14 h gerührt. Das ppy-dekorierte PNIPAM-AAc wurde dreimal mit destilliertem Wasser zentrifugiert. PNIPAM-ppy-5 und PNIPAM-ppy-10 wurden durch Gefriertrocknung für 48 h erhalten.

Synthese von krebszielgerichteten PNIPAM-ppy Nanokompositen

Zur Erhaltung krebszielgerichteter PNIPAM-ppy-Nanokomposite (PNIPAM-ppy-FA) wurden 10 mg PNIPAM-ppy in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 ml, pH 5,5) gelöst und 5 min ultraschalliert. EDC (15 mg, 0,078 mmol) und NHS (15 mg, 0,13 mmol) wurden in die PNIPAM-ppy-Lösung gegeben. Nach 1 h wurde FA-PEG-NH₂ (5 mg) hinzugefügt und über Nacht zusätzlich gerührt. Unreaktives FA-PEG-NH₂, EDC und NHS in der PNIPAM-ppy-Lösung wurden durch eine Dialysemembran (MWCO 6–8 kDa) entfernt und PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite wurden 48 h lyophilisiert.

Synthese von Antikrebs-Medikament-beladenen PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen

10 mg PNIPAM-ppy-FA wurden in deionisiertem Wasser gelöst und 5 min ultraschalliert. 0,5 mg/ml Dox wurde tropfenweise zur PNIPAM-ppy-FA-Lösung gegeben, während bei Raumtemperatur kräftig gerührt wurde. Unbeladener Dox wurde durch Zentrifugation (14.000 U/min, 10 min) entfernt und mit deionisiertem Wasser gereinigt. Dox-beladenes PNIPAM-ppy-FA (Dox@PNIPAM-ppy-FA) wurde durch Gefriertrocknung für 48 h erhalten.

Charakterisierung von NIR- und thermoresponsiven PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, JEOL-2100F, JEOL, Japan) wurde verwendet, um Größe, Morphologie und Verteilung der PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite zu charakterisieren. Für TEM-Messungen wurden Proben hergestellt, indem ein Tropfen der Probenlösung in deionisiertem Wasser (Konzentration: 1 g/l) auf ein 200-Mesh-Kupfergitter mit Kohlenstoffbeschichtung aufgebracht wurde. Die Größenverteilung und Oberflächenladung der PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite, die in deionisiertem Wasser gelöst und 5 min ultraschalliert wurden, wurden mit einem Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, UK) gemessen. Die Oberflächenmodifikation und chemische Bindung der PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite wurden durch Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) bestätigt. FT-IR-Spektren wurden an KBr-Pellets mit einem Nicolet iS50 Instrument (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA) im Bereich von 400–4000 cm⁻¹ bei einer Auflösung von 4 cm⁻¹ aufgezeichnet. Die optischen Eigenschaften und die Dox-Beladungskapazität in PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen wurden durch UV-Vis-Spektroskopie (UV 1800, Shimazu, Japan) beobachtet.

Photothermale Eigenschaft und Photostabilität von NIR- und thermoresponsiven PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen

Die photothermale Eigenschaft von Dox-beladenen PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen (Dox@PNIPAM-ppy-FA) wurde durch Echtzeit-Erkennung von Temperaturänderungen bewertet. Dox@PNIPAM-ppy-FA wurde in wässriger Lösung mit unterschiedlichen Konzentrationen von 0,05, 0,1 und 0,2 mg/ml gelöst und 20 min lang mit einem 808 nm NIR-Laser (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., China) bei einer Leistungsdichte von 2 W/cm² bestrahlt. Der Einfluss der NIR-Laser-Leistungsdichte wurde durch Bestrahlung von NIR-Laser für 20 min mit Leistungsdichten von 1, 2 und 3 W/cm² untersucht. Zudem wurde zur Untersuchung der photothermalen Stabilität gegen NIR-Laser die Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösung (0,1 mg/ml) 15 min lang bestrahlt und anschließend 5-mal einem natürlichen Abkühlprozess unterzogen. Während der NIR-Laserbestrahlung wurde die Temperatur der Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösung alle 60 s für 15 min mit einem Thermoelement, verbunden mit einem digitalen Thermometer (DTM-318, Tecpel Co., Taiwan), gemessen.

NIR- und thermoresponsive Arzneimittelfreisetzung von PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen

Zur Untersuchung der Freisetzungsprofile von Dox durch Thermoresponse wurden Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösungen (1 mg/ml) in 5-ml-Fläschchen hergestellt und dann bei 25, 37 und 50 °C gerührt. Zu definierten Freisetzungszeitpunkten (0–72 h) wurde der Überstand jedes Proben durch Zentrifugation gesammelt und durch ein gleiches Volumen frisches Medium ersetzt. Die Menge des aus PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen freigesetzten Dox wurde durch Messung der UV-Vis-Spektroskopie bei 480 nm geschätzt. Zusätzlich wurde das Dox-Freisetzungsverhalten durch NIR-Laser-stimulierte Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösung (1 mg/ml) kräftig bei 37 °C gerührt und für 10 min zu vorbestimmten Zeitpunkten (1, 2, 3, 4 und 5 h) bestrahlt. Als Kontrolle diente Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösung ohne NIR-Laserbestrahlung. Der freigesetzte Dox wurde mit der oben genannten Methode bestimmt.

Zytotoxizitätsanalyse von PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen

Die Zytotoxizität der PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite einschließlich PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA wurde mittels MTT-Test überprüft. A549 und MDA-MB-231 Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen pro Well in 200 μl RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin geimpft und bei 37 °C unter feuchter Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert. Nach 1 Tag wurden 200 μl PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite mit verschiedenen Konzentrationen (20–100 μl) zu jeder Zelle gegeben und die Platte 24 h inkubiert. Die Zellen wurden mit DPBS gewaschen und das Medium wurde dann durch frisches Medium mit MTT-Reagenz (0,5 mg/ml) ersetzt. Nach weiterer 4-stündiger Inkubation wurde das Medium vorsichtig entfernt und 200 μl DMSO zu jedem Well gegeben, um die internalisierten lila Formazan-Kristalle aufzulösen. Die Absorption wurde bei 595 nm mit einem iMark™ Mikroplattenleser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gemessen.

Zelluläre Aufnahmeanalyse von PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen

Zur Bewertung der Zielgerichtetheit auf spezifische Krebszellen von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen wurden A549 und MDA-MB-231 Zellen in 8-Well-Platten (ibidi, München, Deutschland) mit einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/ml geimpft und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann 6 h lang mit PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen (60 μg/ml) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit DPBS gewaschen, um verbleibende Nanokomposite zu entfernen, und mit 4 % Paraformaldehyd für 15 min fixiert. Nach Behandlung mit 0,1 % Triton-X für 15 min bei Raumtemperatur wurden die Zellen schließlich mit Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:200, Invitrogen, USA) für 1 Tag bei 4 °C und 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, Thermo Fisher Scientific, USA) für 10 min gefärbt. Die zellulären Aufnahmebilder wurden mit konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Deutschland) beobachtet.

Verbesserte Antikrebs-Effekte von PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen durch NIR-Laserbestrahlung

Die verbesserte therapeutische Wirksamkeit mittels NIR- und thermoresponsiver PNIPAM-ppy-FA an Brustkrebszellen wurde mittels MTT-Test untersucht. MDA-MB-231 (1 × 10⁴ Zellen/ml) wurden auf 96-Well-Platten geimpft und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit DPBS gewaschen und PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite in verschiedenen Konzentrationen (20, 40, 60, 80 und 100 μg/ml) wurden konzentrationsabhängig in jedes Well gegeben. Nach Übernacht-Inkubation wurde das Medium entfernt, gefolgt von Zugabe von frischem Medium. Für die NIR-Laserbestrahlungsgruppen wurden die Zellen mit 5 W/cm² für 5 min behandelt. Dann wurden MDA-MB-231 mit DPBS gewaschen und frisches Medium mit MTT-Lösung hinzugefügt. Nach 4 h wurde das Medium vorsichtig entfernt und 200 μl DMSO in jedes Well gegeben. Schließlich wurde die Absorption bei 595 nm mit einem iMark™ Mikroplattenleser gemessen, um die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen. Als weitere Methode zur Beobachtung der Krebs therapeutischen Effekte wurde der Live/Dead-Test durchgeführt. PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 μg/ml) wurden in MDA-MB-231 gegeben. Nach 24 h wurden MDA-MB-231 mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung (5 W/cm², 5 min) bestrahlt und mit Calcein AM und Ethidiumhomodimer-1 gefärbt. Nach 30 min wurden die Zellen mehrmals mit DPBS gewaschen. Die Live/Dead-Bilder wurden mit invertierter Fluoreszenzmikroskopie (Olympus Ix73, Japan) aufgenommen.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von NIR- und thermoresponsiven krebszielgerichteten PNIPAM-ppy Nanokompositen

Zur Erzeugung thermoresponsiver PNIPAM-basierter Nanokomposite wurden PNIPAM-AAc-Nanopartikel durch radikalische Polymerisation hergestellt [15]. Zur Kontrolle der LCST via NIR-Laserbestrahlung wurde ppy durch Polymerisationsreaktion in das vorbereitete PNIPAM-AAc überzogen. Das krebszielgerichtete PNIPAM-ppy-FA wurde durch chemische Konjugation von FA-PEG-NH₂ an die Carboxylgruppe in PNIPAM-AAc synthetisiert. Laut TEM-Bildern in Abb. 1a wurden Morphologie, Größe und Dispergiertheit von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA beobachtet. Das hergestellte PNIPAM-AAc wies eine homogene Form mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 274,32 ± 11,62 nm auf. Nach Dekoration mit ppy zeigten PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA ähnliche Größen mit 275,99 ± 11,41 nm bzw. 285,77 ± 17,92 nm. Die Größe von Dox-beladenem PNIPAM-ppy-FA erhöhte sich leicht von 285,77 ± 17,92 auf 290,73 ± 12,28 nm, was darauf hindeutet, dass die Antikrebsmedikamente in PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen beladen waren [26]. Interessanterweise war im Vergleich zu PNIPAM-AAc das Vorhandensein von ppy in PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen durch kleine schwarze Flecken deutlich erkennbar. Zudem waren PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite aufgrund der PEG-Kette gut in wässriger Lösung dispergiert ohne Aggregation [27]. Die durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA wurden mittels DLS-Analyse gemessen (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Die Durchmesser betrugen 432, 450,7, 468,6 und 486,7 nm. Aufgrund unterschiedlicher Analysemethoden war der Durchmesser jedes Nanokomposits größer als der von TEM, aber die Partikelgröße und -verteilung der PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite zeigten einen ähnlichen Trend.

(a) TEM-Bilder von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen. (b) LCST-Analyse von Dox@PNIPAM-ppy-FA mittels DLS. (c) Durchschnittliche Durchmesser von PNIPAM-AAc und Dox@PNIPAM-ppy-FA in Abhängigkeit von verschiedenen Temperaturbedingungen (bei 25 °C, 37,5 °C und 50 °C).

Zur Untersuchung des Einflusses von polymerisiertem ppy in PNIPAM-AAc wurden die LCST-Werte von PNIPAM-AAc und Dox@PNIPAM-ppy-FA bei verschiedenen Temperaturen gemessen (Abb. 1b). Im Vergleich zu unserer vorherigen Arbeit [15] war die LCST von Dox@PNIPAM-ppy-FA leicht niedriger als die von PNIPAM-AAc (42 °C). Dieser Unterschied könnte durch die reduzierten Carboxylgruppen in PNIPAM-AAc aufgrund von polymerisiertem ppy und konjugiertem Krebsziel-Liganden verursacht sein [28]. Anschließend überwachten wir die Partikelgrößenänderung in Abhängigkeit von der Temperatur in Abb. 1c. Dazu wurden die Durchmesser von PNIPAM-AAc und Dox@PNIPAM-ppy-FA im Temperaturbereich von 25 bis 50 °C gemessen. Mit steigender Temperatur verringerte sich PNIPAM-AAc von 436 auf 177 nm. Zudem wurde die Größe von Dox@PNIPAM-ppy-FA stark von 630 auf 420 nm reduziert, was darauf hindeutet, dass ppy-dekorierte PNIPAM-Nanokomposite die Anwendungen von kontrollierten und thermoresponsiven DDS nicht stark beeinflussten [27].

Die Zeta-Potenzialwerte von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA zeigten die Oberflächenänderung der Nanokomposite vor und nach Modifikation (Abb. 2a). Das Zeta-Potenzial von PNIPAM-AAc betrug –37,1 ± 1,61 mV aufgrund der Carboxylgruppen in AAc [29]. Die Werte von PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA stiegen auf –29,6 ± 0,96 mV bzw. –15,6 ± 0,26 mV, was darauf hindeutet, dass positiv geladenes Polypyrrol und FA-PEG-NH₂ erfolgreich in PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite eingeführt wurden [27]. Aufgrund des negativ geladenen Dox änderte sich das Zeta-Potenzial von Dox@PNIPAM-ppy-FA zu negativeren Ladungen (–28,6 ± 0,23 mV). Wie in Abb. 2b gezeigt, wurde die erfolgreiche Synthese von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA durch FT-IR-Spektroskopie bestätigt. Das Spektrum von PNIPAM-AAc zeigte Streckungsschwingungspeaks von C-N und CH₂ zwischen 1100 und 1200 cm⁻¹ und Peaks von C=O, N–H und COOH wurden bei 1545, 1645 und 1750 cm⁻¹ beobachtet, die zu PNIPAM-AAc gehörten [15]. Das Polypyrrol in PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA zeigte zusätzliche Peaks bei 935 und 1050 cm⁻¹ [30]. In den Spektren von PNIPAM-ppy-FA erschienen neue Schwingungspeaks bei 1107 und 2880 cm⁻¹, die auf C–O–C der PEG-Kette zurückzuführen waren. Dieses Ergebnis zeigte die erfolgreiche chemische Konjugation von FA-PEG-NH₂ [31]. Der Ziel-Ligand FA wurde jedoch nicht durch FT-IR detektiert, da seine Struktur der von PEG ähnelte. Zur Bestätigung des Vorhandenseins von FA in PNIPAM-Nanokompositen wurden PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA mittels UV-Vis-Spektroskopie durchgeführt (Abb. 2c). Während die Spektren von PNIPAM-AAc und PNIPAM-ppy (ohne FA) keinen Absorptionspeak zeigten, wies PNIPAM-ppy-FA einen zusätzlichen Peak bei 280 nm auf, der für FA charakteristisch ist [32]. Dieses Ergebnis stützte, dass FA-Moleküle auf PNIPAM-basierte Nanokomposite gepfropft wurden.

(a) Zeta-Potenzial-Analyse von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA. (b) FT-IR-Spektren von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA. (c) UV-Vis-Spektren von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA.

Photothermale Eigenschaft von PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen durch NIR-Laserbestrahlung

Zur Nutzung PNIPAM-basierter Nanokomposite für photothermale Therapie wurde die optische Eigenschaft von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen mittels UV-Vis-Spektroskopie untersucht. Wie in Abb. 2c gezeigt, zeigte PNIPAM-AAc keine Absorption im NIR-Bereich (λ = 700–1000 nm). Die Spektren von PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA zeigten jedoch offensichtlich starke Absorption im gleichen Bereich aufgrund der polymerisierten ppy-Nanopartikel. Diese Absorptionsergebnisse demonstrierten, dass PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite NIR-Licht in Wärme umwandeln können [26]. Als Nächstes bewerteten wir die photothermale Eigenschaft von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen durch NIR-Laserbestrahlung (Abb. 3). Zur Optimierung des photothermaleffekts wurden PNIPAM-FA (ohne Pyrrol), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 μl) und PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 μl) bei gleicher Konzentration (0,1 mg/ml) hergestellt und anschließend 20 min lang 808 nm NIR-Laserbestrahlung bei einer Dichte von 2 W/cm² ausgesetzt (Abb. 3a). Die Temperatur von PNIPAM-ppy-10-FA stieg um 14,5 °C an, was doppelt so hoch war wie bei PNIPAM-ppy-5-FA. Als Kontrolle wurde PNIPAM-FA ohne ppy bestrahlt, aber die Temperatur stieg vernachlässigbar an (2,4 °C). Daher wählten wir PNIPAM-ppy-10-FA für weitere photothermale Experimente. Zur Beobachtung der Temperaturänderungen in Abhängigkeit von der Konzentration wurde NIR-Laser auf PNIPAM-ppy-FA bei verschiedenen Konzentrationen (0,05, 0,1 und 0,2 mg/ml) bestrahlt. In Abb. 3b stieg die Temperatur je nach Konzentration auf 10, 14,5 und 18 °C. Darüber hinaus wurde PNIPAM-ppy-FA-Lösung (0,1 mg/ml) mit verschiedenen Laserleistungsdichten (1–3 W/cm²) in Abb. 3c bestrahlt. Wie erwartet war der Temperaturanstieg des Nanokomposits stark von der Laserleistung abhängig. Anschließend beobachteten wir die photothermale Stabilität der PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite in Abb. 3d. Obwohl die NIR-Laserbestrahlung mindestens 5-mal wiederholt wurde, stieg die Temperatur stetig auf 33 °C an, was zeigt, dass das PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposit ein geeigneter Nanoträger für photothermale Therapie war.

Photothermale Leistung von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen. (a) Temperaturanalyse von Dox@PNIPAM-ppy-5-FA und Dox@PNIPAM-ppy-10-FA unter 808 nm NIR-Laserbestrahlung (2 W/cm²). (b) Temperaturanalyse verschiedener Konzentrationen von Dox@PNIPAM-ppy-FA unter 808 nm NIR-Bestrahlung (2 W/cm²). (c) Photothermaleffekt von Dox@PNIPAM-ppy-FA mit verschiedenen Leistungsdichten (1, 2 und 3 W/cm²). (d) Temperaturkurve von Dox@PNIPAM-ppy-FA über fünf Ein/Aus-Zyklen mittels NIR-Laserbestrahlung (2 W/cm²).

NIR- und thermale responsive Arzneimittelfreisetzung aus PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen

Zur Bewertung der Arzneimittelfreisetzungsprofile via NIR- und Thermoresponse analysierten wir die Einkapselungs- und Freisetzungseigenschaften von Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen. Zunächst maßen wir UV-Vis-Absorptionsspektren des medikamentbeladenen PNIPAM-ppy-FA und beobachteten einen starken Absorptionspeak nahe 480 nm (Abb. 2c). Dieses Ergebnis zeigte, dass Dox erfolgreich in PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite eingekapselt war. Die Dox-Beladungseffizienz von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen wurde auf 15 % mittels Dox-Kalibrierkurve berechnet (Daten nicht gezeigt). In Abb. 4a wurde das Dox-Freisetzungsprofil aus PNIPAM-ppy-FA bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Wir beobachteten das Dox-Freisetzungsverhalten 72 h lang bei 25 °C, 37 °C und 50 °C, und die kumulative Freisetzung von Dox aus PNIPAM-ppy-FA betrug 15 %, 42 % und 67 %. Da die LCST von PNIPAM-ppy-FA leicht auf 42 °C abfiel, war die kumulative Freisetzung bei Körpertemperatur relativ höher als bei Raumtemperatur. Eine große Menge Dox wurde freigesetzt, jedoch beeinträchtigte das freigesetzte Dox nicht die therapeutische Effizienz, da Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite nur in Folsäurerezeptor-positive Zellen internalisiert werden konnten, wie zuvor beschrieben [26, 32]. Oberhalb der LCST (50 °C) wurde die Menge an Dox aus PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen viermal höher freigesetzt als bei Raumtemperatur, was darauf hindeutet, dass PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite in kontrollierten Arzneimittelfreisetzungssystemen durch thermische Response eingesetzt werden können. Zusätzlich untersuchten wir das NIR-Licht ausgelöste Freisetzungsverhalten von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen in Abb. 4b. Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösung (1 mg/ml) wurde 10 min lang NIR-Laser (3 W/cm²) bestrahlt, und dieser Vorgang wurde stündlich wiederholt. Über 6 h erreichte die gesamte Menge an Dox via NIR-Laserbestrahlung 35 %, während das Dox-Freisetzungsprofil ohne NIR-Laserbestrahlung etwa 5 % und 15 % (25 °C und 37 °C) zeigte. Dieses Ergebnis zeigte, dass NIR-Laserbestrahlung eine höhere Temperatur als die LCST der Nanokomposite erzeugte und die Dox-Freisetzung aus den PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen induzierte.

(a) Kumulative Dox-Freisetzungsprofile von Dox@PNIPAM-ppy-FA via Thermoresponse und (b) 808 nm NIR-Laserbestrahlung.

Zytotoxizität und zelluläre Aufnahmeanalyse von PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen

Gemäß Literatur wurde die Zytotoxizität der PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite gegenüber Lungen- und Brustkrebszellen untersucht (Zusatzdatei 1: Abb. S2) [33, 34]. Unabhängig von den Probenkonzentrationen wurde nach Inkubation mit PNIPAM-ppy-FA für 24 h bei beiden Zelllinien eine Lebensfähigkeit von > 85 % beobachtet. Daher zeigten unsere PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite keine Zytotoxizität als Nanoträger für Arzneimittelverabreichungsanwendungen [35, 36]. Um zu untersuchen, ob PNIPAM-ppy-FA selektiv an Krebszellen geliefert werden konnte, untersuchten wir die fluoreszierenden Signale intrazellulärer PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (Zusatzdatei 1: Abb. S3). Das zelluläre Aufnahmeverhalten von PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA wurde in Folsäurerezeptor-negativen (A549) und -positiven (MDA-MB-231) Zelllinien evaluiert [37]. Nach Inkubation von MDA-MB-231 Brustkrebszellen mit Dox@PNIPAM-ppy-FA wurde starke rote Fluoreszenz beobachtet, was zeigte, dass Dox@PNIPAM-ppy-FA in Lysosomen von MDA-MB-231-Zellen internalisiert wurden. Im Gegensatz dazu wurden bei Behandlung von A549-Zellen mit PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA keine Dox-Signale beobachtet. Diese konfokalen Bilder demonstrierten, dass PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite selektiv in Folsäurerezeptor-überexprimierende Krebszellen über den rezeptorvermittelten Endozytoseweg internalisiert werden konnten, wie zuvor beschrieben [38, 39].

Chemo-Photothermale Antikrebs-Effekte von NIR- und thermoresponsiven PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen

Zur Bestätigung der in-vitro-Kombinationstherapie-Wirksamkeit von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen wurden diese an MDA-MB-231-Zellen mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung evaluiert und die Zelllebensfähigkeiten mittels MTT-Test in Abb. 5a bestimmt. Für photothermale Therapie wurden MDA-MB-231 Brustkrebszellen mit PNIPAM-ppy-FA 12 h inkubiert und anschließend NIR-Laser (5 W/cm², 5 min) ausgesetzt. Die Zelllebensfähigkeit von MDA-MB-231 Brustkrebszellen sank auf 70–90 % in Abhängigkeit von den Konzentrationen von PNIPAM-ppy-FA. Zur Bestätigung des rein chemotherapeutischen Effekts wurden Dox-beladene PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite behandelt. Wir beobachteten, dass die Lebensfähigkeiten auf 50 % aufgrund der Dox-Freisetzung aus Nanokompositen abnahmen, entsprechend dem Freisetzungsprofil in Abb. 4. Interessanterweise sank die Zelllebensfähigkeit nach NIR-Laserbestrahlung in MDA-MB-231-Zellen mit Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen drastisch auf bis zu 24 %, was höher war als die der Kontrollgruppen (PNIPAM-ppy-FA mit NIR-Laserbestrahlung, Dox@PNIPAM-ppy-FA ohne NIR-Laserbestrahlung). Dieses Ergebnis zeigte einen optimalen Synergieeffekt der NIR-Laserbestrahlung-vermittelten Chemo-Photothermale Kombinationstherapie. Zudem wurde zur direkten Beobachtung der therapeutischen Effizienz in Krebszellen der Live/Dead-Test in Abb. 5b durchgeführt. Als Kontrollgruppe beobachteten wir die Lebensfähigkeit von MDA-MB-231-Zellen mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung (5 W/cm², 5 min) und die meisten Zellen zeigten grüne Fluoreszenz (lebende Zellen). Dies demonstrierte, dass NIR-Laserbestrahlung die Zelllebensfähigkeit nicht offensichtlich beeinflusste. Zudem zeigten MDA-MB-231-Zellen mit PNIPAM-ppy-FA unter NIR-Laserbestrahlung einige rote Fluoreszenz (tote Zellen), was den phototherapeutischen Effekt durch PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite anzeigte. Trotz fehlender NIR-Laserbestrahlung in MDA-MB-231-Zellen mit Dox@PNIPAM-ppy-FA wurde einige sporadische rote Fluoreszenz beobachtet, was Chemotherapie anzeigte. Darüber hinaus zeigten MDA-MB-231-Zellen, die mit Nanokompositen und NIR-Laserbestrahlung behandelt wurden, die meisten Krebszellen mit roter Fluoreszenz [39, 40]. Diese Ergebnisse stützten die synergistischen therapeutischen Effekte der Chemo-Photothermale Therapie via NIR-Laserbestrahlung und thermoresponsiver Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite.

(a) Quantitative Analyse der Lebensfähigkeit von MDA-MB-231 Brustkrebszellen, behandelt mit PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA in verschiedenen Konzentrationen mit oder ohne 808 nm NIR-Laserbestrahlung. (b) Fluoreszenzbilder des Live/Dead-Assays in MDA-MB-231-Zellen nach Behandlung mit PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA Nanokompositen (60 μg/ml) mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung. Lebende und tote Zellen sind mit Calcein AM (grün) und Ethidiumhomodimer-1 (rot) gefärbt. Skalenbalken 200 μm.

Fazit

Wir haben erfolgreich ein krebszielgerichtetes NIR- und thermoresponsives PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposit für Chemo-Photothermale Kombinationstherapie konstruiert. Um die kontrollierte Freisetzung und den photothermaleffekt via 808 nm NIR-Laserbestrahlung zu induzieren, wurden ppy-Nanopartikel gleichmäßig durch Polymerisationsmethode auf PNIPAM-AAc dekoriert. Dox-beladenes PNIPAM-ppy-FA zeigte signifikanten photothermaleffekt und Photostabilität. Darüber hinaus zeigte Dox@PNIPAM-ppy-FA günstige Eigenschaften des thermosensitiven Übergangs unter verschiedenen Bedingungen, und die Arzneimittelfreisetzung aus PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen konnte durch NIR-Licht und Thermoresponse kontrolliert werden. In-vitro-Studien verifizierten, dass PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite ausgezeichnete Biokompatibilität und verbesserte therapeutische Wirksamkeit gegenüber Brustkrebszellen aufwiesen. Diese verbesserte Antikrebs-Wirksamkeit via Nanokomposite wurde durch folgende Gründe begünstigt: (1) spezifische zelluläre Aufnahme der Nanokomposite in folsäurerezeptorvermittelter Endozytose, (2) akkumulierte Dox-Freisetzung aus PNIPAM-ppy-FA via NIR- und Thermoresponse, und (3) synergistischer therapeutischer Effekt durch Chemo-Photothermale Kombination. Daher könnte unser PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposit potenziell als multifunktionaler Nanoträger für synergistische therapeutische Ansätze gegen verschiedene Krebsarten mit reduzierten Nebenwirkungen eingesetzt werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Daten und Analysen in der aktuellen Arbeit sind auf angemessene Anfrage von den korrespondierenden Autoren erhältlich.

Abkürzungen

PTT:

Photothermale Therapie

NIR:

Nahes Infrarot

FA:

Folsäure

FA-PEG-NH₂:

FA-PEG-Amin

LCST:

Untere kritische Lösungstemperatur

PNIPAM:

Poly(N-isopropylacrylamid)

ppy:

Polypyrrol

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

UV-Vis:

Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie