Nahinfrarotlicht-getriggerte thermoresponsive Poly(N-Isopropylacrylamid)-Pyrrol-Nanokomposite für die chemo-photothermale Krebstherapie

Einführung

Das Drug Delivery System (DDS) ist eine der leistungsfähigsten Methoden zur Verabreichung eines Arzneimittels, um einen therapeutischen Effekt in der Krebstherapie zu erzielen [1]. Obwohl das Ziel von DDS darin besteht, den Wirkstoff abzugeben und sich im gewünschten Bereich anzureichern, geht das konventionelle DDS oft mit schweren Nebenwirkungen und ineffizienter therapeutischer Effizienz einher [2, 3]. Um diese Hindernisse zu überwinden, wurde eine Vielzahl von Nanoträgern entwickelt, die auf spezifische interne oder externe Reize wie Temperatur, Licht, pH, elektrisches Feld, Oxidations-Reduktion, Enzymaktivität und Antigenkonzentration reagieren können verwendet, um eine anhaltende und kontrollierte Wirkstofffreisetzung zu induzieren [4,5,6].

Einer der verschiedenen Reize, der thermoresponsive Nanocarrier, ist ein wirkungsvoller Ansatz zur Verbesserung der Krebsbehandlung, da Medikamente bei einer bestimmten Temperatur in Nanopartikel freigesetzt werden könnten [7]. Außerdem könnte der Vorteil thermosensitiver Nanopartikel mit anderen Stimuli kombiniert werden, um die vollständige Krebseradikation zu induzieren [8, 9]. Als thermoresponsives Nanopartikel ist Poly(N -Isopropylacrylamid) (PNIPAM) hat die meiste Aufmerksamkeit erhalten, da es einen Phasenübergang bei einer unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) von etwa 32 °C aufweist [10, 11]. Unterhalb der LCST existiert das gesamte Polymernetzwerk in PNIPAM aufgrund der Wasserstoffbrücken in einem gequollenen Zustand. Andererseits geht PNIPAM in den hydrophoben Zustand über und Wasserstoffbrücken werden reduziert, was zu einem Kollaps des Polymernetzwerks oberhalb der LCST führt [12, 13]. Im Vergleich zu anderen Nanopartikeln haben PNIPAM-basierte Nanocarrier den Vorteil einer hohen Wirkstoffverkapselungseffizienz, einer kontrollierten Wirkstofffreisetzungskapazität und einer guten Biokompatibilität [14]. Aufgrund der spontanen Wirkstofffreisetzung bei Körpertemperatur reicht ein Nanocarrier auf PNIPAM-Basis jedoch nicht aus, um bei fortgeschrittenem DDS eingesetzt zu werden. Um dies zu überwinden, wurden in den vorherigen Studien organische Säuren (z. B. Vinylessig-, Acryl- und Allylessigsäure) im Syntheseprozess von PNIPAM hinzugefügt, was zu reduzierten Nebenwirkungen durch die kontinuierliche Wirkstofffreisetzung führte [15].

Kürzlich haben sich eine Reihe von Studien auf neue therapeutische Ansätze konzentriert, bei denen die Integration von zwei oder mehr Stimuli Nanopartikel für eine verbesserte therapeutische Wirksamkeit bei Krebs auslöste [16,17,18]. Beispielsweise weist die photothermische Therapie (PTT) mehrere Vorteile auf, wie eine präzise Lichtsteuerung auf Tumoren, nicht-invasive Penetration und geringe Toxizität für normale Zellen [19, 20]. Um die Nanopartikel mit PTT zu kombinieren, müssen die photothermischen Wirkstoffe (z. B. Goldnanostäbchen, Kohlenstoffnanoröhren, Polypyrrol (ppy) und Graphenoxid) gleichmäßig in PNIPAM-basierte Nanopartikel eingekapselt werden [21,22,23]. In der vorherigen Studie wurden mesoporöse silikabeschichtete Goldnanostäbchen mit einer thermo- und pH-responsiven PNIPAM-Hülle hergestellt und in-vivo-Krebstherapieanwendungen weiter untersucht [24]. Diese PNIPAM-basierten Nanokomposite erfordern jedoch einen mehrstufigen Syntheseprozess. Da Nanokomposite darüber hinaus keine zielgerichtete Gruppe gegen spezifische Krebszellen aufweisen, könnte dies schwerwiegende Nebenwirkungen auf andere Organe oder normales Gewebe haben. In unserem vorherigen Bericht haben wir ein bidirektionales kontrolliertes Freisetzungssystem entwickelt, das die thermo- und pH-sensitiven Eigenschaften von PNIPAM nutzt [15]. PNIPAM-Nanogele wurden mit Acrylsäure (AAc)-Gehalten zur effizienten Kontrolle der LCST copolymerisiert. Um das Krebs-Targeting und die therapeutische Wirksamkeit besser zu verbessern, haben wir die Krebs-Targeting-Kombinationstherapie mit chemo- und photothermischem Effekt entwickelt (Schema 1). Als die Temperatur durch NIR-Laserbestrahlung ansteigt, wurden die Wirkstoffe aus thermoresponsiven PNIPAM-Nanokompositen freigesetzt und anschließend der photothermische Effekt aktiviert. Aufgrund der konjugierten Folsäure (FA) zeigten PNIPAM-basierte Nanokomposite eine deutlich verbesserte therapeutische Wirksamkeit gegenüber MDA-MB-231-Brustkrebszellen.

Schematische Darstellung von a Synthese von NIR-Licht- und Thermos-getriggerten Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen und b Anwendung zur verbesserten chemo-photothermischen Kombinationstherapie bei Brustkrebszellen

Materialien und Methoden

Materialien

NIPAM, N,N ′-Methylenbisacrylamid (MBA), Kaliumpersulfat (KPS, 99%), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N ′-Ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und N -Hydroxysuccinimid (NHS) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Pyrrol (98%) wurden von Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA) bezogen. AAc wurde von Dae Jung Chemicals &Materials bezogen. Co. Ltd (Korea). FA-PEG-Amin (FA-PEG-NH₂ , MW:5 kDa) wurde von Nanocs, Inc. (New York, NY, USA) bereitgestellt. Doxorubicinhydrochlorid (Dox) wurde von Tokyo Chemical Industry bezogen. Co. Ltd (Tokio, Japan). Alle Chemikalien und Materialien wurden ohne weitere Reinigung kommerziell verwendet.

Synthese von ppy-dekorierten PNIPAM-AAc-Nanopartikeln

Das mit AAc-Nanopartikeln copolymerisierte thermoresponsive PNIPAM wurde gemäß einem früheren Bericht synthetisiert [15]. 1,13 g NIPAM-Monomer, 0,077 g MBA und 0,136 g AAc wurden in 100 ml entionisiertem Wasser gelöst und in einen 250 ml-Dreihalsrundkolben gegeben. Nach 30 min wurde die Reaktionstemperatur auf 80 °C erhöht und 1 h kräftig gerührt. Um die Polymerisation zu induzieren, wurde KPS (1,5 mg) zu der Mischung gegeben, gefolgt von 4 h Rühren. Die Mischung wurde gegen eine 12–14 kDa-Dialysemembran (MWCO) in entionisiertem Wasser 7 Tage lang dialysiert, um nicht umgesetztes Monomer, Initiator und dispensierbare Ionen zu entfernen, und PNIPAM-AAc-Nanopartikel wurden durch 48 h langes Gefriertrocknen erhalten. Um den photothermischen Effekt zu funktionalisieren, wurde ppy in PNIPAM-AAc-Nanopartikel dekoriert [25]. PVP (50 und 100 mg) und Pyrrolmonomer (50 und 100 μL) wurden schnell in 10 mg/ml PNIPAM-AAc-Lösung zugegeben und 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde KPS (3,4 mg) in die PNIPAM-AAc-Lösung gegeben und zusätzlich 14 h gerührt. Das ppy-dekorierte PNIPAM-AAc wurde dreimal mit destilliertem Wasser zentrifugiert. PNIPAM-ppy-5 und PNIPAM-ppy-10 wurden durch 48 Stunden langes Gefriertrocknen gewonnen.

Synthese von krebsgerichteten PNIPAM-ppy-Nanokompositen

Um krebsgerichtete PNIPAM-ppy-Nanokomposite (PNIPAM-ppy-FA) zu erhalten, wurden 10 mg PNIPAM-ppy in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 ml, pH 5,5) gelöst und 5 min mit Ultraschall behandelt. EDC (15 mg, 0,078 mmol) und NHS (15 mg, 0,13 mmol) wurden in die PNIPAM-ppy-Lösung gegeben. Nach 1 h FA-PEG-NH₂ (5 mg) wurde zugegeben und zusätzlich über Nacht gerührt. Nicht reagiertes FA-PEG-NH₂ , EDC und NHS in PNIPAM-ppy-Lösung wurden durch eine Dialysemembran (MWCO 6–8 kDa) entfernt und PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite wurden 48 h lang lyophilisiert.

Synthese von mit Krebsmedikamenten beladenen PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen

10 mg PNIPAM-ppy-FA wurden in entionisiertem Wasser gelöst und 5 min mit Ultraschall behandelt. 0,5 mg/ml Dox wurden tropfenweise zu der PNIPAM-ppy-FA-Lösung gegeben, wobei bei Raumtemperatur kräftig gerührt wurde. Unbeladenes Dox wurde durch Zentrifugation (14.000 U/min, 10 min) entfernt und mit entionisiertem Wasser gereinigt. Dox-beladenes PNIPAM-ppy-FA (Dox@PNIPAM-ppy-FA) wurde durch 48 Stunden langes Gefriertrocknen erhalten.

Charakterisierung von NIR- und thermoresponsiven PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, JEOL-2100F, JEOL, Japan) wurde verwendet, um die Größe, Morphologie und Verteilung von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen zu charakterisieren. Für die TEM-Messung wurden Proben hergestellt, indem ein Tropfen der Probenlösung in entionisiertem Wasser (Konzentration:1 g/l) auf ein mit Kohlenstoff beschichtetes 200-mesh-Kupfergitter gegeben wurde. Die Größenverteilung und Oberflächenladung von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen, die in entionisiertem Wasser gelöst und 5 min mit Ultraschall behandelt wurden, wurden unter Verwendung eines Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, UK) gemessen. Die Oberflächenmodifikation und chemische Bindung von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen wurden durch Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) bestätigt. FT-IR-Spektren wurden auf den KBr-Pellets unter Verwendung eines Nicolet iS50-Instruments (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA) im Bereich von 400–4000 cm ⁻¹ . aufgenommen bei einer Auflösung von 4 cm ⁻¹ . Die optischen Eigenschaften und die Dox-Beladungskapazität in PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen wurden durch UV-Vis-Spektroskopie (UV 1800, Shimazu, Japan) beobachtet.

Photothermische Eigenschaften und Photostabilität von NIR- und thermoresponsiven PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen

Die photothermischen Eigenschaften von Dox-beladenen PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen (Dox@PNIPAM-ppy-FA) wurden durch Echtzeit-Erfassung von Temperaturänderungen bewertet. Dox@PNIPAM-ppy-FA wurde in wässriger Lösung mit unterschiedlichen Konzentrationen von 0,05, 0,1 und 0,2 mg/ml gelöst und 20 min mit einem 808 nm NIR-Laser (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., China) bei einer Leistungsdichte von 2 W/cm ² . Der Einfluss der NIR-Laserleistungsdichte wurde durch Bestrahlung eines NIR-Lasers für 20 Minuten mit einer Leistungsdichte von 1, 2 und 3 W/cm ² . untersucht , bzw. Um die photothermische Stabilität gegenüber NIR-Lasern zu untersuchen, wurde die Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösung (0,1 mg/mL) außerdem 15 min lang exponiert und anschließend fünfmal auf natürliche Weise abgekühlt. Während der NIR-Laserbestrahlung wurde die Temperatur der Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösung mit einem Thermoelement in Verbindung mit einem digitalen Thermometer (DTM-318, Tecpel Co., Taiwan) alle 60 s für 15 Minuten gemessen.

NIR und thermoresponsive Wirkstofffreisetzung von PNIPAM-ppy-FA Nanocomposites

Um die Freisetzungsprofile von Dox durch Thermoreaktion zu untersuchen, wurden Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösungen (1 mg/ml) in 5 ml-Fläschchen zubereitet und dann bei 25, 37 und 50 °C gerührt. Zu einer definierten Freisetzungszeit (0–72 h) wurde der Überstand jeder Probe durch Zentrifugation gesammelt und durch ein gleiches Volumen an frischem Medium ersetzt. Die Menge an freigesetztem Dox aus PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen wurde durch Messung der UV-Vis-Spektroskopie bei 480 nm geschätzt. Darüber hinaus wurde das Dox-Freisetzungsverhalten über eine auf NIR-Laserstimuli ansprechende Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösung (1 mg/ml) bei 37 °C kräftig gerührt und zu festgelegten Zeitpunkten für 10 Minuten bestrahlt (1, 2, 3 .). , 4 und 5 h). Als Kontrolle wurde eine Dox@PNIPAM-ppy-FA-Lösung ohne NIR-Laserbestrahlung verwendet. Das freigesetzte Dox wurde nach der oben genannten Methode bestimmt.

Zytotoxizitätsanalyse von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen

Die Zytotoxizität der PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite, einschließlich PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA, wurde mithilfe des MTT-Assays verifiziert. A549- und MDA-MB-231-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Vertiefung in 200 µl RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin und wurden bei 37 °C unter einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ . inkubiert . Nach 1 Tag wurde jede Zelle mit 200 µL PNIPAM-ppy-FA-Nanocomposites mit verschiedenen Konzentrationen (20–100 µL) behandelt und die Platte wurde 24 h inkubiert. Die Zellen wurden mit DPBS gewaschen und das Medium wurde dann durch frisches Medium mit MTT-Mittel (0,5 mg/ml) ersetzt. Nach einer weiteren Inkubation für 4 h wurde das Medium vorsichtig entfernt und 200 µL DMSO in jede Vertiefung gegeben, um die internalisierten violetten Formazankristalle aufzulösen. Die Absorption wurde bei 595 nm mit einem iMark™-Mikroplattenlesegerät (Bio-rad, Hercules, CA, USA) gemessen.

Zelluläre Aufnahmeanalyse von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen

Um die Targeting-Fähigkeit von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen auf spezifische Krebszellen zu bewerten, wurden A549- und MDA-MB-231-Zellen in einer 8-Well-Platte (ibidi, München, Deutschland) mit einer Dichte von 2 × 10 ^{. ausgesät 4} Zellen/ml und wurden für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann 6 h mit PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen (60 µg/ml) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit DPBS gewaschen, um die verbleibenden Nanokomposite zu entfernen, und wurden mit 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten fixiert. Nach Behandlung mit 0,1 % Triton-X für 15 min bei Raumtemperatur wurden die Zellen schließlich mit Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:200, Invitrogen, USA) 1 Tag lang bei 4 °C und 4,6-Diamidino-2- gefärbt. Phenylindol (DAPI, Thermo Fisher Scientific, USA) jeweils 10 Minuten lang. Die zellulären Aufnahmebilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Laserscanningmikroskops (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Deutschland) beobachtet.

Verstärkte Antikrebswirkung von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen durch NIR-Laserbestrahlung

Die verbesserte therapeutische Wirksamkeit mit NIR und thermoresponsivem PNIPA-ppy-FA auf Brustkrebszellen wurde mittels MTT-Assay untersucht. MDA-MB-231 (1 × 10 ⁴ Zellen/ml) wurden auf 96-Well-Platten ausgesät und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit DPBS gewaschen und PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA Nanocomposites in verschiedenen Konzentrationen (20, 40, 60, 80 und 100 μg/ml) wurden konzentrationsabhängig in jede Vertiefung gegeben . Nach Inkubation über Nacht wurde das Medium entfernt, gefolgt von der Zugabe von frischem Medium. Bei den NIR-Laserbestrahlungsgruppen wurden die Zellen mit 5 W/cm ² . behandelt für 5 Minuten Dann wurde MDA-MB-231 mit DPBS gewaschen und das frische Medium einschließlich der MTT-Lösung wurde zugegeben. Nach 4 h wurde das Medium vorsichtig entfernt und 200 μL DMSO in jede Vertiefung gegeben. Schließlich wurde die Extinktion bei 595 nm mit einem iMark™-Mikroplattenlesegerät gemessen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Als ein weiteres Verfahren zur Beobachtung der therapeutischen Wirkungen von Krebs wurde der Lebend- und Tottest durchgeführt. PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 μg/ml) wurden in MDA-MB-231 behandelt. Nach 24 h wurde MDA-MB-231 mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung belichtet (5 W/cm ² , 5 min) und wurden mit Calcein AM und Ethidiumhomodimer-1 gefärbt. Nach 30 Minuten wurden die Zellen mehrmals mit DPBS gewaschen. Die Live-/Totbilder wurden unter Verwendung von invertierter Fluoreszenzmikroskopie (Olympus Ix73, Japan) erhalten.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von PNIPAM-ppy-Nanokompositen mit gezielter NIR- und Thermoreaktionsreaktion

Zur Erzeugung thermoresponsiver PNIPAM-basierter Nanokomposite wurden PNIPAM-AAc-Nanopartikel durch eine radikalische Polymerisationsmethode hergestellt [15]. Um die LCST über NIR-Laserbestrahlung zu kontrollieren, wurde ppy durch eine Polymerisationsreaktion in wie hergestelltem PNIAPM-AAc bedeckt. Das auf Krebs gerichtete PNIPAM-ppy-FA wurde durch chemische Konjugation von FA-PEG-NH₂ . synthetisiert an die Carboxylgruppe in PNIPAM-AAc. Gemäß TEM-Bildern in Abb. 1a wurden die Morphologie, Größe und Dispersität von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA beobachtet. PNIPAM-AAc wies die homogene Form mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 274,32 ± 11,62 nm auf. Nach der Dekoration der ppy zeigten PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA mit 275,99 ± 11,41 und 285,77 ± 17,92 nm ähnliche Größen. Die Größe von Dox-beladenem PNIPAM-ppy-FA stieg leicht von 285,77 ±  17,92 auf 290,73 ±  12,28 nm an, was darauf hindeutet, dass die Krebsmedikamente in PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite geladen waren [26]. Interessanterweise zeigte sich im Vergleich zu PNIPAM-AAc das Vorhandensein von ppy in PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen deutlich durch kleine schwarze Flecken. Darüber hinaus wurden PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite aufgrund der PEG-Kette in wässriger Lösung ohne Aggregation gut dispergiert [27]. Die durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA wurden durch DLS-Analyse gemessen (Zusatzdatei 1:Abb. S1). Die Durchmesser von PNIPAM-AAc, PNIPAM -ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA betrugen 432, 450,7, 468,6 bzw. 486,7 nm. Aufgrund unterschiedlicher Analysemethoden war der Durchmesser jedes Nanokomposits größer als der von TEM, aber die Partikelgröße und -verteilung von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen zeigten einen ähnlichen Trend.

a TEM-Bilder von PNIPAM-AAc-, PNIPAM-ppy-, PNIPAM-ppy-FA- und Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen. b LCST-Analyse von Dox@PNIPAM-ppy-FA durch DLS. c Durchschnittliche Durchmesser von PNIPAM-AAc und Dox@PNIPAM-ppy-FA in Abhängigkeit von unterschiedlichen Temperaturbedingungen (bei 25 °C, 37,5 °C und 50 °C)

Um den Einfluss von polymerisiertem ppy auf PNIPAM-AAc zu untersuchen, wurden die LCST-Werte von PNIPAM-AAc und Dox@PNIPAM-ppy-FA bei verschiedenen Temperaturen gemessen (Abb. 1b). Im Vergleich zu unserer vorherigen Arbeit [15] war die LCST von Dox@PNIPAM-ppy-FA geringfügig niedriger als die von PNIPAM-AAc (42 °C). Dieser Unterschied könnte durch die reduzierten Carboxylgruppen in PNIPAM-AAc aufgrund von polymerisiertem ppy und konjugiertem Krebs-Targeting-Liganden verursacht werden [28]. Anschließend verfolgten wir die Änderung der Partikelgröße in Abhängigkeit von der Temperatur in Abb. 1c. Dazu wurden die Durchmesser von PNIPAM-AAc und Dox@PNIPAM-ppy-FA im Temperaturbereich von 25 bis 50 °C gemessen. Mit steigender Temperatur wurde PNIPAM-AAc von 436 auf 177 nm gesenkt. Darüber hinaus wurde die Größe von Dox@PNIPAM-ppy-FA von 630 auf 420 nm stark reduziert, was darauf hindeutet, dass ppy-dekorierte in PNIPAM-Nanokompositen keine großen Auswirkungen auf Anwendungen von kontrolliertem und thermoresponsivem DDS hatten [27].

Die Zetapotentialwerte von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA zeigten die Oberflächenänderung von Nanokompositen vor und nach der Modifikation (Abb. 2a). Das Zetapotential von PNIPAM-AAc lag aufgrund der Carboxylgruppen in AAc bei − 37,1 ± 1,61 mV [29]. Die Werte von PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA stiegen auf − 29,6 ± 0,96 und − 15,6 ± 0,26 mV, was darauf hindeutet, dass positiv geladenes Polypyrrol und FA-PEG-NH₂ wurden erfolgreich in PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite eingeführt [27]. Aufgrund des negativ geladenen Dox änderte sich das Zetapotential von Dox@PNIPAM-ppy-FA zu negativeren Ladungen (− 28,6 ± 0,23 mV). Wie in Abb. 2b gezeigt, wurde die erfolgreiche Synthese von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA durch FT-IR-Spektroskopie bestätigt. Das Spektrum von PNIPAM-AAc zeigte die Streckschwingungspeaks von C-N und CH₂ zwischen 1100 und 1200 cm ⁻¹ und die Peaks von C=O, N–H und COOH wurden bei 1545, 1645 und 1750 cm ⁻¹ . beobachtet , das zu PNIPAM-AAc gehörte [15]. Das Polypyrrol in PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA zeigte die zusätzlichen Peaks bei 935 und 1050 cm ⁻¹ wurden beobachtet [30]. In den Spektren von PNIPAM-ppy-FA traten die neuen Schwingungspeaks bei 1107 und 2880 cm ⁻¹ . auf , die dem C–O–C der PEG-Kette zugeschrieben wird. Dieses Ergebnis zeigte die erfolgreiche chemische Konjugation von FA-PEG-NH₂ [31]. Der Targeting-Ligand von FA wurde jedoch nicht durch FT-IR nachgewiesen, da seine Struktur der von PEG ähnelte. Um das Vorhandensein von FA in PNIPAM-Nanokompositen zu bestätigen, wurden PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA durch UV-Vis-Spektroskopie durchgeführt (Abb. 2c). Während die Spektren von PNIPAM-AAc und PNIPAM-ppy (ohne FA) keinen Absorptionspeak zeigten, zeigte PNIPAM-ppy-FA den zusätzlichen Peak bei 280 nm, der für FA charakteristisch war [32]. Dieses Ergebnis unterstützte, dass FA-Moleküle auf PNIPAM-basierte Nanokomposite gepfropft wurden.

a Zeta-Potenzialanalyse von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA. b FT-IR-Spektren von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy und PNIPAM-ppy-FA. c UV-Vis-Spektren von PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA

Photothermische Eigenschaften von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen durch NIR-Laserbestrahlung

Um PNIPAM-basierte Nanokomposite für die photothermische Therapie zu verwenden, wurden die optischen Eigenschaften von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen durch UV-Vis-Spektroskopie untersucht. Wie in Abb. 2c gezeigt, zeigte PNIPAM-AAc keine Absorption im NIR-Bereich (λ = 700–1000 nm). Die Spektren von PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA zeigten jedoch offensichtlich die starke Absorption im gleichen Bereich aufgrund polymerisierter ppy-Nanopartikel. Diese Absorptionsergebnisse zeigten, dass PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite NIR-Licht in Wärme umwandeln können [26]. Als nächstes bewerteten wir die photothermischen Eigenschaften von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen durch NIR-Laserbestrahlung (Abb. 3). Um den photothermischen Effekt zu optimieren, wurden PNIPAM-FA (ohne Pyrrol), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 μL) und PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 μL) in derselben Konzentration (0,1 mg/ml) hergestellt ) und wurden dann einer 808-nm-NIR-Laserbestrahlung mit einer Dichte von 2 W/cm ² . ausgesetzt für 20 Minuten (Abb. 3a). Die Temperatur von PNIPAM-ppy-10-FA stieg auf 14,5 °C und war damit doppelt so hoch wie die von PNIPAM-ppy-5-FA. Als Kontrolle wurde PNIPAM-FA ohne ppy bestrahlt, aber die Temperatur wurde vernachlässigbar erhöht (2,4 °C). Daher haben wir uns für PNIPAM-ppy-10-FA entschieden, um zusätzliche photothermische Experimente zu untersuchen. Um die Temperaturänderungen nach Konzentrationen zu beobachten, wurde PNIPAM-ppy-FA mit verschiedenen Konzentrationen (0,05, 0,1 und 0,2 mg/ml) mit einem NIR-Laser bestrahlt. In Abb. 3b stieg die Temperatur je nach Konzentration auf 10, 14,5 bzw. 18 °C. Darüber hinaus wurde PNIPAM-ppy-FA-Lösung (0,1 mg/ml) mit verschiedenen Laserleistungsdichten (1–3 W/cm ² .) bestrahlt ) in Abb. 3c. Wie erwartet war der Temperaturanstieg von Nanokompositen stark von der Laserleistung abhängig. Anschließend beobachteten wir die photothermische Stabilität von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen in Abb. 3d. Obwohl die NIR-Laserbestrahlung mindestens fünfmal wiederholt durchgeführt wurde, wurde die Temperatur stetig auf 33 °C erhöht, was zeigt, dass das PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposit ein geeigneter Nanoträger für die photothermische Therapie war.

Photothermische Leistung von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen. a Temperaturanalyse von Dox@PNIPAM-ppy-5-FA und Dox@PNIPAM-ppy-10-FA unter 808 nm NIR-Laserbestrahlung (2 W/cm ² .) ). b Temperaturanalyse verschiedener Konzentrationen von Dox@PNIPAM-ppy-FA unter 808 nm NIR-Bestrahlung (2 W/cm ² .) ). c Photothermischer Effekt von Dox@PNIPAM-ppy-FA mit verschiedenen Leistungsdichten (1, 2 und 3 W/cm ² ). (D) Temperaturkurve von Dox@PNIPAM-ppy-FA über fünf Ein-/Aus-Zyklen mit NIR-Laserbestrahlung (2 W/cm ² .) )

NIR- und thermisch ansprechende Wirkstofffreisetzung aus PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen

Um die Wirkstofffreisetzungsprofile über NIR und Thermoreaktion zu bewerten, analysierten wir die Einkapselungs- und Freisetzungseigenschaften von Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen. Zunächst haben wir UV-Vis-Absorptionsspektren des wirkstoffbeladenen PNIPAM-ppy-FA gemessen und ein starker Absorptionspeak wurde nahe 480 nm beobachtet (Abb. 2c). Dieses Ergebnis zeigte, dass Dox erfolgreich in PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite geladen wurde. Die Dox-Beladungseffizienz von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen wurde unter Verwendung der Dox-Kalibrierungskurve (Daten nicht gezeigt) auf 15% berechnet. In Abb. 4a wurde das Dox-Freisetzungsprofil von PNIPAM-ppy-FA bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Wir beobachteten das Freisetzungsverhalten von Dox für 72 h bei 25 °C, 37 °C und 50 °C und die kumulative Freisetzung von Dox aus PNIPAM-ppy-FA betrug 15 %, 42 % bzw. 67 %. Da die LCST von PNIPAM-ppy-FA leicht auf 42 °C abnahm, war die kumulative Freisetzung bei Körpertemperatur relativ höher als bei Raumtemperatur. Es wurde eine große Menge Dox freigesetzt, das freigesetzte Dox hatte jedoch keinen Einfluss auf die therapeutische Wirksamkeit, da Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite nur in Folatrezeptor-positiven Zellen internalisiert werden konnten, wie zuvor beschrieben [26, 32]. Bei über LCST (50 °C) wurde die Dox-Menge aus PNIAPM-ppy-FA-Nanokompositen viermal höher als bei Raumtemperatur freigesetzt, was darauf hindeutet, dass PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite in einem kontrollierten Wirkstofffreisetzungssystem durch thermische Reaktion verwendet werden könnten. Darüber hinaus haben wir das durch NIR-Licht ausgelöste Freisetzungsverhalten von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen in Abb. 4b untersucht. Dox@PNIAPM-ppy-FA-Lösung (1 mg/ml) wurde einem NIR-Laser (3 W/cm ² .) ausgesetzt ) Bestrahlung für 10 min und dieser Vorgang wurde alle 1 h wiederholt. Während 6 Stunden erreichte die Gesamtmenge an Dox durch NIR-Laserbestrahlung 35 %, während das Dox-Freisetzungsprofil ohne NIR-Laserbestrahlung etwa 5 % und 15 % (25 °C und 37 °C) aufwies. Dieses Ergebnis zeigte, dass die NIR-Laserbestrahlung zu einer höheren Temperatur als die LCST von Nanokompositen führte und die Freisetzung von Dox aus den PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen induzierte.

a Kumulative Dox-Freisetzungsprofile von Dox@PNIPAM-ppy-FA über Thermoreaktion und b 808 nm NIR-Laserstrahlung

Zytotoxizität und zelluläre Aufnahmeanalyse von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen

Laut Literatur wurde die Zytotoxizität von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen gegenüber Lungen- und Brustkrebszellen untersucht (Zusatzdatei 1:Abb. S2) [33, 34]. Unabhängig von den Probenkonzentrationen wurden nach Inkubation mit PNIPAM-ppy-FA für 24 h beide Zelllebensfähigkeiten beobachtet (>   85 %). Daher zeigten unsere PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite keine Zytotoxizität als Nanoträger für Anwendungen zur Wirkstoffabgabe [35, 36]. Um zu untersuchen, ob PNIPAM-ppy-FA selektiv an Krebszellen liefern könnte, untersuchten wir die Fluoreszenzsignale von intrazellulären PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (Zusatzdatei 1:Abb. S3). Das zelluläre Aufnahmeverhalten der PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA wurde in Folatrezeptor-negativen (A549) und positiven (MDA-MB-231) Zelllinien untersucht [37]. Nach Inkubation von MDA-MB-231-Brustkrebszellen mit Dox@PNIPAM-ppy-FA wurde eine starke rote Fluoreszenz beobachtet, die zeigt, dass Dox@PNIAPM-ppy-FA in Lysosomen von MDA-MB-231-Zellen internalisiert wurde. Wenn PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA mit A549-Zellen behandelt wurden, wurden keine Dox-Signale beobachtet. Diese konfokalen Bilder zeigten, dass PNIAPM-ppy-FA-Nanokomposite selektiv in Folatrezeptor-überexprimierte Krebszellen über den rezeptorvermittelten Endozytoseweg, wie zuvor beschrieben, internalisiert werden können [38, 39].

Chemo-photothermische Antikrebswirkung von NIR- und thermoresponsiven PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen

Um die therapeutische Wirksamkeit der In-vitro-Kombinationstherapie von PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen zu bestätigen, wurden die PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite an MDA-MB-231-Zellen mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung bewertet und die Zelllebensfähigkeit wurde durch den MTT-Assay in Abb. 5a bewertet . Für die photothermische Therapie wurden die MDA-MB-231-Brustkrebszellen mit PNIPAM-ppy-FA 12 h inkubiert und anschließend einem NIR-Laser (5 W/cm ² .) ausgesetzt , 5 Minuten). Die Zelllebensfähigkeit von MDA-MB-231-Brustkrebszellen nahm in Abhängigkeit von den Konzentrationen von PNIPAM-ppy-FA auf 70–90% ab. Um den einzigen chemotherapeutischen Effekt zu bestätigen, wurden Dox-beladene PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite behandelt. Wir beobachteten, dass die Lebensfähigkeit aufgrund der Dox-Freisetzung aus Nanokompositen auf 50 % abnahm, was dem Freisetzungsprofil in Abb. 4 entspricht Die Lebensfähigkeit der Zellen nahm dramatisch um bis zu 24% ab, was höher war als die der Kontrollgruppen (PNIPAM-ppy-FA mit NIR-Laserbestrahlung, Dox@PNIPAM-ppy-FA ohne NIR-Laserbestrahlung). Dieses Ergebnis zeigte einen optimalen Synergieeffekt der durch NIR-Laserbestrahlung vermittelten chemo-photothermischen Kombinationstherapie. Um die therapeutische Effizienz in Krebszellen direkt zu beobachten, wurde außerdem der Lebend/Tot-Assay in Abb. 5b durchgeführt. Als Kontrollgruppe beobachteten wir nur die Lebensfähigkeit von MDA-MB-231-Zellen mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung (5 W/cm ² , 5 min) und die meisten Zellen zeigten grüne Fluoreszenz (lebende Zellen). Es zeigte sich, dass die NIR-Laserbestrahlung die Lebensfähigkeit der Zellen nicht offensichtlich beeinflusste. Darüber hinaus zeigten die MDA-MB-231-Zellen mit PNIPAM-ppy-FA unter NIR-Laserbestrahlung einige rote Fluoreszenz (tote Zellen), was auf einen photothermischen therapeutischen Effekt hinweist, der durch PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite verursacht wird. Trotz keiner NIR-Laserbestrahlung in MDA-MB-231-Zellen mit Dox@PNIPAM-ppy-FA wurde einige sporadische rote Fluoreszenz beobachtet, die auf eine Chemotherapie hinweist. Darüber hinaus zeigten die meisten Krebszellen bei der Behandlung von MDA-MB-231-Zellen mit Nanokompositen und NIR-Laserbestrahlung eine geringe rote Fluoreszenz [39, 40]. Diese Ergebnisse unterstützten die synergistischen therapeutischen Wirkungen der chemo-photothermischen Therapie mittels NIR-Laserbestrahlung und thermoresponsiven Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen.

a Quantitative Analyse der Lebensfähigkeit von MDA-MB-231-Brustkrebszellen, die mit PNIPAM-ppy-FA und Dox@PNIPAM-ppy-FA mit unterschiedlichen Konzentrationen und mit oder ohne 808 nm NIR-Laserbestrahlung behandelt wurden. b Fluoreszenzbilder von lebenden/toten Assays in MDA-MB-231-Zellen nach Behandlung von PNIPAM-ppy-FA- und Dox@PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen (60 μg/ml) mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung. Die lebenden und toten Zellen werden mit Calcein AM (grün) und Ethidium homodimer-1 (rot) gefärbt. Maßstabsbalken sind 200 μm

Schlussfolgerung

Wir haben erfolgreich ein auf Krebs ausgerichtetes NIR und thermoresponsive PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite für die chemo-photothermische Kombinationstherapie konstruiert. Um die kontrollierte Freisetzung und den photothermischen Effekt durch 808 nm-NIR-Laserbestrahlung zu induzieren, wurden ppy-Nanopartikel durch das Polymerisationsverfahren einheitlich auf PNIPAM-AAc dekoriert. Dox-beladenes PNIPAM-ppy-FA zeigte einen signifikanten photothermischen Effekt und Photostabilität. Darüber hinaus zeigte Dox@PNIPAM-ppy-FA günstige Eigenschaften des thermosensitiven Übergangs bei verschiedenen Bedingungen und die Wirkstofffreisetzung aus PNIPAM-ppy-FA-Nanokompositen konnte durch NIR-Licht und Thermoreaktion kontrolliert werden. In-vitro-Studien bestätigten, dass PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposite eine ausgezeichnete Biokompatibilität und eine verbesserte therapeutische Wirksamkeit gegenüber Brustkrebszellen aufweisen. Diese verbesserte Antikrebswirksamkeit durch Nanokomposite wurde aus den folgenden Gründen beigetragen:(1) spezifische zelluläre Aufnahme von Nanokompositen bei Folatrezeptor-vermittelter Endozytose, (2) akkumulierte Dox-Freisetzung aus PNIPAM-ppy-FA über NIR und Thermoreaktion und (3 ) synergistischer therapeutischer Effekt durch chemo-photothermale Kombination. Daher könnte unser PNIPAM-ppy-FA-Nanokomposit potenziell als multifunktionaler Nanoträger für synergistische Therapieansätze bei verschiedenen Krebsarten mit reduzierten Nebenwirkungen verwendet werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Daten und die Analysen in der aktuellen Arbeit sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Abkürzungen

PTT:

Photothermische Therapie

NIR:

Nahinfrarot

FA:

Folsäure

FA-PEG-NH₂ :

FA-PEG-Amin

LCST:

Niedrigere kritische Lösungstemperatur

PNIPAM:

Poly(N -Isopropylacrylamid)

ppy:

Polypyrrol

TEM:

Transmissionsmikroskopie

UV–Vis:

Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie